#1  
قديم 11-23-2015, 10:00 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Mkks فارغة الفئران لديها النمط الظاهري تشبه متلازمة بارديه-بيدل

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/14/9/1109.full




متلازمة McKusick-كوفمان (MKS) هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز polydactyly بعد المحوري، وعيوب خلقية في القلب وموه رحمي مهبلي، شذوذ خلقي الهيكلي من الأعضاء التناسلية للإناث. وقد تبين أيضا طفرات في الجين MKKS أن يسبب بعض حالات متلازمة بارديه-بيدل (BBS) التي تتميز البدانة، اعتلال الشبكية الصباغي، polydactyly، تشوهات الكلى ونقص الأعضاء التناسلية مع ميزات الثانوية من ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري. على الرغم من أن هناك تداخل في المظاهر السريرية بين MKS وBBS، والمرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة MKS ليست ولا تتطور اعتلال الشبكية أو لديك صعوبات التعلم. لمواصلة استكشاف الفيزيولوجيا المرضية لBBS وMKS اضطراب ذات الصلة، قمنا بتطوير Mkks - / - نموذج الفأر. يظهر هذا النموذج أن غياب Mkks يؤدي إلى تنكس الشبكية من خلال موت الخلايا المبرمج، فشل تشكيل الحيوانات المنوية سياط، ارتفاع ضغط الدم والسمنة. ويرتبط بالسمنة مع فرط الأكل وانخفاض النشاط. وبالإضافة إلى ذلك، وفحص عصبي يكشف عجز في الشم والهيمنة الاجتماعية. الفئران لا تملك polydactyly أو تشوهات المهبل. النمط الظاهري للMkks - / - الفئران يشبه النمط الظاهري من نماذج الماوس الأخرى من BBS (Bbs2 - / - وBbs4 - / -). وتشير هذه الملاحظات أن الغياب الكامل للMKKS يؤدي إلى BBS حين من المرجح أن يكون راجعا إلى حدوث طفرات محددة النمط الظاهري MKS.
مقدمة

متلازمة McKusick-كوفمان (MKS) هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز polydactyly بعد المحوري، عيوب القلب الخلقية وموه رحمي مهبلي، شذوذ خلقي الهيكلي من الأعضاء التناسلية الأنثوية (1، 2). تم تعيين في البداية الجين MKKS وحددت بشكل كبير طائفة الأميش المشابهة. يظهر البروتين MKKS توقع التماثل إلى الوحيدات ألفا من Thermoplasma acidophilum thermosome (1، 3)، مجمع chaperonin بدائيات النواة مع التشابه الهيكلي لchaperonin حقيقية النواة يسمى "مجمع مجمع خاتم ببتيد العديم الذيل" (TRIC)، وهو chaperonin-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات تشارك في للطي من العديد من البروتينات بما في ذلك تويولين والأكتين (4). وقد تبين أيضا طفرات في الجين MKKS أن يسبب بعض حالات متلازمة بارديه-بيدل (BBS) التي تتميز البدانة، اعتلال الشبكية الصباغي، polydactyly، والتشوهات الكلى، والتشوهات الوظيفية ونقص الأعضاء التناسلية مع ميزات الثانوية من ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري (5 - 9 ). على الرغم من أن هناك تداخل كبير في المظاهر السريرية بين MKS وBBS، ومرضى متلازمة MKS لا يعانون من السمنة المفرطة وعدم تطوير اعتلال الشبكية أو التعلم الإعاقة.
حتى الآن، تم تعيين ثمانية BBS المكاني وتم التعرف على الجين BBS في كل من هذه الامكنه بما في ذلك الجين MKKS (كما يشار إلى BBS6) (3، 10 - +18). باستثناء MKKS، وغيرها من البروتينات المعروفة BBS ليس لديهم تشابه كبير لchaperonins. ومع ذلك، BBS4 وBBS8 يحتوي على تكرار المجالات tetratricopeptide مما يشير إلى أنها قد تتفاعل مع بروتينات أخرى. الجين BBS3 حددت مؤخرا هو ADP-ribosylation عامل مثل الجين (17، 18).
وتشير البيانات الأخيرة التي تشارك الجينات BBS في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا، ويتم حفظها الجينات BBS في الكائنات مهدبة، ولكن ليس في الكائنات غير مهدبة (16، 17). وقد ثبت أن بعض البروتينات BBS في توطين إلى الجسم القاعدية من الخلايا المهدبة وأن تشارك في نقل intraflagellar (15، 19). نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن Bbs4- وBbs2 خروج المغلوب الفئران لها ملامح الفوضى البشري وأن غياب هذه البروتينات يؤدي إلى فشل تشكيل الحيوانات المنوية سياط، ولكن ليس تشكيل أهداب بشكل عام. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن غياب Bbs2 أو البروتينات Bbs4 لا يعطل تماما تطوير خلية مستقبلة للضوء الأولية، على الرغم من أن الشاذة التشكل القرص هو واضح. ربط أهداب موجودة أيضا في الحيوانات ناقصة لBbs2 أو Bbs4. ولكن المستقبلات الضوئية تخضع لموت الخلايا بسبب موت الخلايا المبرمج (20، 21). لمواصلة استكشاف الفيزيولوجيا المرضية لBBS وMKS اضطراب ذات الصلة، وقد وضعنا الآن وتتميز وMkks - / - نموذج الفأر.

النتائج

جيل من الفئران Mkks خروج المغلوب

تم إنشاء Mkks الفئران -deficient باستخدام بناء استهداف الجين مصممة لإزالة اكسون 3 من الجين Mkks في مجملها (الشكل 1 A). تم transfected في بناء الاستهداف إلى الجذعية الجنينية (ES) الخلايا وتم التنميط الجيني ل~1000 خطوط الخلايا ES لتحديد خمسة (0.5٪) recombinants مثلي. تم حقن اثنين من الحيوانات المستنسخة المستهدفة في الكيسات الأريمية والوهم التي تنتج كل. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Mkks متخالف (Mkks +/-) الفئران على خلفيات وراثية مختلطة والفطرية التي التزاوج مع C57BL / 6J و 129 الفئران / SvEv، على التوالي. تم مرمزة الفئران باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (الشكل 1 Mkks B) - / - ولدت الفئران أقل كثيرا مما كان متوقعا من قبل الميراث مندلية (P <0.05). 600 مرمزة الفئران، فإن نسبة من Mkks + / +، Mkks +/- وMkks - / - كان 26.5، 54.4 و 19.1٪ على التوالي. الندرة النسبية للMkks - / - من المرجح إما بسبب وفاة داخل الرحم للأجنة خروج المغلوب متماثل أو موت الحيوانات خروج المغلوب متماثل بعد فترة قصيرة من الولادة الفئران. لقد رصدها بعناية الفئران حديثي الولادة، وقد وجدت تسع حالات وفاة بعد الولادة، حيث تمكنا من استعادة الحيوان لالتنميط الجيني. وكان اثنان من هذه الفئران تسعة Mkks - / -، ثلاثة كانت متماثل وضعها الطبيعي وأربعة كانوا الزيجوت، والتوزيع التي لا تختلف كثيرا عن النسب المندلية. لقد ضحى أيضا ثلاثة الفئران الحوامل الإناث في 14 أيام الحمل ومرمزة الأجنة. وكانت ثلاثة أجنة متماثل وضعها الطبيعي، وتسعة كانت الزيجوت وستة كانوا Mkks - / -. وكانت جميع الأجنة الطبيعية بشكل صارخ على الفحص باستثناء واحد Mkks - / - الجنين الذي كان أصغر بكثير من الأجنة الأخرى. وتشير هذه البيانات إلى أن بعض Mkks - / - الفئران تموت في وقت متأخر من الحمل.

الشكل 1. تمثيل تخطيطي للMKKS استهدفت استراتيجية التعطيل. (A) خريطة للمكان MKKS (أعلى)؛ استهداف ناقلات الجينات (وسط). هيكل المتوقعة من مكان تحور (القاع). السهام تشير الاشعال المستخدمة لاختبار إعادة التركيب 5'- و3'-مثلي واختبار خروج المغلوب الداخلي. (B) PCR التنميط الجيني من النوع البري، متخالف (+/-) وBBS فارغة (- / -) الفئران. وamplimers أعلى ومنتصف تتوافق مع 5'- و3'مناطق من الجينات المقاومة بالنيوميسين. مشتق الفرقة السفلي من التضخيم باستخدام MKKS اكسون 3 الاشعال الداخلية. (C) تحليل الشمالي لطخة من Mkks التعبير في الكلى مجموع RNA الخلوية من النوع البري (+ / +)، متخالف (+/-) ومتماثل (- / -) الحيوانات. وهذا التحقيق هو Mkks كدنا] جزئي. (القاع) نفس وصمة عار إعادة بحثها مع β - الأكتين كعنصر تحكم التحميل.

Mkks الاستهداف أسفر عن أليل باطل كما يتبين من غياب Mkks مرنا عن طريق تحليل لطخة الشمالي (الشكل 1 C).

Mkks - / - الفئران تصبح بدينة ولديها مستويات اللبتين عالية

وكانت Mkks الفئران -deficient الطبيعية بشكل صارخ فيما يتعلق التشكل، على الرغم من أنها ظهرت لتكون أصغر عند الولادة من تتزاحم بهم. في وقت الفطام (3 اسابيع من العمر)، Mkks - / - وزن الفئران أقل بكثير من نظرائهم من النوع البري وتتزاحم متخالف. بواسطة ~8-12 أسابيع من العمر، الفئران Mkks -null وزن نفس Mkks + / + وMkks +/- الحيوانات. بعد 28 أسبوعا، Mkks - / - كانت الفئران أكبر بكثير من كل من البرية من نوع والزيجوت (الشكل 2 A). كان والضوابط أكبر في الإناث منها في ذكور الفئران - الفرق في الوزن بين Mkks - /.

الشكل 2. زيادة الوزن واستهلاك الأغذية البرية من نوع، Mkks +/- وMkks - / - الفئران. (A) زيادة الوزن في الفئران الإناث والذكور مقابل العمر. أدرج ما لا يقل عن سبعة حيوانات في كل مجموعة. كانت الفئران انخفاض وزن المواليد من Mkks +/- أو Mkks + / + الفئران ولكن بحلول الاسبوع 16 وكانت أثقل بكثير - MKKS - /. (B) استهلاك الغذاء بالنسبة للفئران الذكور والإناث، وبلغ متوسط ​​كل 7 أيام. أدرج ما لا يقل عن ستة حيوانات في كل مجموعة Mkks - / - الفئران تستهلك أكثر بكثير من الغذاء Mkks + / + وMkks +/- الفئران. (C) أربعة وعشرون بيانات النشاط ساعة مقاسا القياس Mkks - / - الفئران تبدي أقل بكثير الحركة بالمقارنة مع من النوع البري.

وأشارت دراسات التغذية الطولية التي Mkks - / - الفئران تأكل أكثر من متخالف والنوع البري تتزاحم (الشكل 2 وتظهر انخفاضا كبيرا في النشاط كما تقاس 24 ساعة القياس بالمقارنة مع من النوع البري الفئران (الشكل B). 2 C) Mkks - / - الفئران كان أعلى متوسط ​​مستويات اللبتين في الدم من النوع البري الضوابط (27 ± 15.3 SD و 2.3 ± 2.6 SD نانوغرام / مل على التوالي، N = 4).

Mkks - / - قد عزز الفئران ضغط الدم

Mkks - / - الفئران كانت أعلى بكثير الانبساطي، يعني وضغط الدم الانقباضي من الضوابط على النحو الذي يحدده 24 ساعة القياس عن بعد. كان متوسط ​​الفرق في الضغط الشرياني يعني بين خروج المغلوب ومراقبة الحيوانات 12 مم زئبق (الجدول 1).

الجدول 1.
ضغط الدم (مم زئبق) ومعدل ضربات القلب (نبضة في الدقيقة) من Mkks - / - الفئران والضوابط

Mkks - / - الفئران لا يحمل polydactyly

على الرغم من polydactyly هو سمة مشتركة لكلا MKS وBBS في البشر، لا Mkks - زيارتها الفئران polydactyly أو غيرها من تشوهات الأطراف البارزة - /. تم تحديد هذا عن طريق عد الأرقام من جميع الأطراف الأربعة 115 Mkks - / - الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليل الأشعة السينية في 20 الكبار Mkks - / - الفئران. وكشف تحليل الأشعة السينية لهذه الحيوانات أن أيا كان الشذوذ الأطراف بما في ذلك polydactyly، ارتفاق الأصابع، قصر الأصابع والمفقودين أو العظام تتكرر في الأطراف.

Mkks - / - الفئران تمتلك العصبي الحسي والسلوكية الظواهر

تم تقييم التحليلات السلوكية والوظيفية من الفئران باستخدام بروتوكول SHIRPA المعدلة (22). وتمت مقارنة البيانات من 38 قياسات الرصد منفصلة بين Mkks + / +، Mkks +/- وMkks - / - الفئران. وتتلخص تلك التجارب تظهر فروق ذات دلالة إحصائية بين الأنماط الجينية في الجدول 1. وكان متوسط ​​عمر الفئران في وقت التقييم 23 أسبوعا. والفئة العمرية 16-34 أسابيع. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية عند مقارنة البيانات من Mkks +/- مع Mkks + / + الفئران من كلا الجنسين. وبالمثل، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين خروج المغلوب والسيطرة الفئران في العضلات وانخفاض وظائف الخلايا العصبية الحركية مثل وضع الجسم والتوازن والتنسيق، والمشية والسلبية الموضعية، وذيل الارتفاع، وقوة قبضة أو لهجة الجسم، ولا كانت هناك فروق ذات دلالة إحصائية في وظائف الحسية مثل قرصة اصبع القدم وردود الفعل. وأخيرا، لم يكن هناك تأثير كبير من النمط الجيني على وضع البصري (P = 0.43)، لوحظ الاختبار الذي يخفض الماوس لأسفل على شبكة الأسلاك وتمديد الذراعين.
/ - - كانت الفئران الإناث أقل صخبا أثناء المناولة بالمقارنة مع الضوابط (P <0.05) Mkks - Mkks. / - أظهرت الفئران الشم تتضاءل إذا ما قيست القدرة على الحصول على الغذاء مخفي (الجدول 2).

الجدول 2.
ملخص فروق ذات دلالة إحصائية بين MKKS-، Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة مقارنة مع هم تتزاحم من النوع البري في SHIRPA الشاشة الرئيسية الملاحظات السلوكية

كما Mkks - / - لوحظت الفئران أن تكون أكثر منصاع لمعالجة، تم إجراء اختبار الهيمنة الاجتماعية. في 33/46 تجارب (72٪؛ P <0.05)، وMkks + / + تم العثور على الفئران أن تكون مهيمنة على Mkks - / - في اختبار الهيمنة الاجتماعية المقترنة. عندما تم اختبار الفئران متخالف ضد Mkks - / - الفئران، كانت الفئران متخالف أيضا المهيمنة (35/46 المحاكمات؛ 76٪؛ P <0.05). كان هذا الاستنتاج صحيحا بالنسبة لكل من الحيوانات من الذكور والإناث. لم يكن هناك اختلاف في الهيمنة الاجتماعية بين النوع البري والحيوانات متخالف (P> 0.05).

Mkks - / - عرض الفئران انحطاط مبصرة

Mkks - / - ظهرت الفئران لشبكية العين الطبيعية في وقت مبكر من الحياة ولكن في وقت لاحق الخضوع تنكس الشبكية. عيون من Mkks - / - الفئران من مختلف الأعمار قيمت 2-11 أشهر تشريحيا (الشكل 3). في 2-3 أشهر من العمر، تم التفريق بين قطاعات الداخلية والخارجية بشكل واضح، تم تخفيض طبقة النووية الخارجي قليلا، وكانت نواة الخلية موجودة في الفضاء تحت الشبكية. تم تخفيض شرائح الداخلية والخارجية في الارتفاع (الشكل 3 A). في 4-5 أشهر من العمر، وأظهرت طبقة النووية الخارجي انخفاضا معتدلا وتضمنت 3-7 صفوف من النوى. وكان من بقايا المواد المقابلة لقطاعات الداخلية والخارجية سيئة متباينة لا تزال موجودة في هذا العصر بين طبقة النووية الخارجي وRPE (الشكل 3 B). في 6 أشهر من العمر، تم تخفيض طبقة النووية الخارجي إلى حد كبير، مع 1-2 فقط صفوف من نوى المتبقية وكميات متفاوتة من المواد الداخلية / الجزء الخارجي؛ كانت خلايا عديدة موجودة في الفضاء تحت الشبكية (الشكل 3 C). قبل 8 أشهر، وطبقة النووية الخارجي المتخلفة تماما ولا بقايا من قطاعات الداخلية أو الخارجية قابلة للكشف (لا تظهر البيانات).

الشكل 3. الهيماتوكسيلين يوزين تلطيخ Mkks - شبكية العين الماوس / - - (C A). تم فحص الفئران في 2-3 أشهر من العمر (A)، 4-5 أشهر (B) و 6 أشهر (C). بعض التغيرات التنكسية في طبقة النووية الخارجي (ONL) واضحة في فئران عمرها 3 أشهر 2- ل، على الرغم من قطاعات الداخلية والخارجية يمكن تمييزها بوضوح. قبل 5 أشهر من العمر (B)، والتمييز بين القطاعات الداخلية والخارجية هو أقل وضوحا وطبقة النووية الخارجي هو أرق بكثير مما كانت عليه في Mkks + / + العينين. في 6 أشهر من العمر (C)، وطبقة النووية الخارجي قد تدهورت إلى حد كبير وليس قطاعات الداخلية أو الخارجية موجودة. تلطيخ المضادة للرودوبسين موجود في الجزء الخارجي من قبل 2 أشهر من العمر (D). IS، قطاعات الداخلية، OS، شرائح الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية. GCL، طبقة الخلايا العقدية.

تلطيخ المضادة للرودوبسين من شبكية العين من Mkks - / - الحيوانات مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة RetP1 قبل إكمال فقدان المستقبلات الضوئية كشفت مناعية أوبسين الطبيعي في قطاعات الخارجي في 2 أشهر من العمر. بالإضافة إلى ذلك، كان مترجم بعض رودوبسين إلى الخلية الهيئات في طبقة النووية الخارجي في Mkks - / - الفئران (الشكل 3 D).

Mkks - / - فشلت الفئران لتشكيل الحيوانات المنوية سياط

Mkks - / - فشل الفئران الذكور في تلقيح متخالف أو من النوع البري إناث الحيوانات. من أجل التحقيق في أسباب العقم، ونحن فحص الخصيتين من Mkks - / -. ولوحظ غياب الأسواط في شمعة أنبوب صغير المنوية في الخصيتين من Mkks - / - الفئران (الشكل 4 أ و ب). ولوحظ غياب الأسواط في Mkks - / - الفئران من جميع الأعمار فحص. كان نوى مع لونين مكثف للغاية تشبه رؤوس الحيوانات المنوية الحالي، ولكن سياط كانت غائبة.

الرقم 4. سيليا التي تحتوي على هياكل في Mkks - / - الفئران. أقسام من خلال الأنابيب المنوية البرية من نوع (A) وMkks - / - (B) الفئران تكشف عن أن الفئران تعاني من نقص في الجين MKKS تفشل في إنتاج سياط العادي (الهيماتوكسيلين يوزين وصمة عار، على نطاق وبار = 90 ميكرون). المجهر الإلكتروني للنبيب القاصي الكلوي (C) من Mkks - / - الفئران يكشف عن تشكيل طبيعي من أهداب الكلوي. مقياس شريط = 2 ميكرون. المتوقع Z-سلسلة من الخلايا الظهارية القصبة الهوائية مثقف البرية من نوع (D) وMkks - / - (E) الفئران التمايز التالية مع واجهة الهواء السائل. مورفولوجية أهداب في Mkks - / - الفئران مماثلة لتلك التي البرية من نوع الفئران. وصفت الخلايا مع أجسام مضادة موجهة ضد β تويولين-IV لتصور أنيبيب (الخضراء). نوى كانت ملطخة مكافحة مع TO PRO3 (الحمراء).

خلايا من Mkks - / - الفئران تطوير أهداب

تم فحص الكلى من الفئران الشابة التي كتبها المجهر الإلكتروني لتقييم الكلوي التشكل الهدبية الابتدائية في Mkks - / - الفئران. أهداب في Mkks - / - ظهرت العينات أن تكون من الحجم العادي والكثافة (الشكل 4 C). لمزيد من التحقيق ما إذا كان المنتج الجين MKKS يلعب دورا في نشوء حيوي أهداب، ونحن مثقف الخلايا الظهارية القصبة الهوائية من الصغار والكبار من النوع البري وMkks - / - الفئران. بعد الغرس، الخلايا الظهارية الماوس القصبة الهوائية (MTEC) انتشرت بسرعة وأصبح الاستقطاب. بعض الخلايا الظهارية القصبة الهوائية المتقدمة إلى خلايا مهدبة في ظل ظروف الثقافة التي تتعرض الخلايا إلى واجهة الهواء السائل (23). تم تقييم أهداب التي وصفها مناعي مع الأجسام المضادة لمكافحة β تويولين-IV. الخلايا الظهارية المستمدة من كلا البرية من نوع وMkks - / - الفئران طورت عددا مماثلا من أهداب والتشكل من أهداب يبدو طبيعيا عندما تصور مع المجهر متحد البؤر (الشكل 4 C).

نقاش

وتبين لنا أن MKKS الفئران -deficient تطوير السمنة وتنكس الشبكية وأن الذكور تفشل في تشكيل سياط. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الحيوانات لديها زيادة الضغط الشرياني، ضعف حاسة الشم والنمط الظاهري السلوكية مما يشير إلى التفاعل الاجتماعي الشاذ. نتائج السمنة، وتنكس الشبكية وفشل تشكيل سياط تشبه ملامح Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة، ولكن تنكس الشبكية لديه بداية لاحق من ذلك ينظر في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (20 ، 21).
النتائج المعلنة هنا لMkks - / - الحيوانات وسبق لBbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران تشير إلى أن البروتينات BBS لا حاجة على الاطلاق لتشكيل إما أهداب متحركة أو الأساسي. ويتضح ذلك من حقيقة أن الشباب Mkks-، Bbs2- والفئران Bbs4 فارغة إنتاج خلايا مستقبلة للضوء التي هي بشكل صارخ طبيعية شكليا ولكن في وقت لاحق الخضوع انحطاط كاملة. في الدراسة الحالية، ونحن نقدم أدلة على أن القصبة الهوائية الخلايا الظهارية من Mkks - / - الفئران قادرة على توليد أهداب العادي شكليا في الثقافة. ومع ذلك، في كل من نماذج الماوس ثلاثة قمنا بحثت حتى الآن (Mkks - / -، Bbs4 - / - وBbs2 - / -)، للخطر تجميع الحيوانات المنوية سياط. عدم وحظ من سياط في الأنابيب المنوية قد يكون راجعا إلى الفشل الكامل لتشكيل هذه الهياكل، أو بدلا من ذلك، قد تنتج عن تحلل السريع لسياط التالية تأليفهم. ومع ذلك، في الحيوانات درسناه، ونحن لم يلاحظ أي الحيوانات المنوية مع الأسواط، مشيرا إلى أن سياط تتشكل أبدا. فشل تشكيل الأسواط أو صيانة خلال النطاف يشير إلى أن هناك اختلافات بين عمليات أهداب مقارنة مع الجمعية سياط.
تم الإبلاغ عن موه رحمي مهبلي، لاتكون المهبلي والتشوهات البولي التناسلي أخرى في كل من MKS والمرضى BBS (24). ولادة قدموا ما يقرب من 3٪ من المرضى BBS (24). وقد لوحظت حالات شاذة لا المهبلية في Mkks - / - الفئران، على الرغم من أنها على ما يبدو الخصوبة انخفضت. ثلاثة من خمسة Mkks - / - الإناث تزاوج أصبحت حاملا.
وعلى الرغم من التجمع العادي الأول من أهداب في Mkks الفئران -deficient، دليل على وظيفة الأهداب غير طبيعية موجودا. على سبيل المثال، على الرغم من أن قطاعات الخارجية للخلايا مستقبلة للضوء يبدو أن تتطور بشكل طبيعي، فإنها تصبح غير منظمة، وفي نهاية المطاف خلايا مستقبلة للضوء الخضوع انحطاط. ومواصلة دراسة هذه النماذج الحيوانية تساعد على توضيح الدور الدقيق للبروتينات BBS في هذه العمليات داخل الخلايا. الملاحظة أن مجموعة فرعية من أجسام الخلايا طبقة النووية الخارجي ظهرت لديك أوبسين mislocalized تتفق مع فكرة أن وظيفة الأهداب قد تنخفض قيمتها في خلايا مستقبلة للضوء. الملاحظة أن Mkks - / - الفئران تطوير تنكس الشبكية مما يؤدي إلى عمى الكامل يعني أيضا أن الدولة فارغة أكثر شبها الطفرات BBS المصاحب في الجين MKS من الطفرات مغلطة في MKS.
وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الفئران Mkks فارغة تطوير البدانة ترتبط بزيادة استهلاك الغذاء مماثلة للنتائج في Bbs2- وBbs4 خروج المغلوب الفئران. الزيادة في استهلاك الطعام تبدأ قبل بداية السمنة خلال فترة النمو اللحاق بالركب وتستمر بعد Mkks - / - الفئران تزن أكثر بكثير من النوع البري تتزاحم Mkks - / - لدى الفئران أيضا انخفاض في النشاط كما تقاس 24 ساعة القياس عن بعد. على أساس هذه المعطيات، يبدو أن البدانة الناجمة عن مزيج من فرط الأكل وانخفاض النشاط.
يتم إنتاج هرمون الليبتين الهرمون في الأنسجة الدهنية ويدور إلى ما تحت المهاد حيث يعمل على مستقبله. اللبتين هو عنصر هام في تنظيم الوزن على المدى الطويل. عندما نشط، فإنه يشير إلى انخفاض في الاستهلاك الغذائي وزيادة في استقلاب الطاقة مما يحد من درجة زيادة الوزن (25). ترتبط إلى حد كبير مستويات اللبتين مع BMI من الفئران والبشر (26). ويطلق على حالة من مستويات اللبتين مرتفعة الذي يحدث مع السمنة مقاومة اللبتين. وقد تم تحديد مقاومة اللبتين في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس السمنة (27). عند مقارنة تتزاحم طبيعية مع أربعة نماذج من الفئران من زيادة الوزن وراثيا، مافيي وآخرون. (26) وجدت ان مستويات هرمون الليبتين 10 أضعاف في فئرانا معدلة وراثيا آغوطي السكري والأصفر، 5 أضعاف أكثر في فئرانا معدلة وراثيا الدهون و 2 أضعاف يصل في فئرانا معدلة وراثيا بدين. في نموذج الفأر السمنة أخرى تفتقر إلى الببتيد neuromedin U، ومستويات هرمون الليبتين هي <2 أضعاف أعلى من التحكم من النوع البري (28). وقد تبين هذا النموذج لتكون مستقلة عن طريق اللبتين الإشارات. Mkks لدينا - / - الفئران لديها مستويات اللبتين في الدم 10 مرة من مستوى التحكم. وقد أفيد أن الشيخوخة النتائج في حالة مقاومة اللبتين في القوارض يعانون من السمنة المفرطة (29)، ولكن في Mkks لدينا -null الفئران، ونرى مستويات اللبتين مرتفعة في الفئران لا تتجاوز أعمارهم 9-12 أسابيع من العمر، قبل ظهور السمنة. ويبدو أن هذا يشير إلى أن مقاومة اللبتين تطور قبل السمنة.
زيادة ضغط الدم لوحظ في Mkks - / - الفئران يتسق مع التقارير السريرية لارتفاع ضغط الدم في المرضى الذين يعانون BBS (9، 30)، وكذلك مع رابطة قوية بين السمنة وارتفاع ضغط الدم (30). ارتفاع مستويات هرمون الليبتين تعميم يمكن أن تسهم في زيادة ضغط الدم لوحظ في Mkks السمنة - / - الفئران. في الواقع، إلى جانب تأثيره على الشهية والتمثيل الغذائي، ليبتين تعمل في منطقة ما تحت المهاد إلى زيادة ضغط الدم من خلال تفعيل الجهاز العصبي الودي (31).
وMkks -null سهم الماوس العديد من النتائج السريرية وجدت في المرضى الذين يعانون BBS البشري (الجدول 3). وMkks - / - نموذج الفأر يلخص النمط الظاهري لوحظ في نماذج الماوس BBS2- وBBS4 خروج المغلوب، على الرغم من بعض جوانب النمط الظاهري قد تكون أقل حدة. وتشير هذه الملاحظات أن الغياب الكامل للMKKS يؤدي إلى BBS، في حين من المرجح أن يكون النمط الظاهري MKS بسبب نتيجة الوظيفية للمركب His84Tyr / Ala24Ser أليل ذكرت في المرضى الذين يعانون MKS. (3). لقد تم الافتراض بأن الطفرة MKS هو ناقص المفعول، في حين أن الطفرات في MKKS تسبب BBS تمثل خسارة كاملة وظيفة (24). على الرغم من أن النتائج التي لوحظت في نموذجنا MKKS الماوس تتفق مع هذه الفرضية، والحالة الوظيفية للالمفترضة العديد من الطفرات BBS6 مغلطة لا يزال يتسم. وسوف تكون ذات فائدة لتحديد كيف تؤدي بعض الطفرات Mkks إلى انحطاط مبصرة والسمنة حين أن البعض الآخر لا يؤدي إلى هذه الظواهر.

الجدول 3.
مقارنة Mkks الماوس النمط الظاهري لBbs2 وBbs4 KO الفئران وMKS الإنسان وBBS الظواهر المرضى

المواد والأساليب

جيل من الفئران MKKS -knockout

تم استخدام 129 / SVJ الحمض النووي الجيني كقالب لاستنساخ شظايا PCR المشتقة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC، الولايات المتحدة الأمريكية). تم استنساخ A جزء 3.6 كيلوبايت تمتد الإكسونات 2-3 من الجين MKKS في الموقع كبن I / سال الأول، تليها الجينات المقاومة بالنيوميسين يحيط بها مواقع LoxP لاختيار إيجابية. كانت المنطقة المحيطة 3 "1.9 كيلوبايت NHE I / القانون المدني I تفتيت تمتد الإكسونات 3-4. تم استخدام كاسيت القاصي ثيميدين كيناز إلى 3'ذراع لاختيار السلبية. تم خطي متجه مع عدم I و electroporated إلى خلايا ES R1 (129X1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). وقد تم تحديد استنساخ مقاومة G418، والذي ناقلات تستهدف قد انضما إلى الجين MKKS، وذلك باستخدام تحليل PCR مع الاشعال تقع خارج المنطقتين 5'- والتي تستهدف 3'وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES لتوليد خطوط الماوس على C57BL / 6 الخلفية.

التنميط الجيني لفئران

تم مرمزة الفئران عن طريق PCR باستخدام الحمض النووي الجيني الذي أعد من الخزعات الذيل أو الأنسجة الجنينية. ولدت لنا 4.1 كيلوبايت 5'-جزء محدد لخروج المغلوب الفئران متخالف ومتماثل باستخدام التمهيدي خارج المنطقة المستهدفة (5'-TGCAGTTTTCAGGTAAGTTCCA-3 ') وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين (5'-TCGCCTTCTTGACGAGTTCT-3). تم إنشاء A جزء 2.9 كيلوبايت مع التمهيدي خارج المنطقة المستهدفة 3'(5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 ') وضمن الجينات المقاومة بالنيوميسين (5'-AGCCAACGCTATGTCCTGAT-3). وقد تم تحديد الفئران خروج المغلوب متماثل باستخدام اثنين من أزواج التمهيدي في المنطقة المحذوفة (بمعنى 5'-TCGAAACCTTTCAGTCACCC-3 "، العقاقير 5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 '؛ والشعور 5'-TTCGAATCCCAGTTGACTTCAG-3"، العقاقير 5'-GCAAAGATGAGACCCTTAAAACA-3 " ). وقد تم قالب طويل PCR في 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تليها 35 دورة في 94 مئوية لمدة 15 ثانية، 60 مئوية لمدة 30 ق، 68 C لمدة 5 دقائق والنهائي تمديد 7 دقيقة في 68 C.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل لطخة الشمالي

الأنسجة من فئران بالغة تم تجميد بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. أجريت مجموع استخراج الحمض النووي الريبي الخلوية، هلام الكهربائي، النشاف والتهجين وتصوير الإشعاع الذاتي خارج كما هو موضح سابقا (32). ولدت فأر الجزئي Mkks [كدنا التحقيق والمهجنة مع وصمة عار الشمالية. تم تجريده من لطخة من النشاط الإشعاعي وإعادة تهجين مع التحقيق [كدنا لβ -actin للتحقق من التحميل على قدم المساواة من الحمض النووي الريبي.

دراسات الوزن

لتقييم أوزان الأولية وزيادة الوزن، وتم وزن الحيوانات في 3 و 4 أسابيع من العمر، وعلى أساس شهري بعد ذلك. للدراسات الاستهلاك الغذائي، وأضيف على وزن ثابت من المواد الغذائية إلى كل قفص يحتوي على حيوان واحد، وكان وزنه الطعام المتبقية في 5 أيام من كل أسبوع. ثم تم حساب متوسط ​​الاستهلاك الغذائي للكل أسبوع.

مصل مستويات هرمون الليبتين

وقد تم جمع المصل من Mkks أنثى - / - الفئران (اثنان في 11 أسبوعا ويومين في 26 أسبوعا) والضوابط المطابقة سنهم. تم قياس مستويات اللبتين في الدم باستخدام متعدد تحليلها الشخصي (لاب نهر تشارلز).

شاشة المراقبة السلوكية الأولية

شاشة المراقبة الأولية هو تعديل لبروتوكول SHIRPA (22). التفاصيل الكاملة لإجراء التجارب ويمكن الاطلاع على الموقع الإلكتروني لشركاء الائتلاف الماوس الطفرات: لجنة نهر الميكونج الثدييات علم الوراثة وحدة هارويل، سميثكلاين بيتشام الصيدلة، كلية امبريال في لندن والملكة ماري ويستفيلد كلية، لندن، المملكة المتحدة (HTTP: // شبكة الاتصالات العالمية. mgc.har.mrc.ac.uk/mutabase/). وتم قياس كمية البيانات من 38 ملاحظات منفصلة، ​​وسجل لكل حيوان. بدأ تقييم كل حيوان مع ملاحظة السلوك دون عائق في أسطواني واضحة جرة العرض (ارتفاع 20 سم، وقطره 11 سم). ثم تم نقل الفئران إلى الساحة (45 × 25 سم 2) لمراقبة السلوك الحركي. وأعقب ذلك سلسلة من التلاعبات التي قيمت رؤية، قوة قبضة، المنعكس التقويمي، انجذاب بالجاذبية السلبية، لهجة الجسم، وردود الفعل، أطرافهم لهجة، وأثار العض واللعاب. طوال هذا الإجراء، وسجلت حالات شاذة السلوك، والخوف، والتهيج، والعدوان أو النطق. ومتشكلة الإجراء على ما مجموعه 57 فئران بالغة، 10 من الذكور والإناث تسع الفئران Mkks خروج المغلوب ومتغايرة والنوع البري في العمر كعينة ضابطة بهم. تم تقييم عدد مماثل من Bbs4 فارغة، وBbs2-اغية والفئران متخالف والنوع البري. كانوا ملثمين المراقبين الأساسي للبيانات التنميط الجيني.

هيمنة الاجتماعية أنبوب الاختبار

تم اختبار (14 ذكرا وتسع إناث لكل منهما) ثلاثة وعشرين Mkks البرية من نوع، متغايرة وخروج المغلوب الفئران كما هو موضح سابقا (33) في 30 سم × 3.5 سم القطر (3.0 سم قطر للفئران الأصغر، 4.5 سم القطر للحصول على أكبر الفئران) أنبوب. اثنين من الفئران نفس الجنس العمر المتطابقة، من نوع البرية، ومتغايرة أو بالضربة القاضية وضعت، على طرفي نقيض من الأنبوب وأفرج عنه. أعلن وهناك موضوع ل"الفائز" عند خصمه المدعوم من الأنبوب. تم تنفيذ كل الاقتران مرتين في ترتيب عشوائي لما مجموعه 138 مباراة الصعود. تم اختبار ثلاثين الفئران Bbs4 و 33 الفئران Bbs2 بطريقة مماثلة.

اختبار حاسة الشم

تم اختبار اثني عشر من النوع البري، متغايرة وخروج المغلوب الفئران (خمسة ذكور وسبع إناث لكل منهما) كما هو موضح سابقا (34). تم تقييم قدرة حاسة الشم مباشرة بعد فترة 3 ساعات من الحرمان من الطعام. كانت مخبأة قطعة صغيرة من دوريتوس ناتشو الذرة رقاقة تحت 1-3 سم من الفراش في قفص الماوس نظيفة. وأطلق سراح كل الماوس في قفص وسجلت الوقت اللازم لتحديد موقع رقاقة لمدة أقصاها 20 دقيقة. وبالمثل، تم اختبار 16 الفئران Bbs4 فارغة (10 إناث وستة ذكور) و 13 الفئران Bbs2 (ستة من الذكور والإناث سبعة) مع وجود ضوابط متغايرة والبرية من نوع الخاصة بهم.

ضغط الدم والنشاط

تم استخدام نظام راديو القياس عن بعد لتسجيل الضغط الشرياني ومعدل ضربات القلب والنشاط. تم تخدير الفئران مع الكيتامين (91 ملغ) وزيلازين (9.1 ملغم) كوكتيل البريتونى. تم عزل الشريان السباتي المشترك اليسار وتم إدراج القسطرة وتعادل بشكل آمن باستخدام الحرير. وقد تراجع الارسال تحت الجلد وصولا إلى 'جيب' الحرة تشريح على طول الجهة أقرب إلى hindlimb الصحيح ممكن. تم إغلاق شق الرقبة باستخدام الحرير وزيادة مختومة مع لاصق الأنسجة. بعد أن سجلت 1 أسبوع للتعافي من الجراحة، والضغط الشرياني ومعدل ضربات القلب والنشاط في الدولة غير المقيد واعية لمدة 5 أيام.

التحليل الصرفي من Mkks - / - الفئران

أجريت الدراسات المورفولوجية كما هو موضح سابقا (19، 20). تم فحص المقاطع من اثنين على الأقل خروج المغلوب والبرية من نوع الحيوانات في نقطة زمنية. وتشمل الأنسجة فحص العيون، والخصيتين والكلى. كانت ملطخة الأكريلاميد أقسام جزءا لا يتجزأ مع الهيماتوكسيلين يوزين وصمة عار وجمعت photomicrographs باستخدام أوليمبوس BX-41 المجهر مع الكاميرا الرقمية SPOT-RT. تم إصلاح الكلى من الشباب الفئران خروج المغلوب القديمة 2-أسابيع عن طريق الغمر في نصف قوة تثبيتي Karnovsky بين عشية وضحاها، وكانت شظايا القشرية نقطة حرجة المجفف وتفل المغلفة قبل تصوير مجهري باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح هيتاشي S4000 (مرفق المركزية المجهر البحوث، جامعة ولاية ايوا ).

ثقافة MTEC

تم إجراء ثقافة MTEC (22). لفترة وجيزة، كان المثقف خلايا القصبة الهوائية إما من عمره 6 أسبوع أو 8 أشهر من العمر من النوع البري وBbs6 خروج المغلوب الفئران عند 37 مئوية مع CO 2 5٪ في المعدل المتوسط ​​النسر Dulbecco و(DMEM) / هام في F12 المتوسطة تستكمل مع 4 m m glutamine, 10 U/ml penicillin, 10 µg/ml streptomycin, 5% fetal bovine serum (all Gibco BRL), 10 µg/ml insulin (Roche), 5 µg/ml human transferrin, 62 µg/ml cholera toxin, 10 n m retinoic acid (all Sigma), 5 ng/ml epidermal growth factor and 0.03 mg/ml bovine pituitary extract (both BD Biosciences), on rat-tail-collagen (BD Biosciences) coated Transwell-membranes (CoStar).مرة واحدة وصلت إلى ثقافة confluency، تم إنشاء واجهة الهواء السائل عن طريق إزالة المتوسطة من المقصورة العلوية وإضافة DMEM / F12 المتوسطة مع 2٪ فقط NuSerum (BD) و 10 ن م حمض الريتينويك إلى انخفاض المقصورة. تم تغيير مستنبت في مجلس النواب مرتين في الأسبوع. لتصور ميكروتثبول الهدبية، وخلايا ثابتة في وقت واحد وpermeabilized لمدة 5 دقائق في المخزن PHEM (60 م م أنابيب، 25 م م HEPES، 10 م م EGTA، 2 م م MgSO 4، ودرجة الحموضة 7.0) تحتوي على 0.5٪ الفورمالديهايد، 0.1٪ غلوتارالدهيد و 0.5٪ تريتون X-100، تليها تثبيت لمدة 10 دقيقة في PHEM العازلة التي تحتوي على 1٪ الفورمالديهايد. وتصور أهداب التي وصفها immunocytochemical مع β-IV تويولين الأضداد (Biogenex) وكان ينظر باستخدام مجهر multiphoton بيو راد.

تحليل البيانات

تم تحديد أهمية استخدام الطالب ر -test. عند الاقتضاء، على سبيل المثال مع بيانات المحجمة من الملاحظات السلوكية الأساسية، أجريت تحاليل اللامعلمية باستخدام اختبار فيشر الدقيق.

شكر وتقدير

نشكر P. كارب، K. بوغه، M. Olvera، C. ايستمان، R. سويديرسكي، R. بيرى، A. فيشر وK. فولكن للحصول على المساعدة الفنية وD. أغيار كراوتش للمساعدة الإدارية. علينا أيضا أن نعترف جامعة أيوا، قسم علم الأمراض ومرفق المركزية المجهر الإلكتروني البحوث في جامعة ولاية ايوا للحصول على المساعدة. وأيد هذا العمل من قبل المنح والمنظمات التالية: المنح NIH P50-HL-55006 (VCS) وR01-EY-11298 (VCS وEMS)، كارفر كارنيغي للطب العيون الجزيئية (EMS وVCS) والبحوث للوقاية من العمى، نيو نيويورك، NY (قسم العيون بجامعة أيوا). VCS ونظم الإدارة البيئية المحققين من معهد هوارد هيوز الطبي.
  • © المؤلف 2005. نشرت من قبل مطبعة جامعة أكسفورد. جميع الحقوق محفوظة. لضوابط، يرجى البريد الالكتروني: journals.permissions@oupjournals.org
المراجع

  • ↵
    الحجر، DL، Slavotinek، A.، بوفارد، GG، بانيرجي-باسو، S.، Baxevanis، AD، بر، M. وBiesecker، LG (2000) تحور الجين ترميز chaperonin المفترض تسبب متلازمة McKusick-كوفمان. نات . جينيه.، 25، 79 -82.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    روبينوف، M. وشو، A. (1979) ومتلازمة McKusick-كوفمان: رتق ورثت مقهور المهبل، موه رحمي مهبلي، الازدواجية رحمي مهبلي، الشذوذ الشرجية، polydactyly خلف المحور، وأمراض القلب الخلقية J. Pediatr.، 94، 776 -778.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Slavotinek، AM، حجر، EM، Mykytyn، K.، Heckenlively، JR، أخضر، JS، هيون، E.، Musarella، MA، Parfrey، PS، شيفيلد، VC وBiesecker، LG (2000) الطفرات في MKKS تسبب Bardet- متلازمة بيدل. نات. جينيه.، 26، 15 -16.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    فريدمان، J.، Nimmesgern، E.، Erdjument-Bromage، H.، الحائط، JS، Tempst، P. وهارتل، FU (1992) وظيفة في طي البروتين من TRIC، مجمع خاتم عصاري خلوي يحتوي على TCP-1 وما يتصل بها من الناحية الهيكلية مفارز. EMBO J.، 11، 4767 -4778.
    ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    أخضر، JS، Parfrey، PS، هارنيت، JD، فريد، NR، كريمر، BC، جونسون، G.، هيث، O.، McManamon، PJ، أوليري، E. وPryse فيليبس، W. (1989) المظاهر الأساسية للمتلازمة بارديه-بيدل، وهو شكل من متلازمة لورنس-مون بيدل. N ENGL. J. ميد.، 321، 1002 -1009.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • بيدل، A. (1922) عين geschwisterpaar معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا adiposo-genitaler dystrofie. Dtsch. ميد. Wochenschr.، 48، 1630.
  • بارديه، G. (1920) سور الامم المتحدة متلازمة دي obesite الطفلي AVEC poldactylie آخرون retinite مصطبغ. أطروحة دكتوراه، جامعة باريس، باريس، ص 479.
  • Elbedour، K.، زوكر، N.، Zalzstein، E.، بركي، Y. وكرمي، R. (1994) تشوهات القلب في متلازمة بارديه-بيدل: دراسات تخطيط صدى القلب من 22 مريضا (انظر التعليق). آم. J. ميد. جينيه.، 52، 164 -169.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    هارنيت، JD، أخضر، JS، كريمر، BC، جونسون، G.، الإنزعاج، L.، McManamon، P.، فريد، NR، Pryse فيليبس، W. وParfrey، PS (1988) الطيف من المرض الكلوي في لورانس-مون بيدل متلازمة. N. ENGL. J. ميد.، 319، 615 -618.
    ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Mykytyn، K.، براون، T.، كرمي، R.، حيدر، NB، Searby، CC، شاستري، M.، بيك، G.، رايت، AF، يناكوني، A.، Elbedour، K. وآخرون. ( 2001) تحديد الجين الذي، عندما تحور، يسبب متلازمة السمنة الإنسان BBS4. نات. جينيه.، 28، 188 -191.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • نيشيمورا، DY، Searby، CC، كرمي، R.، Elbedour، K.، فان Maldergem، L.، فولتون، AB، لام، BL، باول، BR، سويديرسكي، RE، بوغه، KE وآخرون (2001) الموضعية استنساخ الجين الرواية على الصبغي 16q تسبب متلازمة بارديه-بيدل (BBS2). همهمة. مول. جينيه.، 10، 865 -874.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • Katsanis، N.، Beales، PL، وودز، MO، لويس، RA، أخضر، JS، Parfrey، PS، انسلي، SJ، ديفيدسون، WS وLupski، JR (2000) الطفرات في MKKS تسبب السمنة، وضمور الشبكية وتشوهات الكلى المرتبطة متلازمة بارديه-بيدل. نات. جينيه.، 26، 67 -70.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • Mykytyn، K.، نيشيمورا، DY، Searby، CC، شاستري، M.، الين، HJ، بيك، JS، براون، T.، Streb، LM، Cornier، AS، كوكس، GF وآخرون (2002) تحديد الجين (BBS1) تشارك الأكثر شيو

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #2  
قديم 11-23-2015, 10:05 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تثبيط الهجرة قمة العصبية راء dysmorphology القحفي والمرض هيرشسبرونغ في متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/105/18/6714.full




التعرف على الوجه أمر أساسي لتشخيص العديد من المتلازمات، وربما تعكس أنماط القحفي مسببات المشتركة. في متلازمة عديد المظاهر بارديه-بيدل (BBS)، وciliopathy الابتدائية يعانون من ضعف النقل intraflagellar، المرضى الذين لديهم الوجه "الجشطالت" المميز الذي dysmorphologists وجدت صعوبة في تميز. هنا، فإننا نستخدم النمذجة السطحية كثيفة (DSM) لتكشف عن أن المرضى BBS والمسوخ الماوس لديها عيوب منتصف الوجه التي تشمل الهياكل المستمدة من قمة العصبية المتجانسة التي تتقاسمها morphants الزرد. تنشأ هذه العيوب من القحفي (CF) هيكل عظمي من الجمجمة الشاذة خلية قمة العصبية (NCC) الهجرة. ولا تقتصر هذه الآثار إلى المنطقة القحفي، ولكن تفشل البلدان المساهمة الصافية العصب الحائر المشتقة لتجميع الجهاز العصبي المعوي، وبلغت ذروتها في المختلين الأمعاء على الحركة. وعلاوة على ذلك، morphants عرض بصمات تعطلت سونيك القنفذ (Shh على) يشير من خلاله البلدان المساهمة الصافية تأخذ العظة الموضعية. نقترح نموذجا حيث البروتينات BBS تعدل الهجرة NCC، والمساهمة في التشكل القحفي وتطوير الجهاز العصبي المعوي. كما شرح هذه العيوب الهجرة جمعية مرض هيرشسبرونغ (HD) مع BBS. وعلاوة على ذلك، وهذا هو أسلوب غير موصوف سابقا من استخدام توصيف dysmorphology الوجه كأساس للتحقيق في ميكانيكية حدوث تنمية CF في متلازمات تشوه.
الاعتراف ب "الجشطالت" الوجه أمر أساسي لتشخيص كثير من الأمراض الوراثية، ولكن التقلب الكبير في ملامح غالبا ما يعيق تصنيف الناجح (1). dysmorphology مؤخرا، وقد تميزت موسع التصوير 3D سطح في متلازمات (2، 3). لا شيء، ومع ذلك، فقد استخدمت لتحديد الوجه إما خلل البنية؛ شوهة أو المساعدات التحقيق خفية من آليات dysmorphology القحفي.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) يسبب تنكس الشبكية، آخر polydactyly المحوري، والسمنة، والفشل الكلوي، وضعف الادراك. وقد تم اكتشاف اثني عشر BBS الجينات (BBS1-BBS12)، والتسبب في خلل يكمن أهداب الابتدائي (4). يتم التعبير عن BBS4، BBS6، وBBS8 (التحقيق في هذه الدراسة) في ظهائر مهدبة وتوطين للهيئات الجسيم المركزي والقاعدية من الخلايا المهدبة (5 - 7). وقد تم الإبلاغ عن حالات الشذوذ القحفي خفية في المرضى (8 - 10). من بين ميزات إضافية عديدة من BBS هو مرض هيرشسبرونغ (HD)، اضطراب في الجهاز المعوي العصبي (ENS) (11).
تيارات الخلايا قمة العصبية (البلدان المساهمة الصافية) من النموذج الدماغ الذيلية معظم من القحفي (CF) هيكل عظمي (انظر المرجع 12 للمراجعة). الجمجمة البلدان المساهمة الصافية (CNCC) تتبع مسارات محددة لتجميع بروز جبهي أنفي وخيشومي قوس اللحمة المتوسطة. هنا، فإنها تتكاثر وتتمايز إلى هياكل الوجه والجمجمة. سونيك القنفذ (Shh على) أعرب في الدماغ بطني والأديم الظاهر الشفوي ضروري لتشكيل معظم الهياكل الوجه (12). الفئران التي تعاني من نقص SHH لها خسارة فادحة في العظام القحفي، و، في البشر، والطفرات SHH تسبب عيوب خط الوسط CF مع اندماج مقدم الدماغ (HPE) (12).
وENS ينظم حركية الجهاز الهضمي وإفراز. انها تستمد من البلدان المساهمة الصافية العصب الحائر والقطنية العجزية (13). في HD، وتتميز تضخم القولون، وهناك انخفاض أو العقد المعوي غائبة في القولون البعيدة.
على الرغم من وفرة الأدلة الحديثة تشير إلى خلل وظيفي الهدبي في BBS، سواء عيوب الوجه و الجهاز الهضمي يصعب التوفيق على هذا الأساس وحده. في هذه الدراسة، وتبين لنا أن البروتينات BBS مطلوبة للهجرة NCC، وبلغت ذروتها في العيوب القحفي Shh على التي تعتمد، واضطراب الأمعاء على الحركة، من المحتمل وراء جمعية HD مع BBS.
النتائج

ثلاثي الأبعاد الكثيفة النمذجة السطحية (DSM) تكشف عيوب الوجه والجمجمة المقارنة في الإنسان والفأر.

لتقييم عيوب CF في BBS، أجرينا 3D DSM تحليل الوجه على 83 مريضا (بغض النظر عن الطفرات) و 230 الضوابط. لمراعاة الفروق النمو، وأجريت التحليلات بشكل منفصل عن مواضيع <20 عاما. تم المشروح بمسح الوجه مع المعالم الرئيسية [المعلومات الداعمة (SI) الشكل. S1]، حسبت DSMs من مناطق الوجه والأنف لمجموعات فرعية من وجوه، وتم قياس الفروق بين السيطرة والمعالم BBS. العديد من القياسات بين المعالم أو كانت أهم طول الشاذة وعرض الوجه (الشكل S2). لتجنب آثار الأنسجة الرخوة المفرطة في وجوه المرضى، ونحن المقيد الأول تحليل شكل لمنطقة الأنف حيث السمنة لديه الأقل تأثير. أظهرت اللون لمسافات تلوينها مقارنات متوسط ​​BBS وأنوف السيطرة للأطفال والكبار الأنف تنسج الجسر وتقصير الانف / انخفاض bulbosity في طرف الأنف (الأحمر والأصفر، الشكل 1 A و B). نقرأ ديناميكية بين BBS والسيطرة تعني أنوف تظهر هذه الخلافات وشكل أخرى في جناح الكبير الأنف وcolumella (انظر أفلام S1 و S2). اختبار Multifolded باستخدام نمط خوارزميات الاعتراف أقامت تمييزا كبيرا [المتلقي مشغل خاصية (ROC) تحليل]، وذلك باستخدام شكل الأنف وحدها (الجدول S1). في المرضى البالغين، وأظهرت مقارنات مرمزة المسافة من متوسط ​​شكل الوجه مع أن من الضوابط النزوح التصاعدي النسبي للأنف والشفة العليا (المناطق الزرقاء في الشكل 1 C)، في منتصف الوجه تنسج وretrognathia معتدل (المناطق الأحمر والأصفر من الشكل 1 D).

تين. 1.
لون لمسافات تلوينها التشكل نفسه من المرضى BBS (الأنف والوجه) وBbs6 فئرانا معدلة وراثيا (جماجم الجافة) مقارنة مع الضوابط WT. (A و B) مقارنة وضعها الطبيعي على السطح للأطفال BBS (A) / بالغين (B) مع بقع حمراء والأصفر يظهر نقص تنسج على جسر الأنف وتقليل طول / bulbosity في طرف الأنف. (C) مقارنة الرأسية للمرضى البالغين من الذكور مع التصحيح الأزرق يظهر تقصير منتصف الوجه. (D) عمق الحكمة للمرضى الكبار أنثوية المنطقة الحمراء الأصفر تظهر تسطيح منتصف الوجه وretrognathia معتدل. المقارنة (E) عمودي للأطفال BBS مع التصحيح الأزرق يظهر تقصير منتصف الوجه. (F) مقارنة العمق الحكمة للأطفال BBS مع المنطقة الحمراء الأصفر تظهر تسطيح منتصف الوجه وretrognathia معتدل. (G) عادي على السطح بالنسبة للفئران Bbs6 مع الأحمر والأصفر المنطقة للحد من يظهر في المناطق القاطعي والفكين (ملاحظة: تم إزالة الفك السفلي قبل التصوير). عرض (يسار) Dorasl. (يمين) عرض جانبي.

المكون الرئيسي 3 من DSM للأطفال تحكم يعكس التسطيح من منتصف الوجه، وارتبط توضع خلفي الفك السفلي بقوة [بيرسون حظة المنتج الارتباط (PPMC) = 0.81] مع الموقف تصنيف وجها فيما يتعلق السيطرة متوسط ​​وBBS الأطفال وجوه (الشكل S3). و/-تعديل حجم المقارنة عمر متوسط ​​أثرت BBS وأظهرت وجوه الأطفال التحكم أكبر عرض الوجه والأنف النزوح التصاعدي (الشكل 1 E)، وكذلك تسطيح منتصف الوجه وretrognathia (الشكل 1 F). نتائجنا تشير إلى أن هذه التقنية يمكن أن يميز الظواهر الوجه خفية تتحدى حتى dysmorphologists خبرة.
نحن التحقيق المقبل ما إذا كانت نماذج الماوس BBS (Bbs4 - / - وBbs6 - / -) قد يكون التشوهات القحفي مماثلة Bbs4 - / - (ن = 31)، متخالف (ن = 30)، وWT (ن = 20) وكانت الفئران تصوير باستخدام الليزر الماسح الضوئي 3D (الشكل S2). على الرغم من الخلافات الجسيمة في علم التشريح القحفي بين البشر والفئران، وهناك أوجه تشابه كبيرة في النسب الرئيسية، بما في ذلك أكبر عرض منتصف الوجه إلى ارتفاع (P <0.01)، وخطم أقصر (P <0.01). شوهدت تشوهات مماثلة في سطح Bbs6 الفئران -null (الجدول S2). وأظهرت الزيجوت لم الشذوذ التاريخي.
لتحديد أصول العظمية مفصلة للتغيرات القحفي، فإننا 3D المقبل ليزر سطح الممسوحة ضوئيا Bbs6 - / - (ن = 9) وWT (ن = 15) الجماجم. مرمزة مقارنات بين الأسطح الجمجمة يعني تؤكد أن تقصير يعزى إلى نقص تنسج طليعة الفك العلوي والفك العلوي، مما أدى إلى خطم أقصر بكثير، على غرار عجز الإنسان (الشكل 1 F و G والسينما S3).
BBS Morphants الزرد لديها عيوب الوجه والجمجمة انعكاس المسوخ الثدييات.

على الرغم من الاختلافات الشكلية بين الجماجم الثدييات والأسماك، وكثير من نفس الجزيئات يشير تنظيم تنميتها، وتنظيم الهيكل العظمي الجمجمة يشبه بشكل ملحوظ (12). وneurocranium الأمامي (ANC) ويتكون من الترابيق ولوحة الغربالية، وكلاهما NC مستمدة ومماثلة للفك العلوي الثدييات (14).
لتقييم مسببات العيوب CF الإنسان والفأر، ونحن حقن الأجنة الزرد مع bbs4، bbs6، وmorpholinos bbs8 (MO) وتصور الغضاريف في الجمجمة في 5 أيام postfertilization (إدارة الشرطة الاتحادية). وعلى الرغم من التقارب والإرشاد (CE) عيب (15، 16)، وكان morphants bbs4 التشكل CF طبيعي إلى حد كبير (الشكل 2 B، G، وL و A، F، K و) على الرغم من ان الفك السفلي أوسع وأقصر. في morphants bbs6، وتقصير ANC، ضغط الوجه (الجدول S3). وقد تقلص إلى حد كبير في الفك السفلي، وكان هناك عدد أقل من الأقواس خيشومي مصبغ (الشكل 2 وأعرب على نطاق واسع C، H، وM). bbs8 في الجنين الزرد (الشكل. S4).

تين. 2.
عيوب قمة القحفي والعصبية في BBS الزرد morphants. (A-E) وجهات النظر بطني من wholemount، الألسيان الأزرق الملون، الزرد 5 DPF. morphants bbs8 هم أشد (D)، مع فقدان جهاز البلعوم (2D رأس السهم)، الفك السفلي، وتقصير من القحف الغضروفي. (F-J) إطلالة جانبية على اليرقات التي تبين الحد من الأقواس خيشومي وتقصير من الفك السفلي في bbs6 وbbs8 morphants. (K-O) Flatmounts من neurocrania من الضوابط وmorphants. morphants bbs8 غالبا ما يكون انصهار الترابيق في خط الوسط (رأس السهم) مماثلة لسيو المسوخ. (P-T) Crestin في الموقع في الأجنة 20ss يكشف تيارات الهجرة البلدان المساهمة الصافية في الضوابط (رأس السهم) مع عدد أقل من تدريجيا تيارات في bbs4، bbs6، وmorphants bbs8، على التوالي. (U-X) Sox10: EGFP التعبير في الهجرة تيارات (السهام) يظهر انخفاض مماثل في عدد من تيارات إلى التعبير crestin. (Y) الكمي لعدد من تيارات في morphants يؤكد وجود خلل الهجرة قمة العصبي الشديد في morphants bbs8 التي يمكن انقاذهم من قبل مرنا البشري. (Z و AA) التعبير DCT في 27 HPF الأجنة التحكم (Z) وmorphants bbs8 (AA). [الحانات مقياس: 500 ميكرون (A-J)، و 100 ميكرون (K-O)، و 100 ميكرون (P-X).]

وقد لوحظت العيوب أشد باستمرار مع MO bbs8: تصبغ، تصقلب جزئية، والحد من القحفي الذي تم تقصير ANC مع خط الوسط انصهار الترابيق (الشكل 2 D، I، وN). في ≈20٪ من الحالات، كان الغضروف غائبة تماما في الرأس (الشكل 2 D أقحم). وكانت الفك السفلي والأقواس خيشومي غائبة تماما في 5 DPF (الشكل 2 D)، وSox10 التعبير في 72 HPF (انظر الشكل S5 A) أظهرت هذه فشلت في تشكيل. Coinjections مع bbs8 الإنسان مرنا انقاذ هذه العيوب تماما (الشكل 2 E، J، وO)، كما فعل bbs4 وbbs6 مرنا (لا تظهر البيانات). عن طريق حساب النسبة بين حزب المؤتمر الوطني الافريقي وطول الجسم، وأظهرت أن حزب المؤتمر الوطني الافريقي تقصير مستقلة عن عيوب CE (الشكل. S6 A).
NCC الهجرة يكمن وراء النمط الظاهري الجمجمة في الزرد.

الغالبية العظمى من هيكل عظمي رئيس مستمد من CNCC، والتي تهاجر الخلايا بطريقة النمطية إلى الأقواس الخيشومية وعملية الجبهي الأنفي. لمعرفة ما إذا كانوا متورطين البروتينات BBS في الهجرة NCC وCF التشكل، ونحن التحقيق ثلاث مراحل رئيسية في وقت مبكر NCC التنمية: المواصفات، والصيانة، والهجرة في morphants BBS. كانت تعبيرا عن foxd3 وsox10 العادي في مرحلة 5 الجسيدة (اس اس)، تثبت أن تلك المواصفات دون تغيير (الشكل S7). في الشمس 12ss، تدل التعبير عن crestin أن صيانة NCC كانت طبيعية (الشكل S7).
ومع ذلك، في 20ss، تعطلت تيارات crestin -expressing البلدان المساهمة الصافية التي تهاجر عادة من الناحية البطنية من الأنبوب العصبي (NT) في الجذع في BBS morphants. درجة الهجرة ترتبط مع مستوى CF عيب (أشد في morphants bbs8) (الشكل 2 P-S). الكمي للتيارات الهجرة (الشكل 2 Y) يرتبط مباشرة مع نسبة تناقص طول قحفي عصبي إلى العرض في bbs4، bbs6، وmorphants bbs8، على التوالي (الشكل. S6 B). لإثبات هذه البيانات في الموقع التهجين، لاحظنا وجود نمط مماثل للهجرة NCC باستخدام Sox10: EGFP الزرد، التي تعبر عن GFP في البلدان المساهمة الصافية (هدية من R. Kelsh) (الشكل 2 U-X) (14). مرة أخرى، تم انقاذ النمط الظاهري bbs8 مع مرنا البشري (الشكل 2 T). وفرة من البلدان المساهمة الصافية في NT تشير إلى أن الاستقراء، والصيانة، أو الانتشار لا يتأثر. بدلا من ذلك، هناك تثبيط هجرة الخلايا.
دعما لدور مشتبه بهم لBbs8 في تطوير NC، وmorphants bbs8 التي عرقلت التشكل القحفي وتقريبا لا الجذع NC الهجرة، يفتقر أيضا الخلايا الصباغية، النسب آخر NC مشتقة. لم يكن هناك أي تعبير عن DCT، علامة السلائف الصباغية، في morphants bbs8 في 27 HPF مقارنة مع الضوابط (الشكل 2 Z و AA).
اخترنا لدراسة morphants bbs8 أبعد من ذلك، باستخدام Sox10: الزرد المعدلة وراثيا EGFP. في التحكم في الشمس 12ss، البلدان المساهمة الصافية قد بدأت للتو إلى الهجرة من المنطقة وراء العين في الرأس (الشكل 3 A). بواسطة 20ss، والبلدان المساهمة الصافية هاجروا إلى المنطقة الأمامية الأكثر من الجنين، ≈250 ميكرون (الشكل 3 B). في morphants bbs8، فشلت الهجرة ليبدأ بحلول الشمس 12ss (الشكل 3 C). بواسطة 20ss، قد الخلايا هاجروا فقط في منتصف العين، ≈80 ميكرون (الشكل 3 D).

تين. 3.
الهجرة قمة العصبية في morphants bbs8. (A و B) Sox10: GFP الزرد المعدلة وراثيا تظهر هجرة CNCCs الأمامية بين 12 (A) و20ss (B). ويمثل كمية الحركة خلال الفترة 4-ساعة في B عن طريق الفرق بين الأبيض (الموقف في الشمس 12ss) والأحمر (الموقف في 20ss) النصال، ≈250 ميكرون. (C و D) تثبيط الهجرة CNCC في morphants bbs8. انتقلت على بعد مسافة صغيرة (80 ميكرون) فقط في الفترة 4-ساعة. (E و E ') البلدان المساهمة الصافية من السيطرة الأجنة المحقونة MO المطعمة إلى المضيفين السيطرة تهاجر الأمامية لملء الرأس. يظهر السهم في موضع الخلية anteriormost يظهر تغير في الموقف خلال الفترة 4-ساعة. (F و F ') الخلايا المأخوذة من متبرعين morphant bbs8 تفشل في ترحيل عند زرعها في المضيفين السيطرة، مما يشير إلى أن الخلل الهجرة غير خلية مستقلة. (G و G ') خلايا مراقبة زرعها في bbs8 المضيفين morphant الهجرة كالمعتاد. (H) وانا مراقبة والأجنة morphant في 48 HPF تظهر Sox10: EGFP التعبير في الترابيق النامية التي تفشل في استطال في morphants. (J) المهاجرة CNCCs التحكم في 14ss تظهر نتوءات filopodial الاستقطاب (السهام) أساسا في اتجاه الهجرة (السهم كبير). تبقى (K) CNCCs bbs8 morphant تتجمع بإحكام وعدم وجود نتوءات الاستقطاب. (L) في المختبر الصفر التئام الجروح فحص على 3T3 الخلايا يظهر الإغلاق المتأخر من الفجوة في Bbs8 خلايا ضربة قاضية مقارنة مع الضوابط. (M) الرسم البياني قياس عرض الفجوة على مدار الساعة 48 ساعة. (N) نفس التئام الجروح فحص باستخدام الخلايا الليفية الأولية المأخوذة من يتأثر وBBS8 - / - المرضى يظهر أيضا الهجرة تأخر. الخلايا (O) BBS8 المرضى تهاجر أبطأ من السيطرة. (P) الاستقطاب microfilaments الأكتين في السيطرة 3T3 الخلايا المهاجرة إلى الفجوة الجرح. خلايا ضربة قاضية (Q) Bbs8 لها الأكتين الهيكل الخلوي المختلين. (R و S) ولخص هذا الاضطراب في هجرة الخلايا الليفية الأولية للمرضى. [الحانات مقياس: 100 ميكرون (A-G)، 100 ميكرون (H وI)، 20 ميكرون (J و K)، و 200 ميكرون (L و N)، و 20 ميكرون (P-S)]

لتحديد ما إذا كان هذا الاضطراب الهجرة غير خلية مستقلة أو نتيجة لتثبيط الأنسجة المجاورة، أجرينا تجارب التطعيم. تم coinjected EGFP الأجنة وراثيا مع عنصر تحكم أو bbs8 MO: Sox10. في 4 HPF، تم زرع خلايا من متبرعين حقنها التحكم أو المضيفين morphant. تم تصوير عملية زرع ناجحة في الشمس 12ss لمدة 4 ساعات. على زرع ضبط MO حقن الخلايا في المضيفين السيطرة، والبلدان المساهمة الصافية هاجر الأمامية ≈150 ميكرون (الشكل 3 E وE '). ومع ذلك، الخلايا المانحة bbs8 morphant زرعها في المضيفين السيطرة فشلت في الهجرة، مما يوحي بأن فقدان Bbs8 لها دور خلايا مستقلة في تثبيط الهجرة (الشكل 3 F وF '). الخلايا المانحة السيطرة زرعها في المضيفين morphant هاجرت عادة، مما يثبت أن تثبيط الهجرة غير الثانوي إلى تثبيط الأنسجة (الشكل 3 G و G ').
لاستبعاد احتمال وجود فشل في وقت مبكر من انتشار NC، نحن FACS فرز كاملة Sox10: السيطرة EGFP والأجنة morphant في 16ss و20ss. وكانت نسبة البلدان المساهمة الصافية في morphants مماثلة لضوابط في 20ss (4.4٪ مقابل 4.7٪، P = 0.23) (الشكل. S6 G و H). نحن أيضا استبعاد موت الخلايا NC كما أن العامل المسبب، وذلك باستخدام 7AAD لتحديد عدد الخلايا الميتة Sox10 إيجابية (الضوابط 0.5٪ مقابل 0.7٪ morphants). وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام علامة PH3 الإنقسامية، ونحن لا نرى أي اختلاف في انتشار الخلايا Sox10 إيجابية في 24 HPF أو 72 HPF في morphants (الشكل S5 A-D).
استبعدنا بجانب إمكانية misdifferentiation من البلدان المساهمة الصافية. على الرغم من أن جذع morphant البلدان المساهمة الصافية بقي في NT، فإنها لم تفرق بشكل غير لائق في الخلايا العصبية في 30 HPF (HUC / D) (الشكل S5 E و F).
في 48 HPF، لاحظنا عدم تمديد الترابيق البدائية وعدم وجود لوحة الغربالية في تأسيس المؤتمر الوطني الأفريقي في morphants bbs8 في Sox10: الأجنة EGFP (الشكل 3 H وI)، مما يدل على أن dysmorphology CF ينشأ من انخفاض في في وقت مبكر الهجرة NCC، مما يؤدي إلى فشل خلايا لتجميع لوحة الغربالية.
التصوير عالية الطاقة من CNCCs المهاجرة الأمامية حول العين يظهر نتوءات خلية الاستقطاب أساسا في اتجاه الهجرة في التحكم في الشمس 12ss (الشكل 3 J). في morphants bbs8، كانت هذه الخلايا متفاوت بإحكام وتفتقر إلى نتوءات رأيت على الخلايا السيطرة (الشكل 3 K).
بعد ذلك، درسنا الهيكل الخلوي أكتين في الهجرة CNCCs، NIH 3T3، والخلايا الليفية الأولية من المرضى BBS8. على الرغم من الصعوبات في حل الهيكل الخلوي من CNCCs في الجسم الحي، لاحظنا microfilaments غير منظم في morphants (لا تظهر البيانات). وكان الهيكل الخلوي أكتين mispolarized أكثر وضوحا في Bbs8 تعاني من نقص الخلايا الليفية 3T3 والابتدائية (الشكل 3 L-O). وأظهرت هذه الخلايا نقص حاد في استقطاب الهيكل الخلوي. في البداية المقايسات التئام الجروح، تم تخفيض الهجرة في المسوخ كل أنواع الخلايا، مقارنة مع الضوابط (الشكل 3 P-S).
شاذ Noncanonical WNT اشارة قد تكمن وراء النمط الظاهري هجرة.

وينظم الهجرة NCC في وقت مبكر عن طريق الإشارات WNT noncanonical (17). الأعلى وإلى الأسفل تنظيم noncanonical WNT يشير كلا تمنع الهجرة NC (17). في ضوء الأدلة مسبق من تورط من البروتينات BBS في هذا المسار (16)، ونحن اختبار ما إذا كان هذا الدور قد يمتد إلى البلدان المساهمة الصافية.
نحن الناجم عن noncanonical يشير WNT في الزرد بالإعراب عن شكل اقتطاع من Dishevelled (DVL Δ N) (18). في 20ss، أظهرت الأجنة المحقونة مع DVL Δ N تثبيط الهجرة تيارات من البلدان المساهمة الصافية من NT (crestin في الموقع؛ الشكل 4 أ و ب). حقن bbs8 MO أيضا الهجرة تحول دون (الشكل 4 C). ومع ذلك، coinjecting 3 نانوغرام من bbs8 MO وDVL Δ N مرنا انقاذ جزئيا الخلل الهجرة NCC (الشكل 4 D). كان هذا الإنقاذ الجرعة التي تعتمد على لحقن 2 نانوغرام من bbs8 MO فشلت في إنقاذ عيب الهجرة (الشكل 4 E).

تين. 4.
Noncanonical يشير WNT والهجرة NC. (A-C) حقن كل من DN مرنا DVL وbbs8 MO ينتج بشكل فردي في تثبيط NCC الهجرة بالنسبة للضوابط. (D) Coinjection من 3 نانوغرام من bbs8 MO مع نتائج DVL DN في عمليات الإنقاذ الجزئي للهجرة NCC التي كتبها ≈4 أضعاف نسبة إلى morphants bbs8. فشل (E) Coinjection من DN DVL مرنا مع 2 نانوغرام من bbs8 MO لانقاذ الهجرة NCC. (F) حقن 50 خريج من MYR / بال الأسباب DVL تثبيط الهجرة NCC. (G) Coinjection من MYR / بال DVL مع 3 نانوغرام من bbs8 MO أيضا ينقذ جزئيا هجرة NC الكبت. (H) رسم بياني تحديد عدد من تيارات crestin -positive البلدان المساهمة الصافية المهاجرة من خلال الجذع. (شريط مقياس: 200 ميكرون).

نحن تأكدت هذه النتائج عن طريق حقن DVL التي تستهدف غشاء بناء (MYR / PAL DVL) (19)، وهو ما تسبب أيضا تثبيط للهجرة، ومرة أخرى تم انقاذ جزئيا coinjection مع 3 نانوغرام من bbs8 MO (الشكل 4 F و G) . معا، وتشير هذه النتائج إلى أن اضطراب مسار WNT noncanonical يمكن أن تسهم في تثبيط الهجرة NC.
عدم وجود المعوية الخلايا العصبية في Morphants النتائج في العيوب الأمعاء على الحركة.

النظر في دور الملاحظة لBbs8 في الجذع والجمجمة الهجرة NC، ونحن التحقيق التالي إذا كان لديها دور في تنمية ENS. هذا السؤال هو المناسب في ضوء ارتباط نشرت من BBS مع HD، فشل الخلايا العصبية المعوية لتجميع المعى المؤخر.
درسنا ENS الاستعمار من الأمعاء باستخدام علامة العصبية HUC / هود. في اليرقات تحكم في 4 DPF الخلايا العصبية المعوية بالسكان على طول القناة الهضمية لفتحة الشرج (الشكل 5 A). في morphants bbs8 (2 نانوغرام)، امتدت هذه الخلايا في منتصف الطريق على طول المعى المؤخر، أبدا الوصول إلى فتحة الشرج (الشكل 5 B). مع 4 نانوغرام من MO، فشل الخلايا العصبية للدخول في المعى المؤخر (الشكل 5 C). تم تخفيض كمية من الخلايا العصبية في المنطقة بين فتحة الشرج وبداية ساق صفار من 108 في الضوابط إلى 22 و 5 في 2 نانوغرام من و4 نانوغرام من والأجنة MO حقن، على التوالي (ن = 10 في كل الحالات ؛ P <0.001 لmorphants) (الشكل 5. D).

تين. 5.
تطوير المعوية الجهاز العصبي في BBS morphants. الأجنة (A) تحكم في 4 DPF تظهر الخلايا العصبية المعوية ملء طول القناة الهضمية من الأمامي (الجانب الأيسر) إلى فتحة الشرج (رأس السهم). (B) مع 2 نانوغرام من bbs8 والهجرة MO من الخلايا العصبية المعوية تتوقف في منتصف الطريق على طول القناة الهضمية (النجمة)، وليس الخلايا العصبية تصل إلى فتحة الشرج (رأس السهم). (C) أربعة نانوجرام من bbs8 MO تسبب غياب كامل للخلايا العصبية المعوية، مما أدى إلى عيوب القناة الهضمية الحركة (انظر الفيلم S4 وفيلم S5). (D) الكمي لخفض عدد الخلايا العصبية المعوية مع الجرعات الكبيرة تدريجيا من bbs8 MO. (E و F) البلدان المساهمة الصافية الخروج من منطقة العصب الحائر تصور من قبل crestin تظهر أي فرق بين الرقابة وmorphant. (G و H) التعبير phox2b في 48 HPF يظهر عدد محدود من البلدان المساهمة الصافية في الأقواس الخيشومية. (I و J) عرض جانبي من الأجنة في G و H يدل على فشل الخلايا لترك الأقواس البلعومية وإدخال أنبوب الأمعاء. (K) phox2b الخلايا العصبية المعوية -positive ملء طول القناة الهضمية على طول الطريق إلى فتحة الشرج. يظهر السهم على مدى تأخرا من الهجرة، وتمثل النجمة فتحة الشرج. (L و M) حقن 2 نانوغرام من و4 نانوغرام من، bbs8 MO، على التوالي، يسبب الخلايا العصبية للهجرة في منتصف الطريق فقط على طول القناة الهضمية (2 نانوغرام) أو تفشل في دخول القناة الهضمية على الإطلاق (4 نانوغرام). [الحانات مقياس: 500 ميكرون (A-D)، و 100 ميكرون (E و F)، 200 ميكرون (G-J)، و 300 ميكرون (K-M).]

للتحقيق في سبب هذا النمط الظاهري، درسنا على مدار الساعة من العصب الحائر الهجرة NC. في 36 HPF، البلدان المساهمة الصافية هاجروا من منطقة العصب الحائر عادة في morphants bbs8، كما يتضح من crestin التعبير (الشكل 5 E و F). في 48 HPF، ويظهر التعبير phox2b انخفاض في عدد الخلايا في الأقواس الخيشومية (شرح عدم وجود الأقواس الخيشومية في morphants bbs8) (الشكل 5 G و H). يظهر منظر جانبي أن هناك خلايا المهاجرة في أنبوب الأمعاء في morphants في هذا الوقت (الشكل 5 الأول وJ)، مما يشير إلى أن عدم وجود ENS ينشأ من فشل الخلايا على الهجرة من منطقة العصب الحائر، من خلال الأقواس وداخل القناة الهضمية، وليس من فشل مواصفات أو الخروج من منطقة العصب الحائر.
أكدنا نتائج HUC من قبل في الموقع التهجين لphox2b في 72 HPF. في الضوابط، وخلايا -positive phox2b ملؤها الأمعاء إلى فتحة الشرج (الشكل 5 K). مع 2 نانوغرام من MO، خلايا تصل إلى منتصف المعى المؤخر (الشكل 5 L) في حين أن الجرعات العالية (4 نانوغرام من MO) أدى إلى غياب الخلايا -positive phox2b من المعى المؤخر (الشكل 5 M).
لأن يرتبط GI الحركة مع الأرقام الخلايا العصبية المعوية، استخدمنا المجهري الفيديو لمراقبة منتصف الأمعاء في اليرقات عند 4.5 DPF. في كل morphants (2 نانوغرام من MO)، لاحظنا عدم وجود التمعج ربط مع قلة الخلايا العصبية المعوية (أفلام S4 و S5). وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs8 أمر مهم لالمعوي السكان الجهاز العصبي من خلال البلدان المساهمة الصافية المهاجرة من منطقة العصب الحائر وعلى الأرجح ما يفسر جمعية HD مع حالات BBS.
القنفذ اشارة تشعر بالانزعاج في BBS Morphant السمك.

وأخيرا، فإننا التحقيق في آلية محتملة لmispatterning المنطقة القحفي في BBS morphants. الانصهار من الترابيق في الأجنة morphant bbs8، جنبا إلى جنب مع تصقلب الجزئية (الشكل 2 D أقحم)، وكان يذكرنا Shh على المسوخ ممرا أو أجنة الأسماك المعالجة سايكلوبامين (12). غضاريف الرئيسيان لحزب المؤتمر الوطني الافريقي اليرقات، لوحة الغربالية والترابيق (الشكل 2 N؛ رأس السهم)، تنشأ من السلائف NCC متميزة، وكلاهما يعتمد على Shh على إشارات لتنميتها (14). والجدير بالذكر أن المرضى BBS يكون polydactyly ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك وجود نسبة منخفضة من عيوب الجسم الثفني والقاطعة مركزي واحد (الملاحظة الشخصية)، بصمات الشاذة يشير SHH.
أثناء الهجرة، Shh على توجيه الهجرة والزخرفة من البلدان المساهمة الصافية (12). دراسات في الزرد وفرخ تشير إلى أن Shh على من الأديم الظاهر الوجه يعزز الفك وثمرة الجبهي الأنفي (12). نحن التحقيق Shh على إشارات في BBS morphant الزرد. Patched1 (ptc1)، في حد ذاته هدفا النسخي من Shh على الإشارات، هو علامة موثوقة عن الاستجابات الخلوية لShh على (20). في 24 HPF morphant الأجنة، كان هناك انخفاض عام في ptc1 التعبير في جميع morphants النسبي لضوابط، الأكثر لفتا في bbs8 (تخفيض 64٪ بحلول QRT-PCR) (الشكل S8 A-D). كما أظهرت QRT-PCR Gli1 أن ينظم إلى أسفل إلى 52٪ من السيطرة التعبير في morphants bbs8. على النقيض من ذلك، فإن العامل pax6 النسخ، وقمع عادة Shh على الإشارات، والمتابعة تنظيما وأعرب ectopically في جميع أنحاء الأنبوب العصبي في morphants bbs8 (الشكل S8 E-H) (21)، مما يدل على misregulation من Shh على الإشارات.
حقن ptc1 MO (أو SHH مرنا، لا تظهر البيانات) التي يسببها مسار Shh على (الشكل S8 I.)، وcoinjection مع bbs8 MO انقاذ جزئيا هذا الاستقراء (الشكل S8 J.)، مشيرا إلى أن وظائف Bbs8 المصب Ptc1 لكن ليست ضرورية لShh على تنبيغ.
ويلزم البروتينات IFT لكلا GLI المنشط وكاظمة وظائف النسخي، والبروتينات جلي لا تعير اهتماما لسمو يجند في غياب البروتينات IFT. نحن اختبار ما إذا كان Bbs8 ينظم معالجة جلي في خلايا الثدييات. إضافة ناهض Purmorphamine Shh على الخلايا NIH 3T3 يحفز مسار Shh على المؤلمة التي كتبها مباشرة مملس. والموهن ردا على التحفيز في ضربة قاضية shRNA بوساطة من Bbs8 التي كتبها ≈40٪ (P <0.01) (الشكل S8 M). تحليل لطخة غربية لGli3A: نسب Gli3R في هذه الخلايا كشفت ردود اضعافها لSHH منبهات (الشكل S8 N و O.). وهذا ما أكده في الجسم الحي من قبل coinjecting الأجنة الزرد مع المهيمن السلبي PKA مرنا (الذي يعطل Gli3 الفسفرة)؛ bbs8 مرنا انقاذ النمط الظاهري (الشكل S8 K و L.). هذه النتائج تشير إلى أن bbs8 أمر مهم، ولكنه ليس أساسيا، لسمو الإشارات من خلال العمل المصب من Ptc1 وتنظيم وتجهيز Gli3.
الخلايا العصبية كريست الدب سيليا الابتدائية.

ونظرا لأهمية أهداب لShh على وnoncanonical إشارات Wnt، أن Shh على أمر ضروري لتوجيه خط الوسط المهاجرة CNCCs، ودور noncanonical WNT في الهجرة NCC، نحن مسبب أن تهاجر البلدان المساهمة الصافية يجب أن يتحمل أهداب الأولية التي شعروا التدرجات محدثة التخلق وربما تنظيم الخلية القطبية (14، 17، 22). بعد تسليخ مجهري مضان من Sox10: EGFP البلدان المساهمة الصافية، لاحظنا أهداب اضح القمي الأساسي (ملطخة تويولين الأسيتيل) بما يتفق مع متطلبات تعتمد على أهداب Shh على التنبيغ (الشكل S9 A، B، و B '.).
أكدنا أن Shh على لم يكن مهما للاوائل الهجرة NCC التي كتبها استعداء Shh على الإشارات باستخدام سايكلوبامين. CNCCs لا يزال هاجر عادة في 19 HPF على الرغم من الزخرفة تعطلت بنسبة 30 HPF (الشكل S10).

نقاش

في هذه الدراسة، لقد أظهرنا أن تحليل DSM يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد خلل البنية؛ شوهة الوجه خفية في كل من البشر والفأرة. DSM يمكن تسليط الضوء على الاختلافات الرئيسية في سحنة من الأمراض الوراثية مثل متلازمة سميث Magenis، متلازمة فيلو-القلب والوجه، والمتلازمات ويليامز، والآن BBS (2، 3).
مزايا استخدام تحليل DSM مورفولوجيا الوجه BBS الإفراط في الاعتماد على الملاحظة البشرية هي الموضوعية والقدرة على ضبط حجم بحيث لا يسيطر المرصودة الزخرفة منتصف الوجه من قبل أنسجة الوجه المفرطة. يمكننا الآن التأكد لفك تسطيح مع متوسط ​​على أنف أصغر وretrognathia معتدل توفير وسيلة موضوعية لم يسبق وصفه من التعرف على الوجه في BBS (فيلم S1). يحلل التمييز مؤخرا من وجوه الضوابط والأفراد المتطابقة مع الظروف الوراثية أدوا عند مستويات دقة ما بين 85٪ و 95٪ (2)، والآن منطقة الأنف وحدها في BBS تقدم دقة مماثلة. مددنا أيضا التحليل القائم DSM-على الفئران وأظهرت تشوهات مقارنة القحفي في الماوس، فضلا عن الأسماك، ونماذج من BBS. هذه النتائج تشير إلى أن الجينات BBS دورا حاسما في التنمية CF.
على الرغم من الاختلافات الشكلية بين الجماجم السمك الإنسان، والماوس، والعديد من نفس مسارات الإشارات وتسلسل الجنينى تنظيم تطوير CF بهم (12). أصبح الزرد نموذجا صالحا لدراسة تطوير CF (14).على غرار النماذج الزرد ذكرت سابقا من الأمراض الوراثية البشرية، الظواهر وحظ في كثير من الأحيان أكثر وضوحا على الأرجح بسبب التطور السريع والحساسية المرتبطة اضطراب وراثي (23، 24).
وقد لاحظنا التطور المعيبة في مناطق الهيكل العظمي مماثلة من منتصف الوجه في كل من الفأر وتحور الجينات البشر لBBS. في السمك، وحددنا شرط Bbs8 للهجرة CNCC في لقسم الأمامي من الرأس. العيوب القحفي مثل SHH في bbs8 أدت morphants لنا لإثبات أن هناك حاجة أيضا البروتينات BBS لكفاءة مما يشير SHH. في ضوء الدراسات الحديثة تشير إلى أهمية أهداب وIFT في نجاح Shh على التنبيغ (22، 25، 26)، ومعرفة أن البروتينات BBS تنظم عمليات التحويل غير الرسمية (5، 27)، ويمكن نقص BBS شرح dysmorphology القحفي.
لم تقتصر هذه العيوب المهاجرة إلى CNCCs: أظهرنا عدم وجود تنمية ENS وفقدان الأمعاء على الحركة في morphants BBS ربما يفسر ارتباط HD مع BBS (8، 28، 29). ينشأ HD نتيجة لعيوب الهجرة NCC وارتبط لسمو رفع القيود. SHH فئرانا معدلة وراثيا تطوير كولون بانعدام العقد والتشوهات الشرجية (30، 31)، وعلاوة على ذلك، ارتبط HD مع العيوب البعيدة أطرافهم، والتشوهات الشرجية، وHPE (11).
على الرغم من أوائل الهجرة NC هي Shh على المستقلة، وتبين لنا أنه قد تعتمد، على الأقل جزئيا، على noncanonical إشارات Wnt. ولذلك، فإننا نقترح فرضية لتطوير dysmorphology CF وHD حيث نقص البروتينات BBS يشوش noncanonical WNT يشير ضروري لأوائل الهجرة NCC. لأن Shh على إشارات في CNCCs أمر ضروري لتنميط العادية (12)، ونحن التكهن بأن البلدان المساهمة الصافية وصوله في الرأس لديهم رد فعل من الاكتئاب إلى SHH يفرز من الأديم الظاهر الوجه، وبلغت ذروتها في ضعف الفك وثمرة الجبهي الأنفي. مزيج من تثبيط للهجرة وShh على عدم الاكتراث في BBS-نقص البلدان المساهمة الصافية يوفر آلية لتطوير قطاعات اعقدي في HD BBS المصاحب.

طرق

ماوس الجمجمة دراسة الإنسان و.

تعرض المرضى BBS والضوابط تتأثر لمسح الوجه 3D، و"يعني" حسبت الوجه. Bbs4 - / - ورسمت الفراء WT الفأر مع نشا الذرة ومسحها ضوئيا لالتشكل الوجه الإجمالي. وباستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم إعداد جماجم ومسحها على الماسح الضوئي الفوق الليزر. وقد تم تجميع قياس الأشكال سطح كثيف باستخدام برامج مخصصة في المنزل.

الزرد.

Morpholinos ضد bbs4، bbs6، وbbs8 تم حقنها في أجنة الزرد. لwholemount في الموقع التهجين، واستخدمت البروتوكولات القياسية مع تحقيقات التالية: ptc1، pax6، phox2b، foxd3، sox10، وcrestin. تم تنفيذ المناعية باستخدام البروتوكولات القياسية. تم تصوير الأجنة على المجهر متحد البؤر ايكا SPUV. لتحليل FACS، تم فصل الأجنة مع التربسين وtriturated قبل الفرز مع آلة بيكتون ديكنسون FACS.

زراعة الخلايا.

خلايا NIH 3T3 التعبير عن ثابت وshRNA ضد bbs8 وقد حفزت أو السيطرة التسلسل مع purmorphamine (Calbiochem) أو المؤتلف Shh على (R & D الأنظمة)، وتعرض لفحص luciferase المراسل (PROMEGA). بدلا من ذلك، كانت هي lysed الخلايا، وكانت electrophoresed البروتينات ونشف مع الأجسام المضادة لمكافحة Gli3 (سانتا كروز). لفحوصات شفاء الجروح، وقدم الصفر على مثقف NIH 3T3 أو الخلايا الليفية الإنسان الأساسية. كانت ملطخة الهيكل الخلوي الأكتين مع Phalloidin-594 (إينفيتروجن) وتصويرها على زايس AxioImager. المواد كاملة وأساليب يمكن العثور عليها في مواد SI وطرق.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #3  
قديم 11-23-2015, 10:09 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي التحليلات الفنية من المتغيرات تكشف عن وجود دور كبير للالأليلات السلبية والمشتركة السائدة في قليل الجينات متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/107/23/10602.full




التقدم التكنولوجي تبشر من تحفيز بسرعة اكتشاف المتغيرات المسببة للأمراض لمرض وراثي. ومع ذلك، خفف هذا الاحتمال القيود في تفسير العواقب الوظيفية الاختلاف الجيني في مواضع مرشح. هنا، نقدم أسلوب منهجي، ترتكز على فحوصات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، لتقييم المحتوى تغيري (125 الأليلات) من 14 الجينات المرتبطة مع متلازمة بارديه-بيدل (BBS). مزيج من في الجسم الحي المقايسات مع احقا في التحقق من صحة المختبر تشير إلى أن جزءا كبيرا من الطفرات BBS المصاحب لديهم النمط السائد سلبية للعمل. وعلاوة على ذلك، نجد أن مجموعة فرعية من الأليلات المشتركة، التي سبق بحثها إلى تكون حميدة، هي، في الواقع، يضر وظيفة البروتين، ويمكن أن تتفاعل مع الأليلات نادرة قوية لتعديل العرض المرض. وتمثل هذه البيانات إجراء تقييم شامل لتحميل الجيني في مرض multilocus. الأهم من ذلك، التراكب هذه النتائج إلى بيانات الوراثة البشرية يشير إلى وجود تعقيد تقدير كما في السابق في مجال العمارة الأمراض التي قد تكون مشتركة بين الظواهر السريرية المتنوعة.
Exome وكامل الجينوم resequencing من المرجح أن تحفيز نقلة نوعية في تحديد الآفات الوراثية في المرضى (1). في نفس الوقت، حتى ضمن حدود الجينوم الترميز، هذه التكنولوجيات تشكل مشكلة تفسيرية، في أن ترشيح الإمراض من الطفرات يمكن أن تستمد إلا من خلال نماذج وراثية ضيقة ومحدودة أدوات التنبؤ الحسابية، وكلاهما من المرجح أن كيل وإساءة تفسير تأثير بعض الطفرات. وعلاوة على ذلك، وتقلب المشترك بين وداخل الأسرة، وهي ظاهرة سائدة في معظم الصفات الوراثية، يبقى عامل التباس كبير لأن كلا الاختلاف الأليلي في مكان واحد وموقع ثاني معدلات غير المشبعة يمكن أن تمارس تأثيرا كبيرا على انتفاذ والتعبيرية من خلال المضافة وروكبي الآثار ( 2).
بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو نموذج مفيد لتشريح قشوة لأن معظم الجينات 14 BBS يمكن أن تسهم أيضا الأليلات روكبي (+3 - +17). BBS هو أيضا ممثل الطيف مرض ciliopathy، مجموعة من الاضطرابات التي تتميز عيوب في بنية الهدبية و / أو إخراج إشارة الهدبية (18). وتشمل السمات المميزة لBBS تنكس الشبكية، والسمنة، وقصور الغدد التناسلية، polydactyly، الفشل الكلوي، والتخلف العقلي (19).
نحن وغيرنا قد أظهرت أن الزرد يوفر نماذج الانقياد تجريبيا وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية من الجوانب الهامة من اختلال وظيفي الهدبي (2، 15، 17، 20 - +23). وعلاوة على ذلك، يمكن مرنا البشري للجينات ciliopathy انقاذ كل من morphant ومتحولة الظواهر الزرد بكفاءة، وتوفير منصة قوية لتفسير أهمية المرضية من الأليلات مغلطة المحددة، التي لاضطراب العلاقة السببية لا يمكن إثباتها بشكل قاطع بحجج وراثية وحده (15، 17 ، 22، 23).
هنا، لدينا المتكاملة متعددة مستقلة في المقايسات الجسم الحي، تليها في المختبر التصديقات، لاستجواب جوانب وظيفة كل من 125 الأليلات وتحديد مساهمتها في مرض وراثي بوصفها وظيفة من مجموع الحمل تغيري عبر جميع الجينات BBS المعروفة.
النتائج

النمذجة BBS العيوب التنموية في الزرد.

حقن morpholino ضد كل BBS النتائج الجينات في العيوب تكون المعيدة.

لقد أظهرنا سابقا أن قمع بعض البروتينات BBS في الزرد يسبب العيوب تكون المعيدة التي تشمل تقصير محاور الجسم، ويعد القطع البدنية النمطية، وnotochords اسعة ومتلوى (14، 16، 17، 20، 21). هذه الظواهر هي متسقة مع مستو غير طبيعي الخلية القطبية (PCP) يشير إلى (21، 22، 24، 25)، والتي من المرجح يكمن وراء العديد من الظواهر السريرية في المرضى الذين لديهم BBS، بما في ذلك عيوب السمع (20)، العصبية تشوهات إغلاق الأنبوب (26)، تشكيل الكلوي الكيس (27)، وربما السمنة وضعف الادراك (28). حقيقة أن هذه الملاحظات هي ذات الصلة الأرجح إلى الباثولوجيا السببية من BBS (20، 21، 23 - 25)، والحقيقية لجميع BBS orthologues سبعة اختبار (bbs1، bbs4، bbs6، bbs10، bbs12، mks1، وcep290) وكذلك ل كما الثلاث BBS معدلات mgc1203، mks3، وrpgrip1l، اقترح أن أنها قد تمثل المقايسات مفيدة لجميع الجينات BBS. ولذا فإننا مصممة حجب ترجمة morpholinos (موس) ضد bbs1 - 12 (وSI الملحق، الجدول S1) وحقن كل في الأجنة WT بتركيزات متفاوتة لإنشاء منحنى بقاء (SI الملحق، الجدول S3) يمكن من خلالها استخلاص العمل الأمثل تركيز MO (الحد الأدنى من السمية الخلوية، النمط الظاهري القصوى). التهديف من 8-10 الأجنة مرحلة الجسيدة كشفت أن ضربة قاضية لكل النتائج BBS الجينات في عيوب مماثلة لتلك التي سبق وصفها (الشكل 1 A). من غير المرجح أن يكون سبب التسمم غير محددة لأنها استنسخت بشكل كامل عن طريق الحقن من المنظمات الأعضاء حجب لصق، والتي ضربة قاضية فعالة يمكن أن يدل على RT-PCR (هذه الظواهر SI الملحق، الشكل. S1 A-C والجدول S3). ودعمت هذه الآثار عن طريق القياس الكمي لمحور الجسم تقصير عيب بواسطة التهجين في الموقع (SI الملحق، الشكل S2) والكمي لعيوب في الحركات تكون المعيدة (SI الملحق، الشكل S3).

تين. 1.
قمع BBS4 تنتج عيوب محددة. (A) حقن المنظمات الأعضاء ضد BBS الفردية الجينات (bbs4 هو موضح هنا) في الأجنة الزرد تنتج العيوب تكون المعيدة، بما في ذلك محور قصيرة الجسم، والحبل الظهري اتسعت ومتلوى (*)، والقطع البدنية النمطية توسيع (رأس السهم)، والتي يمكن انقاذهم من قبل WT مرنا البشري. Coinjections من من mRNAs متحولة إنتاج مجموعة متنوعة من العيوب. (B) في حين WT RNA ينقذ الظواهر MO (WT RNA)، coinjection من الطفرات hypomorphic (N165H) ينقذ جزئيا النمط الظاهري. ومع ذلك، والطفرات فارغة (D102G، N274H، وM472V في BBS4) لا إنقاذ، والطفرات السائدة سلبية (L327P) تفاقم النمط الظاهري وتنتج العيوب عن طريق الحقن من RNA وحدها.
الإنسان BBS مرنا ينقذ الظواهر morphant.

وبالنظر إلى الحفاظ على ارتفاع بين orthologues BBS الزرد البشرية و(SI الملحق، الجدول S2) والانقاذ ذكرت سابقا من bbs11، mks1 / bbs13، وcep290 / bbs14 مع من mRNAs الإنسان (15، 17)، ونحن مسبب هذا التعبير من الآخرين BBS البشري وينبغي أيضا أن يكون قادرا على إنقاذ الظواهر morphant البروتينات. لذا أجرينا تجارب الانقاذ لكل BBS MO (bbs1 - 12) مع كامل طول مرنا البشري.
على التهديف من تسعة (± 1) الأجنة مرحلة الجسيدة، وجدنا الإنقاذ فعال في كل حالة [SI الملحق، التين. S1-S4 والجدول S4، وقاعدة بيانات على شبكة الإنترنت (http://misc.ciliaproteome.org/bbs_mutations؛)]، والتي أكدتها الكمي بواسطة التهجين الموضعي فضلا عن التهديف الحركات اكتفار، كل واحدة منها كانت مشابهة لضوابط uninjected في (التين. 2 و3 وSI الملحق). لمزيد من التحقق من خصوصية كل BBS مرنا لانقاذ BBS المقابلة MO، نحن coinjected كل BBS MO مع مختلف BBS مرنا، والعكس بالعكس، ولم ير أي الانقاذ (SI الملحق، الشكل. S1 D). الأهم من ذلك، في المقارنة بين الأجنة سجل عمياء، الظواهر بين الأفواج الجنين انقاذ وباستمرار تحسن إحصائيا من الفوج MO (SI الملحق، الجدول S4).

تين. 2.
في التحقق من صحة المختبر من آثار الطفرة. (A - C) توطين الموسومة MYC WT BBS4 البروتين (الحمراء) في الخلايا IMCD3 يظهر وجود في الجسم القاعدية، كما يتبين من colocalization مع γ تويولين والأسيتيل α تويولين (الخضراء). (D - F) مقدمة من طفرة N165F اصطناعية في BBS4 ليس له تأثير ملحوظ على الترجمة. التعبير عن متحولة D102G، وصفها بأنها باطلة في الجسم الحي التهديف، غير قابل للكشف د 2 بعد ترنسفكأيشن (G - I)، في حين يتم التعبير عن البديل N165H hypomorphic لكن mislocalized (J - L). نتائج طفرة L327P المهيمنة سلبية في mislocalization في الخلايا تالية للتفتل (M - O) ولكن ليس في تقسيم الخلايا (P - R). (S) التعبير عن ثوابت-MYC الموسومة 4 د بعد ترنسفكأيشن غير قابل للكشف عن الطفرات فارغة (D102G، N274H، وN165H)، على الرغم من أن RT-PCR أظهرت الرسالة في كل حالة.


تين. 3.
تأثير مهيمن سلبية من BBS4 L327P. (A) Coinjection من 3 نانوغرام من bbs4 MO و 100 خريج من WT مرنا البشري ينقذ النمط الظاهري morphant، وcoinjection من 100 خريج من L237P تحمل BBS4 مرنا تنتج عيوب مماثلة، أو أشد من، MO حدها. إدخال كميات متساوي المولية (50 خريج لكل منهما)، ولكن من كلا WT ومرنا متحولة خفف قدرة 50 خريج من WT مرنا وحده لانقاذ جزئيا النمط الظاهري morphant. (B) حقن جرعة دون المستوى الأمثل (10 PG) من L327P مرنا تنتج الظواهر الهامة. (C) overexpression من المهيمنة سلبية L327P طفرة BBS4 ولكن ليس من الخسارة من وظيفة أليل تنشيط الكنسي إشارات Wnt من قبل luciferase الفحص سوبر TOP-فلاش بطريقة مماثلة لBBS4 قمع. overexpression من L327P مرنا في تركيز عال (300 خريج) النتائج في الأجنة dorsalized ومحاور مزدوجة (السهام) (D) وخارج الرحم التعبير chordin (E). (F) وفي سياق الميراث قليل الجينات، والابتدائي (المتنحية) موضع لديه احتمال زيادة كبيرة كونها hypomorphic (P <0.0001)، في حين من المرجح أن تكون شديدة، مع إثراء كبير من الآفات المهيمنة السلبية (موضع روكبي P = 0.0004).
إنقاذ الظواهر تكون المعيدة ينتج طائفة من الشدة.

إنقاذ BBS morphants مع مرنا البشري لجميع الجينات BBS أتاح لنا الفرصة لاختبار تأثير كل التغييرات الأحماض الأمينية nonsynonymous وجدت في المرضى الذين يعانون في سياق تسلسل البروتين البشري. أولا، نحن المهندسة بنيات متحولة عن طريق إدخال تغييرات النوكليوتيدات واحدة في كل الجينات البشرية (ن = 109). نحن ثم يعاير كفاءة إنقاذ كل بناء عن طريق حقن الأجنة WT إما (ط) لمراقبة سلبية، (ب) MO وحدها، (ج) MO بالاضافة الى كمية المولي محدد سلفا من WT RNA البشري، (د) MO بالإضافة إلى نفسه مقدار المولي مرنا متحولة، (ت) WT من mRNAs وحده، أو (السادس) من mRNAs متحولة وحدها. وسجل كل coinjection وعلى سبيل المقارنة مع MO وحدها أو مع الانقاذ WT (قيم P في SI الملحق، الجدول S4).
وأظهرت أربعة عشر الأليلات عدم وجود فروق ملموسة في كفاءة الإنقاذ (SI الملحق، الشكل. S4 والجدول S5)، مما يدل على أنهم كانوا حميدة فيما يتعلق وظيفة (ق) يعاير. على سبيل المثال، BBS6 R518H مرنا إنقاذهم بالكامل النمط الظاهري morphant (SI الملحق، التين. S2-S4). على النقيض من ذلك، حققت 15 الأليلات الظواهر تحسن كبير من الأجنة MO حقن لكن أسوأ من الأجنة coinjected مع WT مرنا، مما يشير إلى أن هذه الأليلات هي hypomorphs وظيفي، كما يتضح من BBS4 N165H (الشكل 1). مجموعة ثالثة من 45 الأليلات لم تسفر عن أي الانقاذ، وأنها بالتالي وسجل كما بلا قيم (على سبيل المثال، BBS4 D102G، N274H، الشكل 1). الظواهر أخيرا، 35 الأليلات أنتجت أسوأ بكثير من MO وحده، ومرنا تنتج الظواهر متحولة مماثلة أو أسوأ من MO وحدها، مما يوحي بأن هذه قد تكون الأليلات السائدة سلبية (على سبيل المثال، BBS4 L327P؛ الشكل 1). الأهم من ذلك، نحن يعاير عشوائيا 26 الطفرات من خلال تتبع اكتفار القياسات الكمي والجسيدة طول الجذع وجدت التوافق الكامل في جميع المقايسات، مما يوحي بأن يحرز التحيز غير المرجح أن يعرض نتائج إيجابية كاذبة.
هذا التقييم المنهجي، بالإضافة إلى سابقا لدينا أفادت بيانات لBBS13-14، MKS3، وRPGRIP1L (17، 23)، مكنتنا من إنشاء سلسلة أليلية كاملة ل 125 المتغيرات الترميز nonsynonymous في جميع الجينات المرتبطة BBS (الشكل 1 و SI الملحق، الشكل. S4 والجدول S5).
حساسية وخصوصية: إثبات وراثية.

وقد وفرت الفصل والتحليل القائم على السكان أو في البيانات الوظيفية المختبر لمجموعة فرعية من الطفرات وجدت في المرضى الذين لديهم BBS أدلة قوية على الإمراضية، وتكفل لنا الفرصة لاختبار حساسية في الجسم الحي لدينا التهديف. لذا اخترنا 49 الأليلات المرضية المعروفة في البشر وسألت عن كيفية وسجل انهم في الجسم الحي (SI الملحق، الجدول S5). باستثناء أليل S329L في BBS10 (سجل حميدة)، وتوقع 48 من 49 الأليلات بشكل صحيح المسببة للأمراض كما، مما يدل على أن المقايسات في الجسم الحي لديها حساسية من 98٪.
يمكن تنفيذها نهج مماثل لاختبار خصوصية. اخترنا 12 التغييرات (BBS2 123 IV؛ BBS6 C517R؛ BBS9 A455T؛ BBS10 D142N؛ BBS12 I170V، R235M، Q386R، وS429T؛ MKS1 L491I؛ MKS3 D261N، وL437V وRPGRIP1L G1025S) شائع في البشر (تردد أليل طفيفة> 15 ٪)، وبالتالي وجدت في كثير من الأحيان الآباء تتأثر والأشقاء المرضى، وأحيانا في زيجوت متماثلة الألائل. نحن أيضا اختبار أليل ال13، BBS4 N165F، وهو التغيير الناجم عن ذلك لا يغير من خصائص البروتين (انظر أدناه)، وأربعة الأليلات BBS6 (G52D، I339V، S511A، وR518H) التي تصرف indistinguishably من WT في الخلايا المستزرعة ( 29)؛ وكانت 14 من 17 التغيرات حميدة في جميع المقايسات الثلاثة في الجسم الحي، مما يشير إلى خصوصية> 82٪.
في فحوصات المختبر.

وقد لوحظت الظواهر تتعلق ببعض البروتينات BBS في الخلايا المستزرعة (+8 - 10، +29 - 34). لذا، طلبنا ما إذا كانت بعض النشاط الشاذ في الأجنة الزرد يمكن تفسير السلوك خلل في خلايا الثدييات.
ركزنا في البداية على BBS4 لأنه، على النقيض من البروتينات BBS أخرى، التعريب لها بالقرب من centrioles اثنين يمكن أن يتحقق بتكاثر التي كتبها overexpression من البروتين الموسومة في مختلف خطوط الخلايا تحولت (31، 32). نحن المهندسة ستة الطفرات BBS4 مغلطة إلى MYC N-محطة -tagged متجه التعبير الثدييات. وتوقع ثلاثة لاغيا (D102G، N274H، وM472V)، وكان واحد ناقص المفعول (N165H)، كان واحدا المهيمنة سلبية (L327P)، وكان واحدا حميدة البديل N165F. وبعد ترنسفكأيشن في الخلايا IMCD3، وجدنا ملاحظاتنا أن تكون متطابقة مع التقييمات في الجسم الحي. على الرغم من أن بناء N165F حميدة أظهرت نمطا من التوطين لا يمكن تمييزها عن تلك التي WT (الشكل 2 A - F)، كل من سبع طفرات nonneutral أظهر الظواهر استنساخه الحالية في> 70٪ من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. كانت D102G وN274H الطفرات فارغة لا يمكن الكشف عنها 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الشكل 2 G - I وS.)، في حين كان تدهور أليل N165H hypomorphic أيضا، وإن كان بوتيرة أبطأ (96 ساعة بعد ترنسفكأيشن، الشكل 2 J - L وS.) . أخيرا، أظهرت أليل المهيمنة سلبية على L327P الاستقرار لا يمكن تمييزها عن تلك التي WT (الشكل 2 S.) لكنه فشل في colocalize مع γ تويولين في الخلايا تالية للتفتل (الشكل 2 M - O). ومن المثير للاهتمام، لاحظنا توطين مريكزي من L327P في المغزل الإنقسامية من الخلايا المنقسمة، مما يشير إلى أن هذه الطفرة تمارس تأثيرا تالية للتفتل معين (الشكل 2 P - R). تم التحقق من التعبير عن كل بناء من قبل RT-PCR ومع علامة GFP cotransfection (SI الملحق، التين. S2 و S6).
وكانت هذه الملاحظات لا تقتصر على BBS4. نحن المهندسة بنيات التعبير الثدييات لمجموعة عشوائية من 17 الطفرات BBS (14٪). على الرغم من أن معظم البروتينات WT overexpressed تظهر نزع فتيل باستمرار توزيع حشوية، على غرار التقارير السابقة (34)، كنا لا نزال قادرين على تقييم الاختلافات بين WT ويبني متحولة. أظهرت عدة الأليلات يتوقع أن تكون ضارة وظيفة البروتين نمط توطين متميز من WT (SI الملحق، الشكل. S6). والجدير بالذكر أن لاحظنا العديد من الأمثلة التي تحور قاد توطين البروتين إلى المناطق التحت خلوية لم يسبق له مثيل مع بنيات وزن. على سبيل المثال، تم الكشف عن WT BBS7 في جميع أنحاء السيتوبلازم ولكن تم استبعاد حد كبير من النواة (SI الملحق، الشكل. S6 L). على النقيض من ذلك، وجدنا المسوخ T211I وH323R في نواة لنسبة كبيرة من الخلايا (SI الملحق، الشكل. S6 M و N).
نحن لم تجد نتيجة واحدة متفاوتة: كان أليل BBS6 T112A حميدة في الزرد، بعد أن أظهر بناء 112A، معربا عن التعريب الشاذة في النواة في خلايا الثدييات (SI الملحق، الشكل S6.). على الرغم من أنه ليس من الواضح أي من فحوصات اثنين من أكثر بالمعلومات، فإننا نخلص إلى أنه متحفظ، لدينا استراتيجية في الجسم الحي لديها معدل دقة بالمقارنة مع في المختبر بيانات الخلية الثديية من 94٪ (مقارنة مع مستوى حساسية لوحظ عبر ثلاثة في المقايسات فيفو). الأهم من ذلك، ملاحظاتنا من خلايا IMCD3 تم إثباتها بشكل كامل من قبل دراسات الترجمة في ARP19 وhTERT الخلايا المهدبة الإنسان (قاعدة بيانات على الإنترنت).
الطفرات المهيمنة سلبية.

وكشفت دينا في الدراسات المجراة 35 مرشح الأليلات السائدة سلبية (28٪). لدراسة هذا الاحتمال، أجرينا دراستين مستقلة. نحن إعادة النظر أولا في الجسم الحي الزرد فحص ومعللا أنه إذا كانت هذه الأليلات السائدة سلبية، يجب أن تكون البيانات التاليين صحيحا: حقن مرنا ترميز الأليلات السائدة سلبية وحدها أن نسخة مظهرية النمط الظاهري morphant، وحقن متساوي المولية من المهيمنة سلبية و WT مرنا يجب تخفيف من تأثير إنقاذ الرسالة WT.
وجدنا البيان الأول أن يكون صحيحا لجميع الأليلات السائدة سلبية. حقن مرنا المهيمن سلبية تنتج وحدها الظواهر مماثلة لMO حدها لكل من 35 الطفرات (الشكل 3 A، SI الملحق، الشكل. S7 A-E، وقاعدة بيانات على الإنترنت). وهذا صحيح حتى بتركيزات دون المستوى الأمثل، الذي WT مرنا تنتج الحد الأدنى من العيوب (الشكل 3 B و SI الملحق، الشكل. S7 F و G). وعلاوة على ذلك، اقترح إجراء مزيد من التجارب البيان الثاني أيضا ليكون صحيحا. على سبيل المثال، لbbs4، coinjection من MO و 100 خريج من WT مرنا أنقذت بكفاءة النمط الظاهري morphant. Coinjection من 100 خريج من 327P مرنا مع MO، ومع ذلك، أدت إلى النمط الظاهري الجنين أسوأ بكثير مما كانت عليه عندما MO حدها تم حقن، كما فعل حقن 100 خريج من مرنا متحولة وحدها. وعلاوة على ذلك، في حين coinjection من bbs4 MO و 50 خريج من WT مرنا انقاذ جزئيا النمط الظاهري morphant، إضافة 50 خريج من 327P الترميز مرنا (أي ما مجموعه 100 خريج من مرنا) قلصت قدرة WT مرنا لانقاذ النمط الظاهري (الشكل 3. A). لاحظنا سيناريوهات مماثلة لجميع الأليلات اختبار (SI الملحق، الشكل. S7 A-E).
البحث عن أدلة إضافية، لجأنا إلى الثدييات خلية القاعدة مقايسة البيوكيميائية. لقد أظهرنا سابقا أن قمع BBS4 يؤدي إلى ارتفاع الكنسي النشاط الإشارات WNT، كما رصدتها luciferase الفحص سوبر TOP-فلاش، في حين overexpression من WT BBS4 ليس له أي تأثير (21). وإذا كنا قد تفسر البيانات الزرد بشكل صحيح، توقع BBS4 الأليل الوحيد لتكون مهيمنة سلبية، L327P، يجب transactivate مراسل β-catenin بطريقة مماثلة لBBS4 shRNA. ولذلك عبرنا عن L327P وكذلك WT، أربعة الخسارة من وظيفة الطفرات BBS4 (D102G، N165H، N274H، وM472V)، والبديل محايد الاصطناعي N165F. وتوقع تحليل أعمى من البيانات بشكل صحيح L327P أن تكون مهيمنة سلبية في ثلاثة تجارب منفصلة (الشكل 3 C). لتحديد ما إذا كان هذا التأثير يمكن تكرارها في الجسم الحي، ونحن overexpressed L327P مرنا في تركيز عال (300 خريج) وdorsalization احظ، بما في ذلك تشكيل محور مزدوج في نسبة صغيرة من الأجنة (الشكل 3 D)، وهي السمة المميزة ليصل التنظيم من الكنسي إشارات Wnt. باستمرار، هذه الأجنة يحمل التعبير خارج الرحم من الكنسي WNT الجين المستهدف، chordin (21)، في مراحل midepiboly (3 الشكل E).
اكتشاف عدد كبير من الطفرات السائدة سلبية لا يتفق مع فكرة المفاهيمية من الخسارة من وظيفة الآثار في مرض المتنحية. أن الملاحظات الفنية من غير المحتمل بسبب استنساخ بهم عبر التكرار متعددة وفحوصات مستقلة. لذا سألنا عما إذا رؤى الوراثية يمكن أن تستشف من خلال دراسة توزيع مرشح الأليلات المهيمنة سلبية في 218 المرضى وعائلاتهم في فوج لدينا. وجدنا أن الأليلات السائدة سلبية تشكل أقلية (18٪) من كل الأليلات BBS. ومع ذلك، نحن وغيرنا وأفادت العديد من الأسر التي طفرة غير المشبعة الثالثة تتفاعل وراثيا مع الأليلات المتنحية في موضع الأساسي لتعديل انتفاذ المرض والتعبيرية (+34 - +37). عند تعيين موقف الأليلات السائدة سلبية (موضع الابتدائي مقابل موضع روكبي)، وجدنا زيادة كبيرة من الطفرات السلبية المهيمنة في مواضع روكبي (33٪ في معدلات مقابل 18٪ مساهمة في إجمالي الطفرات؛ P = 0.0004؛ الشكل 3 F)، مما يدل على أن غالبية الظواهر معدل ويورث.
المتغيرات المشتركة في BBS.

لم تقتصر دينا المقايسات الفنية إلى حدوث طفرات نادرة أو خاصة ولكن متكاملا يعرف كل الألائل في الجينات BBS. وأشارت سواء في الجسم الحي الاختبارات والدراسات توطين الخلية أن 7 من 14 الأليلات المصنفة رسميا باسم الأشكال (> 1٪ تردد السكان) هي أيضا ضارة وظيفة البروتين، وبالتالي قد تشارك في عملية المرض (SI الملحق، الشكل S5 والجدول S6 ). وبالنظر إلى أن معظم هذه المتغيرات يمكن العثور عليها في زيجوت متماثلة الألائل في الأفراد تحكم يوحي بأنها غير كافية لتسبب المرض. ومع ذلك، تساءلنا عما إذا كانوا قد تتفاعل مع طفرات قوية لتحفيز BBS، كما هو مبين في الآونة الأخيرة عن واحد منهم، وأليل A229T في RPGRIP1L (23).
وأشارت هذه البيانات إلى أن تردد سكان الأليلات ليس بالضرورة مؤشرا على وظيفة، مما دفعنا للاستعلام عن الفصل بين كل الأشكال nonsynonymous (ن = 18) في عائلاتنا. ليس من المستغرب، فصلت ما بين سبعة تعدد الأشكال الحميدة في أنماط لا علاقة لهذا المرض (SI الملحق، الشكل S5 والجدول S6). لالأليلات أخرى، ومع ذلك، كان الجمع بين في الجسم الحي البيانات والفصل يحتمل أن تكون قادرا على حساب لنقل الفوضى في الأسر. نحن وغيرنا وذكرت العديد من الأنساب التي تم العثور احدة فقط الطفرة المسببة للأمراض متخالف في أي BBS جين معين (4، 5، 7، 14، 16، 17، 38). وقد تم افتراض أن الطفرة الثانية قد تكمن في عنصر تنظيمي. ومع ذلك، بياناتنا تقدم الفرضية البديلة، الذي، بالنسبة لبعض الأسر، وهذا المرض يمكن تفسير noncomplementation nonallelic بين الأليلات النادرة والمشتركة. على الرغم من أن معظم هذه الأليلات كانت نادرة جدا في فوج لدينا لأداء الاختبارات الجينية رسمية لهذه الفرضية، لم يكن هذا هو الحال بالنسبة ل123 IV في BBS2 [13.3٪ في الضوابط لدينا (ن = 240)، و 13٪ في سكان يوتا مع أصل من أوروبا الشمالية والغربية (CEU) هاب ماب]. في شمال AR186 الأسرة الأوروبية، وكان المريض haploinsufficient لBBS1 (مع وجود الحسنة الخسارة من وظيفة طفرة Q128X النية، على النحو الذي يحدده الفحص في الجسم الحي (الشكل 4 B و C)، لم يكن لديها الحذف واضح في الآخر ومع ذلك، كان أليل (كما تقرره SNP تغاير على مستوى ~ 1 كيلو بايت من القرار عبر مكان)، وليس لديها أي الأليلات المسببة للأمراض أخرى مرشحة في BBS1. هذا المريض أيضا متماثل ل123 IV SNP في BBS2، وظيفية ناقص المفعول (الشكل 4 A - C). الأهم من ذلك، على الرغم من أن أليل 123V قد تبدو كافية لالمرضية في هذه العائلة، وجود أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل 123V في عموم السكان (3٪ في الضوابط لدينا، 3.3٪ في CEU هاب ماب) ويقول أن الجمع بينها وبين هراء أليل BBS1 قد تحفيز الدولة المرض.

تين. 4.
إعادة تقييم البيانات الوراثية باستخدام المجراة التهديف. وتشير آثار الطفرات استنادا في الجسم الحي التحليلات أن شدة الطفرات BBS تتفق مع العزل من المرض في العائلات مع BBS. (A) على الرغم من أن هراء متخالف BBS1 طفرة Q128X موجودة في شخص لديه BBS في AR186 الأسرة باطل وظيفيا (B و C)، وجودها لا يأخذ في الحسبان تماما لهذا المرض. (B و C) تتأثر فرد، ومع ذلك، هو أيضا متماثل لتعدد الأشكال BBS2، I123V، وتوقع أن يكون ناقص المفعول معتدل. (D) حقن إما bbs1 أو bbs2 MO حده في النتائج تركيزات دون المستوى الأمثل في الأجنة تتأثر بشكل معتدل. Coinjection كل من المنظمات الأعضاء تنتج معا الأجنة المصابة بشدة مع الظواهر لم أر عن طريق الحقن إما MO وحده، بما في ذلك شبه كاملة فقدان تعريف أجسودي (المسمى من قبل myoD) وفقدان الحقل العين (المسمى من قبل pax2).

لأن التغيير 123 IV هو متكررة بشكل كاف في أوروبا، كنا قادرين على اختبار ما إذا كان التنبؤ في الجسم الحي من nonneutrality صحيح بالسؤال عما إذا كان إثراء أليل 123V من BBS2 وovertransmitted في المرضى الذين لديهم BBS. لاحظنا على حد سواء ليكون صحيحا: لقد وجدنا 123V في 55 (19.3٪) من 284 الكروموسومات من المرضى شمال أوروبا الذين BBS مقارنة مع 32 (13.3٪) من 240 الكروموسومات من الضوابط عرقيا المتطابقة، وهو فارق كبير (χ 2 = 8.78، P = 0.003)، على الرغم من أن اختبار اختلال التوازن انتقال أظهر أن 25 ثلاثيات بالمعلومات تحليلها (أي متماثل الأم لأليل طفيفة وباستثناء "اكتشاف" AR186 الأسرة)، وأحيلت 123V للفرد المصاب في 22 من الحالات (88٪؛ P = 0.02).
هذه البيانات، على الرغم من الأرقام متواضعة، وكلاهما يتفق مع المجراة التحليلات وموحية للتفاعل بين BBS1 وBBS2. لذا نحن اختبار ما إذا كان فقدان subeffective من BBS2 يمكن أن تعدل النمط الظاهري من فقدان BBS1 وظيفة. وجدنا دليلا قويا على أن هذا صحيح: حقن كل من bbs1 وbbs2 المنظمات الأعضاء تنتج الظواهر بشكل ملحوظ أكثر حدة من حقن إما MO وحدها، وبعضها، مثل فقدان شبه كامل للتعريف الجسيدة وفقدان مجال العين، كانت لم يلاحظ في أي حقن MO واحد، حتى في تركيزات أعلى (الشكل 4 D).

نقاش

استخدمنا واسع وشامل في استراتيجية التحليلية الجسم الحي التصديق عليها من قبل عدة مستقلة في المختبر والأدوات الوراثية لتقييم العواقب الوظيفية من المتغيرات nonsynonymous في الجينات BBS. تطبيق مثل شاملة في الجسم الحي المقايسات ليست فريدة من نوعها. على سبيل المثال، تم استخدام misexpression من جينات الإنسان في ذبابة الفاكهة لتقييم إمكانات المسببة للأمراض من الجينات / الأليلات المرتبطة اعتلال عضلة القلب (+39 - 41). وتشمل مزايا نظامنا استخدام الفقاريات التي يشترك في العديد من العمليات التنموية والميزات التشريحية مع البشر ويعاير من النمط الظاهري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ذات الأهمية المعروفة للمرض بين البشر. نلاحظ أننا يعاير فقط هذا الجانب من النمط الظاهري BBS وغيرها من عناصر الفوضى التي هي من PCP مستقلة قد لا يتم التقاطها. والجدير بالذكر، ومع ذلك، كانت البيانات المتوفرة لدينا أيضا متسقة مع جميع الملاحظات التي نشرت من أليل المرضية، مما يوحي بأن هذه المقايسات هي بدائل معقولة. لقد وجدنا 48 من 49 الطفرات يتوقع أن تكون ممرضة من التحليل الجيني البشري ليكون مثل، في حين أن تفسيرنا للأليل BBS1 M390R باعتباره ناقص المفعول يتسق مع M390R الضربة القاضية في نموذج الفأر (42) وتوقعاتنا BBS11 P130S أن تكون الممرضة يتسق مع تقرير سابق من فشل هذه أليل لإنقاذ النقل جسيم ميلانيني (15). وعلاوة على ذلك، في الجسم الحي لدينا بيانات عن BBS3 وBBS6 متفقة مع اثنين من الدراسات البيوكيميائية الأخيرة (29، 30).
لقد فوجئنا في البداية لإيجاد رجحان عال من الأليلات المهيمنة سلبية. رأيناها لأول مرة إمكانية أن هذا قد يكون قطعة أثرية للنظام في الجسم الحي، ربما بدافع من مستويات عالية من التعبير عن متحولة مرنا / البروتين. ومع ذلك، والحقن متساوي المولية من WT / مرنا متحولة قلصت ولكنها لم تطفئ تأثير مهيمن سلبية، والتعبير حتى بتركيزات دون المستوى الأمثل تنتج عيوب شديدة. هناك ثلاث آليات المرجح أن تفسر هذه الملاحظات. أولا، تم العثور على وجود فائض من الطفرات السلبية المهيمنة في العلاقات معدل الموقع الثاني، مما يشير إلى أن التعديل روكبي هو مرض وراثي جسمي، في حين أن المرض في حد ذاته لا يزال المتنحية. ثانيا، نتوقع أن الناقلين من الأليلات السائدة سلبية سوف تظهر تحت الإكلينيكي الظواهر BBS المصاحب. وتمشيا مع هذه الفكرة، تم الإبلاغ عن آباء المرضى الذين لديهم BBS أن تكون أكثر عرضة للبدانة وخلل في شبكية العين (43، 44). يثير الاهتمام والفضول، وجدنا طفرة BBS6 A242S أن يكون الاستنتاج السائد سلبية. وقد ارتبط هذا التحول مع السمنة في ولاية متخالف في دراسة على أساس السكان (45). وأخيرا، نعتقد أن الأليلات السائدة سلبية قد يؤدي الى تأثيرات على المستوى الكيمياء الحيوية، وربما عن طريق تعطيل BBSome (31) أو عن طريق التأثير في الكنسي / noncanonical توازن الإشارات WNT، كما كان الحال بالنسبة لBBS4 L327P. فمن الممكن أن مثل هذه التفاعلات من البروتينات متحولة إلى تفاقم النمط الظاهري المرض ولكن هذا التفاعل من متحولة والبروتين WT، على الرغم من أن تضر WT ظيفة البروتين، لا في حد ذاته يؤدي إلى المرض. هذه الصيغة هي متسقة مع التقرير الأخير للطفرة المهيمنة سلبية في β اميلويد البروتينات السلائف في رثت مقهور مرض الزهايمر (46).
تشير البيانات المتوفرة لدينا أيضا أن الأليلات المشتركة يمكن أن يكون ضارا وظيفة البروتين، وأنه في العديد من الحالات، والتفاعل تعتمد على سياق الأليلات النادرة ومشتركة يمكن تحديد النمط الظاهري. نحن التكهن بأن هذه التفاعلات هي على الارجح وفيرة في اضطرابات وراثية، وأنه ينبغي تقييم وجود والنسبية مساهمة الأليلات مع ارتفاع وتيرة أليل طفيفة بعناية في سياق المتغيرات النادرة إضافية.
وأخيرا، استفادت الدراسة من الطفرات BBS من مزيج من الحفظ التطوري قوي وفهم مسبق لبعض الممرات المشتركة في إمراض المرض. ومع ذلك، فمن المرجح أن هذا النهج هو ممكن من الناحية النظرية لمجموعة واسعة من الظواهر السريرية الأخرى. وسيكون من المهم لتطوير الأدوات التجريبية التي يمكن تقييم أثر الاختلاف على إخراج آليات المرض واضحة، أو على نطاق أوسع، على عواقب المظهرية لأنظمة بأكملها. سوف توفر على نطاق واسع resequencing يستلزم تطوير وتطبيق اختبارات بيولوجية مثل تلك المذكورة هنا لتقييم أهمية وظيفية من المتغيرات المحددة في الأفراد مع الظواهر المثيرة للاهتمام.

المواد والأساليب

المنظمات الأعضاء والتلاعب الأجنة.

المنظمات الأعضاء ضد الزرد bbs1 - 12 (SI الملحق، الجدول S1 تم الحصول عليها) والسيطرة MO من أدوات الجينات. تم حقن واحدة نانولتر كل الحل في الأجنة الزرد WT في واحد- إلى مرحلة الخلية يومين. مرنا WT ومتحولة البشري لBBS1 - 12 تم نسخه في المختبر مع عدة آلة SP6 رسالة (AMBION). MO ومرنا تركيزات (SIالملحق، الجدول S3 تم تحديد) على أساس الجمع التي WT مرنا انقاذ بكفاءة النمط الظاهري morphant. استخدمت تركيزات نفسها للانقاذ مع مرنا متحولة أو حقن مرنا وحدها. متوفرة عند الطلب البيانات منحنى الجرعة والاستجابة الكاملة لكل MO.

تصنيف وتسجيل النقاط من الأجنة.

تم تصنيف الأجنة تتأثر إلى قسمين الظواهر متدرج على أساس شدة النسبية مقارنة مع العمر المتطابقة الضوابط uninjected من نفس القابض، كما هو موضح في SI الملحق. وأجريت مقارنات بين حقن MO حدها، مرنا وحده، والإنقاذ متحولة، وWT الإنقاذ عن طريق χ 2 الاختبار.

كامل جبل RNA في الموقع التهجين.

جبل بأكمله في الموقع التهجين أجريت، تليها تركيب مسطحة، وتطهير في الساليسيلات الميثيل، والتصوير الفوتوغرافي في التكبير من × 10، والقياس، كما هو موضح في SI الملحق.

رصد حركات تكون المعيدة.

تم رصد تحركات تكون المعيدة عن طريق الحقن قسيم أرومي واحدة من 10000-M R-ديكستران مترافق الأخضر النسب الفلورسنت التتبع (إينفيتروجن) في المرحلة 16 خلية ورصد المواقع من الخلايا الفلورسنت من خلال مراحل اكتفار.

زراعة الخلايا الثديية.

وقد نمت الخلايا على coverslips الزجاج في DMEM وسائل الإعلام / F12 (10٪ المجلد / المجلد FBS). بعد ترنسفكأيشن عابرة مع Fugene 6 (روش)، تم إصلاح الخلايا في الميثانول بعد 48 ساعة وimmunostained مع مكافحة Myc على ومكافحة γ تويولين الأضداد الأرنب بولكلونل (سيغما).

شكر وتقدير

نشكر اندي McCallion، جيم Lupski، والمختبر Katsanis لمراجعة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل عن طريق منح R01HD04260 من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية. منح R01DK072301، R01DK075972 (لNK)، وR01DK52431 (لRLL) من المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى. مؤسسة البقعي الرؤية البحوث (NK)؛ والبصرية زمالة برنامج تدريب العلوم العصبية (NAZ)؛ ومؤسسة Berrie راسل (RLL). NK هو جان وجورج BRUMLEY أستاذ.

الحواشي

  • 1 لمن ينبغي أن تعالج المراسلات. البريد الإلكتروني: katsanis@cellbio.duke.edu.
  • الكاتب المساهمات: NAZ، ECO، JLB، وNK مصممة البحوث؛ NAZ، YL، JMG، CG، ECO، CCL، YB، JB، يقوم AS، وJLB البحوث؛ NAZ، YL، JMG، CG، ECO، CCL، YB، JB، RLL، AS، JLB، وNK تحليل البيانات؛ وNAZ، YL، ECO، RLL، كتب JLB، وNK ورقة.
  • الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.
  • * كان تقديم هذه المادة المباشرة محرر مسبقا.
  • تحتوي هذه المقالة على معلومات داعمة على الانترنت في http://www.pnas.org/lookup/suppl/doi...DCSupplemental.

المراجع

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #4  
قديم 11-23-2015, 10:12 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي السرطان والتشوهات الكلوي في أقارب المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل

 

http://ndt.oxfordjournals.org/content/15/12/1977.full




الخلفية. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب وراثي جسمي مقهور مع خمسة مواضع التعرف عليهم حتى الآن. الطيف من الأمراض تشمل تشوهات متنوعة في الكلى والمسالك البولية السفلي. الإصابة BBS حوالي 1/100 000 مع تردد متغايرة المتوقعة لل1/160، وقد اقترح أن الزيجوت هي في زيادة خطر الإصابة بالسمنة وارتفاع ضغط الدم.
طرق. وصفنا المرض الكلوي في أقارب من 109 مريض في المملكة المتحدة BBS. باستخدام PCR مع الواسمات الوراثية الفلورسنت نحن تضخيم DNA المستمدة من أورام الكلى من الآباء المتضررين لتحديد ما إذا كان هناك فقدان تغاير في أي من أربعة مواضع BBS واثنين من مواضع الجينات الأخرى المرتبطة خلية واضحة سرطان الخلايا الكلوية (CC-RCC).
النتائج. تم تشخيص CC-RCC في ثلاث من 180 الآباء BBS، وكان هناك فقدان تغاير في BBS1 (11q13) في أنسجة الورم واحد من هذه المواضيع. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك تم تحديد وجود نسبة عالية من عدم تخلق الكلوي في الأشقاء المرضى BBS وعائلتين BBS مع الإرث المهيمن على ما يبدو من تشوهات الكلى. في عائلة واحدة كنا قادرين على إثبات أن تشوهات الكلى فصلت مع موضع BBS2 (16q21).
الاستنتاجات. وبما أن جميع الآباء والأمهات وثلثي الأشقاء المرضى BBS يجب أن يكون متخالف للطفرات BBS، ملاحظاتنا قد تورط الجينات BBS في التسبب في كلا سرطان الكلى والتشوهات، سواء اضطرابات في نمو الخلايا السلائف والتمايز. نقترح قد يكون هذه الملاحظات آثار هامة لفحص ناقلات BBS المحتملة لأمراض الكلى، وقد تؤدي إلى فهم أفضل للعوامل المسببة لأمراض الكلى في عموم السكان.
الكلمات الدالة

مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) (MIM 209900) هو شرط مقهورة مع طائفة واسعة من المظاهر السريرية. المظاهر الأساسية في متماثل الأفراد (المتضررين) تشمل، ضمور قضيب / مخروط، والسمنة، polydactyly، قصور الغدد التناسلية، وصعوبات التعلم وعيوب الكلى [1، 2]. وتشمل الميزات طفيفة داء السكري، تليف كبدي، عجز الكلام، بتشوهات في الأسنان والسلوك المغاير. يتم التشخيص من خلال وجود أربعة معايير رئيسية [3].
وقد وصفت تشوهات الكلى في ما يصل الى 100٪ من المرضى BBS [2]، والفشل الكلوي هو السبب الرئيسي للمرض والوفاة المبكرة في BBS [2]. وقد تم الإبلاغ عن خلل التنسج، التهاب كبيبات الكلى المزمن، ومرض أنبوبي الكيسي، وكأسي وانخفاض تشوهات المسالك البولية، وعيوب أنبوبي التركيز قدرة [4].
BBS هو مرض غير متجانسة وراثيا مع مواضع التي أمكن التعرف عليها حتى الآن على 11q13 (BBS1)، 16q21 (BBS2)، 3p13 (BBS3)، و15q23 (BBS4)، كل منها مرتبط مع النمط الظاهري مماثلة في الدراسات حتى الآن [+5 - +8]. مؤخرا جدا، تم تعيينها موضعا الخامس ل2q31 (BBS5) في عائلة نيوفاوندلاند واحدة [9].
في العديد من الحالات المتنحية، وقد لوحظت مظاهر المرض جزئية في ناقلات متغايرة. ناقلة للترنح توسع الشعريات عرضة لخطر متزايد للإصابة بسرطان الثدي [10]، وحملة راثي متنحي من نوع متلازمة آلبورت قد يكون البيلة الدموية "حميدة" [11]. وقد اقترحت الآثار الناقل في الأسر BBS مع زيادة في حدوث السمنة، وارتفاع ضغط الدم ومرض السكري [12، 13]. أكملنا دراسة سريرية 109 مريض BBS وأقاربهم الذين يعيشون في المملكة المتحدة [14]، ولاحظ ارتفاع معدل انتشار واضح خلية سرطان الكلى الخلية (CC-RCC) وتشوهات الكلى بين الأقارب تتأثر. نحن الآن وصف عدة حالات واثنان من الأنساب من تشوهات الكلى وتقديم نتائج بحث عن فقدان الأليل في BBS المكاني في ثلاث الآباء الناقل تلزم الذي طور CC-RCC. نقترح أن الأفراد متخالف للطفرات BBS معرضون لخطر متزايد من هذه الاضطرابات. ملاحظاتنا آثار لفهم التسبب في اضطرابات النمو الكلى والتمايز، ولها آثار العملية تنطوي على أهمية لفحص أقارب BBS.

المواد والأساليب

المواضيع

وأجريت مقابلات مع أفراد BBS وأقارب من الدرجة الأولى من خلال الاستبيان من خلال قاعدة بيانات غي مستشفى بارديه-بيدل وقائمة أعضاء لورانس-مون بارديه-بيدل المجتمع "، وقد ذكرت في مخطوطة منفصلة [14]. وتشكل هذه الدراسة أكبر استطلاع واحد من الذين يعيشون المرضى BBS. تناول الاستبيان معرفة مسبقة من التاريخ الطبي للعائلة كبيرة. وقد سعى الملاحظات الطبية، مع موافقة المرضى، للتحقق من التشخيص والعلاج وأمراض الكلى. في حالات التشوهات ذكرت الكلى، والتقارير الإشعاعية والتصوير بالموجات فوق الصوتية وpyelograms تم الحصول عليها عن طريق الوريد. ومع ذلك، تم إجراء أي التصوير بالموجات فوق الصوتية الكلوي المنتظم على أقارب probands BBS. تم إرسال مائة وخمسة وعشرين probands من 105 أسرة الاستبيانات مع رسالة تفسيرية دعوة المشاركة، وعاد منهم 111 الانتهاء. لم المرضى اثنين فقط لا تفي معايير الاشتمال. حيث شوهدت المناسب والمرضى وأقاربهم في العيادة أو في المنزل، أو تم الاتصال به هاتفيا للحصول على مزيد من التفاصيل. أجريت جميع التحاليل النسيجية من قبل الأطباء الكلى.
استخراج الحمض النووي

كنا استراتيجيتين الجزيئية للتحقيق في قبائل وأفراد مختارين. أولا، سعينا دليل على فقدان تغاير في ثلاث عينات الورم في BBS1-4 (مواضع المعروف أن تترافق مع BBS في وقت هذه الدراسة)، وهيبل لينداو فون (VHL) و3p14 المنطقة (المنطقتين المرتبطة العائلية RCC). تم استخراج DNA من كتل جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين الكلى طبيعية وورم كلوي. بعد الدقيقة تشريح للأقسام 20 ميكرون، وعثر على الحمض النووي من الورم والأنسجة الكلى طبيعية، وذلك باستخدام طريقة استخراج الفينول كلوروفورم. لفترة وجيزة، تم إلغاء مشمع-العينة في الزيلين لمدة 30 دقيقة ثم يغسل ممهى متتابعة في 100، 80، 50٪ من الإيثانول وأخيرا في الماء المقطر. ثم خضع العينة الهضم من خلال إعادة تعليق في تحلل العازلة (150 ملي كلوريد الصوديوم، و 25 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) مع بروتين K (10 ملغ / مل) و 10٪ SDS. وحضنت المزيج على 55 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. وقد تحقق تنقية، أولا عن طريق إضافة الفينول، كلوروفورم، isoamylalcohol (25: 24: 1) إلى الأنبوب ثم الطرد المركزي لبيليه. وطاف ثم إزالتها، وأضاف أن حجم مساو من كلوروفورم، isoamylalcohol (24: 1). بعد الطرد المركزي أخرى، يضاف 2.5 مجلدات من الايثانول البارد لتترسب في الحمض النووي. كان هذا ثم غسلها في 70٪ من الإيثانول ومعلق في TE جاهزة للاستخدام في PCR.
ثانيا، سعينا ربط الكلوي تشوه النمط الظاهري إلى BBS مواضع الأربعة التي تم الاعتراف بها في وقت الدراسة. لهذا، تم استخراج DNA من الكريات البيض في الدم الطرفية ومرمزة كما هو موضح سابقا [15].
الاشعال

واستخدمت خريطة Genethon المستمدة تسلسل التمهيدي كما وصفها Beales وآخرون. [15]. وكان الاشعال تصنيعه تجاريا (لايف تكنولوجيز شركة) وكان يسمى التمهيدي واحد من كل زوج في موقف 5 'مع phosphoramidite صبغ (FAM، HEX أو النظم البيولوجية TET التطبيقية). وأخيرا تم تنقيته كل التمهيدي باستخدام HPLC.
البلمرة سلسلة من ردود الفعل والكهربائي للهلام

تم تضخيم كل تسلسل الحمض النووي الهدف من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تتضمن الواسمات الوراثية fluorescently المسمى المرافقة مواضع معروفة. تم تضخيمه في حجم رد فعل 10 ميكرولتر تحتوي على 1 ميكرولتر PCR العازلة (× 10) (670 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 166 ملي NH: أربعون نانوجرام من الحمض النووي الجيني أو قسامة 1 ميكرولتر من الحمض النووي المستمدة من الورم (20 المخفف 1) 4 SO 4، 67 ملي MgCl 2، 1،7 ملغ / مل BSA)، 5 ملي من كل dNTP (dATP، dCTP، dGTP، dTTP)، 2 بمول من كل التمهيدي فلوري (LTI) و 0.6 U من بوليميريز طق (شركة PROMEGA) . تم تنفيذ PCR في أحد الحرارية cycler على PTC-100 (الوراثية البحوث الأجهزة المحدودة). وكانت ظروف التفاعل النموذجية على النحو التالي، تمسخ الأولي في 94 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم 24 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، درجات الحرارة الصلب 54-60 درجة مئوية لمدة 45 ق والإرشاد عند 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها مباراة نهائية تمديد 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تم تحسين عدد دورة لكل عينة DNA المشتقة من الأنسجة لتوليد قمم المنتجات المماثلة في تقرير من فقدان الأليل.
بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام

وقد تم جمع عينة (1 ميكرولتر) من الناتج PCR مع 2 ميكرولتر من غير المتأينة الفورماميد و 0.5 ميكرولتر من حجم علامة فلوري (GS500-طمرة، النظم البيولوجية التطبيقية). بعد 3 دقائق تمسخ في 94 ° C، تم تحميل العينة على هلام 6٪ بولي أكريلاميد تغيير طبيعة (Sequagel-6، تشخيص الوطني) في 1 × TBE العازلة. تم تشغيل الجل على الآلية DNA الفلورسنت جزء محلل (نموذج 373A، النظم البيولوجية التطبيقية) لمدة 5 ساعات في 35 W و 40 درجة مئوية. تم تعيين الأليلات الأحجام، ومرتفعات النسبية ومجالات القمم باستخدام GENESCAN وGENOTYPER البرمجيات (ABI).
نسب أليل وتحديد LOH

تم تحديد ارتفاع ذروة أعلى أليلين (إذا متخالف) في الاقتران عينات طبيعية والورم. في حالة واحدة (متماثل) الذروة، تم تحديد منطقة لعينات المزدوجة. تم احتساب نسبة الأليلات لكل عينة طبيعية وورم كما وصفها Cawkwell وآخرون. [16]. يتم التعبير عن النتائج في مجموعة 0،00-1،00، حيث نسبة 0.50 أو أقل تشير فقدان أليلية كبيرة. كان PCR المتكررة للمرة الثانية لاستبعاد القطع الأثرية.
الكشف عن الطفرات VHL

وقد سعى سلالة الجرثومية الطفرات الجينية VHL كما هو موضح سابقا [17]. باختصار، تم إجراء التحليل الجنوبي لأول مرة على DNA الدم للكشف عن الجينات الحذف، وأجريت ضفيرة واحدة التشكل تعدد الأشكال (SSCP) تحليل للكشف عن الطفرات داخل الجين. تم تنفيذ التسلسل المباشر في المنطقة الترميز كاملة لتوصيف طفرة في المرضى الذين يعانون من الفرقة التحول SSCP واستبعاد طفرة في تلك مع تحليل SSCP العادي. ويتوقع لهذه التحقيقات إلى تحديد الطفرات في 80٪ على الأقل من سلالة الجرثومية الطفرات VHL الجينات [17].
إحصائيات

حسبت خمسة وتسعين في فترات الثقة في المائة (CI) لالخطر النسبي للوضع CC-RCC. لمقارنة النسب، استخدمنا الاختبار الدقيق ذي الحدين أو χ 2 الاختبار. -values ​​P <اتخذت 0.05 لتكون كبيرة.

النتائج

السرطان

وكان ثلاثة من 180 الآباء، كل القوقازيين، الذين تتراوح أعمارهم بين 37 عاما (الأم 1، الذكور)، 52 سنة (الأم 2، الذكور) وأنثى عمرها 40 عاما (الأم 3) غدية الكلى، مع كل الأنسجة الخلية واضحة. كان الوالد 1 بدون أعراض، وتشخيص عن طريق الفحص بالموجات فوق الصوتية عندما طلب منه المشاركة في برنامج البحوث التي تنطوي على ابنته، الذي لديه BBS والمزمن الفشل الكلوي. كان هذا الأصل أيضا أدلة من تشوه، مع الكلى والحالب الوجهين. سرطان بلده مقطوعة تماما وانه لا يزال خالية من الأمراض بعد 3 سنوات استئصال الكلية (الشكل 1 ⇔). عند التشخيص، كان الوالد 2 أعراض، مع المرض المنتشر، وتوفي بعد فترة وجيزة. تم تشخيص سرطان في الأصل 3 خلال تقييم الإشعاعي للتبرع بالكلى المحتملين لها BBS ابنة، الذي كان الفشل الكلوي في نهاية المرحلة. هذه الأم على قيد الحياة وبصحة جيدة 3 سنوات بعد استئصال الكلية. كانت تعرف أيا من هؤلاء الآباء والأمهات لديهم ما يلي عوامل الخطر المعترف بها لسرطان الكلى على النحو الذي استعرضه VOGELZANG وستادلر [18]: غسيل الكلى المزمن، والسمنة، التدخين، ارتفاع ضغط الدم الشرياني، الاستروجين، والتعرض المهني للمعادن الثقيلة والمنتجات النفطية.
كانت نسبة الآباء الذين لديهم أورام الكلى 1.67٪ (3/180). خطر السكان عموما من CC-RCC يرتفع بشكل حاد بعد 55 سنة [19]، في حين أن خطر التراكمي لتطوير CC-RCC تحت 55 سنة من العمر في عموم السكان 1 في 1041 [19]. هؤلاء الآباء الثلاثة، الذين كانوا صغار السن نسبيا في وقت التشخيص من CC-RCC، لذلك، لديهم خطر متزايد من CC-RCC (P = 0.0007، ثنائية nomial الاختبار المحدد (على الوجهين)). استقراء من هذا، فإن خطر التراكمي النسبي للآباء الأطفال BBS تطوير CC-RCC تحت 55 سنة هو 17 مرات (95٪ CI = 3،6 حتي 49،9) أن من عامة السكان.
ومن المهم تحديد ما إذا كان أي من هؤلاء الآباء والأمهات كانوا يحملون طفرة سلالة الجرثومية في جين VHL، والتي قد تساهم في تطوير CC-RCC. تم العثور على احد الوالدين (الأم 2) أن يكون طفرة مغلطة متخالف في جين VHL (C470G، Pro86Arg) على الرغم من أنه لم يكن هناك أي التاريخ الطبي أو العائلة سابقة تشير إلى مثل هذا التشخيص، وكما هو معروف في هذه الحالة. ولكن، حتى إذا تمت إزالة هذه الأم من التحليل، لا تزال هناك زيادة كبيرة في مخاطر CC-RCC. وعند مقارنة هذه النسبة من 1.11٪ (2/180) مع RCC مع خطر التراكمي العام للسكان تطوير RCC تحت 55 سنة (1/1041)، ويصبح الخطر النسبي 11 أضعاف (P = 0.017، اختبار دقيق ذي الحدين (اثنين -sided)).
باستخدام PCR (كرر مرة واحدة)، ونحن تضخيم DNA الورم مع الواسمات الوراثية من BBS1-4 ومن 3P. وكانت خسارة كبيرة أليلية الحالية في اثنين من الآباء BBS (2 و 3) مع CC-RCC (الشكل 2 ⇔). أظهر الأم 2 LOH في D11S480 (BBS1) مع نسبة أليلية من 0.33 وعلى D3S1300 (3p14) مع نسبة 0.50. تم العثور على الوالد 3 أن يكون LOH كبير في D3S1263 (VHL) مع نسبة 0.27 (ولكن لا تحور سلالة الجرثومية من VHL وجدت). لم يتم العثور على الوالدين 1 أن يكون LOH كبير في BBS1-4 ومواضع VHL. وبالإضافة إلى ذلك، كما نقوم بكتابته الآباء 2 و 3 باستخدام 38 STRPs عشوائي متباعدة بشكل متساو عبر الجينوم (في المتوسط ​​واحد لكل ذراع الكروموسوم) (الجدول 1 ⇔) وموثقة لا LOH كبير.

تين. 1.
(A) الموجات فوق الصوتية فحص ابنته مع BBS والفشل الكلوي في نهاية المرحلة تظهر صغيرة والكلى التنسج. (B) الموجات فوق الصوتية والد المريض BBS (A) يصور الورم الكيسي الكلوي. (C، D) هي أقسام ملطخة haematoxylin وحمض الدوري شيف من استئصال الكلية في الكلى هو مبين في (B). (C، D) منخفضة على التوالي (× 20) وارتفاع (× 63) صور قوة طبيعية أنسجة الكلى بالقرب من الورم تصور الكبيبات والأنابيب القريبة. (E، F) صور منخفضة وعالية الطاقة من ورم مجاور تظهر الأنابيب واصطف مع الخلايا مع السيتوبلازم واضح: ينظر إلى أي الكبيبات العادية أو الأنابيب القريبة.


تين. 2.
تم العثور على خسائر كبيرة في تغاير في D11S480 BBS1 علامة (11q13) في الأصل 2، في D3S1300 (3p14) في الأصل (2) وD3S1263 (VHL المنطقة 3p25) في الأصل 3. تم الكشف لا LOH في أي مكان في الأم 1.


الجدول 1.
الواسمات الوراثية المستخدمة في الدراسة
التشوهات

من 109 المواضيع BBS، وكان خمسة من 123 الأشقاء غير المصابين (4.1٪) واحد أو أكثر التشوهات الخلقية الكلى. وكان اثنان (1.6٪) عدم تخلق الكلوي من جانب واحد، منهم واحد لديه تشوه معقد المسالك البولية الانفرادي تتألف من الازدواجية وureterocoele (الجدول 2 ⇔). وفقا لKiprov وآخرون. في مسح 9200 التشريح وقوع عدم تخلق الكلوي من جانب واحد في عموم السكان حوالي واحد في 1000 [20]. لذلك، وقوع غياب من جانب واحد تعمل أنسجة الكلى في 2/123 الأشقاء BBS يمثل زيادة بنسبة 20 أضعاف (P = 0.007). وبالإضافة إلى ذلك، كان ثلاثة (2.4٪) جزر مثاني حالبي وثلاثة (2.4٪) لديهم ازدواجية في الحالب والحوض. ومع ذلك، قد تكون هذه الحوادث تقع في تلك المعترف بها لعامة الناس [21، 22]. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من المثير للاهتمام أن نلاحظ أن هذه الأشقاء الخمسة، وكان جد واحد لاتكون الكلوي من جانب واحد، مع الكلى الانفرادي في الفشل الكلوي في نهاية المرحلة، وكان آخر الأصل (الأم 1 أعلاه) على الجهاز الكلوي مزدوج. وكانت هذه التقارير من تشوه الكلوي كل العرضية، وكان قد تم فحص لا الوالدين ولا الأشقاء بهدف مراقبة تشوهات الكلى. وبالإضافة إلى ذلك، سجلنا تاريخ بارز من تشوهات الكلى في اثنين من القبائل، الآن وصفا تفصيليا.

الجدول 2.
مجموعة من التشوهات الكلى ذكرت في 123 الأشقاء المرضى BBS
الأسرة A

والمستلفت تتميز في البداية من قبل رونج وآخرون. [23]، كان صبيا BBS البالغ من العمر 4-الذين لقوا حتفهم من الفشل الكلوي الثانوي إلى خلل التنسج الكلوي. توفي والده (الأم 2) من CC-RCC، ولكن لم يكن معروفا لديهم أي تشوه الكلوي وليس هناك تاريخ تشوه الكلوي في أسرته. والدة المستلفت هي صحية، ولكن لديها تاريخ عائلي قوي من تشوهات الكلى، والتي يبدو أنها ورثت بطريقة جسمية مهيمنة مع التعبير متغير (الشكل 3 ⇔). وتشمل هذه التشوهات مجموعات من عدم التخلق الكلوي وخلل التنسج الكلوي المقابل أو الازدواجية الجهاز الكلوي. الأم نفسها لديها بنية طبيعية الكلى وظيفة (المقررة من قبل الفحص بالموجات فوق الصوتية والكرياتينين البلازما). ومن المؤسف أن عينات من الحمض النووي أو المواد بعد الوفاة لم تكن متاحة من أي عضو من أعضاء الأم المشابهة كما فرضيتنا يمكن أن تدعم مزيدا من تبادل واحدة أو أكثر BBS الأليلات بين الأم وأقاربها مع تشوهات الكلى.

تين. 3.
الأسرة A. يوضح هذه النسب والميراث المهيمن اثنين من تشوهات الكلى. الازدواجية في الكلى والكلى المسالك وطرف واحد / لاتكون الكلوي الثنائي في عائلة الأم والمستلفت ل. لم يكن هناك تاريخ عائلي من تشوهات الكلى على الجانب الأبوي. ومع ذلك، فقد تم العثور على والد المستلفت لتحمل طفرة VHL سلالة الجرثومية.
الأسرة B

هذه العائلة (الشكل 4 ⇔) يتألف التوائم ثنائي الزيجوت مع BBS. اشتكى شقيقة يتأثر بهم من آلام الخاصرة اليسرى عندما كان مراهقا، ووجد أن ارتفاع ضغط الدم. على التحقيق، تم العثور على الكلى خلل التنسج صغير اليسار وفيما بعد إزالتها، وارتفاع ضغط الدم لها حل. وقالت انها أيضا جزر مثاني حالبي الى بلدها الكلية اليمنى، مع التهاب الحويضة والكلية المتكررة. ابنها الأصغر (الآن 2 سنة من العمر) كان التضيق الأبهري حرجة وتتطلب بضع الصمام في يوم 5. Antenatally، لوحظ ان لديه خلل التنسج multicystic يقم الكلى، والتي كانت غير وظيفية (أكد بعد الولادة عن طريق النظائر المشعة المسح الضوئي) وصورة المثانة micturating كشف الجزر المثاني الحالبي، في نظام المقابل. بعد ستة أشهر، قد الكلى multicystic ملتف حيث تم الإبلاغ عنها في غيرهم من الأفراد [24]. ووجد تحليل النمط الفرداني هذه الأسرة أن تكون متسقة مع الربط BBS2 (16q21)، الذي يحظى بدعم من جراء الاستبعاد من ثلاثة مواضع أخرى [15]. لتحديد حالة الناقل للأخت غير متأثر، والتنميط الجيني أيضا هي وعائلتها (الشكل 4 ⇔). انها، ابنها وابنة أخرى قد ورثت الجزء الكروموسوم نفسه، وهو من أصل الكبرى، الأب، كما أن تتقاسمها التوائم المتضررة. ويبدو أنها تحمل كل المنطقة التي تحتوي على الجين BBS2. ومع ذلك، فإن ابنة لديها بنية الكلى العادي على تصوير الحويضة الوريدي.

القسم السابق القسم التالي

تين. 4.
الأسرة B. هذه النسب مع اثنين من التوائم غير المتطابقة المتضررة (4.1 و 4.2) يتسق مع الربط BBS2 على 16q21 (استبعاد من BBS1، 2، 3 و 4). والنمط الفرداني في 4.1 يظهر الحدث إعادة التركيب بين D16S3034 وD16S408. يظهر مزيد من التحليل أختهم تتأثر (4.3) واثنين من أطفالها (4.7، 4.8) يحملون BBS2 الجينات المحتملة (بعد أن ورثت المرض grandpaternal يحمل كروموسوم). 4.7 لديها هيكل الكلى الطبيعية.

نقاش

خلية واضحة سرطان الخلايا الكلوية

حساب سرطان الكلى لمدة 2٪ من جميع حالات السرطان وعن 80-85٪ من الأورام الخبيثة الكلى [25]. وتشمل عوامل الخطر المعروفة لCC-RCC غسيل الكلى المزمن، والسمنة، التدخين، ارتفاع ضغط الدم الشرياني، الاستروجين، والتعرض المهني للمعادن الثقيلة والمنتجات النفطية [18]. يتم التعرف على العوامل الوراثية بشكل متزايد على أنها حاسمة في التسبب في العديد من الأورام، وخطر الإصابة CC-RCC يزيد على متوسط ​​1.6 أضعاف حيث هناك المتضررة من الدرجة الأولى النسبية [18].
الشكل الأكثر شيوعا من العائلي RCC خلية واضح هو مرض VHL، ولكن تم التعرف على عدم VHL المتغير خلية واضحة أيضا [26]. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا من تسع قبائل مع خلية واضحة غير VHL-الأسرية مجلس قيادة الثورة (HCRC) أن معظم المرضى تطوير RCC <50 سنة من العمر (EM، الملاحظات غير منشورة). الأساس الجزيئي للHCRC غير معروف ولكن هذا المرض لا أليلية مع مرض VHL أو العائلي حليمي سرطان الخلايا الكلوية [26؛ EM، الملاحظات غير منشورة] وأنه من الممكن أن BBS مواضع قد تكون متورطة في HCRC أو تمثل منخفضة انتفاذ خلية واضحة RCC قابلية أليل.
فيما يتعلق بالملاحظات رواية المحرز في هذه الدراسة، وهناك سؤالين رئيسيين للنظر فيها. أولا، هو وقوع غدية الكلى أعلى مما هو متوقع عن طريق الصدفة؟ ملاحظتنا من ثلاث حالات CC-RCC في كان 180 الآباء ذات دلالة إحصائية (P = 0.0007) مقارنة مع، التراكمي الخطر السكاني العام المرتبط بالعمر. حتى إذا أردنا إزالة الوالدين 2 على أساس أن الاستعداد له لمجلس قيادة الثورة وكان من المقرر بالكامل لنقل طفرة VHL وأنه لا يوجد أي مساهمة BBS، تبقى الملاحظات ذات دلالة إحصائية. وعلاوة على ذلك، فإن سن مبكرة نسبيا من التنمية من CC-RCC في هؤلاء الآباء والأمهات (37 و 40 و 52 عاما) لافت للنظر (CC-RCC تسود عادة في عقود 7-8TH الحياة [25])، ويشير إلى وجود المسببات المرضية الوراثية. حيث وصل سعر الناقل للBBS في المملكة المتحدة ما يقرب من 1 في 160، فإننا نتوقع أن يكون هناك نحو 350 000 ناقلات الجينات BBS (سكان المملكة المتحدة ~56 مليون دولار). وبناء على هذه الأرقام، 1 في 90 من شركات الطيران قد تكون في خطر لتطوير CC-RCC (3889 في المجموع). نسبة المبكر بداية RCC الذي يمكن أن يعزى إلى الزيجوت BBS قد يكون مرتفعا كما 6،9٪.
ثانيا، هناك أدلة الجزيئي لتوريط BBS مواضع في التسبب في هذه السرطانات؟ منذ BBS هو متلازمة المتنحية، كل من الوالدين هو متخالف لطفرة BBS. العديد من الاضطرابات الوقاية من الاصابة بالسرطان ناتجة عن ورم القامع تعطيل الجينات وفقدان البرية من نوع أليل (الكشف عن طريق تحليل LOH) غير متكررة في الورم. سيكون لدينا دليل على LOH كبير في موضع BBS في سرطان الكلى من الأم 2 تدعم الفرضية القائلة بأن الأليلات BBS متورطة في التسبب في RCC خلية واضح. على الرغم من أن الأم 2 زيارتها طفرة VHL سلالة الجرثومية، وLOH في BBS1 هو موح من تأثير المعدلة. واعتبر LOH أيضا في الأنسجة السرطانية الأم 2 لفي 3p14 (D3S1300)، وهي منطقة تورط سابقا في CC-RCC التنمية ولكن ليس على 3p25 (D3S1263 بالقرب من VHL). خرائط BBS3 إلى 3p13. ترتبط طفرات في جين سلالة الجرثومية VHL مع ارتفاع مخاطر من المبكر بداية وعديد المراكز CC-RCC وجسدية الطفرات الجينية VHL أو مثيلة وجدت في ما يصل إلى 70٪ من خطوط الخلايا CC-RCC والأورام الأولية [27]. ومع ذلك، VHL تثبيط الجين غير كاف لبدء CC-RCC وLOH في 3p12-P21 غير متكررة في CC-RCC مع وبدون تعطيل VHL الجينات [27]. الفاصل الزمني 3p12-P21 يحتوي على العديد من المناطق المرشحة CC-RCC TSG: 3p12 و3p21.3 الذي يتم حذف homozygously في خطوط خلايا الثدي وسرطان الرئة و3p14 الذي يحتوي على موقع FRA3B الهش [28] وهذا الجين FHIT [29]. ومن المثير للاهتمام أن D3S1300 (3p14) حذفت في الورم الأم 2، ولكن من غير الممكن معرفة مدى أهمية هذا التطور CC-RCC في هذه الحالة. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك ربما LOH في BBS4 في نفس الورم، إلا أن نسبة أليلية من 0.65 لن تبلغوا المستوى التقليدي للأهمية. على الرغم من أن المناطق ما يصاحب ذلك من LOH تم وصفها بشكل جيد في العديد من الأورام [30، 31]، وأهمية، والتفاعل بين، ومواضع مختلفة غير معروفة.
نستنتج أن LOH في BBS مواضع في CC-RCC في الزيجوت BBS من غير المرجح أن نشأت عن طريق الصدفة، والتحليل على نطاق كروموسوم عشوائي لم تكشف LOH على نطاق واسع (الجدول 1 ⇔). إذا ظيفة الجينات BBS كما ورم المكثفات، ثم يجب أن يكون أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل BBS في خطر متزايد من CC-RCC. لقد واجهنا حالة واحدة فقط من CC-RCC في المريض BBS (PLB، والمراقبة الشخصية) وذكرت حالة واحدة فقط في الأدب [32].
الفرضية البديلة قد يكون أن هناك تفاعلات روكبي بين BBS المكاني (والجينات التنموية الكلى ربما غيرها) بحيث فقدان أليل الطبيعي في مكان واحد أو أكثر يزيد من خطر CC-RCC. إذا كان الأمر كذلك، ثم الخطر النسبي لتطوير CC-RCC في كل الزيجوت وأصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل سيتوقف على وتيرة فقدان أليلية في موضع الثاني (interactor ل). النتيجة طفرة مغلطة VHL في الأصل 2، وكذلك LOH في علامة -associated VHL في الأصل 3 يتسق تماما مع هذه الفرضية. الآن أن الجينات BBS الخامس (2q31) تم تعيين [9]، سيكون من المثير للاهتمام أيضا لدراسة هذا الموضع في هذه الأورام.
تشوهات الكلى

مصطلح "تشوه الكلى" يصف الشذوذ المختلفة [33]. في عدم تخلق الكلوي الكلى غائب. وتشير "الكلى خلل التنسج" إلى أجهزة سيئة متباينة، والتي تحتوي على كثير من الأحيان الخراجات ('الكلى خلل التنسج multicystic'). وتشمل التشوهات التي تؤثر على المسالك البولية السفلي الازدواجية، جزر مثاني حالبي وureterocoele. كما تجدر الإشارة إلى أن الكلى خلل التنسج multicystic يمكن مطوي قبل أو بعد الولادة [24]، مدفوعا الخلايا الزائدة [33]، لإعطاء مظهر "عدم تخلق". قد تكون موروثة تشوهات الكلى الإنسان، إما في عزلة أو كجزء من متلازمات (على سبيل المثال عدم تخلق الكلوي وحاسة الشم لمبة تشوه في متلازمة كالمان [33]، وجزر مثاني حالبي مع ثلامات العصب البصري في هذه المتلازمة الكلوية-ثلامة [33]). الجينات المشفرة بواسطة BBS مواضع ربما يؤثر على نمو الخلايا السلائف والتمايز في الكلى الجنينية. لكن، وكما أمراض الكلى في المرضى الذين يعانون BBS يتراوح بين، وحتى داخل القبائل، جينات أخرى أو العوامل البيئية يجب أن تشارك في تحديد النمط الظاهري النهائي.
حالات التشوهات الكلى في عموم السكان هي عدم تخلق الكلوي من جانب واحد، 1/1000. من جانب واحد الكلى خلل التنسج multicystic، 1/5000. عدم تخلق الثنائية و / أو النمو الشاذ، 1 / ​​5000-10 000؛ جزر مثاني حالبي، 1/100. الحالب مزدوج من جانب واحد، 1/20 [20 - +22، 36]. لذلك، وقوع غياب من جانب واحد من نسيج الكلى تعمل في اثنين من الأشقاء 123 BBS يمثل زيادة بنسبة 20 أضعاف كبيرة. كما لا الفحص بالأشعة أو الموجات فوق الصوتية الرسمي للأقارب في هذه الدراسة وقعت، ومن المرجح أن تكون تحت تقدير هذه المخاطر. شاشة الموجات فوق الصوتية المنهجية لهؤلاء الأقارب هو مخطط لها ويمكن أن تكشف عن وجود نسبة أعلى بكثير من تشوهات الكلى. العثور ارتداد مثاني حالبي في 3/123 الأشقاء BBS المثير للاهتمام، ولكن ارتفاع نسبة هذا الاضطراب في عموم السكان يحول دون أي استنتاجات قاطعة فيما يتعلق BBS.
لدينا وصف عائلتين مع تشوهات الكلى على ما يبدو يورث هو فضول. في الأسرة A (الشكل 3 ⇔)، توفي والد المستلفت من CC-RCC لكن كان له تاريخ عائلي عادي خلاف ذلك، في حين أن والدته لا يوجد لديه تشوه الكلى نفسها، لكن لديه تاريخ عائلي قوي من تشوه الكلوي. الأم قد تمثل عدم انتفاذ-لاتكون الكلوي / عسر تصنع الجينات [35، 36]. عائلة B (الشكل 4 ⇔) يدل بوضوح على أن شريحة الكروموسومات من أصل الكبرى، الأب، التي تحتوي على BBS2 على 16q كان، شارك في رثته التوائم ثنائي الزيجوت المتضررة، أختهم تتأثر (مع ارتداد مثاني حالبي وخلل التنسج الكلوي)، ابنها الأصغر مع ملتف multicystic الكلى خلل التنسج وجزر مثاني حالبي، وابنتها التي تبدو طبيعيه الكلى. مرة أخرى، انتفاذ غير مكتملة قد تفسر السبب في أن ابنة لديها بنية الكلى العادي. ومع ذلك، فإن نمط الميراث أدلة دامغة لتشغيل الجينات التنموي الكلوي شيوعا في هذه العائلة. الاخوة التوأم في هذه العائلة لها نموذجي التركيبية الكلى (أي تفصص الجنين والخراجات كأسي) ولكن وظيفة الكلى طبيعية. فشلت دراسات الربط السابقة لتمييز أي اختلافات في أمراض الكلى في المرضى المتضررين من موضع [15، 37، 38].
الآثار المترتبة على الفحص الصحي

ويبدو أن ناقلات متخالف الجينات BBS لتكون في خطر متزايد من CC-RCC والمسالك البولية والتشوهات. إذا يمكن تأكيد هذه النتائج في مزيد من الأسر BBS، نقترح أن جميع الأقارب من الدرجة الأولى من حالات BBS ينبغي فرزها مع التصوير بالموجات فوق الصوتية للغامض تشوهات الجهاز الكلوي، لأن هذه قد تترافق مع ارتفاع ضغط الدم أو الفشل الكلوي. وعلاوة على ذلك، فإن سرطان الكلى يجب أن تكون مستبعدة في جميع الآباء والأمهات المرضى BBS، لأن الاكتشاف المبكر والعلاج قد تؤدي إلى تحسين أحوال الطقس.

ملاحظة المضافة في الدليل

منذ قبول هذه الورقة، ونحن قد ذكرت رسم الخرائط لمكان جديد BBS (BBS6) والتعرف على الجينات وما شابه ذلك. تم العثور على طفرات حادة في MKKS (McKusick-كوفمان متلازمة) الجين على 20p12 في 40٪ من الأسر نيوفاوندلاند BBS. الآلية المقترحة من التعطيل من قبل الجمعية مثل chaperonin المشفرة تشير إلى أن misfolding من البروتينات الوليدة حاول التعمق في الكلى، وشبكية العين والأطراف برعم والدماغ تنمية يحدث [39].

شكر وتقدير

ونود أن نشكر الدكتور كاثرين لويس، والدكتور شيلا فيشر للحصول على الدعم الإحصائي، وملكة جمال آه مون كوان لحساب المعدل التراكمي للسرطان الكلى تصل إلى 54 عاما، والدكتور ستيوارت بلاكي لتوفير عينات المرضية، والدكتور روز دي بروين، للحصول على المشورة الإشعاعية و السيدة جنيفر اليسون للمساعدة في جمع العينات. وأيد PLB من قبل زمالة من مجلس الأبحاث الطبية وحاليا، ويلكوم ترست. مشروع بحث عمل جرانت (S / P / 8178) تدعم ASW. ونحن ممتنون للجمعية لورانس-مون بارديه-بيدل متلازمة لما قدموه من مساعدة والتشجيع وللمرضى وأقاربهم الذين شاركوا في هذه الدراسة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #5  
قديم 11-23-2015, 10:23 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي IFT27، ترميز مكون GTPase صغيرة من جزيئات IFT، وتحور في عائلة الأقارب الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/23/12/3307.full



IFT27، ترميز مكون GTPase صغيرة من جزيئات IFT، وتحور في عائلة الأقارب الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل

+ الكاتب الانتماءات
  • 1 قسم الوراثة و
  • 2 قسم طب وجراحة العيون في مستشفى الملك فيصل التخصصي ومركز الأبحاث، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 3 قسم علم الوراثة و
  • قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية 4 من والكيمياء الحيوية، جامعة ييل، نيو هافن، CT، الولايات المتحدة الأمريكية
  • 5 السريرية في طب الأطفال، الأمير سلطان المدينة الطبية العسكرية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • قسم 6 لطب العيون، كلية الطب، جامعة الإمام محمد بن سعود الإسلامية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 7 قسم طب الأطفال، مستشفى الملك فهد المركزي بجازان، المملكة العربية السعودية
  • 8 السريرية لطب العيون، كلية الطب، جامعة الملك سعود، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • قسم 9 من التشريح وبيولوجيا الخلية، كلية الطب، جامعة الفيصل، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 10 قسم العيون، كلية الطب، جامعة الفيصل، الرياض، المملكة العربية السعودية،
  • قسم 11 من الوراثة الطبية، مستشفى الملك فهد العام، جدة، المملكة العربية السعودية و
  • 12 قسم أمراض كلى الأطفال، الأمير سلطان المدينة الطبية العسكرية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • ↵ * لمن ينبغي أن تعالج المراسلات على العنوان التالي: قسم العيون في مستشفى الملك فيصل التخصصي ومركز الأبحاث، الرياض، المملكة العربية السعودية. البريد الإلكتروني: falkuraya {في} kfshrc.edu.sa (FSA)؛ البريد الإلكتروني: zhaoxia.sun {في} yale.edu (ZS)
  • تلقى 26 نوفمبر 2013.
  • تلقى مراجعة 16 يناير 2014.
  • قبلت 27 يناير 2014.

ملخص

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي ciliopathy مقهورة مع إصابات أجهزة متعددة. حتى الآن، تم تحديد 18 جينات BBS والغالبية منهم من الضروري لوظيفة BBSome، وهو بروتين معقد تشارك في نقل البروتينات الغشاء من وإلى أهداب. بعد العيوب في الجينات المحددة ليست بقادرة على جميع الحالات BBS. تباين وراثي لهذا المرض يشكل تحديا كبيرا في تحديد الجينات BBS إضافية. في هذه الدراسة، ونحن إلى جانب علم الوراثة البشرية مع التحقق من صحة وظيفية في الزرد وIFT27 تحديدها على أنها رواية BBS الجين (BBS19). وهذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تورط لنقل intraflagellar (IFT) الجينات في التسبب في BBS، وتسليط الضوء على التعقيد الجيني لهذا المرض.

مقدمة

وهدب هو، عضية بغشاء القائم على أنيبيب أن يبرز من معظم الخلايا حقيقية النواة بعد الإنقسامية. في العقد الماضي، وتراكم أدلة تدعم الدور الحاسم من هذه العضية مصغرة بمثابة الهوائي إشارة للخلية حيوان فقاري، وقد تم ربط عيوب الهدبية إلى قائمة متزايدة من الأمراض التي تصيب الإنسان يشار إليها مجتمعة ب ciliopathies (1، 2).
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي واحدة من أفضل ciliopathies درس (3، 4). بل هو نادر وراثي جسمي اضطراب المتنحية التي تتميز إصابات أجهزة متعددة، بما في ذلك العين (نمط معين من تنكس الشبكية المعروفة باسم التهاب الشبكية الصباغي)، الطرف (polydactyly) والكلى (الكلى المتعدد الكيسات)، والتي يمكن تفسيرها عن عيوب الهدبية (2، 5). وتشمل المظاهر الرئيسية الأخرى السمنة، والإعاقة الذهنية ونقص الأعضاء التناسلية، على الرغم من ارتباطها ضعاف هدب أقل وضوحا (5). BBS غير المتجانسة وراثيا. حتى الآن، تم تحديد 18 جينات (3، +6 - +23).
وعلى الرغم من تحديد 18 جينات BBS، دليل يدعم وجود جينات BBS مجهولة (24). بحثنا السابق عن رواية جينات المرض BBS في 29 عائلة ولكن وجدت أنهم جميعا تؤوي الطفرات الجينية المعروفة (25، 26). في هذه الدراسة، ونحن نعرب تحليلنا لتسع عائلات جديدة. في واحدة من هذه الأسر، تم استبعاد جميع الجينات BBS المعروفة. أجرينا كذلك تسلسل كامل exome (WES) إلى جانب التحقق من صحة وظيفية في الزرد للبحث عن رواية BBS الجينات في هذه العائلة. بشكل غير متوقع، حددنا لنقل intraflagellar (IFT) الجينات، IFT27، ورواية BBS الجين (BBS19). IFT الجين يشفر مكونات الجزيئات IFT التي هي ضرورية لنشوء حيوي أهداب وصيانة (27 - 29). على الرغم من أن الجينات IFT ترتبط ارتباطا وثيقا مع وظائف الهدبية، عملنا هو أول من ربط الجين IFT إلى BBS.

النتائج

يحدد تحليل الطفرات الموجهة Autozygome الطفرات BBS سببية

اجتمع تسع عائلات متعددة غير موصوف سابقا التعريف السريري للBBS وكانوا مسجلين في هذه الدراسة. فإن الطبيعة الأقارب من جميع الأسر تسعة من الممكن استخدام autozygosity باعتباره معلما من الجين المرض المحتمل لأنه من المحتمل جدا أن الطفرات المسببة سوف يقيم في أليل الأجداد التي تم تقديمها ذاتي الأمشاج جنبا إلى جنب مع توضيح النمط الفرداني أجداده (30) . لذلك، استخدمنا autozygome المشتركة لكل عائلة لتوجيه تحليل تحور الجينات BBS كما هو موضح سابقا (25، 26). يسمح هذا النهج لنا للتعرف على طفرة السببية في ثمانية من أسر تسعة و، بما يتفق مع عملنا السابق، كان التباين الوراثي واضح. الجدول 1 يلخص النتائج السريرية والجزيئية في هذه الحالات.

الجدول 1.
ملخص النتائج السريرية والجزيئية في مجموعة الدراسة

التعرف على عائلة BBS مع رواية BBS الجينات

الأسرة BBS DG_7 هي عائلة سعودية الأقارب التي تتكون من الأصحاء الآباء ابن عم الأول وطفلين مع BBS فضلا عن ثلاثة أطفال أصحاء (الشكل 1). أقدم اثنين من الأشقاء المتضررة هو صبي يبلغ من العمر 15 عاما مع السمنة المرضية، إعاقة ذهنية خفيفة، polydactyly من جميع الأطراف، والفشل الكلوي الشريط الحدودي والتهاب الشبكية الصباغي. وبالإضافة إلى ذلك، لديه سحنة نموذجية، الكبد الدهني، نقص الشم، تأتب ونقص الأعضاء التناسلية. أخته البالغة من العمر 14 عاما هي مشابهة جدا في أن لديها السمنة المرضية (ق / ع تكميم المعدة)، polydactyly من ثلاثة أطراف، والفشل الكلوي في نهاية المرحلة تتطلب غسيل الكلى والتهاب الشبكية الصباغي (الشكل 1). لديها أيضا سحنة نموذجية، الكبد الدهني، نقص الشم وتأتب الشديد. وبالتالي، يتم تأكيد التشخيص من BBS الكلاسيكية على أسس سريرية. ويشارك autozygome من الأشقاء اثنين تتداخل مع اثنين من المعروف BBS مواضع: BBS7 وBBS12. ومع ذلك، تتابع على المستوى الجيني وRNA كشف أي المتغيرات، مما يدل على أن الرواية BBS الجينات قد تكون لهم علاقة في التسبب في المرض. التكميلية المواد، الجدول S1 يسرد الاشعال كدنا] تستخدم لاستبعاد الطفرات الربط في BBS7 وBBS12 التي قد يكون لها ضاعت على المستوى الجيني.

الشكل 1.
التعرف على عائلة BBS أن يعين موضعا الرواية. نسب الأسرة تبين طبيعة الأقارب وجود اثنين من الأطفال المتضررين (اللوحة العليا). وأظهرت الطرز الوراثية للطفرة IFT27 لكل عضو. صور الممثل polydactyly (اللوحة السفلى اليسرى) والتغيرات قاع (اللوحة السفلى اليمنى) (صورة قاع العين اليمنى تظهر الأوعية الشبكية الموهنة، شاحب القرص البصري، ضمور البقعي والتغيرات RPE منتشر) ترد. العائلة لم يوافق على عرض الصور في الوجه.

ويحدد كامل exome التسلسل طفرة جديدة في IFT27

من أجل التعرف على الطفرات المسببة في الأسرة BBS DG_7، وقد تابعت WES في المؤشر. فحص دقيق لجميع الجينات المعروفة BBS تحديد أي تغييرات المسببة للأمراض. نحن ثم يصفى مجموع 71 670 المتغيرات لتحديد الترميز متماثل / المتغيرات الربط (باستثناء التغييرات مرادفة) التي تكون موجودة داخل المشتركة autozygome من الأشقاء اثنين، ولكن تغيب في خادم Exome البديل و+357 السعودية في منزل exomes كما هو موضح سابقا (31، 32). هذا النهج القضاء على جميع ولكن متغير واحد في IFT27 [NM_006860.4. c.296G> A: ص (Cys99Tyr)] (الشكل 2). تم الحفظ جدا بقايا المتضررة، وتوقعت أن يكون البديل الإمراض التي كتبها في سيليكون وتحليل (PolyPhen 1.0، فرزت 0.0) (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، نفذنا النمذجة التماثل للهيكل IFT27 البشري باستخدام التركيب البلوري للمثلي كلاميدوموناس reinhardtii IFT27 كقالب (33). وأظهرت النتيجة أن الأحماض الأمينية C99 من IFT27 الإنسان يبدو أن تقع في قلب جزيء ويحتمل أن تشارك في استقرار التفاعلات إلى بقايا لوي الحفظ جدا قريب (الشكل 3 A). ان الطفرة C99Y يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير سلسلة جانبية (السيستئين إلى صور) الذي قد يؤدي إلى اشتباكات الفراغية مع سلاسل الجانب يسين الحفظ (الشكل 3 B)، يحتمل أن تسبب زعزعة الاستقرار في بنية البروتين.

الرقم 2.
WES يحدد IFT27 كما رواية BBS مكان. وتظهر اللوحة العليا سير العمل لتصفية متكررة من المتغيرات WES. لاحظ أن المتغير الوحيد الذي يبقى بعد التصفية هو البديل في IFT27، ويتم عرض اللوني تسلسله جنبا إلى جنب مع الضابطة للمقارنة. تظهر لوحة المتوسطة كرتون من بنية البروتين. وتظهر اللوحة السفلى محاذاة متعددة الأنواع لتسليط الضوء على الحفظ قوي من بقايا المتضررة.


الرقم 3.
3D تقديم تناظر غرار IFT27 هيكل. يقع C99 في قلب جزيء ويحتمل أن تشارك في استقرار التفاعلات إلى الحفظ جدا المخلفات لوي قريب (A). ان الطفرة C99Y يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير سلسلة جانبية (السيستئين إلى صور) الذي قد يؤدي إلى اشتباكات الفراغية مع سلاسل الجانب يسين الحفظ (B)، يحتمل أن تسبب زعزعة الاستقرار في بنية البروتين.

IFT27 C99Y هو الأليل الخسارة من وظيفة

تقديم أدلة قاطعة على أن C99Y هو أليل الإمراض، ونحن استغلال نموذجا الزرد أن نشرنا سابقا (34). يتم حفظها عاليا البروتين Ift27 الزرد مع نظيرتها الإنسان مع 54٪ مخلفات متطابقة. الأهم من ذلك، هو يحفظ بقايا C99 في الإنسان (C100 في الزرد) أيضا (الشكل 2). وبالتالي فإننا شيدت متجه التعبير عن ift27 C100Y الزرد. الأجنة الزرد شارك حقن مع morpholino بنسبة ضئيلة المنشأة ضد ift27 والسيطرة EGFP مرنا عرض الظواهر ciliopathy نموذجية. على وجه التحديد، أظهر 58.3٪ morphants (الحيوان ضربة قاضية الناتجة عن morpholino حقن) وجود عيوب تجانب، 52.3٪ مع بطني انحناء الجسم و 36.1٪ مع الكلى الكيسي (الشكل 4). وتمشيا مع السابق الدراسة، وشارك في حقن ift27-EGFP مرنا انقاذ morphants بشكل ملحوظ، مع 18.9٪ من الأجنة المحقونة تظهر العيوب تجانب، 15.5٪ مع انحناء و 13.3٪ مع الكلى الكيسي (الشكل 5). في المقابل، فشل شارك في حقن ift27C100Y-EGFP مرنا لإنقاذ أي من الظواهر. تظهر جنبا إلى جنب، وهذه النتائج أن هذا الأليل مع انخفاض شديد النشاط، إن لم يكن الخسارة من وظيفة أليل كاملة.

الرقم 4.
الظواهر من ift27 morphants. (A - C) تجانب كما يتضح من موقف القلب في 1 DPF. وتظهر الأجنة في وجهات النظر بطني. L: اليسار جانب. M: المتوسط؛ R: الجانبين الأيمن. (D) الجنين حقن مع morpholino السيطرة على ift27 مع قواعد متطابقة (C MO) في 3 DPF. (E) وهو morphant ift27 (ift27 MO) في 3 DPF. (F و G) نظرا الموسع من المناطق محاصر في D و E، على التوالي. الحمراء نقاط السهم إلى الكيس الكلى.


الرقم 5.
C100Y هو الأليل الخسارة من وظيفة. (A - C) الصور مجموعة من 4 DPF الأجنة شارك حقن مع ift27 MO وGFP مرنا (A، GFP)، ift27 MO وift27 GFP مرنا (B، ift27 GFP) وift27 MO وift27 C100Y GFP مرنا (C، C100Y GFP)؛ (D - F) الرسوم البيانية التي تبين مدى فعالية ift27 GFP أو ift27 C100Y GFP في إنقاذ العيوب تجانب (D، نسبة مشتركة من القلب المتوسطة والجانب الأيمن)، انحناء الجسم (E) والخراجات الكلى (F) لوحظ في ift27 morphants من ثلاث تجارب مستقلة. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. * P <0.05؛ ** P <0.01.

راقبنا التعبير عن النوع البري وC100Y Ift27 عن طريق التفتيش إشارات EGFP في الأجنة المحقونة، ولاحظت أن الأجنة المحقونة مع ift27C100Y-EGFP مرنا تظهر تخفيض إشارة GFP (الشكل 6 A). للتحقق من صحة هذه النتيجة، نحن حقن دفعتين مستقلة مرنا ترميز من النوع البري ومتحولة Ift27 إلى البرية من نوع الأجنة، استخراج البروتين وإجراء التحليل الغربي. وأظهرت النتائج أن مستوى البروتين الطافر وانخفاض كبير مقارنة مع النوع البري (الشكل 6 B)، مما يشير إلى أن البديل C100Y يقلل من استقرار Ift27، بما يتفق مع التنبؤ من 3D النمذجة.

الرقم 6.
يؤثر استبدال C100Y استقرار Ift27. (A) إشارة GFP في 7.5 ساعة الأجنة بعد الإخصاب حقنوا ift27 GFP (WT) أو ift27 C100Y GFP (C100Y) مرنا. (B) لطخة غربية تظهر مستوى Ift27-GFP (WT) أو Ift27 C100Y GFP (C100Y) في الجنين لست] كاملة. تم حقن الأجنة مع دفعتين مستقلة من mRNAs. واستخدمت تويولين كعنصر تحكم التحميل.

وقد تبين في وقت سابق ان في عدة نماذج BBS الزرد، والتشكل من حويصلة في كوبفر (KV)، وهي ضرورية الجهاز مهدبة لإقامة التماثل بين اليسار واليمين، ونقل إلى الوراء الأجسام الصباغية معيب (35، 36). للتحقيق في ما إذا كانت تشارك ift27 في هذه العمليات، ونحن التفتيش أولا KV التشكل في ift27 morphants وجدت لا يوجد فرق كبير (الشكل 7 A و B). درسنا كذلك النقل إلى الوراء الأجسام الصباغية بإخضاع morphants للعلاج الادرينالين. ومن المثير للاهتمام، تأخر الاستجابة جسيم ميلانيني التجميع بشكل كبير في ift27 morphants (الشكل 7 C و D)، مما يوحي بأن Ift27 قد تلعب دورا في نقل الحويصلة خارج أهداب.

الرقم 7.
ift27 هو الاستغناء عن KV التشكل ولكنه يشترك في النقل إلى الوراء الأجسام الصباغية استجابة لالادرينالين. (A) مورفولوجية KV. (B). التحليل الإحصائي لقطر KV في morphants التحكم (ن = 10) وift27 morphants (ن = 12). (C). الأجنة مع وبدون علاج ادرينالين تبين مورفولوجيا الخلايا الصباغية. (D) التحليل الإحصائي للزمن الاستجابة في ثواني للعلاج الادرينالين في السيطرة (ن = 10) وift27 morphants (ن = 13). شريط النطاق في A: 20 ميكرون. CMO: حقن الأجنة مع morpholino السيطرة مع قواعد متطابقة. MO، ift27 morphant. برنامج التحصين الموسع والعلاج الادرينالين. ** P = 0.0014.

نقاش

كشفت توصيف الكيمياء الحيوية المنوي من البروتينات المشفرة بواسطة الجينات BBS أن سبعة البروتينات BBS (المشفرة بواسطة BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكل نواة لمجمع بروتين، يدعى BBSome، أساسي للبروتينات غشاء الاتجار، مثل كما مستقبلات البروتين يقترن G-Somastatin مستقبلات 3، من وإلى أهداب (4، +37 - +39). بالإضافة إلى ذلك، Arl6، المشفرة بواسطة BBS3، مطلوب لاستهداف BBSomes إلى هدب (37)، وBBIP1، المشفرة بواسطة BBS18، هو مكون من BBSome ومطلوب لBBSome التجمع (20، 40). جنبا إلى جنب، وتشير هذه النتائج إلى أن عيب BBSome يمكن أن تكون الآلية الكامنة وتوحيد لBBS.
بشكل غير متوقع، في هذه الدراسة، حددنا IFT27 كما رواية BBS الجينات. IFT27 يشفر المكون من المجمع IFT-B اللازم لنقل تقدمي البروتينات الهدبية. على الرغم من البروتينات IFT هي من بين المجموعات الأولى وأفضل درس البروتينات التي تؤثر في وظائف الهدبية، والطفرات ذلك الإنسان حتى في الجينات IFT اقتصرت في عواقب المظهري لciliopathies الهيكل العظمي (41 - 48). هناك تفاعلات موثقة بين المجمعات IFT وBBSomes. في ايليجانس انواع معينة، والبروتينات BBS الجسور IFT-A والمجمعات B (49، 50). ربما الأكثر أهمية، في كلاميدوموناس، وBBSome هو شحنة من IFT (39). ومن المثير للاهتمام، ويظهر IFT27 البروتين العديد من المزايا الفريدة مقارنة مع البروتينات IFT أخرى. وهو GTPase الصغيرة التي تحمل شبها قويا لRab8 وRab11 (33)، وتشكل subcomplex مع IFT25 (51). وخلافا لمعظم البروتينات IFT، لا يتم الحفاظ على حد سواء IFT25 وIFT27 في C. ايليجانس والدروسوفيلاميلانوجاستر (52، 53)، مما يشير إلى دور أكثر تخصصا في IFT. وعلاوة على ذلك، IFT25، الشريك ملزم من IFT27، في حين يمكن الاستغناء عنها لتكون الأهداب، لتغطية تكاليف القنفذ الإشارات المناسبة (52)، تشبه بروتينات BBS متعددة (54). جنبا إلى جنب مع هذه النتائج، النتيجة في أن IFT27 تشارك في BBS يثير احتمال إثارة للاهتمام أن هذا GTPase صغير قد ربط البضائع BBSome إلى آلية IFT.
على الرغم من عدم التجانس الوراثي للBBS لم يقدر تماما، وتشير الأعمال السابقة أن أي رواية BBS الجين المرجح أن يفسر سوى نسبة صغيرة من المرضى (25). ويؤيد ذلك من قبل القليلة الماضية الجينات BBS وصف (BBS15 و ​​17 و 18) التي كانت تستند جميع على الأسر واحدة أو المرضى واحد في بعض الأحيان (10، 14، 20). وبالمثل، وتبين لنا أن واحدا فقط من تسع عائلات في هذه الدراسة يمكن تفسير الطفرات في IFT27. إذا جمعنا هذه المجموعة مع شركائنا سابقا فوج من 29 عائلة (25)، مساهمة IFT27 هو <3٪ في الأسر BBS السعودية. على الرغم من أن مساهمة IFT27 الطفرات إلى تجمع طفرة BBS في السكان الأباعد غير معروف، نشك في أنها سوف تكون صغيرة بالمثل، وتمشيا مع بعض الجينات BBS وصف مؤخرا أنه حتى الآن لم يتم تحديدها خارج الأسر الأصلية / الحالات التي كانوا تحديدها. ومع ذلك، وتحديد رواية نادرة الجينات BBS مهم حيث أنه يوفر معلومات مفيدة في أهداب البيولوجيا وciliopathies بشكل عام، والتسبب الجزيئي للBBS على وجه الخصوص.
وخلاصة القول، أن نحدد IFT27 كما رواية BBS جين المرض باستخدام الخرائط الموضعية، WES وتأكيد وظيفية في نموذج الزرد. وهذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تورط بروتين IFT في التسبب في BBS.

المواد والأساليب

بالكائن البشري

تم تشخيص المرضى الذين يعانون من BBS وفقا للمعايير المحددة التي تأخذ بعين الاعتبار عدد من المظاهر السريرية الكبرى والصغرى (5). تم تجنيد جميع المرضى وأفراد العائلة ذات الصلة باستخدام بروتوكول المعتمد IRB مع الموافقة المسبقة. تم جمع الدم الوريدي في أنابيب EDTA، وعند الاقتضاء، في PAXGene لاستخراج DNA و RNA، على التوالي.

Autozygome تحليل تقرير والجينات مرشح

وكان تقرير لمجموعة كاملة من فترات ذاتي الأمشاج للفرد (autozygome) أساسا كما هو موضح سابقا (30). لفترة وجيزة، تم إجراء التنميط الجيني الجينوم على نطاق على منصة اكسيوم باتباع إرشادات الشركة المصنعة. وأعقب ذلك تحديد أشواط من زيجوت متماثلة الألائل كبديل للautozygosity باستخدام برنامج autoSNPa (55). تم فحص قائمة 18 تعرف جينات المرض BBS عبر إحداثيات autozygome المشتركة الأفراد المتضررين لتحديد أي الجينات لتضخيم والتسلسل (56). متوفرة عند الطلب الاشعال PCR والظروف.

كامل exome التسلسل

تم تنفيذ القياسي تسلسل كامل exome باستخدام TruSeq Exome إثراء مجموعة (البورشيد) تليها إعداد مكتبة التسلسل البورشيد، مع إثراء للهدف المطلوب باستخدام بروتوكول إثراء البورشيد Exome. والتسلسل المكتبات استولت باستخدام IlluminaHiSeq 2000 التسلسل. ويقرأ تم تعيينها ضد UCSC hg19 من قبل التحالف. تم الكشف عن تعدد الأشكال وIndels التي كتبها SAMTOOLS.

في النمذجة سيليكون

وأجري النمذجة تناظر من IFT27 الإنسان من استخدام كل من المنمذج برنامج وخادم النمذجة الآلية I-TASSER، التي صنفت كأفضل الخادم في تقييم نقدي الأخير من تقنيات لبنية البروتين المسابقات النمذجة التنبؤ (+57 - 59). يتم النمذجة عن طريق المنمذج في الخطوات التالية. قبل النمذجة، ومحاذاة تسلسل IFT27 الإنسان مع أن من كلاميدوموناس reinhardtii IFT27، الذين الكريستال هيكل وقد تم تحديد (PDBID: 2YC2) (33). وفي وقت لاحق، وكانت متواليات الانحياز مدخلات المنمذج للنمذجة تناظر باستخدام البنية البلورية كلاميدوموناس IFT27 كقالب باستخدام وظيفة المدمج في لالمنمذج. هو ممنوح الثقة في النمذجة تناظر بنسبة (ط) درجة عالية من التماثل تسلسل بين الجزيئات الإنسان وكلاميدوموناس IFT27 (الهوية ~37٪ و~54٪ تشابه)، و (ثانيا) تشابه النماذج الناتجة تنتجها المنمذج وI -TASSER. النموذج الناتج هو موثوق بها وخاصة بالنسبة للمنطقة حول بقايا C99، التي تحيط بها بقايا لوي الحفظ جدا في IFT27 البروتينات.

تربية الزرد

واستمر الزرد وفقا لبروتوكولات القياسية (60). وقد تم الحصول على البيض من خلال التفريخ الطبيعي.

ضربة قاضية، وتحليل النمط الظاهري والإنقاذ التجارب في الزرد

A morpholino بنسبة ضئيلة المنشورة سابقا (5 'GGAGGTAATAGTGTGTGTCTACGTG 3') ضد الموقع الشروع متعدية ift27 (34 تم استخدام) لضربة قاضية للتعبير عن ift27. تم استخدام morpholino مع خمس قواعد mispaired (5 'GGA ج GTAATA ج TGT ج ز TGT TAC ج TG 3'، وحالات انخفاض ومسطرة) باعتباره morpholino السيطرة. تم الحصول على GFP بناء ift27 C100Y بواسطة الطفرات موقع الموجه بناء على البلازميد ift27 GFP (34). ift27 GFP أو تم تصنيعه ift27 C100Y GFP مرنا في المختبر باستخدام عدة mMESSAGE mMACHINE (AMBION، AM1340).
للمقايسة الإنقاذ، كان 150 خريج من ift27 GFP مرنا أو ift27 C100Y GFP مرنا شارك في حقن 2 نانوغرام من ift27 morpholino إلى الأجنة خلايا مرحلة واحدة. وقد لوحظت الأجنة لعيوب تجانب على أساس موقف القلب في 1 DPF (يوم بعد الإخصاب)، للانحناء الجسم على 2 إدارة الشرطة الاتحادية، والخراجات سليفة الكلوة في 3-4 DPF.
لتفقد مورفولوجية KV، وقد شنت الأجنة الحية في جميع أنحاء مرحلة 14 الجسيدة في 3٪ ميتيل، تصوير باستخدام تدخل الفرق النقيض المجهري، وتم قياس قطر في برنامج فوتوشوب. تم تأكيد فعالية morpholino عن طريق التفتيش نفس دفعة من الأجنة المحقونة للجسم انحناء النمط الظاهري في 1 DPF.
تم إجراء فحص النقل جسيم ميلانيني باستخدام بروتوكول نشرت سابقا (35) مع تعديلات طفيفة. على وجه التحديد، تعرضوا 2 DPF الأجنة إلى 3.75 م م الادرينالين في المتوسط ​​الجنين وتفتيشها تحت نطاق تشريح. تم تسجيلها في وقت والاستجابة لكل جنين.

استخراج البروتين والنشاف الغربي

تم deyolked الأجنة في برنامج تلفزيوني يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز (روش، REF11836170001) والمتجانس في تريس العازلة تحلل (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 150 م م كلوريد الصوديوم، 0.5٪ NP40، 0.1 م م DTT) يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز . تم التشويه والتحريف البروتينات في SDS عينة العازلة عند 100 درجة مئوية لمدة 7 دقائق وتطهيرها عن طريق الطرد المركزي في 12 000 ز لمدة 3 دقائق. لالنشاف الغربي، كانت تستخدم الماوس مكافحة GFP مفتش (روش) والفأر مكافحة تويولين (المسابر الجزيئية، A11126) في 1: 1000 كما الأجسام المضادة الأولية. تم استخدام الأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق الفجل الثانوية (جاكسون المناعية للبحوث) في 1: 2000. تعرض الأغشية لتعزيز الكشف عن معان كيميائي باستخدام الإضاءة الغربية بالإضافة إلى ECL مجموعة (بيركن، إلمر علوم الحياة).

التحليل الاحصائي

وقد تم الحصول على -values ​​P من خلال ر الطالب -test باستخدام Microsoft Excel.

المواد التكميلية


التمويل

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة دبي هارفارد للأبحاث الطبية التعاونية منحة بحثية (لFSA)، R01 DK092808 من المعهد الوطني للصحة ومنحة بحثية RSG-10-247-01-DDC من الجمعية الأمريكية للسرطان (لZS) و الأساسية الحيوان لمركز البحوث تكيس أمراض الكلى في جامعة ييل (DK090744).

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
إضافة رد

« الموضوع السابق | الموضوع التالي »

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك
BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة
الانتقال السريع

 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع |  المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية


الساعة الآن 05:39 AM.

الاتصال بنا - موقع أطفال الخليج ذوي الاحتياجات الخاصة - الأرشيف - الأعلى

Powered by vBulletin® Version 3.8.2
Copyright ©2000 - 2025, Jelsoft Enterprises Ltd

a.d - i.s.s.w