#1  
قديم 11-23-2015, 09:14 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بوساطة التفاعل جوهري البروتين البروتين وChaperonin بمساعدة الجمعية متسلسل من مستقر بارديه-بيدل متلازمة مجمع البروتين، وBBSome *

 

http://www.jbc.org/content/287/24/20625.full



الميزات عديد المظاهر من السمنة، وتنكس الشبكية، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الإدراك، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري وجدت في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) تجعل هذا الاضطراب اضطراب نموذجا هاما لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في الأمراض الإنسانية المشتركة. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 16 جينات BBS، سبعة منها (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) رمز للبروتينات التي تشكل مجمع المعروفة باسم BBSome. وظيفة BBSome ينطوي على نشوء حيوي الغشاء الهدبي. ثلاثة جينات BBS إضافية (BBS6، BBS10، وBBS12) لديها تناظر لكتابة II chaperonins والتفاعل مع CCT / البروتينات TRIC وBBS7 لتشكيل مجمع يطلق عليه مجمع BBS-chaperonin. مطلوب هذا المجمع لBBSome التجمع. ولا يعرف الكثير عن هذه العملية وتنظيم تشكيل BBSome. استخدمنا الطفرات نقطة والأليلات فارغة من البروتينات BBS لتعطيل تجميع BBSome مما يؤدي إلى تراكم BBSome سيطة التجمع. التي تميز BBSome سيطة التجمع، وتبين لنا أن المجمع BBS-chaperonin يلعب دورا في الاستقرار BBS7. يتفاعل مع BBS7 BBS2 ويصبح جزءا من التجمع BBS7-BBS2-BBS9 المتوسطة ويشار إلى أن مجمع الأساسية BBSome لأنها تشكل جوهر BBSome. وأضاف BBS1، BBS5، BBS8، وأخيرا BBS4 حتى النخاع BBSome لتشكيل BBSome كاملة.
مقدمة

المجمعات الجزيئات، بما في ذلك الريبوسوم، و26 S proteasome و، مجمع المسام النووي، ومجمعات النقل intraflagellar، هي المسؤولة عن وظائف أساسية، مما أدى إلى اهتمام واسع في توصيف والعملية التي يتم تجميعها (1، -، 6 ). تنص على تجميع البروتين المعقد والمهم، إذا تقدير كما ينبغي وفي الوسائل التي يمكن أن خلايا تنظيم وظيفة. وعلاوة على ذلك، يمكن فهم أفضل التجمع بروتين معقد توفير نظرة ثاقبة الأمراض غير المتجانسة وراثيا وmultigenic ويحتمل أن توفر وسيلة جديدة للتعديل الدوائي من وظيفة، مما يؤدي إلى تصاميم دواء جديد.
الميزات عديد المظاهر من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) 4 بما في ذلك السمنة، تنكس الشبكية، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الإدراك، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري جعل BBS باعتبارها نموذجا جذابا لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في الأمراض المشتركة (7، 8). حتى الآن، وقد تم تحديد 16 جينات BBS المسببة لل(9). سبعة من البروتينات BBS (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) وقد ثبت أن تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome (10). وظيفة BBSome ينطوي على نشوء حيوي الغشاء الهدبي من خلال Rab8 GTPase الصغيرة والبروتين التفاعل لها، Rabin8. وBBSome أيضا يتفاعل وراثيا مع مسار النقل intraflagellar لتنظيم نقل الإشارة الصوتية القنفذ (11). BBSome مفارز تحتوي على مجالات معروفة للتوسط تفاعلات البروتين البروتين. على وجه التحديد، BBS1، BBS2، BBS7، وBBS9 احتواء المجالات المروحة بيتا. BBS4 وBBS8 يحتوي على عدة tetratricopeptide تكرار المجالات. وBBS5 يحتوي على اثنين من المجالات تناظر pleckstrin. BBS3 / ARL6 (ADP-ribosylation مثل عامل 6) هو عضو في الفصيلة رأس من البروتينات ملزم GTP صغيرة ومطلوب من أجل توطين الهدبية من BBSome (12، -، 15). BBS6، BBS10، وBBS12 دينا نوع II تناظر chaperonin (16، -، 19). وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS6، BBS12، وBBS7 التفاعل مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل المجمع الذي سنشير فيما بعد باسم مجمع BBS-chaperonin. مجمع BBS-chaperonin يسهل BBSome التجمع (20). ولا يعرف سوى القليل عن عملية متسلسلة من تشكيل BBSome، وتنظيم هذه العملية، أو الانتقال من BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى BBSome. في الجسم الحي، وتوجد البروتينات BBSome بوفرة في مجمع BBSome بدلا من كونها في شكل فردي أو ضمن المجمعات الحرة أصغر (10)، مما يوحي بأن BBSome سيطة التجمع عابرة وقصيرة الأجل.
فهم عملية BBSome التجمع قد تساعد في تحديد المكونات الجزيئية الجديدة، والطفرات التي تسبب إما أو تعديل الظواهر BBS. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فهم عملية تشكيل BBSome قد توفر معلومات عن وظيفة فرعية فردية، وبالتالي توفير رؤى جديدة بشأن BBSome وظيفة. وعلاوة على ذلك، فإن توصيف BBSome التجمع توفر المقايسات خلية مقرها فعالة لتقييم الطفرات نقطة المحددة في المرضى. وأخيرا، فإن فهم عملية BBSome التجمع قد يؤدي إلى علاجات جديدة للالظواهر ذات الصلة BBS BBS و.
كنا مناهج متعددة لتحديد BBSome سيطة التجمع بما في ذلك إدخال طفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS إلى الفردية البروتينات BBS، والاستفادة من الفئران خروج المغلوب، واستخدام رني ضد الجينات BBS لعرقلة تشكيل BBSome. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن overexpressed مفارز BBSome المحددة التي أسفرت عن تجميع وتراكم سيطة BBSome متميزة. التي تميز هذه الوسيطة، علينا أن نبرهن على BBSome التجمع هو عملية أمر ينطوي على البروتينات مثل chaperonin BBS (BBS6، BBS10، وBBS12) والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين.

إجراءات تجريبية

للحصول على وصف مفصل لمواد وأساليب، انظر "المواد والأساليب". التكميلية
السكروز التدرج تجزئة

تعطلت الأنسجة التي كتبها TISSUEMISER (فيشر) في المخزن تحلل (1- PBS، 0.5٪ تريتون X-100 مع مثبطات الأنزيم البروتيني). تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 20 دقيقة. تم تحميل supernatants على التدرج السكروز 20-60٪. تم طرد التدرج في 100،000 × ز لمدة 14 ساعة باستخدام الدوار TH-660 الحرارية العلمية (أشفيل، NC). أخذت اثنين من كسور مائة ميكروليتر من أعلى وعجلت عن طريق الأسيتون البارد. وقد نسج عينات المترسبة في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة. حلت الكريات في SDS-PAGE عينة العازلة.

البروتيني حساسية الفحص

وهي lysed الخلايا العازلة في الفحص (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 م م بوكل، 10 م م CaCl 2، 10٪ الجلسرين). كمية متساوية من البروتينات كانت مختلطة مع 200 ميكروغرام / مل thermolysin في 4 درجة مئوية لمدة الأوقات المحددة، وردود الفعل أوقفهم إضافة EDTA لتحقيق تركيز النهائي من 10 م م.

النتائج

BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج ترناري الجمعية المتوسطة

وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS7، التي هي جزء لا يتجزأ من BBSome، يتفاعل مع مجمع BBS-chaperonin (20). حقيقة أن جميع مكونات المجمع BBS-chaperonin هي بروتينات نوع chaperonin باستثناء BBS7 تشير إلى أن BBS7 قد تكون بمثابة ركيزة للمجمع BBS-chaperonin وأن يستقر من قبل المجمع. كيف يجعل BBS7 الانتقال من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع BBSome غير معروف حاليا. لمعالجة هذه المسألة، ونحن استخدام العديد من الطرق التي تؤدي إلى تراكم متميزة BBSome سيطة التجمع. وتتلخص الطفرات نقطة المستخدمة في هذه الدراسة في تكميلية الشكل. S1. عندما كنا بإفراط BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة T211I في الخلايا 293T، متحولة BBS7 T211I لديه قدرة انخفضت إلى التفاعل مع مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع WT BBS7 على النحو الذي يحدده المشترك مناعي باستخدام FLAG الأجسام المضادة. ومع ذلك، مناعي من BBS7 T211I يسحب إلى أسفل أكثر نسبيا BBS2 من البروتينات الأخرى BBSome (على سبيل المثال، BBS1 أو BBS4) (الشكل 1 أ)، مشيرا إلى أن هناك تفاعل ثنائي بين BBS7 T211I وBBS2 التي المحاصرين (لا تشرع في الخطوة التالية في التجمع).

الشكل 1.
BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية BBSome. A، و transfected BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة (T211I) وWT BBS7 إلى خلايا 293T. وتم سحب كلا WT وBBS7 متحولة بنسبة الخرز FLAG. تم الكشف عن وجود غيرها من مفارز BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. B، غياب BBS2 يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS1، في حين أن فقدان BBS1 لا يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS2. C، الموسومة FLAG BBS5، BBS8 ، و transfected BBS9، وBBIP10 إلى خلايا 293T. تم immunoprecipitated البروتينات الموسومة (IP) من خلال حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز أخرى BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. D، كان يستخدم BBS9 رني لاسقاط الذاتية التعبير BBS9 في خط الخلية مستقرة التعبير عن FLAG-BBS2. وimmunoprecipitated وBBSome التي كتبها حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية.

لقد أوقفنا بجوار أسفل BBS2 لتحديد تأثير ذلك على BBSome التجمع. ضربة قاضية من BBS2 يقلل من جمعية BBS7 مع BBS1، في حين أن ضربة قاضية من BBS1 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2 (الشكل 1 B). هذا يدل على أن BBS2 وBBS7 قادرين على التواصل مع كل أخرى مستقلة من BBS1. ويتم الحصول على نتائج مماثلة تظهر التفاعل مستقر من BBS2 مع BBS7 مع الأنسجة من الفئران الطافرة التي تعبر عن شكل متحولة من BBS1 مع أرجينين لطفرة في الحمض الأميني ميثيونين 390 (Bbs1 M390) (الشكل 2 C). هذه النتيجة مزيد من يدعم فكرة أن BBS7 بربط BBS2 مستقل ملزمة لBBS1 والبروتينات BBSome أخرى. وانسجاما مع هذه النتيجة، BBS7 يتفاعل بقوة مع BBS2 وضعيفة مع BBS1 في المقايسات التفاعل البشرى (التكميلي الشكل S2 A).

الشكل 2.
أدرج BBS1 في BBSome قبل BBS4. A، البقع الغربية من لست] البروتين من WT وBbs1 M390R / M390R الفئران تبين أن غياب BBS1 لا يؤثر على الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين، في حين أن انخفاض مستويات البروتين BBS1 إلى حد كبير في عينات من Bbs1 الفئران M390R / M390R كما هو مبين بالسهم. ويعترف هذا الضد أيضا عدة فرق إضافية لا تغيير في كثافة بالمقارنة بين WT وBbs1 M390R / M390R الفئران، مشيرا إلى أن هذه العصابات هي غير محددة. B، تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs1 M390R الخصيتين يوضح أن معظم BBS4 يتم فصلها عن وsubcomplex تتكون من BBS2، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9. C، مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2 من البروتين لست] الخصيتين يدل على أن BBS4 يتم فصلها من subcomplex في غياب BBS1. هذه النتائج مشابهة لتلك التي تظهر من خلال تحليل الانحدار السكروز. D، مناعي المتبادل من الخلايا 293T transfected يوضح أن BBS4 التفكك من BBS1 M390R يرجع إلى انخفاض التفاعل بين BBS1 M390R وBBS4 مقارنة مع WT BBS1. E، رسم بياني للترتيب تسلسلي لل BBS1 وBBS4 إدماجها في BBSome.

المقبل، ونحن overexpressed BBS9 الموسومة FLAG في الخلايا 293T وتستخدم BBS9 لهدم مفارز BBSome الذاتية. مناعي من خارجيا أعرب النتائج BBS9 في مناعي كميات كبيرة من BBS2 وBBS7، في حين يتم سحب كميات صغيرة فقط من BBS1 وBBS4 أسفل في ظل هذه الظروف (الشكل 1 C). هذه النتيجة تشير إلى أن BBS9 يشكل مجمع الثلاثي مع BBS2 وBBS7. لمزيد من الدعم وجود مجمع الثلاثي BBS2-BBS7-BBS9، فإننا نهدم BBS9 التعبير باستخدام رني. ضربة قاضية من BBS9 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2، مشيرا إلى أن التفاعل BBS7 / BBS2 لا يتوقف على BBS9. ومع ذلك، ضربة قاضية لBBS9 يقلل إلى حد كبير من جمعية BBS1، BBS4، وBBS8 مع BBS2 (الشكل 1 D).
وانسجاما مع هذه النتيجة، تشير الدراسات إلى التفاعل البشرى أن BBS2 يتفاعل مباشرة مع BBS7 وBBS9، في حين BBS7 وBBS9 لا تتفاعل مباشرة، بل تتفاعل إلا في وجود من BBS2 (التكميلي الشكل S2 B). نشير إلى مجمع الثلاثي يتكون من BBS2-BBS7-BBS9 كما المجمع الأساسية BBSome لأن هذا المجمع يبدو أن العنصر المركزي اللازمة لتشكيل BBSome كاملة.

BBS1 وBBS4 هل الوحدات الصغرى الطرفية من BBSome

وأظهرت دراساتنا التفاعل البشرى أن BBS9 يتفاعل مباشرة مع عدة وحدات فرعية BBSome بما في ذلك BBS2، BBS1، BBS5، وBBS8، وإنشاء BBS9 كما سقالة المركزية للBBSome (10). لتحديد الترابط الذي يتم إدراج مفارز BBSome أخرى في BBSome، ونحن استخدام الأنسجة من BBS فئرانا معدلة وراثيا ولدت في المختبر لدينا (21، -، 24). أظهر النشاف الغربي من أنسجة الخصية (الذي يعبر عن كميات كبيرة من البروتينات BBS) أن الفئران Bbs1 M390R / M390R انخفضت مستويات البروتين BBS1، ولكن الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين مماثلة لمستويات WT (الشكل 2 A). ويكشف تحليل الانحدار السكروز أن BBS1 M390R طفرة الزميلة عادة مع جميع البروتينات BBSome، باستثناء BBS4 (الشكل 2 B). ونأت معظم BBS4 من BBSome في Bbs1 M390R / M390R الأنسجة الماوس متحولة. لتأكيد هذه النتيجة، ونحن immunoprecipitated وBBSome الذاتية من Bbs1 M390R / M390R فئرانا معدلة وراثيا باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2. كما هو متوقع، BBS1 مفقود من مجمع جنبا إلى جنب مع BBS4 (الشكل 2 C).
للتأكد من أن BBS1 M390R البروتين الطافر يؤثر BBS4 إدماجها في BBSome، شاركنا transfected. Myc على الموسومة BBS1 مع الموسومة FLAG مفارز BBSome إلى خلايا 293T. BBS1 M390R البروتين الطافر قد تقلص إلى حد كبير التفاعل مع BBS4 (الشكل 2 D)، ولكن التفاعلات الطبيعية مع BBS9 وBBS2. معا، وهذه البيانات تشير إلى أن يتم تضمينها BBS1 في BBSome قبل BBS4 (الشكل 2 E). باستخدام نهج مماثل، علينا أن نظهر أن فقدان BBS4 لا يؤثر على إدماج مفارز BBSome الأخرى (بما في ذلك BBS1) في BBSome (الشكل 3، A و B)، مشيرا إلى أن BBS4 هو الوحيدات الماضية لتضاف إلى BBSome (الشكل 3 C).

الشكل 3.
ومن المرجح BBS4 الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome A، تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs4 - / - الخصيتين لست] يدل على أن جميع مفارز BBSome أخرى لا تزال تشكل تعقيدا في غياب BBS4 B، مناعي باستخدام المضادة. BBS2 الضد من البروتين لست] الخصيتين إلى أن BBS4 هو الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome. C، رسم بياني يبين ترتيب تسلسلي للBBS مكونات إدماجها في BBSome.

لتحديد ما إذا كان غياب البروتينات BBS أخرى يسمح جزئي BBSome التجمع، ونحن ترسيتها التعبير عن BBS5 وBBS8 باستخدام رني في الخلايا RPE1. بينت النتائج أن مفارز BBSome أخرى لا تزال تتضمن في BBSome في غياب BBS5، وكذلك في غياب BBS8 (25)، مشيرا إلى أن مثل BBS1، BBS5 وBBS8 تدرج بشكل مستقل في BBSome. وتتفق هذه النتائج مع البيانات التفاعل البشرى تبين أن BBS1، BBS5، BBS8، وBBS2 التفاعل مباشرة مع BBS9 (10).

BBS4 بربط PCM1 ويموضع لالجسيم المركزي / محيط بالمريكز الأقمار الصناعية المستقلة للBBSome الوحدات الصغرى أخرى

حقيقة أن BBS4 من بين مفارز الأخيرة لإدراجها في BBSome يضعه في موقف طيب للتفاعل مع البروتينات غير BBSome بما في ذلك الشحنات BBSome. وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBSome تنتقل من السيتوبلازم إلى محيط بالمريكز الأقمار الصناعية ثم إلى أهداب. BBS4 يموضع لالجسيم المركزي / الأقمار الصناعية محيط بالمريكز ويتفاعل مع محطة C من PCM1 (10، 26). أهمية وظيفية لهذا التفاعل ليست واضحة. لتحديد ما إذا كان يتعين على التفاعل BBS4-PCM1 لتوطين الجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز من BBS4، تم WT-الموسومة GFP وشكلين متحولة من BBS4 (BBS4 G277E وBBS4 R295P) بشكل مستقل شارك transfected مع جزء C-محطة HA الموسومة من PCM1. كل من الطفرات نقطتين تعطلت تفاعل BBS4 مع PCM1 (الشكل 4 A). عندما transfected في الخلايا RPE1 الإنسان، سواء BBS4 G277E وBBS4 R295P تفقد القدرة على توطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز (الشكل 4 B). وتشير هذه البيانات إلى أن التفاعل BBS4 PCM1 مطلوب للBBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية.

الشكل (4).
مطلوب تدخل BBS4-PCM1 لBBSome لتوطين لالجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز. A، BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل التفاعل بين BBS4 ومحطة C من PCM1. BBS4 (WT أو المسوخ) وHA الموسومة PCM1 C محطة و transfected المشارك في الخلايا 293T، وأجريت شارك في مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد HA وGFP الموسومة GFP. B، BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل جسيم مركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية BBS4. أظهرت هو تلطيخ مناعي من GFP-BBS4 (WT والمسوخ) في الخلايا RPE1 transfected. γ-تويولين يستخدم (الأحمر) كعلامة centrosomal. C، و transfected الخلايا الأولية الكلى مع GFP-BBS4، وكانت الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل شارك في ملطخة γ تويولين. يمثل شريط 10 ميكرون.

لتحديد ما إذا كان يلزم BBSome سليمة لBBS4 لتوطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز، ونحن transfected خلايا الكلى مثقف من BBS خروج المغلوب الفئران مع GFP-BBS4. غياب BBS2، BBS6، أو BBS7 لا يؤثر BBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية (الشكل 4 C)، مشيرا إلى أن هذا التعريب هو سمة أصيلة من BBS4 مجانا (يحدث مستقلة عن BBSome). لمزيد من تميز التفاعلات BBS4، رسمناها المجال BBS4 التي تتفاعل مع PCM1 إلى N-380 محطة الأحماض الأمينية (التكميلي الشكل S3 A). الأحماض الأمينية N-المحطة 380 من BBS4 لا تحتوي على المجال الذي يربط مع BBIP10، وهو بروتين BBSome لا يتجزأ يربط المجمع من خلال BBS4 (27). وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن PCM1 يمكن أن تتفاعل مع BBIP10 فقط عندما BBS4 موجود (التكميلي الشكل S3 B).

BBS10 ينظم تفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / TRIC البروتينات لتشكيل مجمع BBS-Chaperonin

كما ذكر سابقا، وأظهرت الدراسات أن BBS7 تشكيل مجمع مع BBS6، BBS12، وCCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin (20). حقيقة أن BBS7 هو العنصر غير chaperonin الوحيد في مجمع BBS-chaperoinin تشير إلى أن BBS7 قد يكون الركيزة لBBS-chaperonin. وظيفة واحدة ممكنة من مجمع BBS-chaperonin هو استقرار BBS7. ويرتبط BBS10 مع هذا المجمع عند مستويات substoichiometric (أقل من نسبة 1: 1). وتشير هذه النتيجة إلى أن BBS10 ليس العنصر الهيكلي للمجمع BBS-chaperonin بل يلعب دورا في تنظيم تشكيل تعقيدا. للتحقيق في دور BBS10 في تشكيل معقد BBS-chaperonin، ونحن استخدام رني لاسقاط BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والتي هي بمثابة أداة ملائمة لمناعي للمجمع BBS-chaperonin. غياب BBS10 يقلل من تفاعل BBS6 مع TCPα وTCPβ، وهما CCT / البروتينات TRIC (الشكل 5 A). وعلاوة على ذلك، overexpression من BBS10 يعزز التفاعل بين BBS6 مع TCPα وTCPβ (الشكل 5 B). وتبين هذه النتائج أن BBS10 ينظم تشكيل مجمع BBS-chaperonin.

الشكل 5.
مطلوب BBS10 للتفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin. A، يستخدم BBS10 رني لاسقاط التعبير عن BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والذي تم استخدامه لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7 وCCT / البروتينات TRIC للكشف عن وجود هذه البروتينات في المجمع. B، overexpression من BBS10 يسهل جمعية BBS6 مع CCT / البروتينات TRIC. وقد شارك في transfected-FLAG-BBS10 مع ناقلات فارغة أو Myc على-BBS6، وكان يستخدم Myc على الأجسام المضادة لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7، TCPα، وTCPβ (وحدتين فرعيتين من البروتينات CCT / TRIC) للكشف عن هذه البروتينات في المجمع. IP، مناعي.

الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-Chaperonin يتم التنسيق مع BBSome كور تشكيل مجمع

لا يحتوي على شكل ناضج من BBSome BBS6، BBS12، أو CCT / البروتينات TRIC، مما يوحي يجب فصل هذه المكونات chaperonin من سيطة التجمع عند نقطة معينة. لتحديد متى يتم الافراج عن هذه المكونات من وسيطة التجمع، ونحن overexpressed FLAG الموسومة BBS6 في الخلايا 293T وimmunoprecipitated مع FLAG الأجسام المضادة. كما هو متوقع، مكونات معقدة BBS-chaperonin أخرى، فضلا عن BBS7 الذاتية وشارك immunoprecipitated جنبا إلى جنب مع BBS6 (الشكل 6 A). بالإضافة إلى ذلك، سحبت BBS6 أسفل بعض BBS2. ومع ذلك، فإن كمية BBS2 انزلوا كانت بالنسبة إلى BBS7 أقل من مبالغ BBS2 وجدت في BBSome (كما هو موضح من قبل إنزال BBSome مع BBS5). هذا يدل على أن التفاعل بين BBS2 مع BBS7 يقترن مع الافراج عن BBS6 وBBS12 من مجمع BBS-chaperonin (التكميلي الشكل. S4).

الشكل 6.
ويتم تنسيق الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-chaperonin مع تشكيل معقد BBSome الأساسية. وقد overexpressed A، FLAG-BBS6 في الخلايا 239T إلى سيطة فخ BBSome. نحن انزلوا BBS6 باستخدام الخرز FLAG والكشف عن مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية. وقد استخدم FLAG-BBS5 كعنصر تحكم إيجابية، وكان يستخدم FLAG-GFP كما سلبي السيطرة. B، وoverexpressed مفارز BBSome الفردية في الخلايا 293T، وكانت تستخدم لتحديد جمعيات معينة مع CCT / البروتينات TRIC. BBS7 وBBS2 فقط قادرين على التواصل مع CCT البروتينات / TRIC. وقد استخدم FLAG-VHL كعنصر تحكم إيجابية. استخدمت FLAG-GFP وFLAG-BBS3 والضوابط السلبية. IP، مناعي.

التالي درسنا الافراج عن البروتينات CCT / TRIC من وسيطة التجمع. نحن overexpressed كل الوحيدات BBSome في الخلايا 293T وتحديد ما إذا كان أي الوحيدات BBSome يمكن immunoprecipitate أن التحويلات النقدية المشروطة / البروتينات TRIC. أظهر BBS2 وBBS7 المنسدلة قوية من CCT / البروتينات TRIC. أظهر BBS9 المنسدلة أقل نسبيا من البروتينات TRIC CCT / مقارنة مع BBS2 وBBS7 (الشكل 6 B). هذه النتيجة تشير إلى أن إدماج BBS9 لتشكيل يقترن مجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن BBS2 / BBS7 من CCT البروتينات / TRIC.

استقرار BBS2 يعتمد على تفاعله مع البروتينات الأخرى

لقد أثبتنا أن BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية (الشكل 1). لتحديد أهمية هذا المجمع، درسنا مستوى البروتين من BBS2 في غياب BBS7 وBBS9، وكذلك في حالة عدم وجود مجمع BBS-chaperonin. غياب BBS7 يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين في أنسجة الخصيتين BBS2 من Bbs7 - / - الفئران. وعلاوة على ذلك، فإن غياب BBS6 (أحد مكونات المجمع BBS-chaperonin) في Bbs6 - / - نتائج الفئران أيضا إلى انخفاض كميات BBS2 (الشكل 7. A). لأننا لم يكن لديك Bbs10 الفئران خروج المغلوب، نحن نستخدم الخلايا الليفية الجلد من مريض البشري الذي هو متماثل لطفرة BBS10 المشتركة، c91fs95. ومن المتوقع أن تؤدي هذه الطفرة في الغياب التام للبروتين BBS10. في دراستنا، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الإنسان، وغياب BBS10 لا يؤثر على تشكيل أهداب (التكميلي الشكل S5)، على النقيض من التقرير السابق (28). ومع ذلك، فإن غياب BBS10 يخفض مستويات بروتين BBS2 (الشكل 7 أ) ويمنع تشكيل BBSome (التكميلي الشكل. S6).

الشكل 7.
وubiquitinated BBS2 والمتدهورة التي proteasome و. A، استقرار BBS2 يعتمد على مجمع الأساسية BBSome، فضلا عن مجمع BBS-chaperonin. البروتينات من BBS خروج المغلوب الأنسجة الماوس (الخصية) أو من تم فصل لست] الخلية SDS-PAGE رني المعالجة. كان يستخدم لمكافحة BBS2 الأجسام المضادة للكشف عن مستويات البروتين BBS2. B، BBS2 حساس لالبروتيني العلاج. أصيب الكلى مع اتش معربا عن FLAG-BBS2 - الخلايا الأولية من WT وBbs6 - /. كانت مختلطة كميات متساوية من البروتين الكلي مع البروتيني thermolysin في 4 درجات مئوية للمرة المشار إليه. مقارنة مع خلايا WT، BBS2 يحط أسرع في Bbs6 - / - الخلايا، مما يشير إلى أن BBS2 غير مستقر في ظل غياب BBS6 C، خلايا 293T وعولج FLAG-BBS2 الخلايا معربا عن مستقرة، مع MG132 proteasome والمانع. وimmunoprecipitated BBS2 (IP) من خلال حبات FLAG أو مكافحة BBS2 الأجسام المضادة، وتم الكشف عن BBS2 ubiquitinated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. D، HA-بتحول وكان transfected في الخلايا 293T، وimmunoprecipitated BBS2 الذاتية من قبل مكافحة BBS2 الأجسام المضادة. تم الكشف عن BBS2 Ubiquitinated من قبل مكافحة HA الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. E، تم علاج الخلايا 293T مع 50 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد (فروج) مع أو بدون 20 μ م proteasome والمانع MG132 أو MG115 لمدة 8 ساعات. تم الكشف عن BBS2 الذاتية في الخلية لست] بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS2.

وبعد ذلك، كنا رني في الخلايا RPE1 للحد بشكل فردي التعبير عن BBS9 (BBSome عنصر معقد الأساسية)، BBS12 وTCPβ (مكونات معقدة BBS-chaperonin). تخفيض كل من هذه البروتينات يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين BBS2. في المقابل، فإن عدم وجود البروتينات BBSome العادي BBS4 أو BBS1 (باستخدام أنسجة من Bbs4 - / - وBbs1 M390R فئرانا معدلة وراثيا، على التوالي) لا تؤثر على مستويات البروتين BBS2 (الشكل 7. A). وتشير هذه البيانات إلى أن استقرار BBS2، وهو مكون من مجمع الأساسية BBSome، يتطلب مجمع BBS-chaperonin، فضلا عن العنصرين الآخرين من مجمع الأساسية BBSome (BBS7 وBBS9). وبالمثل، فإن استقرار BBS7 يتطلب مجمع BBS-chaperonin، وكذلك المكونات الأخرى اثنين من مجمع الأساسية BBSome (BBS2 وBBS9) (التكميلي الشكل S7).
لتحديد كيفية BBS-chaperonin الاستقرار التأثيرات المعقدة البروتين BBS2، ونحن المصابة Bbs6 - / - خلايا الكلى وخلايا الكلى WT مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. تم استخدام نفس تعدد العدوى لتصيب WT وBbs6 - / - خلايا الكلى، وكميات متساوية من البروتينات استخدمت في التحليل. مستوى البروتين BBS2 أقل في Bbs6 - / - الخلايا من الخلايا في WT (الشكل 7. B، 0 ')، بما يتفق مع الاستنتاج أن المجمع BBS-chaperonin مطلوب للBBS2 الاستقرار البروتين. البروتين BBS2 المتبقية في Bbs6 - / - الخلايا أكثر حساسية لالبروتيني thermolysin العلاج. عمر النصف من BBS2 في Bbs6 - / - الخلايا يتم تقليل ~3 أضعاف (4 دقيقة في خلايا WT مقابل 12 دقيقة في Bbs6 - / - الخلايا) (الشكل 7. B). ويتم الحصول على نتائج مشابهة عندما وإعادة تقديم FLAG-BBS2 إلى Bbs7 - / - خلايا الكلى (التكميلي الشكل S7.). وتشير هذه البيانات إلى أن مجمع BBS-chaperonin وBBS7 تلعب دورا في استقرار BBS2.

واليوبيكويتين-proteasome والمسار تشارك في BBS2 تدهور

للتحقيق في الآلية التي تتحلل BBS2 في الخلايا، درسنا ما إذا كان ينطوي على مسار بتحول-proteasome وفي هذه العملية. وubiquitinated كلا BBS2 أعرب خارجيا وأعرب عن التطور الطبيعي عند تحول دون proteasome والتي MG132 (الشكل 7 C). علينا أن نبرهن أيضا أن BBS2 الذاتية وubiquitinated حتى من دون تثبيط proteasome وعندما كنا overexpressed HA-بتحول في الخلايا 293T (الشكل 7 D). أسفرت علاج الخلايا 293T مع تخليق البروتين المانع سيكلوهيكسيميد في انخفاض مستويات البروتين BBS2. وزاد انخفاض مستويات البروتين BBS2 في الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد عندما يتم التعامل مع الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد أيضا مع مثبطات proteasome وMG132 أو MG115 (الشكل 7 E). وتبين هذه النتائج أن BBS2 الحرة وubiquitinated وتدهورت قبل proteasome و.

BBSome الجمعية نموذج

واستنادا إلى البيانات الواردة أعلاه، نقترح نموذجا فيه أشكال BBSome في عملية متسلسلة أمر يساعده على حد سواء الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات BBSome، فضلا عن عدم BBSome-تشبه chaperonin البروتينات BBS (BBS6، BBS10 وBBS12) (الشكل 8). يتفاعل مجمع BBS-chaperonin مع BBS7 لتحقيق الاستقرار فيه. التحولات BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع الأساسية BBSome، وهو مجمع يتألف من BBS7-BBS2-BBS9. ويرافق تشكيل مجمع الأساسية BBSome عن طريق إزالة مجمع BBS-chaperonin. الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين تعزيز إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يضاف BBS4 لاستكمال BBSome، وهي خطوة تتطلب وجود BBS1. مطلوب مجمع BBS-chaperonin لاستقرار الفرد من BBS2 وBBS7 البروتينات قبل هذه البروتينات المشاركة مع BBS9 لتشكيل مجمع الأساسية BBSome.

الشكل 8.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وchaperonin بوساطة التجمع متتابعة من BBSome. المعروضة هي المخططات من النموذج الحالي من أجل BBSome التجمع. واستقرت BBS7 من قبل BBS-chaperonin معقدة (BBS6-BBS12-BBS7-CCT) ويجعل الانتقال إلى مجمع الأساسية BBSome (BBS7-BBS2-BBS9). يتطلب هذا التحول BBS10. والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين توجه إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يتطلب BBS4 BBS1 على أن تدرج في المجمع وغير الوحيدات مشاركة تضاف إلى المجمع.

نقاش

ارتفاع معدل انتشار السمنة، ومرض السكري، وتنكس الشبكية في عموم السكان يجعل دراسة BBS ذات الصلة سريريا تتجاوز تلك مع هذه المتلازمة نادرة نسبيا. في الواقع، وقد ارتبطت متغيرات جينية BBS مع كل من الطفولة وتعليم الكبار السمنة مشتركة في عدد السكان واحد على الأقل (29). وعلاوة على ذلك فهم الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية من BBS سوف توفر معلومات مفيدة تتعلق هذه الاضطرابات شيوعا. على الأقل مجموعة فرعية من وظائف فردية البروتينات BBS تعتمد على تشكيل BBSome، وهو مجمع متعدد فرعية مستقرة تتكون من BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، BBS9، وBBIP10، وهو بروتين الذي الطفرات لم يتم بعد المتورطين في المرض. وقد تركزت الدراسات السابقة وظيفة BBSome على تحديد البروتينات أو الشحنات التي تتفاعل مع BBSome (14، 15، 26، 30، -، 32). هنا، نحن نقترب من الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية من BBS من وجهة نظر الجمعية BBSome. دراستنا يربط مباشرة مجمع BBS-chaperonin (تتألف من BBS6، BBS12، BBS7، وCCT / البروتينات TRIC) إلى BBSome، مجمعين تم تحديدها من خلال تحليل الكيمياء الحيوية.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وChaperonin مثل دليل BBS البروتينات أمر الجمعية BBSome

بشكل عام، والتجمع بروتين كبير المعقد هو عملية أمرت، عادة ما تتطلب خطوات وسيطة متعددة (1، 3، 5).غالبا ما يكون من الصعب تحديد طبيعة وسيطة التجمع بسبب طبيعتها العابرة ونصف الحياة قصيرة. يمكن ترتيب تجميع محدد من مجمعات البروتين يحتمل أن تلعب دورا هاما في تحديد طبيعة الظواهر الناتجة عن الطفرات في مكونات المجمع. في بعض الحالات، يمكن أن تحور في بروتين واحد من مجمع يؤدي إلى تراكم من تجميع وسيطة أن يحافظ على وظيفة متبقية أو مكسب من وظيفة، في حين أن النظام المختلفة التكوين يمكن أن يؤدي إلى انعدام تام التجمع وخسارة كاملة وظيفة.
في هذه الدراسة، طبقنا النهج وموارد متعددة لتوصيف BBSome سيطة التجمع. الطفرات نقطة في بروتينات معينة BBS، والطفرات فارغة تفتقر تماما بعض البروتينات BBS، والتدخل RNA للحد من مستويات البروتين BBS، وكذلك overexpression من مفارز BBSome محددة تؤدي إلى تراكم الخلايا من التجمع سيطة متميزة. وأملت الجمعية من BBSome من قبل الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات وBBSome ويسترشد أيضا من البروتينات BBS مثل chaperonin-BBS6، BBS10، وBBS12. التحليل البنيوي يكشف أن BBS1، BBS2، BBS7، وBBS9 احتواء المجالات المروحة بيتا، BBS4 وBBS8 يحتوي على عدة tetratricopeptide تكرار المجالات، وBBS5 اثنين من المجالات تناظر pleckstrin. هذه المجالات التوسط عادة تفاعلات البروتين البروتين. وأظهرت البشرى المقايسات المشترك مناعي أن BBS7 يتفاعل مع BBS2 وأن BBS9 يتفاعل مع BBS1، BBS2، BBS5، وBBS8. وقد تبين BBS1 للتفاعل مع BBS2 وBBS4. عملية التجميع BBSome تعكس هذه التفاعلات البروتين البروتين. البروتينات BBS مثل chaperonin (BBS6، BBS10، وBBS12) ضرورية في بدء الخطوة الأولى لتشكيل BBSome من خلال تشكيل مجمع BBS-chaperonin لتحقيق الاستقرار BBS7.

BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج BBSome الأساسية مجمع

لدينا حددت الدراسة BBS2-BBS7-BBS9 بمثابة مجمع المتوسطة هاما في تجميع BBSome ناضجة. ويتم تنسيق تشكيل هذا المجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن مجمع BBS-chaperonin من BBS7. تظهر وظيفة واحدة من هذا المجمع BBS-chaperonin أن يكون لتحقيق الاستقرار BBS7 قبل ارتباطه BBS2 وBBS9. غياب BBS2، BBS7، BBS9، أو أي من مكونات معقدة BBS-chaperonin يقلل من مستويات BBS2 وBBS7، في حين أن غياب أو تحور BBS1 أو BBS4 له تأثير ضئيل على BBS2 وBBS7 الاستقرار البروتين. تتحلل BBS2 المجاني من مسار بتحول-proteasome و. يغاز بتحول لBBS2 غير معروف حاليا.
BBS11 / TRIM32 هو يغاز E3 لعدة بروتينات بما في ذلك الأكتين وdysbindin (33، 34). طفرة معينة من P130S في عائلة واحدة تسبب الظواهر BBS (35). ومن المثير للاهتمام أن يتكهن بأن يغاز E3 المفترض لBBS2 قد يكون BBS11 / TRIM32.

تنظيم BBSome وظيفة

هناك العديد من الآليات المحتملة التي يمكن أن تحدث في تنظيم وظيفة BBSome. أحد الاحتمالات هو أن يحدث التنظيم بعد تجميعها BBSome تماما، وحركة BBSome في المقصورة، وظيفية الخلوية (أي ينظم، أهداب). سواء كانت إيجابية (RAB8) والسلبية interactors (LZTFL1) BBSome وقد تم تحديد (10، 25). ومع ذلك، وتنظيم التجمع هو أيضا احتمال وارد. وبناء على دراستنا، فإن تنظيم التجمع الأرجح أن يحدث على مستوى تشكيل مجمع BBS-chaperonin، على مستوى تشكيل مجمع الأساسية BBSome، و / أو على مستوى الإفراج BBS6، BBS12، والبروتينات CCT / TRIC من BBS7. ومن المرجح BBS10 عنصر تنظيمي رئيسي للمجمع BBS-chaperonin.

أهمية الفسيولوجية والسريرية BBSome الوسطيات: دور للBBSome الوسطيات الجمعية في BBS النمط الظاهري التغير

في ظل ظروف طبيعية، يبدو أن هناك بركة مجانية محدودة من مفارز BBSome الفردية مع الغالبية العظمى من مفارز يجري في BBSome الأشكال المعقدة. ومع ذلك، BBSome سيطة التجمع مثل مجمع الأساسية BBSome قد تشكل في ظروف مثل تلك التي تحدث عند وجود خالية أو نقطة طفرات معينة في المرضى الذين يعانون BBS. الظواهر من BBS تتفاوت تفاوتا كبيرا بين العائلات المختلفة وحتى داخل أفراد من نفس العائلة (الأفراد بنفس طفرة معينة) (36، -، 38). وتشير هذه الملاحظات إمكانية المعدلات الوراثية. يمكن أن يحدث تعديل النمط الظاهري عندما متغير متخالف في جين واحد يؤثر على مظهر المظهري من الجين المسبب للمرض آخر. لأن بعض الطفرات قد يؤدي إلى تراكم التجمع مستقر وسيطة، وجود وسيطة قد يفسر بعض الاختلافات المظهرية لوحظ بين مختلف طفرات الجينات BBS. مثال واحد للاهتمام هو النمط الظاهري ارتفاع ضغط الدم الذي يتجلى في Bbs4 - / - الفئران، في حين Bbs2 - / - الفئران ليس لديها ارتفاع ضغط الدم (39، 40). وعلاوة على ذلك، كما تم الإبلاغ عن الاختلافات الفسيولوجية بين المرضى BBS البشرية التي تسببها طفرات في الجينات BBS متميزة (37). والآلية التي قد تحدث هذا يتطلب مزيدا من التحقيق.
توضيح من الطريقة التدريجية التي يتم تشكيل BBSome يوحي بإمكانية نوع معين أشكال خلية من BBSome. وبعبارة أخرى، فإن حقيقة أن بعض البروتينات BBSome (على سبيل المثال، BBS1، BBS5، وBBS8) تضاف بشكل مستقل لمجمع المتوسطة مستقر يسمح لاحتمال أن BBSome التجانس موجود وأن أشكال غير متجانسة من BBSome قد يكون الأدوار الوظيفية في أنسجة معينة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #2  
قديم 11-23-2015, 09:18 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome وغيابها في الفئران النتائج في بارديه-بيدل الظواهر متلازمة وتشوهات انتقائية في غشاء الاتجار البروتين

 

http://jcs.biologists.org/content/126/11/2372.full



بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو اضطراب عديد المظاهر ومتخالف وراثيا تسبب بشكل مستقل من قبل العديد من الجينات (BBS1-BBS17). سبعة البروتينات BBS الحفظ جدا (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome، التي تعمل في نشوء حيوي الغشاء الهدبي. BBS7 على حد سواء وحدة فرعية فريدة من BBSome ويعرض التفاعل المادي المباشر مع BBS الثاني معقد، مجمع chaperonin BBS. لفحص وظيفة في الجسم الحي من BBS7، ولدت لنا Bbs7 الفئران خروج المغلوب Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لغيرها من الجينات BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، والسمنة، ventriculomegaly والعقم عند الذكور تتميز الشاذ axonemes الحيوانات المنوية سوطي. باستخدام أنسجة من Bbs7 - / - الفئران، وتبين لنا أن BBS7 مطلوب لتشكيل BBSome، وأن BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. على الرغم من أن BBSome بمثابة مجمع معطف للبروتينات الغشاء الهدبي، غير مطلوب BBS7 لتوطين بروتينات الغشاء الهدبي polycystin-1، مستقبلات polycystin-2، أو الطعم المر، ولكن غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات إلى الغشاء الهدبي، مشيرا إلى أن BBS7 تشارك في توطين محددة بروتين الغشاء لأهداب.
مقدمة

أهداب هي الهياكل القائمة على أنيبيب التي تمتد من سطح الخلية لمعظم خلايا حقيقية النواة. أنها تحتوي على مكونات فريدة غشاء الخلية منفصلة عن الغشاء البلازمي، وتصنف على أنها إما أهداب متحركة أو الأساسي (immotile). أهداب تلعب دورا مهما أثناء التطور وعلم وظائف الأعضاء في أنسجة البالغين. عيوب أهداب تؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان ciliopathies يطلق التي تشمل dyskinesis الأساسي الهدبي، مرض الكلى المتعدد الكيسات، سحاف الكلية، جوبير syndome، متلازمة العليا-لوكن، متلازمة ميكل-جروبر، ORO-الوجه الرقمية متلازمة، متلازمة Alstrom، وBardet- متلازمة بيدل (BBS).
BBS هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، والتشوهات الكلى، والإعاقة ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك العيوب الثانوية بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم التعلم. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 17 جينات BBS أن يسبب اضطراب مستقل (عبد الستار وجليسون، 2011). على الرغم من أن الوظائف الخلوية من البروتينات BBS لا تزال غير مفهومة تماما، وقد كشفت الدراسات الوظيفية في الكائنات نموذج التي تشارك البروتينات BBS في وظائف الهدبية والنقل داخل الخلايا. في ايليجانس انواع معينة، يتم التعبير عن BBS الجينات في الخلايا العصبية المهدبة وتوطين للقاعدة الهدبية / المنطقة الانتقالية والمشاركة في IFT على طول الهدبية الخيط المحوري. bbs7 وbbs8 متحولة C. ايليجانس خطوط لها صبغة ملء العيوب، أهداب أقصر، وعيوب في النقل intraflagellar (IFT) (Blacque وآخرون، 2004). ضربة قاضية للتعبير عن BBS الجينات في نتائج الزرد في العيوب الحويصلة كوبفر، وفقدان أهداب سابقة لأوانها، وجسيم ميلانيني الوراء تأخير النقل (الين وآخرون، 2006). BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص انحطاط والسمنة الظواهر الشبكية ينظر في المرضى الذين يعانون BBS. وبالإضافة إلى ذلك، ذكر BBS فئرانا معدلة وراثيا تفتقر سياط الحيوانات المنوية (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛ Mykytyn وآخرون، 2004.؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). وتشير الدراسات البيوكيميائية أن سبعة من البروتينات BBS المعروفة (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) تشكيل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome (Nachury وآخرون، 2007). البروتينات BBS الأخرى بما في ذلك BBS6، BBS10، وBBS12 تشكل المجمع الذي ينظم BBSome التجمع (سيو وآخرون، 2010). واحدة من وظائف BBSome هو تعزيز أهداب نشوء حيوي الغشاء من خلال Rab8 GTPase الصغيرة وبمثابة مجمع معطف للاتجار الهدبية بروتين الغشاء (جين وآخرون، 2010.؛ Nachury وآخرون، 2007.).
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص معظم الظواهر BBS، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. على سبيل المثال، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران هي ارتفاع ضغط الدم، في حين Bbs2 - / - الفئران هي سوي ضغط الدم (رحموني وآخرون، 2008. Bbs3) - / - الفئران لها hydocephalus أكثر حدة وأقل بدينة من غيرها من الفئران BBS (تشانغ وآخرون، 2011). بما يتفق مع الدراسات الماوس، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر على حد سواء. وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011.؛. Kulaga وآخرون، 2004)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، الجينات BBS المختلفة قد تمتلك ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هي فريدة من نوعها من حيث أنه هو وحدة فرعية من BBSome ويتفاعل مباشرة مع جسديا مجمع chaperonin BBS. من أجل دراسة دور BBS7 في الجسم الحي، وتحديد ما إذا كان فقدان Bbs7 لديه أي الظواهر الفريدة المرتبطة بها، ولدت لنا Bbs7 بالضربة القاضية الفئران Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في آخر BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، وعدم من سياط الحيوانات المنوية، والسمنة، وventriculomegaly. علينا أن نبرهن على BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين وما هو مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. والجدير بالذكر، وتبين لنا أن BBSome غير مطلوب للعالمي توطين الهدبية بروتين الغشاء. ومع ذلك، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

النتائج

جيل من الفئران Bbs7 باطل

BBS7 هي فريدة من نوعها بين البروتينات BBS لأنه جزء لا يتجزأ من BBSome ومكون من مجمع chaperonin BBS. للتحقيق في وظيفة في الجسم الحي من الجين Bbs7، ولدت لنا Bbs7 الفئران بالضربة القاضية جين عن طريق استبدال اكسون 5 مع كاسيت بالنيوميسين. هذا يؤدي إلى انزياح الإطار مما أدى إلى Bbs7 أليل فارغة (المواد التكميلية الشكل S1A). تم التحقق من عدم وجود Bbs7 مرنا من خلال تحليل RT-PCR RNA باستخدام معزولة عن Bbs7 - / - الخصيتين الماوس مع الاشعال داخل اكسون 5 (المواد التكميلية الشكل S1B.). وأكد عدم وجود بروتين BBS7 قبل الغرب النشاف (المواد التكميلية الشكل S1C).
أدى التزاوج من الزيجوت Bbs7 +/- 26٪ في Bbs7 + / + الفئران، و 55٪ الفئران Bbs7 +/-، و 19٪ Bbs7 - / - الفئران (ن = 387؛ P <0.05). تردد انخفضت من Bbs7 - / - وقد لوحظ في ذرية أخرى فئرانا معدلة وراثيا BBS وتشير إلى أن بعض Bbs7 - / - الفئران توفي قبل الولادة أو فترة ما حول الولادة.

Bbs7 - / - الفئران تصبح بدينة، تفتقر الخراجات الكلى ولا تتطور polydactyly

Bbs7 - / - الفئران هي الضعفاء عند الولادة، تزن أقل من تتزاحم بهم في 3 أسابيع من العمر، وسمنة على مر الزمن. بعد الفطام، Bbs7 - / - الفئران تبدأ في كسب المزيد من الوزن من النوع البري الفئران بسبب زيادة الاستهلاك الغذائي. قبل 12 أسبوعا من العمر، Bbs7 - / - الفئران (ذكورا وإناثا) تزن أكثر بكثير من تتزاحم سيطرتها، والخلافات أصبحت أكبر في الحيوانات الأكبر سنا. قبل 7 أشهر، من النوع البري الفئران هي 28.7 ± 2.8 جم مقابل Bbs7 - / - 41.1 ± 3.25 غ (P <0.05).
على الرغم من شذوذ الكلوي وpolydactyly هي السمات الأساسية للالظواهر BBS في البشر، ونحن لم نلاحظ الكيسات الكلوية أو polydactyly من الأطراف الأمامية أو hindlimbs في فئرانا معدلة وراثيا Bbs7، مما يشير إلى اختلاف الأنواع أو الاختلافات عتبة بين الماوس والبشرية.

Bbs7 - / - الفئران تبدي تنكس الشبكية وventriculomegaly

التحليل النسيجي للBbs7 العمر 4-8 شهرا - / - تظاهر عيون انحطاط كبير من القطاعات الداخلية والخارجية للخلايا مستقبلة للضوء وطبقة النووية الخارجي (الشكل 1A، B.). وقد لوحظ Ventriculomegaly في البطينات الجانبية والثالث من الدماغ كما رأينا في أقسام الاكليلية من Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - الفئران (الشكل 1C-F.). نحن أيضا لوحظ تخفيف من القشرة المخية وانخفاض في حجم الحصين والجسم المخطط. لم يلاحظ أي تشوهات جسيمة في المخيخ في Bbs7 فئرانا معدلة وراثيا أو غيرها من فئرانا معدلة وراثيا BBS (المواد التكميلية الشكل S2).

تين. 1.
Bbs7 - / -. ملطخة E-عرض الفئران مبصرة فقدان الخلية وventriculomegaly (A، B) H & القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - (B) عيون تظهر فقدان مبصرة الداخلي وشرائح الخارجي فضلا عن انحطاط الطبقة النووية الخارجي. PC، خلايا مستقبلة للضوء. (C-F) محايد الحمراء الملطخة 60-100 ميكرون سميكة أقسام الدماغ الاكليلية من النوع البري (C، E) وBbs7 - / - الفئران (D، F) تظهر البطينات الجانبية الموسع (*)، والظهرية الموسع البطين الثالث (رأس السهم العلوي والسفلي)، وانخفاض المخطط الإحضار (S) وقرن آمون (H)، وترقق القشرة المخية (CC). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 1 مم (C-F).

Bbs7 - / - الفئران لديها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ

منذ BBS هو مرض له علاقة أهداب، درسنا أهداب متحركة وأهداب الابتدائي في Bbs7 - / - الفئران. درسنا أهداب متحركة من طبقة الخلايا البطانة العصبية المبطنة للالبطينين عن طريق تلطيخ أقسام الاكليلية من العمر 3 اشهر من النوع البري وBbs7 - / - أدمغة فئران مع-α تويولين الضد ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة لمكافحة الأسيتيل كعلامات أهداب . مقارنة مع الضوابط، Bbs7 - / - أظهرت الفئران عددا كبيرا من أهداب انخفاض خلية بطانية عصبية وأهداب المتبقية هي أقصر (الشكل 2A، B).

تين. 2.
Bbs7 - / - الفئران لها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ (A، B) كشفت تلطيخ مناعي من البطين الدماغ خلايا البطانة العصبية باستخدام المضادة للالأسيتيل α تويولين (الخضراء) ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة (أحمر) عدم وجود أهداب وأهداب قصيرة (السهم) في طبقة البطانة العصبية من Bbs7 - / - الفئران (A) مقارنة مع من النوع البري الضوابط (B). (C، D) تحليل TEM من المقطع الطولي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر القصير وانتفخ أهداب مع حويصلات في Bbs7 من العمر 3 اسابيع - / - الفئران (D) مقارنة مع عمرها 3 أسابيع تحكم من النوع البري (C). (E-G) تحليل TEM من المقطع العرضي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر هيكل axonemal غير طبيعي في Bbs7 - / - الفئران (F، G) مقارنة مع السيطرة البرية من نوع (E). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 0.2 ميكرون (C-G).

لمزيد من التحليل أهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ، أجرينا تحليل TEM من العمر 3 اسابيع من النوع البري وBbs7 - أدمغة الفئران - /. أهداب متحركة من Bbs7 - / - الدماغ طبقة البطانة العصبية لديها القصير، انتفخ أهداب مع حويصلات (الشكل 2C، D.) وتلك أهداب متحركة أيضا هياكل axonemal المعيبة (الشكل 2F، G.) بالمقارنة مع النوع البري الضوابط (الشكل. 2E). وتشير هذه الدراسات إلى أن غياب البروتين BBS7 يؤثر هياكل أهداب متحركة.
لدراسة أهداب الأساسي في الجسم الحي، ونحن ملطخة أقسام الأنسجة من الكلى والبنكرياس مع الأسيتيل α تويولين. لم نجد اختلافات في أرقام أهداب الأولية أو طول أهداب بين النوع البري وBbs7 - / - الفئران (المواد التكميلية الشكل S3.). كما شكلت أهداب الابتدائي وتظهر طبيعي في الخلايا المستزرعة الظهارية الكلى والخلايا الليفية الجنينية مثقف (MEF) المستمدة من Bbs7 - / - الفئران (. المواد التكميلية الشكل S3 والبيانات لا تظهر)، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية أن يكونوا قد يكون خفية العيوب الهيكلية، مثل التغييرات بعد التعديل في الأنابيب الدقيقة.

Bbs7 - / - الفئران يكون غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية

أثبتنا سابقا لعدم وجود الحيوانات المنوية الأسواط في Bbs1 M390R / M390R knockin، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛. Mykytyn وآخرون، 2004؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - كشفت الخصيتين ندرة الحيوانات المنوية سياط (الشكل 3A، B.). نحن صقلها على هذه الملاحظة عن طريق تلوين المناعي من أنسجة الخصيتين. في حين أن معظم الحيوانات المنوية من Bbs7 - / - الفئران تفتقر إلى ذيل سوطي، وبعض من الحيوانات المنوية لديهم سياط تالف. هذه الأسواط غير طبيعي في كثير من الأحيان تشكيل هيكل حلقة نوع (الشكل 3C-F). لدراسة هذه الآفة تالف في مزيد من التفاصيل، أجزاء من النوع البري وBbs7 - / - تم تحليل الخصيتين بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). الهياكل microtubular والألياف الكثيفة الخارجية المحيطة هيكل microtubular في قطعة الرئيسي غير منظمة إلى حد كبير في المسوخ (الشكل الجيل الثالث 3G، H). في بعض الأحيان لاحظنا العادية 9 + 2 الهياكل axonemal في Bbs7 - / - الفئران (8،8٪ مقابل 100٪ في البرية من نوع، P <0.01). في المقابل، فإن الهياكل axonemal من أهداب متحركة في القصبة الهوائية من Bbs7 - / - الفئران طبيعية إلى حد كبير عن طريق تحليل TEM (المواد التكميلية الشكل S4.).

تين. 3.
Bbs7 - / - الفئران لها غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية (A، B) H & E الملون القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - أظهرت (B) الأنابيب المنوية عدم وجود الحيوانات المنوية سياط. أظهر (C-F) مناعي تلطيخ الخصيتين سياط باستخدام المضادة للالأسيتيل-α تويولين تلطيخ عيوب في Bbs7 - / - الفئران. في كثير من الأحيان ولوحظ وجود نوع من عصابة هيكل أنيبيب في Bbs7 - / - الفئران. C و D الصور وانخفاض القوة، E و F هي صور عالية الطاقة. (G، H) تحليل TEM من المقطع العرضي البرية من نوع (G) وBbs7 - / - (H) الحيوانات المنوية سياط يكشف أن Bbs7 - / - سياط الحيوانات المنوية لا يكون نموذجي 9 + 2 axonemes، ولكن تظهر الهياكل أنيبيب غير منظمة (السهم) والألياف الكثيفة الخارجي (رأس السهم) المحيطة الهياكل microtubular. أشرطة النطاق: 100 ميكرون (A، B)؛ 50 ميكرون (C، D)؛ 20 </ emph> ميكرون (E، F)؛ 0.1 ميكرون (G، H).

مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome

منذ Bbs7 - / - الفئران لها الظواهر مماثلة لغيرها من BBSome الفئران فرعية خروج المغلوب وBBS7 هو وحدة فرعية من BBSome، ونحن التحقيق آثار خسارتها على تشكيل BBSome. والمثير للدهشة، وكانت مستويات البروتين BBS2 بشكل ملحوظ انخفضت في Bbs7 - / - الخصيتين لست] البروتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين. وبالمثل، فقد انخفضت مستويات البروتين BBS7 في Bbs2 - / - الخصيتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين (الشكل 4A.). لتحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى تدهور البروتين أو انخفضت النسخ، كنا نصف الكمية RT-PCR لتقييم Bbs2 وBbs7 مرنا مستويات التعبير. نحن لم تراع الفوارق التعبير عن Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الخصيتين أو الاختلافات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الخصيتين مقارنة مع الضوابط (الشكل 4B.). معا هذه النتائج تشير إلى أن BBS2 وBBS7 الخلافات مستوى البروتين تنتج عن الاختلافات في استقرار البروتين، والتي BBS2 وBBS7 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار.

تين. 4.
مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. (A) BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. أظهرت هي البقع الغربية من إجمالي لست] البروتين من النوع البري (WT)، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs7 - / - الخصيتين. ويظهر تحليل (B) RT-PCR أي تغييرات واضحة في مستويات Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الفئران ولا تغييرات في مستويات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الفئران. (C) وBBSome لا تشكل في BBS الخصيتين الماوس خروج المغلوب. أظهرت هي البقع الغربية من البروتينات الخصيتين immunoprecipitated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS1. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome أخرى مع الأجسام المضادة ضد مفارز BBSome الفردية. واستخدمت كميات متساوية من البروتين الأولي من الخصيتين lystaes للمناعي. (D) تحليل الانحدار السكروز من البروتين لست] الخصيتين تثبت أنه لا يوجد أشكال BBSome في غياب BBS7. (E) فقدان تشكيل BBSome في خلايا الكلى مثقف من BBS الفئران خروج المغلوب وBBS2 انقاذ BBSome تشكيل في Bbs2 - خلايا الكلى - /. أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من مختلف الفئران خروج المغلوب BBS المصابين اتش معربا عن FLAG-BBS2. وهي lysed الخلايا المصابة وتم سحب البروتينات أعرب بنسبة مكافحة FLAG الأجسام المضادة. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة الغربية. (F) FLAG-BBS7 (WT والمسوخ) كانت المشترك مع transfected BBS2 الموسومة MYC إلى خلايا 293T والتفاعل بين BBS7 وBBS2 كان يعاير من قبل المشارك مناعي وكميا بواسطة يماغيج. و transfected (G) FLAG-BBS7 (WT وH323R طفرة) في الخلايا 293T وتم سحب البروتينات transfected أسفل عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. تم تحديد وجود مفارز BBSome الذاتية من قبل، BBS2، BBS4 وBBS7 الأجسام المضادة BBS1 المضادة. وتم قياس كمية مبالغ BBS1، BBS2، BBS4 وBBS7 التي كتبها يماغيج.

ترابط BBS2 وBBS7 للاستقرار البروتين يتسق مع النتائج تبين أن BBS2 يتفاعل جسديا مع BBS7 ويشكل subcomplex (Nachury وآخرون، 2007). ومن المثير للاهتمام، BBS7 وBBS2 مشاركة ملفوف لفائف تناظر تسلسل المجال في المناطق الوسطى من (المواد التكميلية الشكل S5). لم يكن مطلوبا من BBS7 ملفوف لفائف مجال للربط إلى BBS2. بدلا من ذلك، يطلب من الأحماض الأمينية 200-C النهائي للBBS7 للربط إلى BBS2 (المواد التكميلية الشكل S5A). وبالمثل، المجال ملفوف لفائف من BBS2 غير مطلوب على الاطلاق للتفاعل مع BBS7، ولكن فقدان هذا المجال يقلل من التفاعل مع BBS7 (المواد التكميلية الشكل S5B). وعلاوة على ذلك، فإن حذف المنطقة ملفوف لفائف في BBS7 لا يعطل تفاعلها مع غيرها من الوحدات الفرعية BBSome الذاتية. البروتين BBS2 مع حذف المنطقة ملفوف لفائف يعطل التفاعل مع بعض مفارز BBSome الذاتية (BBS7) مع الحفاظ على القدرة على التفاعل مع مفارز BBSome أخرى (BBS1 وBBS9) (المواد التكميلية الشكل S5C).
لدراسة تشكيل BBSome في غياب BBS7، أجرينا مناعي مع الأجسام المضادة ضد BBS1، واحدة من مفارز من BBSome. وقد انخفض وجود مفارز BBSome أخرى في BBS1 سحب هبوطا أو غير قابلة للكشف في غياب BBS7 أو BBS2 كما يتبين من لطخة غربية. هذا يدل على أن BBSome سليمة غير مشكلة في غياب BBS7 (الشكل 4C). أكدنا أيضا هذه النتائج عن طريق تحليل الانحدار السكروز من إجمالي لست] البروتين من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين (الشكل 4D).
للتحقيق في ما إذا كان شرط من BBS7 لتشكيل BBSome هي فريدة من نوعها لأنسجة الخصيتين، ونحن عزل الكلى الخلايا الظهارية الأولية من كلا من النوع البري وBbs7 - / - الفئران وإصابة الخلايا المستزرعة مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. نحن انزلوا العلم BBS2 والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية باستخدام أجسام مضادة لمكافحة BBS (الشكل 4E). وجدنا أن في غياب البروتين BBS7، ويتم تشكيل أي BBSome كامل (ناقص BBS7)، على الرغم من أن بعض المكونات BBSome لا تزال تشكل subcomplex. إذا كانت هذه subcomplexes تزال تحتفظ ببعض المهام المتبقية هي مسألة الفائدة.
لتقييم تأثير على تشكيل BBSome من متماثل الطفرات BBS7 مغلطة (T211I وH323R) وجدت في المرضى الذين يعانون BBS، نحن اختبار ما إذا كان BBS7 تحتوي على هذه الطفرات يمكن إدراجها في BBSome. ويظهر تحليل النشوء والتطور أن هذه الطفرات تقع في مناطق محمية من البروتين. ونحن إنشاء بنيات BBS7 تحور بواسطة الطفرات موقع الموجه والموسومة لهم FLAG في N-محطة من البروتينات. انخفضت البروتينات BBS7 تحور القدرة على التفاعل مع BBS2 كما يتبين من شارك في مناعي عندما transfected المشارك في الخلايا 293T (الشكل 4F). طفرة مغلطة BBS7 H323R قد تراجع في القدرة على هدم مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع من النوع البري BBS7 البروتين (الشكل 4G). تم الحصول على نتيجة مماثلة مع متحولة بروتين T211I (تشانغ وآخرون، 2012b). وتشير هذه النتائج إلى أن الطفرات BBS7 مغلطة تؤثر BBSome تشكيل. وهذا يوفر تفسيرا لماذا هذه الطفرات نقطة متماثل تسبب BBS. في المقابل، لم غياب BBS7 لا تؤثر على مستويات البروتين من مكونات معقدة IFT أو IFT تشكيل معقد (المواد التكميلية الشكل S6A، B). لم فقدان BBS7 لن يؤثر IFT البروتين الهدبية توطين (المواد التكميلية الشكل S6C)، بما يتفق مع الحقائق التي فقدان الجينات BBS ديها الظواهر أكثر اعتدالا من ذلك من فقدان الجينات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف إذا كان معدل حركة IFT هو تغييرها.

غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين مستقبلات الذوق، polycystin-1 أو polycystin-2

ومن المعروف أن BBSome تشارك في نشوء حيوي غشاء أهداب من خلال Rab8. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من BBS الجينات في النتائج الزرد في عيوب في الحويصلة Kuffer وإلى الوراء تأخير النقل جسيم ميلانيني. وعلاوة على ذلك، فقد BBS البروتينات النتائج في تراكم عنصر الصوتية مسار القنفذ مملس (SMO) داخل أهداب دون تفعيل المسار (تشانغ وآخرون، 2012A). هذه الدراسات تدل على أن البروتينات BBS تعمل في الاتجار محدد الحويصلة. وقد تبين أن البروتينات أهداب الأخرى ذات الصلة مثل AHI1 وتشارك FUZZY في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لأهداب الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛ هسياو وآخرون، 2009.). لاختبار ما إذا تشارك BBS7 في الغشاء العام الاتجار البروتين، درسنا مسارات الإلتقام-بالكلاذرين مستقلة وتعتمد على بالكلاذرين في مثقف من النوع البري وBbs7 - / - الخلايا الأولية الكلى باستخدام fluorophore المسمى السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة كعلامات على التوالي. تم الكشف عن عدم وجود اختلافات من السم الكوليرا أو ترانسفيرين مستقبلات الإلتقام بين النوع البري وBbs7 - / - الخلايا (المواد التكميلية التين S7، S8). ويتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام خلايا MEF من النوع البري وBbs7 - / - الفئران. وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs7 ليست متورطة في الاتجار حويصلي العام، ولكن بدلا تشارك في أنواع معينة من الاتجار حويصلي مثل جسيم ميلانيني النقل في الزرد و / أو الاتجار إلى وجهات التحت خلوية محددة مثل الأغشية الهدبية.
بعد ذلك، درسنا الهدبية غشاء الاتجار البروتين في الخلايا فارغة Bbs7. وقد تم مؤخرا أظهرت مستقبلات الطعم المر للتوطين لغشاء الهدبية في أهداب متحركة من ظهارة الهوائية والذوق مستقبلات الأشكال ترتبط عدوى الجهاز التنفسي (لي وآخرون، 2012.؛ شاه وآخرون، 2009.). رغم عدم وجود النمط الظاهري واضح في الكلى، وقد تبين وجود ارتباط طعم مستقبلات مرير مع نوع معين من اعتلال الكلية، البلقان المتوطنة إعتلال الكلى، (التغطية بالخشب وآخرون، 2012). لاختبار إذا يتم ترجمة مستقبلات الطعم المر أيضا إلى غشاء أهداب الابتدائي، ونحن ملطخة خلايا الكلى مثقف مع الأجسام المضادة ضد مستقبلات الطعم المر T2R4 وT2R43 جنبا إلى جنب مع أهداب علامة الأسيتيل α تويولين. وأظهرت النتائج أن مستقبلات الطعم المر توطين لغشاء أهداب الكلى الابتدائي (المواد التكميلية الشكل S9A-C). مستقبلات الذوق وظيفية كما يتضح من العلاج مع ديناتونيوم مجمع المر للحصول على 2+ استجابة الكالسيوم (المواد التكميلية الشكل S9I). من المذكرة، لم فقدان Bbs7 لن يؤثر على توطين أهداب من هذه المستقبلات (المواد التكميلية الشكل S9D-F)، ولا يؤثر على الكالسيوم 2+ تعبئة عندما حفز مع مجمع المر ديناتونيوم (المواد التكميلية الشكل S9J)، مشيرا إلى أن BBS7 و غير مطلوب BBSome لتوطين الغشاء الهدبي أو وظيفة مستقبلات الطعم المر.
طفرة من عدة بروتينات الغشاء الهدبية بما في ذلك polycystin-1، polycystin-2، وMecklin (MKS3)، يسبب الأمراض التي تصيب الإنسان مع الظواهر التي تتداخل تلك BBS. ولذلك، فإننا التحقيق في توطين كلا polycystin-1 وpolycystin-2 في تربيتها Bbs7 - / - خلايا الكلى الأولية باستخدام الأجسام المضادة ضد polycystin-1 وpolycystin-2. غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin 2 (الشكل 5). حقيقة أن Bbs7 - / - الفئران لا تتطور الكيسات الكلوية إلى أن polycystin-1 وpolycystin-2 لا تزال وظيفية، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية عيوب وظيفية خفية في غياب BBS7.

تين. 5.
غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin-2. (A-L) أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من النوع البري (A-C، G-I) وBbs7 - / - (D-F، J -L) الفئران ملطخة مكافحة الأسيتيل α تويولين (الخضراء) كعلامة أهداب ومضادة للpolycystin-1 (A-F؛ أحمر) ومضادة للpolycystin 2 (G-L، أحمر) الأجسام المضادة. أشرطة النطاق: 10 ميكرون.

غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات الغشاء الهدبي

وقد أظهرت الدراسات الجينية في الكائنات النموذج الذي فقدان البروتينات BBS تؤدي إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل في الزرد، IFT عيوب تحول في الطرف الهدبية في C. ايليجانس، وتراكم يشير البروتينات داخل الأسواط في كلاميدوموناس، وتراكم مملس داخل أهداب في الفئران (Lechtreck وآخرون، 2009.؛ وي وآخرون، 2012.؛. الين وآخرون، 2006؛ تشانغ وآخرون، 2012A). ولذلك، فإننا التحقيق مستقبلات الذاتية التي قد تتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - الفئران. وقد تبين أن مستقبلات الدوبامين D1 (D1R) تتراكم في أهداب في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). لتحديد ما إذا D1R يتراكم في أهداب في Bbs7 - / - الفئران، ونحن ملطخة أقسام الدماغ من النوع البري وBbs7 - / - الفئران مع العصبية ACIII أهداب علامة والأجسام المضادة ضد D1R. لا يمكننا العثور على أي تلطيخ الهدبية من D1R في البرية من نوع الدماغ (الشكل 6A-C). في المقابل، وجدنا مناطق متعددة بما في ذلك المخطط واللوزة حيث يموضع D1R لأهداب في Bbs7 - / - (الدماغ الشكل 6D-F). وتشير هذه البيانات إلى أن BBSome يمكن أن تنظم النقل إلى الوراء من D1R داخل أهداب الخلايا العصبية وفقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

تين. 6.
فقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للمستقبلات الدوبامين D1 داخل الأهداب. (A-F) أقسام الدماغ من النوع البري (A-C) وBbs7 - / - كانت ملطخة (D-F) الفئران مع مكافحة ACIII الأجسام المضادة ( الأحمر) كعلامة أهداب الخلايا العصبية ومكافحة D1R الأجسام المضادة (الخضراء). D1R يتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - مخ الفأر مقارنة البرية من نوع السيطرة. شريط النطاق: 20 ميكرون.

نقاش

وهدب هو عضية الهامة التي تلعب أدوارا متعددة خلال التنمية وفي التوازن من أنسجة البالغين. أهداب متحركة مهمة لوظائف مثل إزالة المخاط من الرئتين والدورة الدموية من السائل الشوكي الدماغي من خلال البطينين الدماغي، في حين أهداب الأساسي والمهم لchemo- والميكانيكية والإحساس، وكذلك القنفذ وWNT نقل الإشارة. وسلط الضوء على أهمية أهداب التي كتبها النتائج أن أهداب عطل يساهم في مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان المعروفة باسم ciliopathies التي تشمل متلازمة بارديه-بيدل.
BBS هو اضطراب عديد المظاهر التي تنطوي على العديد من أجهزة الجسم. بعض الظواهر BBS مثل السمنة، وتنكس الشبكية، والسكري، وارتفاع ضغط الدم لديها معدلات انتشار عالية في عموم السكان. ولذلك، فإن دراسة BBS يوفر فرصة فريدة من نوعها للكشف عن بعض مسارات الكامنة أو التأثير على هذه الأمراض الشائعة. BBS خروج المغلوب الفئران تحاكي النمط الظاهري البشري، وبالتالي توفير أداة مفيدة لاكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا المرض فضلا عن اختبار علاجات جديدة.
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا تشترك الظواهر BBS مشتركة، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. الأهم من ذلك، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر (كرمي وآخرون، 1995). وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، قد يكون الجينات BBS مختلفة ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هو جزء لا يتجزأ من BBSome ويتفاعل مع مجمع BBS chaperonin، وهي نتيجة فريدة من نوعها لBBS7 بين BBSome البروتينات جسديا. غياب BBS7 يؤثر على استقرار البروتين من BBS2 ويمنع تشكيل BBSome سليمة. ومع ذلك، لا تزال تشكل أهداب الابتدائية في غياب BBS7. على عكس بالضربة القاضية جين IFT، التي أهداب لا تشكل ويؤدي إلى الفتك الجنينية في الفئران، Bbs7 - / - الفئران يمكن البقاء على قيد الحياة إلى سن الرشد وأهداب الابتدائي لا تزال تشكل في الأنسجة بما فيها الكلى والجزر من البنكرياس، والقناة البنكرياسية، في الظهارية الكلوي مثقف الخلايا والخلايا الليفية. وعلى النقيض من أهداب الابتدائي، أهداب متحركة من خلايا البطانة العصبية بطانة البطينات الدماغية والحيوانات المنوية لديهم سياط عيوب خطيرة في Bbs7 - / - الفئران. أهداب متحركة المعيبة ليست بسبب وventriculomegaly المتقدمة في غياب BBS7 منذ أهداب عيب متحركة تطوير في وقت مبكر من 3 أسابيع في ependyma الدماغ. لا تفعل تظهر أهداب متحركة المعيبة أن يكون السبب الرئيسي للventriculomegaly. تطوير غير طبيعي للخلايا العصبية السلف قد تكمن وراء تطوير ventriculomegaly في هذا النموذج الماوس كما هو موضح لنماذج أخرى الماوس BBS لأن كلا BBS7 وBBS1 تعتبر ضرورية لسلامة BBSome (كارتر وآخرون، 2012). غياب BBS7 لا يؤثر على تشكيل المجمعات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف ما اذا تأثر الحركة من الجسيمات IFT التي كتبها غياب BBSome. ويبدو أن الجينات BBS والجينات IFT أن تؤثر على جوانب مختلفة من وظيفة الهدبية. نتائجنا في الفئران تتسق مع نتائج كلاميدوموناس، وتسليط الضوء على التفاعل بين BBSome ومجمع IFT (Lechtreck وآخرون، 2009).
أثبتنا أن BBS7 البروتين إيواء الطفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS7 (T211I وH323R) لديه قدرة انخفضت إلى تشكيل BBSome مقارنة مع البروتين BBS7 العادي. الأساليب المستخدمة هنا يمكن أن توفر نظام فحص خلية القاعدة فعال لتقييم طبيعة الطفرات مغلطة BBS الإنسان في المختبر.
في الآونة الأخيرة أظهرت الدراسات أن الجينات ذات الصلة أهداب، مثل AHI1 وغامض، وتشارك في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لالهدبية الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛. هسياو وآخرون، 2009). في المقابل، غياب BBS7 لا يؤثر على مسارات إما مستقلة بالكلاذرين وأو بالكلاذرين الإلتقام يتوقف. وبالمثل، وغياب أو طفرة من البروتينات BBS لا تؤثر على مسار إفرازية العام للبروتينات الغشاء بما في ذلك SST3R وترانسفيرين مستقبلات غشاء البلازما (جين وآخرون، 2010) (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن الاتجار حويصلة العامة لا يبدو أن يتطلب BBS7 أو BBSome والاتجار بروتينات معينة أو من غشاء البلازما يمكن أن يثير الشبهة في غياب BBSome. ومن الأمثلة على الاتجار مستقبلات اللبتين، وهو ما ثبت للتفاعل مباشرة مع BBSome (سيو وآخرون، 2009). ومن المثير للاهتمام، في C. ايليجانس، وفقدان BBS الجينات يؤدي إلى زيادة إطلاق سراح الحويصلات كثيفة الأساسية والأنشطة المعززة للأنسولين، نيوروبيبتيدي، وأمين مسارات إشارات الاحيائية (لي وآخرون، 2011). نستنتج أن BBS7 وبالتالي BBSome لا تشارك في الهدبي الاتجار العام بروتين الغشاء بل في محدد الغشاء الهدبي الاتجار البروتين. ويستند هذا الاستنتاج على ملاحظة أن الهدبية بروتينات غشاء مثل polycystin-1، polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر لا تزال المترجمة إلى غشاء الهدبية في الغياب التام للبروتين BBS7، وهو مطلوب لBBSome التجمع. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدلائل إلى أن polycystin-1، لا تزال polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر وظيفية في غياب BBS7. في المقابل، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم SMO داخل أهداب دون تحفيز SMO يجند (تشانغ وآخرون، 2012A). وقد ثبت الأخرى بروتينات الغشاء الهدبي بما في ذلك SST3R وMCHR1 لتوطين لأهداب الخلايا العصبية في ظل ظروف طبيعية، ولكن ليس في غياب BBS2 أو BBS4 (Berbari آخرون، 2008A.؛ Berbari وآخرون، 2008b.). ومع ذلك، فإن غياب BBS7 لا يؤثر توطين الهدبي إما SST3R أو MCHR1 في الخلايا العصبية في الدماغ أو في الخلايا المستنبتة من Bbs7 - / - الفئران (لا تظهر البيانات). في المقابل، تراكمت D1R داخل أهداب في غياب BBS7، على غرار النتائج في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). تراكم D1R داخل أهداب قد يرجع ذلك إلى النقل إلى الوراء تغير من D1R داخل أهداب في غياب BBS7. ودعما لهذا الاحتمال، وأظهرت الدراسات الجينية في الزرد إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل عند التعبير عن BBS يتم منع الجينات (الين وآخرون، 2006). وعلاوة على ذلك، SMO يتراكم داخل أهداب دون التحفيز يجند في غياب BBSome (تشانغ وآخرون، 2012A). تأخر نقل إلى الوراء يمكن أن تنجم عن النشاط تغير المحرك، خلل في مجمع IFT أو تتغير بنية أهداب axonemal، أو تغيير معين في قدرة بعض الشحنات للخروج من هدب. دراسات في C. ايليجانس تشير إلى أن البروتينات BBS بمثابة linkers بين مجمع IFT B ومجمع IFT A (Blacque وآخرون، 2004). وفقدان البروتينات BBS يؤدي إلى وظيفة غير لائقة المجمعات IFT. ودعما لهذا الاحتمال، المسوخ مضاعفة من Bbs7 وTg737orpk تفتقر تماما أهداب، تشبه مجمع IFT B بالضربة القاضية الحقيقية (تشانغ وآخرون، 2012A). بدلا من ذلك، أهداب الأساسي من المسوخ Bbs7 قد يكون لها أيضا خفية خلل في بنية axonemal التي قد تسهم في تراكم D1R داخل الأهداب. أهمية وظيفية من تراكم D1R داخل أهداب غير معروفة حاليا. وقد تبين أن المرضى BBS وBBS الفئران خروج المغلوب زادت القلق والاكتئاب (بارنيت وآخرون، 2002.؛ Eichers وآخرون، 2006.). ومن المثير للاهتمام، انسداد D1R السرقة مع الأدوية الموهن مكيفة التجمد (اختبار الخوف مشروط) أثناء الاختبار الاستبقاء (Guarraci وآخرون، 1999a... Guarraci وآخرون، 1999b). توطين D1R في مناطق الجسم المخطط واللوزة تشير إلى أن الدوبامين إشارات قد تلعب دورا لعيوب السلوك التي لوحظت في نماذج الماوس BBS والمرضى BBS.

المواد والأساليب

الكواشف والأجسام المضادة

وقد تم الحصول على الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS2 الببتيد DKTARYWRIK والأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS7 الببتيد VLQERENYQQ من توسيع النظم البيولوجية (هانتسفيل، AL). وكانت هذه الأجسام المضادة النقاء تقارب والتحقق منها في الفئران خروج المغلوب. وحيدة النسيلة المضادة للبيتا تويولين، بولكلونل مكافحة β-الأكتين، وحيدة النسيلة المضادة للالأسيتيل تويولين، وحيدة النسيلة المضادة للγ تويولين، بولكلونل الأرنب تم شراؤها مكافحة BBS8 وBBS9 من سيغما (سانت لويس، MO). تم شراء الماعز المضادة للBBS1 (N-20)، الماعز المضادة للBBS2 (C-16) الأجسام المضادة، والفأر مكافحة D1R الضد من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، CA). تم شراؤها لمكافحة T2R4 الضد الأرنب بولكلونل والأرنب المضادة للT2R43 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة من العلم الحرارية (بيتسبرغ، PA). تم شراؤها اليكسا 488 مترافق السم الكوليرا واليكسا 568 البشرية مترافق نقل مستقبلات من إينفيتروجن (كارلسباد، كاليفورنيا). وكان الأرنب بولكلونل المضادة للpolycystin-1 هدية من الدكتور أوكسانا Ibraghimov-Beskrovnaya (شركة جنزايم). كان الأرنب بولكلونل مكافحة polycystin-2 الأجسام المضادة هدية من الدكتور ستيفان Somlo (جامعة ييل)، والدكتور غريغوري Pazour (مدرسة الطب بجامعة ماساتشوستس).

جيل من Bbs7 الفئران خروج المغلوب

تم استخدام PCR لتضخيم 5 'و 3' مناطق Bbs7 الجينات من 129 / SVJ الحمض النووي الجيني والمستنسخة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC). تم خطي ناقلات و electroporated إلى R1 الجذعية الجنينية (ES) خلايا (129 × 1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). كما تم عرض G418 واستنساخ مقاومة للganciclovir التي كتبها بعيد المدى PCR لتحديد خطوط الخلايا ES المستهدفة بشكل صحيح. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES مستقلة لإنتاج الوهم. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Bbs7 الفئران متخالف على خلفية وراثية مختلطة من قبل التزاوج مع C57BL / 6J الفئران. تم intercrossed الفئران متخالف، وكان التنميط الجيني لسلالة بواسطة PCR. جميع الدراسات انضمت إلى المبادئ التوجيهية الموضوعة لرعاية واستخدام حيوانات التجارب وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR

تم عزل الحمض النووي الريبي من العمر 2.5 شهرا من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين الماوس باستخدام TRIzol كاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). وقد أعد كدنا] من 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مرتفع الثالث الناسخ العكسي (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا).

تحليل لطخة غربية

من النوع البري وBbs7 تعطلت الخصيتين متحولة من قبل TISSUEMISER (فيشر العلمية، بيتسبرغ، PA) في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100 و مثبط البروتياز من روش، انديانابوليس، IN). تم تجميد الأنسجة تعطلت في النيتروجين السائل وإذابة في حمام الماء درجة حرارة الغرفة. وتكررت هذه الدورة تجميد أذاب ثلاث مرات. ثم تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة وتم قياس تركيز supernatants باستخدام بيو راد العاصمة فحص البروتين (هرقل، CA).
تم فصل البروتينات عن طريق الكهربائي باستخدام 4-12٪ المواد الهلامية NuPAGE مكرر تريس (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا)، يليه نقل إلى الأغشية النيتروسليلوز وتم الكشف عنها من قبل SuperSignal دورا مددت الركيزة (بيرس، روكفورد، IL).

التحليل النسيجي للBbs7 - / - الفئران

الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ العينين والخصيتين من العمر 4-8 شهرا Bbs7 أجريت متحولة والعمر كعينة ضابطة من حد وصفه. أقسام الدماغ الاكليلية من 60-100 ميكرون من العمر 4-8 شهرا Bbs7 - - / كانت ملطخة الحيوانات والعمر كعينة ضابطة مع محايد الأحمر وصورت مع stereomicroscope أوليمبوس SZX12 كما هو موضح (ديفيس وآخرون، 2007.).

دراسات الوزن

تناول الطعام في قفص فردي Bbs7 - - / تم مقارنتها مع الحيوانات Bbs7 +/- والحيوانات البرية من نوع السيطرة تتراوح أعمارهم 4-28 أسابيع باستخدام متوسط ​​ستة حيوانات في كل مجموعة. تم تسجيل الوزن بداية الأسبوعية عند الفطام.

نقل الإلكترون المجهري

تم perfused الفئران مع نصف القوة تثبيتي Karnovsky وتم تشريح الأنسجة وإصلاحها في نصف القوة تثبيتي Karnovsky لعدة ساعات قبل الأوسيميوم بعد التثبيت، والجفاف، وتضمينها في الإي بي 812. نقل الميكروسكوب الإلكتروني اتخذت كما هو موضح سابقا (سويديرسكي وآخرون آل.، 2007).

جيل من BBS2 البشري وBBS7 متحولة بنيات الحذف والطفرات نقطة

تم إنشاء BBS7 المسوخ الحذف عن طريق PCR والمستنسخة في التعبير الثدييات ناقلات pCS2 +. وتم التحقق من كل المسوخ الحذف عن طريق التسلسل المباشر. تم إنشاؤها الطفرات نقطة BBS7 بواسطة الطفرات موقع الموجه (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا) باستخدام N-محطة الموسومة FLAG من النوع البري BBS7 كقالب والتحقق من التسلسل.

مناعي

تفاضلي الموسومة الجينات BBS الإنسان و transfected المشارك في الخلايا 293T. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت هي lysed الخلايا في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100، ومثبط البروتياز، روش، انديانابوليس، IN) ونسج في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تم مسح supernatants من قبل الحضانة مع حبات بروتين G (بيرس، روكفورد، IL). وحضنت لست] مسح مع الأجسام المضادة ضد علامات المقابلة لمدة 4 ساعات. وبعد ذلك يضاف بروتين G الخرز والمحتضنة لمدة 4 ساعات أخرى. تم غسلها حبات أربع مرات مع العازلة تحلل وتم الكشف عن التفاعلات التي النشاف الغربي.

المناعي المجهري

تم إصلاح الخلايا في 4٪ paraformaldhyde في برنامج تلفزيوني أو ثابتة مع الميثانول البارد لمدة 5 دقائق (ل-γ تويولين صمة عار) وpermeabilized مع 0.2٪ تريتون X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. تم غسلها الخلايا 3 × PBS وسدوا مع عازلة تمنع (1٪ BSA في PBS). وكانت مخففة الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تم غسلها الخلايا 3 × PBS، سدت مع عازلة تمنع، ثم حضنت مع فلور اليكسا 488 أو فلور اليكسا 568 المسمى الأجسام المضادة الثانوية (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). كانت ملطخة النوى مع دابي (سيغما، سانت لويس، MO).

كلية زراعة الخلايا الأولية

الكلى من النوع البري وBbs7 - / - تم تشريح الفئران وتعقيمها قبل التنسيب إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 ثوان، ثم مفروم مع مقص. تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 دون المصل. 20 مل من pronase (1 ملغ / مل، روش، انديانابوليس، IN) وأضيف إلى الأنسجة والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 وحضنت مع 20 مل 1-× التربسين EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. تم مكعبات الأنسجة في 500 غ لمدة 5 دقائق وإعادة علقت في 30 مل DMEM / F-12 مع 10٪ مصل. كانت مطلية الأنسجة إعادة علقت في ثلاثة أطباق 10 سم مغلفة بولي-L-ليسين (سيغما، سانت لويس، MO).

السم الكوليرا وترانسفيرين مستقبلات الإلتقام

أجريت السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة المقايسات الإلتقام كما وصفها هسياو وآخرون. (هسياو وآخرون 2009).

التصوير الكالسيوم

تم إجراء التصوير الكالسيوم كما هو موضح سابقا (شاه وآخرون، 2009). خلايا الكلى مثقف من النوع البري وBbs7 - / - تم تحميل الفئران مع 1 ميكرومتر Fura2 صباحا، تم تقييم التغييرات تركيز الكالسيوم في ظهائر باستخدام مجهر مقلوب (نيكون الكسوف TE200، نيكون انسترومنتس، ميلفيل، NY)، والبيانات تم تحليلها باستخدام برنامج شيكل، عناصر (نيكون). تم تطبيق ديناتونيوم apically في تركيزات المشار إليها. تم استخدام برنامج تلفزيوني عن السيطرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #3  
قديم 11-23-2015, 09:26 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome وغيابها في الفئران النتائج في بارديه-بيدل الظواهر متلازمة وتشوهات انتقائية في غشاء الاتجار البروتين

 

http://jcs.biologists.org/content/126/11/2372.full



بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو اضطراب عديد المظاهر ومتخالف وراثيا تسبب بشكل مستقل من قبل العديد من الجينات (BBS1-BBS17). سبعة البروتينات BBS الحفظ جدا (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome، التي تعمل في نشوء حيوي الغشاء الهدبي. BBS7 على حد سواء وحدة فرعية فريدة من BBSome ويعرض التفاعل المادي المباشر مع BBS الثاني معقد، مجمع chaperonin BBS. لفحص وظيفة في الجسم الحي من BBS7، ولدت لنا Bbs7 الفئران خروج المغلوب Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لغيرها من الجينات BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، والسمنة، ventriculomegaly والعقم عند الذكور تتميز الشاذ axonemes الحيوانات المنوية سوطي. باستخدام أنسجة من Bbs7 - / - الفئران، وتبين لنا أن BBS7 مطلوب لتشكيل BBSome، وأن BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. على الرغم من أن BBSome بمثابة مجمع معطف للبروتينات الغشاء الهدبي، غير مطلوب BBS7 لتوطين بروتينات الغشاء الهدبي polycystin-1، مستقبلات polycystin-2، أو الطعم المر، ولكن غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات إلى الغشاء الهدبي، مشيرا إلى أن BBS7 تشارك في توطين محددة بروتين الغشاء لأهداب.
مقدمة

أهداب هي الهياكل القائمة على أنيبيب التي تمتد من سطح الخلية لمعظم خلايا حقيقية النواة. أنها تحتوي على مكونات فريدة غشاء الخلية منفصلة عن الغشاء البلازمي، وتصنف على أنها إما أهداب متحركة أو الأساسي (immotile). أهداب تلعب دورا مهما أثناء التطور وعلم وظائف الأعضاء في أنسجة البالغين. عيوب أهداب تؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان ciliopathies يطلق التي تشمل dyskinesis الأساسي الهدبي، مرض الكلى المتعدد الكيسات، سحاف الكلية، جوبير syndome، متلازمة العليا-لوكن، متلازمة ميكل-جروبر، ORO-الوجه الرقمية متلازمة، متلازمة Alstrom، وBardet- متلازمة بيدل (BBS).
BBS هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، والتشوهات الكلى، والإعاقة ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك العيوب الثانوية بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم التعلم. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 17 جينات BBS أن يسبب اضطراب مستقل (عبد الستار وجليسون، 2011). على الرغم من أن الوظائف الخلوية من البروتينات BBS لا تزال غير مفهومة تماما، وقد كشفت الدراسات الوظيفية في الكائنات نموذج التي تشارك البروتينات BBS في وظائف الهدبية والنقل داخل الخلايا. في ايليجانس انواع معينة، يتم التعبير عن BBS الجينات في الخلايا العصبية المهدبة وتوطين للقاعدة الهدبية / المنطقة الانتقالية والمشاركة في IFT على طول الهدبية الخيط المحوري. bbs7 وbbs8 متحولة C. ايليجانس خطوط لها صبغة ملء العيوب، أهداب أقصر، وعيوب في النقل intraflagellar (IFT) (Blacque وآخرون، 2004). ضربة قاضية للتعبير عن BBS الجينات في نتائج الزرد في العيوب الحويصلة كوبفر، وفقدان أهداب سابقة لأوانها، وجسيم ميلانيني الوراء تأخير النقل (الين وآخرون، 2006). BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص انحطاط والسمنة الظواهر الشبكية ينظر في المرضى الذين يعانون BBS. وبالإضافة إلى ذلك، ذكر BBS فئرانا معدلة وراثيا تفتقر سياط الحيوانات المنوية (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛ Mykytyn وآخرون، 2004.؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). وتشير الدراسات البيوكيميائية أن سبعة من البروتينات BBS المعروفة (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) تشكيل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome (Nachury وآخرون، 2007). البروتينات BBS الأخرى بما في ذلك BBS6، BBS10، وBBS12 تشكل المجمع الذي ينظم BBSome التجمع (سيو وآخرون، 2010). واحدة من وظائف BBSome هو تعزيز أهداب نشوء حيوي الغشاء من خلال Rab8 GTPase الصغيرة وبمثابة مجمع معطف للاتجار الهدبية بروتين الغشاء (جين وآخرون، 2010.؛ Nachury وآخرون، 2007.).
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص معظم الظواهر BBS، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. على سبيل المثال، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران هي ارتفاع ضغط الدم، في حين Bbs2 - / - الفئران هي سوي ضغط الدم (رحموني وآخرون، 2008. Bbs3) - / - الفئران لها hydocephalus أكثر حدة وأقل بدينة من غيرها من الفئران BBS (تشانغ وآخرون، 2011). بما يتفق مع الدراسات الماوس، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر على حد سواء. وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011.؛. Kulaga وآخرون، 2004)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، الجينات BBS المختلفة قد تمتلك ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هي فريدة من نوعها من حيث أنه هو وحدة فرعية من BBSome ويتفاعل مباشرة مع جسديا مجمع chaperonin BBS. من أجل دراسة دور BBS7 في الجسم الحي، وتحديد ما إذا كان فقدان Bbs7 لديه أي الظواهر الفريدة المرتبطة بها، ولدت لنا Bbs7 بالضربة القاضية الفئران Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في آخر BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، وعدم من سياط الحيوانات المنوية، والسمنة، وventriculomegaly. علينا أن نبرهن على BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين وما هو مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. والجدير بالذكر، وتبين لنا أن BBSome غير مطلوب للعالمي توطين الهدبية بروتين الغشاء. ومع ذلك، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

النتائج

جيل من الفئران Bbs7 باطل

BBS7 هي فريدة من نوعها بين البروتينات BBS لأنه جزء لا يتجزأ من BBSome ومكون من مجمع chaperonin BBS. للتحقيق في وظيفة في الجسم الحي من الجين Bbs7، ولدت لنا Bbs7 الفئران بالضربة القاضية جين عن طريق استبدال اكسون 5 مع كاسيت بالنيوميسين. هذا يؤدي إلى انزياح الإطار مما أدى إلى Bbs7 أليل فارغة (المواد التكميلية الشكل S1A). تم التحقق من عدم وجود Bbs7 مرنا من خلال تحليل RT-PCR RNA باستخدام معزولة عن Bbs7 - / - الخصيتين الماوس مع الاشعال داخل اكسون 5 (المواد التكميلية الشكل S1B.). وأكد عدم وجود بروتين BBS7 قبل الغرب النشاف (المواد التكميلية الشكل S1C).
أدى التزاوج من الزيجوت Bbs7 +/- 26٪ في Bbs7 + / + الفئران، و 55٪ الفئران Bbs7 +/-، و 19٪ Bbs7 - / - الفئران (ن = 387؛ P <0.05). تردد انخفضت من Bbs7 - / - وقد لوحظ في ذرية أخرى فئرانا معدلة وراثيا BBS وتشير إلى أن بعض Bbs7 - / - الفئران توفي قبل الولادة أو فترة ما حول الولادة.

Bbs7 - / - الفئران تصبح بدينة، تفتقر الخراجات الكلى ولا تتطور polydactyly

Bbs7 - / - الفئران هي الضعفاء عند الولادة، تزن أقل من تتزاحم بهم في 3 أسابيع من العمر، وسمنة على مر الزمن. بعد الفطام، Bbs7 - / - الفئران تبدأ في كسب المزيد من الوزن من النوع البري الفئران بسبب زيادة الاستهلاك الغذائي. قبل 12 أسبوعا من العمر، Bbs7 - / - الفئران (ذكورا وإناثا) تزن أكثر بكثير من تتزاحم سيطرتها، والخلافات أصبحت أكبر في الحيوانات الأكبر سنا. قبل 7 أشهر، من النوع البري الفئران هي 28.7 ± 2.8 جم مقابل Bbs7 - / - 41.1 ± 3.25 غ (P <0.05).
على الرغم من شذوذ الكلوي وpolydactyly هي السمات الأساسية للالظواهر BBS في البشر، ونحن لم نلاحظ الكيسات الكلوية أو polydactyly من الأطراف الأمامية أو hindlimbs في فئرانا معدلة وراثيا Bbs7، مما يشير إلى اختلاف الأنواع أو الاختلافات عتبة بين الماوس والبشرية.

Bbs7 - / - الفئران تبدي تنكس الشبكية وventriculomegaly

التحليل النسيجي للBbs7 العمر 4-8 شهرا - / - تظاهر عيون انحطاط كبير من القطاعات الداخلية والخارجية للخلايا مستقبلة للضوء وطبقة النووية الخارجي (الشكل 1A، B.). وقد لوحظ Ventriculomegaly في البطينات الجانبية والثالث من الدماغ كما رأينا في أقسام الاكليلية من Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - الفئران (الشكل 1C-F.). نحن أيضا لوحظ تخفيف من القشرة المخية وانخفاض في حجم الحصين والجسم المخطط. لم يلاحظ أي تشوهات جسيمة في المخيخ في Bbs7 فئرانا معدلة وراثيا أو غيرها من فئرانا معدلة وراثيا BBS (المواد التكميلية الشكل S2).

تين. 1.
Bbs7 - / -. ملطخة E-عرض الفئران مبصرة فقدان الخلية وventriculomegaly (A، B) H & القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - (B) عيون تظهر فقدان مبصرة الداخلي وشرائح الخارجي فضلا عن انحطاط الطبقة النووية الخارجي. PC، خلايا مستقبلة للضوء. (C-F) محايد الحمراء الملطخة 60-100 ميكرون سميكة أقسام الدماغ الاكليلية من النوع البري (C، E) وBbs7 - / - الفئران (D، F) تظهر البطينات الجانبية الموسع (*)، والظهرية الموسع البطين الثالث (رأس السهم العلوي والسفلي)، وانخفاض المخطط الإحضار (S) وقرن آمون (H)، وترقق القشرة المخية (CC). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 1 مم (C-F).

Bbs7 - / - الفئران لديها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ

منذ BBS هو مرض له علاقة أهداب، درسنا أهداب متحركة وأهداب الابتدائي في Bbs7 - / - الفئران. درسنا أهداب متحركة من طبقة الخلايا البطانة العصبية المبطنة للالبطينين عن طريق تلطيخ أقسام الاكليلية من العمر 3 اشهر من النوع البري وBbs7 - / - أدمغة فئران مع-α تويولين الضد ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة لمكافحة الأسيتيل كعلامات أهداب . مقارنة مع الضوابط، Bbs7 - / - أظهرت الفئران عددا كبيرا من أهداب انخفاض خلية بطانية عصبية وأهداب المتبقية هي أقصر (الشكل 2A، B).

تين. 2.
Bbs7 - / - الفئران لها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ (A، B) كشفت تلطيخ مناعي من البطين الدماغ خلايا البطانة العصبية باستخدام المضادة للالأسيتيل α تويولين (الخضراء) ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة (أحمر) عدم وجود أهداب وأهداب قصيرة (السهم) في طبقة البطانة العصبية من Bbs7 - / - الفئران (A) مقارنة مع من النوع البري الضوابط (B). (C، D) تحليل TEM من المقطع الطولي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر القصير وانتفخ أهداب مع حويصلات في Bbs7 من العمر 3 اسابيع - / - الفئران (D) مقارنة مع عمرها 3 أسابيع تحكم من النوع البري (C). (E-G) تحليل TEM من المقطع العرضي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر هيكل axonemal غير طبيعي في Bbs7 - / - الفئران (F، G) مقارنة مع السيطرة البرية من نوع (E). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 0.2 ميكرون (C-G).

لمزيد من التحليل أهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ، أجرينا تحليل TEM من العمر 3 اسابيع من النوع البري وBbs7 - أدمغة الفئران - /. أهداب متحركة من Bbs7 - / - الدماغ طبقة البطانة العصبية لديها القصير، انتفخ أهداب مع حويصلات (الشكل 2C، D.) وتلك أهداب متحركة أيضا هياكل axonemal المعيبة (الشكل 2F، G.) بالمقارنة مع النوع البري الضوابط (الشكل. 2E). وتشير هذه الدراسات إلى أن غياب البروتين BBS7 يؤثر هياكل أهداب متحركة.
لدراسة أهداب الأساسي في الجسم الحي، ونحن ملطخة أقسام الأنسجة من الكلى والبنكرياس مع الأسيتيل α تويولين. لم نجد اختلافات في أرقام أهداب الأولية أو طول أهداب بين النوع البري وBbs7 - / - الفئران (المواد التكميلية الشكل S3.). كما شكلت أهداب الابتدائي وتظهر طبيعي في الخلايا المستزرعة الظهارية الكلى والخلايا الليفية الجنينية مثقف (MEF) المستمدة من Bbs7 - / - الفئران (. المواد التكميلية الشكل S3 والبيانات لا تظهر)، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية أن يكونوا قد يكون خفية العيوب الهيكلية، مثل التغييرات بعد التعديل في الأنابيب الدقيقة.

Bbs7 - / - الفئران يكون غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية

أثبتنا سابقا لعدم وجود الحيوانات المنوية الأسواط في Bbs1 M390R / M390R knockin، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛. Mykytyn وآخرون، 2004؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - كشفت الخصيتين ندرة الحيوانات المنوية سياط (الشكل 3A، B.). نحن صقلها على هذه الملاحظة عن طريق تلوين المناعي من أنسجة الخصيتين. في حين أن معظم الحيوانات المنوية من Bbs7 - / - الفئران تفتقر إلى ذيل سوطي، وبعض من الحيوانات المنوية لديهم سياط تالف. هذه الأسواط غير طبيعي في كثير من الأحيان تشكيل هيكل حلقة نوع (الشكل 3C-F). لدراسة هذه الآفة تالف في مزيد من التفاصيل، أجزاء من النوع البري وBbs7 - / - تم تحليل الخصيتين بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). الهياكل microtubular والألياف الكثيفة الخارجية المحيطة هيكل microtubular في قطعة الرئيسي غير منظمة إلى حد كبير في المسوخ (الشكل الجيل الثالث 3G، H). في بعض الأحيان لاحظنا العادية 9 + 2 الهياكل axonemal في Bbs7 - / - الفئران (8،8٪ مقابل 100٪ في البرية من نوع، P <0.01). في المقابل، فإن الهياكل axonemal من أهداب متحركة في القصبة الهوائية من Bbs7 - / - الفئران طبيعية إلى حد كبير عن طريق تحليل TEM (المواد التكميلية الشكل S4.).

تين. 3.
Bbs7 - / - الفئران لها غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية (A، B) H & E الملون القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - أظهرت (B) الأنابيب المنوية عدم وجود الحيوانات المنوية سياط. أظهر (C-F) مناعي تلطيخ الخصيتين سياط باستخدام المضادة للالأسيتيل-α تويولين تلطيخ عيوب في Bbs7 - / - الفئران. في كثير من الأحيان ولوحظ وجود نوع من عصابة هيكل أنيبيب في Bbs7 - / - الفئران. C و D الصور وانخفاض القوة، E و F هي صور عالية الطاقة. (G، H) تحليل TEM من المقطع العرضي البرية من نوع (G) وBbs7 - / - (H) الحيوانات المنوية سياط يكشف أن Bbs7 - / - سياط الحيوانات المنوية لا يكون نموذجي 9 + 2 axonemes، ولكن تظهر الهياكل أنيبيب غير منظمة (السهم) والألياف الكثيفة الخارجي (رأس السهم) المحيطة الهياكل microtubular. أشرطة النطاق: 100 ميكرون (A، B)؛ 50 ميكرون (C، D)؛ 20 </ emph> ميكرون (E، F)؛ 0.1 ميكرون (G، H).

مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome

منذ Bbs7 - / - الفئران لها الظواهر مماثلة لغيرها من BBSome الفئران فرعية خروج المغلوب وBBS7 هو وحدة فرعية من BBSome، ونحن التحقيق آثار خسارتها على تشكيل BBSome. والمثير للدهشة، وكانت مستويات البروتين BBS2 بشكل ملحوظ انخفضت في Bbs7 - / - الخصيتين لست] البروتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين. وبالمثل، فقد انخفضت مستويات البروتين BBS7 في Bbs2 - / - الخصيتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين (الشكل 4A.). لتحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى تدهور البروتين أو انخفضت النسخ، كنا نصف الكمية RT-PCR لتقييم Bbs2 وBbs7 مرنا مستويات التعبير. نحن لم تراع الفوارق التعبير عن Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الخصيتين أو الاختلافات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الخصيتين مقارنة مع الضوابط (الشكل 4B.). معا هذه النتائج تشير إلى أن BBS2 وBBS7 الخلافات مستوى البروتين تنتج عن الاختلافات في استقرار البروتين، والتي BBS2 وBBS7 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار.

تين. 4.
مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. (A) BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. أظهرت هي البقع الغربية من إجمالي لست] البروتين من النوع البري (WT)، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs7 - / - الخصيتين. ويظهر تحليل (B) RT-PCR أي تغييرات واضحة في مستويات Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الفئران ولا تغييرات في مستويات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الفئران. (C) وBBSome لا تشكل في BBS الخصيتين الماوس خروج المغلوب. أظهرت هي البقع الغربية من البروتينات الخصيتين immunoprecipitated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS1. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome أخرى مع الأجسام المضادة ضد مفارز BBSome الفردية. واستخدمت كميات متساوية من البروتين الأولي من الخصيتين lystaes للمناعي. (D) تحليل الانحدار السكروز من البروتين لست] الخصيتين تثبت أنه لا يوجد أشكال BBSome في غياب BBS7. (E) فقدان تشكيل BBSome في خلايا الكلى مثقف من BBS الفئران خروج المغلوب وBBS2 انقاذ BBSome تشكيل في Bbs2 - خلايا الكلى - /. أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من مختلف الفئران خروج المغلوب BBS المصابين اتش معربا عن FLAG-BBS2. وهي lysed الخلايا المصابة وتم سحب البروتينات أعرب بنسبة مكافحة FLAG الأجسام المضادة. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة الغربية. (F) FLAG-BBS7 (WT والمسوخ) كانت المشترك مع transfected BBS2 الموسومة MYC إلى خلايا 293T والتفاعل بين BBS7 وBBS2 كان يعاير من قبل المشارك مناعي وكميا بواسطة يماغيج. و transfected (G) FLAG-BBS7 (WT وH323R طفرة) في الخلايا 293T وتم سحب البروتينات transfected أسفل عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. تم تحديد وجود مفارز BBSome الذاتية من قبل، BBS2، BBS4 وBBS7 الأجسام المضادة BBS1 المضادة. وتم قياس كمية مبالغ BBS1، BBS2، BBS4 وBBS7 التي كتبها يماغيج.

ترابط BBS2 وBBS7 للاستقرار البروتين يتسق مع النتائج تبين أن BBS2 يتفاعل جسديا مع BBS7 ويشكل subcomplex (Nachury وآخرون، 2007). ومن المثير للاهتمام، BBS7 وBBS2 مشاركة ملفوف لفائف تناظر تسلسل المجال في المناطق الوسطى من (المواد التكميلية الشكل S5). لم يكن مطلوبا من BBS7 ملفوف لفائف مجال للربط إلى BBS2. بدلا من ذلك، يطلب من الأحماض الأمينية 200-C النهائي للBBS7 للربط إلى BBS2 (المواد التكميلية الشكل S5A). وبالمثل، المجال ملفوف لفائف من BBS2 غير مطلوب على الاطلاق للتفاعل مع BBS7، ولكن فقدان هذا المجال يقلل من التفاعل مع BBS7 (المواد التكميلية الشكل S5B). وعلاوة على ذلك، فإن حذف المنطقة ملفوف لفائف في BBS7 لا يعطل تفاعلها مع غيرها من الوحدات الفرعية BBSome الذاتية. البروتين BBS2 مع حذف المنطقة ملفوف لفائف يعطل التفاعل مع بعض مفارز BBSome الذاتية (BBS7) مع الحفاظ على القدرة على التفاعل مع مفارز BBSome أخرى (BBS1 وBBS9) (المواد التكميلية الشكل S5C).
لدراسة تشكيل BBSome في غياب BBS7، أجرينا مناعي مع الأجسام المضادة ضد BBS1، واحدة من مفارز من BBSome. وقد انخفض وجود مفارز BBSome أخرى في BBS1 سحب هبوطا أو غير قابلة للكشف في غياب BBS7 أو BBS2 كما يتبين من لطخة غربية. هذا يدل على أن BBSome سليمة غير مشكلة في غياب BBS7 (الشكل 4C). أكدنا أيضا هذه النتائج عن طريق تحليل الانحدار السكروز من إجمالي لست] البروتين من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين (الشكل 4D).
للتحقيق في ما إذا كان شرط من BBS7 لتشكيل BBSome هي فريدة من نوعها لأنسجة الخصيتين، ونحن عزل الكلى الخلايا الظهارية الأولية من كلا من النوع البري وBbs7 - / - الفئران وإصابة الخلايا المستزرعة مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. نحن انزلوا العلم BBS2 والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية باستخدام أجسام مضادة لمكافحة BBS (الشكل 4E). وجدنا أن في غياب البروتين BBS7، ويتم تشكيل أي BBSome كامل (ناقص BBS7)، على الرغم من أن بعض المكونات BBSome لا تزال تشكل subcomplex. إذا كانت هذه subcomplexes تزال تحتفظ ببعض المهام المتبقية هي مسألة الفائدة.
لتقييم تأثير على تشكيل BBSome من متماثل الطفرات BBS7 مغلطة (T211I وH323R) وجدت في المرضى الذين يعانون BBS، نحن اختبار ما إذا كان BBS7 تحتوي على هذه الطفرات يمكن إدراجها في BBSome. ويظهر تحليل النشوء والتطور أن هذه الطفرات تقع في مناطق محمية من البروتين. ونحن إنشاء بنيات BBS7 تحور بواسطة الطفرات موقع الموجه والموسومة لهم FLAG في N-محطة من البروتينات. انخفضت البروتينات BBS7 تحور القدرة على التفاعل مع BBS2 كما يتبين من شارك في مناعي عندما transfected المشارك في الخلايا 293T (الشكل 4F). طفرة مغلطة BBS7 H323R قد تراجع في القدرة على هدم مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع من النوع البري BBS7 البروتين (الشكل 4G). تم الحصول على نتيجة مماثلة مع متحولة بروتين T211I (تشانغ وآخرون، 2012b). وتشير هذه النتائج إلى أن الطفرات BBS7 مغلطة تؤثر BBSome تشكيل. وهذا يوفر تفسيرا لماذا هذه الطفرات نقطة متماثل تسبب BBS. في المقابل، لم غياب BBS7 لا تؤثر على مستويات البروتين من مكونات معقدة IFT أو IFT تشكيل معقد (المواد التكميلية الشكل S6A، B). لم فقدان BBS7 لن يؤثر IFT البروتين الهدبية توطين (المواد التكميلية الشكل S6C)، بما يتفق مع الحقائق التي فقدان الجينات BBS ديها الظواهر أكثر اعتدالا من ذلك من فقدان الجينات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف إذا كان معدل حركة IFT هو تغييرها.

غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين مستقبلات الذوق، polycystin-1 أو polycystin-2

ومن المعروف أن BBSome تشارك في نشوء حيوي غشاء أهداب من خلال Rab8. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من BBS الجينات في النتائج الزرد في عيوب في الحويصلة Kuffer وإلى الوراء تأخير النقل جسيم ميلانيني. وعلاوة على ذلك، فقد BBS البروتينات النتائج في تراكم عنصر الصوتية مسار القنفذ مملس (SMO) داخل أهداب دون تفعيل المسار (تشانغ وآخرون، 2012A). هذه الدراسات تدل على أن البروتينات BBS تعمل في الاتجار محدد الحويصلة. وقد تبين أن البروتينات أهداب الأخرى ذات الصلة مثل AHI1 وتشارك FUZZY في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لأهداب الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛ هسياو وآخرون، 2009.). لاختبار ما إذا تشارك BBS7 في الغشاء العام الاتجار البروتين، درسنا مسارات الإلتقام-بالكلاذرين مستقلة وتعتمد على بالكلاذرين في مثقف من النوع البري وBbs7 - / - الخلايا الأولية الكلى باستخدام fluorophore المسمى السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة كعلامات على التوالي. تم الكشف عن عدم وجود اختلافات من السم الكوليرا أو ترانسفيرين مستقبلات الإلتقام بين النوع البري وBbs7 - / - الخلايا (المواد التكميلية التين S7، S8). ويتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام خلايا MEF من النوع البري وBbs7 - / - الفئران. وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs7 ليست متورطة في الاتجار حويصلي العام، ولكن بدلا تشارك في أنواع معينة من الاتجار حويصلي مثل جسيم ميلانيني النقل في الزرد و / أو الاتجار إلى وجهات التحت خلوية محددة مثل الأغشية الهدبية.
بعد ذلك، درسنا الهدبية غشاء الاتجار البروتين في الخلايا فارغة Bbs7. وقد تم مؤخرا أظهرت مستقبلات الطعم المر للتوطين لغشاء الهدبية في أهداب متحركة من ظهارة الهوائية والذوق مستقبلات الأشكال ترتبط عدوى الجهاز التنفسي (لي وآخرون، 2012.؛ شاه وآخرون، 2009.). رغم عدم وجود النمط الظاهري واضح في الكلى، وقد تبين وجود ارتباط طعم مستقبلات مرير مع نوع معين من اعتلال الكلية، البلقان المتوطنة إعتلال الكلى، (التغطية بالخشب وآخرون، 2012). لاختبار إذا يتم ترجمة مستقبلات الطعم المر أيضا إلى غشاء أهداب الابتدائي، ونحن ملطخة خلايا الكلى مثقف مع الأجسام المضادة ضد مستقبلات الطعم المر T2R4 وT2R43 جنبا إلى جنب مع أهداب علامة الأسيتيل α تويولين. وأظهرت النتائج أن مستقبلات الطعم المر توطين لغشاء أهداب الكلى الابتدائي (المواد التكميلية الشكل S9A-C). مستقبلات الذوق وظيفية كما يتضح من العلاج مع ديناتونيوم مجمع المر للحصول على 2+ استجابة الكالسيوم (المواد التكميلية الشكل S9I). من المذكرة، لم فقدان Bbs7 لن يؤثر على توطين أهداب من هذه المستقبلات (المواد التكميلية الشكل S9D-F)، ولا يؤثر على الكالسيوم 2+ تعبئة عندما حفز مع مجمع المر ديناتونيوم (المواد التكميلية الشكل S9J)، مشيرا إلى أن BBS7 و غير مطلوب BBSome لتوطين الغشاء الهدبي أو وظيفة مستقبلات الطعم المر.
طفرة من عدة بروتينات الغشاء الهدبية بما في ذلك polycystin-1، polycystin-2، وMecklin (MKS3)، يسبب الأمراض التي تصيب الإنسان مع الظواهر التي تتداخل تلك BBS. ولذلك، فإننا التحقيق في توطين كلا polycystin-1 وpolycystin-2 في تربيتها Bbs7 - / - خلايا الكلى الأولية باستخدام الأجسام المضادة ضد polycystin-1 وpolycystin-2. غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin 2 (الشكل 5). حقيقة أن Bbs7 - / - الفئران لا تتطور الكيسات الكلوية إلى أن polycystin-1 وpolycystin-2 لا تزال وظيفية، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية عيوب وظيفية خفية في غياب BBS7.

تين. 5.
غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin-2. (A-L) أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من النوع البري (A-C، G-I) وBbs7 - / - (D-F، J -L) الفئران ملطخة مكافحة الأسيتيل α تويولين (الخضراء) كعلامة أهداب ومضادة للpolycystin-1 (A-F؛ أحمر) ومضادة للpolycystin 2 (G-L، أحمر) الأجسام المضادة. أشرطة النطاق: 10 ميكرون.

غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات الغشاء الهدبي

وقد أظهرت الدراسات الجينية في الكائنات النموذج الذي فقدان البروتينات BBS تؤدي إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل في الزرد، IFT عيوب تحول في الطرف الهدبية في C. ايليجانس، وتراكم يشير البروتينات داخل الأسواط في كلاميدوموناس، وتراكم مملس داخل أهداب في الفئران (Lechtreck وآخرون، 2009.؛ وي وآخرون، 2012.؛. الين وآخرون، 2006؛ تشانغ وآخرون، 2012A). ولذلك، فإننا التحقيق مستقبلات الذاتية التي قد تتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - الفئران. وقد تبين أن مستقبلات الدوبامين D1 (D1R) تتراكم في أهداب في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). لتحديد ما إذا D1R يتراكم في أهداب في Bbs7 - / - الفئران، ونحن ملطخة أقسام الدماغ من النوع البري وBbs7 - / - الفئران مع العصبية ACIII أهداب علامة والأجسام المضادة ضد D1R. لا يمكننا العثور على أي تلطيخ الهدبية من D1R في البرية من نوع الدماغ (الشكل 6A-C). في المقابل، وجدنا مناطق متعددة بما في ذلك المخطط واللوزة حيث يموضع D1R لأهداب في Bbs7 - / - (الدماغ الشكل 6D-F). وتشير هذه البيانات إلى أن BBSome يمكن أن تنظم النقل إلى الوراء من D1R داخل أهداب الخلايا العصبية وفقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

تين. 6.
فقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للمستقبلات الدوبامين D1 داخل الأهداب. (A-F) أقسام الدماغ من النوع البري (A-C) وBbs7 - / - كانت ملطخة (D-F) الفئران مع مكافحة ACIII الأجسام المضادة ( الأحمر) كعلامة أهداب الخلايا العصبية ومكافحة D1R الأجسام المضادة (الخضراء). D1R يتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - مخ الفأر مقارنة البرية من نوع السيطرة. شريط النطاق: 20 ميكرون.

نقاش

وهدب هو عضية الهامة التي تلعب أدوارا متعددة خلال التنمية وفي التوازن من أنسجة البالغين. أهداب متحركة مهمة لوظائف مثل إزالة المخاط من الرئتين والدورة الدموية من السائل الشوكي الدماغي من خلال البطينين الدماغي، في حين أهداب الأساسي والمهم لchemo- والميكانيكية والإحساس، وكذلك القنفذ وWNT نقل الإشارة. وسلط الضوء على أهمية أهداب التي كتبها النتائج أن أهداب عطل يساهم في مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان المعروفة باسم ciliopathies التي تشمل متلازمة بارديه-بيدل.
BBS هو اضطراب عديد المظاهر التي تنطوي على العديد من أجهزة الجسم. بعض الظواهر BBS مثل السمنة، وتنكس الشبكية، والسكري، وارتفاع ضغط الدم لديها معدلات انتشار عالية في عموم السكان. ولذلك، فإن دراسة BBS يوفر فرصة فريدة من نوعها للكشف عن بعض مسارات الكامنة أو التأثير على هذه الأمراض الشائعة. BBS خروج المغلوب الفئران تحاكي النمط الظاهري البشري، وبالتالي توفير أداة مفيدة لاكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا المرض فضلا عن اختبار علاجات جديدة.
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا تشترك الظواهر BBS مشتركة، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. الأهم من ذلك، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر (كرمي وآخرون، 1995). وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، قد يكون الجينات BBS مختلفة ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هو جزء لا يتجزأ من BBSome ويتفاعل مع مجمع BBS chaperonin، وهي نتيجة فريدة من نوعها لBBS7 بين BBSome البروتينات جسديا. غياب BBS7 يؤثر على استقرار البروتين من BBS2 ويمنع تشكيل BBSome سليمة. ومع ذلك، لا تزال تشكل أهداب الابتدائية في غياب BBS7. على عكس بالضربة القاضية جين IFT، التي أهداب لا تشكل ويؤدي إلى الفتك الجنينية في الفئران، Bbs7 - / - الفئران يمكن البقاء على قيد الحياة إلى سن الرشد وأهداب الابتدائي لا تزال تشكل في الأنسجة بما فيها الكلى والجزر من البنكرياس، والقناة البنكرياسية، في الظهارية الكلوي مثقف الخلايا والخلايا الليفية. وعلى النقيض من أهداب الابتدائي، أهداب متحركة من خلايا البطانة العصبية بطانة البطينات الدماغية والحيوانات المنوية لديهم سياط عيوب خطيرة في Bbs7 - / - الفئران. أهداب متحركة المعيبة ليست بسبب وventriculomegaly المتقدمة في غياب BBS7 منذ أهداب عيب متحركة تطوير في وقت مبكر من 3 أسابيع في ependyma الدماغ. لا تفعل تظهر أهداب متحركة المعيبة أن يكون السبب الرئيسي للventriculomegaly. تطوير غير طبيعي للخلايا العصبية السلف قد تكمن وراء تطوير ventriculomegaly في هذا النموذج الماوس كما هو موضح لنماذج أخرى الماوس BBS لأن كلا BBS7 وBBS1 تعتبر ضرورية لسلامة BBSome (كارتر وآخرون، 2012). غياب BBS7 لا يؤثر على تشكيل المجمعات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف ما اذا تأثر الحركة من الجسيمات IFT التي كتبها غياب BBSome. ويبدو أن الجينات BBS والجينات IFT أن تؤثر على جوانب مختلفة من وظيفة الهدبية. نتائجنا في الفئران تتسق مع نتائج كلاميدوموناس، وتسليط الضوء على التفاعل بين BBSome ومجمع IFT (Lechtreck وآخرون، 2009).
أثبتنا أن BBS7 البروتين إيواء الطفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS7 (T211I وH323R) لديه قدرة انخفضت إلى تشكيل BBSome مقارنة مع البروتين BBS7 العادي. الأساليب المستخدمة هنا يمكن أن توفر نظام فحص خلية القاعدة فعال لتقييم طبيعة الطفرات مغلطة BBS الإنسان في المختبر.
في الآونة الأخيرة أظهرت الدراسات أن الجينات ذات الصلة أهداب، مثل AHI1 وغامض، وتشارك في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لالهدبية الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛. هسياو وآخرون، 2009). في المقابل، غياب BBS7 لا يؤثر على مسارات إما مستقلة بالكلاذرين وأو بالكلاذرين الإلتقام يتوقف. وبالمثل، وغياب أو طفرة من البروتينات BBS لا تؤثر على مسار إفرازية العام للبروتينات الغشاء بما في ذلك SST3R وترانسفيرين مستقبلات غشاء البلازما (جين وآخرون، 2010) (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن الاتجار حويصلة العامة لا يبدو أن يتطلب BBS7 أو BBSome والاتجار بروتينات معينة أو من غشاء البلازما يمكن أن يثير الشبهة في غياب BBSome. ومن الأمثلة على الاتجار مستقبلات اللبتين، وهو ما ثبت للتفاعل مباشرة مع BBSome (سيو وآخرون، 2009). ومن المثير للاهتمام، في C. ايليجانس، وفقدان BBS الجينات يؤدي إلى زيادة إطلاق سراح الحويصلات كثيفة الأساسية والأنشطة المعززة للأنسولين، نيوروبيبتيدي، وأمين مسارات إشارات الاحيائية (لي وآخرون، 2011). نستنتج أن BBS7 وبالتالي BBSome لا تشارك في الهدبي الاتجار العام بروتين الغشاء بل في محدد الغشاء الهدبي الاتجار البروتين. ويستند هذا الاستنتاج على ملاحظة أن الهدبية بروتينات غشاء مثل polycystin-1، polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر لا تزال المترجمة إلى غشاء الهدبية في الغياب التام للبروتين BBS7، وهو مطلوب لBBSome التجمع. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدلائل إلى أن polycystin-1، لا تزال polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر وظيفية في غياب BBS7. في المقابل، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم SMO داخل أهداب دون تحفيز SMO يجند (تشانغ وآخرون، 2012A). وقد ثبت الأخرى بروتينات الغشاء الهدبي بما في ذلك SST3R وMCHR1 لتوطين لأهداب الخلايا العصبية في ظل ظروف طبيعية، ولكن ليس في غياب BBS2 أو BBS4 (Berbari آخرون، 2008A.؛ Berbari وآخرون، 2008b.). ومع ذلك، فإن غياب BBS7 لا يؤثر توطين الهدبي إما SST3R أو MCHR1 في الخلايا العصبية في الدماغ أو في الخلايا المستنبتة من Bbs7 - / - الفئران (لا تظهر البيانات). في المقابل، تراكمت D1R داخل أهداب في غياب BBS7، على غرار النتائج في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). تراكم D1R داخل أهداب قد يرجع ذلك إلى النقل إلى الوراء تغير من D1R داخل أهداب في غياب BBS7. ودعما لهذا الاحتمال، وأظهرت الدراسات الجينية في الزرد إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل عند التعبير عن BBS يتم منع الجينات (الين وآخرون، 2006). وعلاوة على ذلك، SMO يتراكم داخل أهداب دون التحفيز يجند في غياب BBSome (تشانغ وآخرون، 2012A). تأخر نقل إلى الوراء يمكن أن تنجم عن النشاط تغير المحرك، خلل في مجمع IFT أو تتغير بنية أهداب axonemal، أو تغيير معين في قدرة بعض الشحنات للخروج من هدب. دراسات في C. ايليجانس تشير إلى أن البروتينات BBS بمثابة linkers بين مجمع IFT B ومجمع IFT A (Blacque وآخرون، 2004). وفقدان البروتينات BBS يؤدي إلى وظيفة غير لائقة المجمعات IFT. ودعما لهذا الاحتمال، المسوخ مضاعفة من Bbs7 وTg737orpk تفتقر تماما أهداب، تشبه مجمع IFT B بالضربة القاضية الحقيقية (تشانغ وآخرون، 2012A). بدلا من ذلك، أهداب الأساسي من المسوخ Bbs7 قد يكون لها أيضا خفية خلل في بنية axonemal التي قد تسهم في تراكم D1R داخل الأهداب. أهمية وظيفية من تراكم D1R داخل أهداب غير معروفة حاليا. وقد تبين أن المرضى BBS وBBS الفئران خروج المغلوب زادت القلق والاكتئاب (بارنيت وآخرون، 2002.؛ Eichers وآخرون، 2006.). ومن المثير للاهتمام، انسداد D1R السرقة مع الأدوية الموهن مكيفة التجمد (اختبار الخوف مشروط) أثناء الاختبار الاستبقاء (Guarraci وآخرون، 1999a... Guarraci وآخرون، 1999b). توطين D1R في مناطق الجسم المخطط واللوزة تشير إلى أن الدوبامين إشارات قد تلعب دورا لعيوب السلوك التي لوحظت في نماذج الماوس BBS والمرضى BBS.

المواد والأساليب

الكواشف والأجسام المضادة

وقد تم الحصول على الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS2 الببتيد DKTARYWRIK والأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS7 الببتيد VLQERENYQQ من توسيع النظم البيولوجية (هانتسفيل، AL). وكانت هذه الأجسام المضادة النقاء تقارب والتحقق منها في الفئران خروج المغلوب. وحيدة النسيلة المضادة للبيتا تويولين، بولكلونل مكافحة β-الأكتين، وحيدة النسيلة المضادة للالأسيتيل تويولين، وحيدة النسيلة المضادة للγ تويولين، بولكلونل الأرنب تم شراؤها مكافحة BBS8 وBBS9 من سيغما (سانت لويس، MO). تم شراء الماعز المضادة للBBS1 (N-20)، الماعز المضادة للBBS2 (C-16) الأجسام المضادة، والفأر مكافحة D1R الضد من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، CA). تم شراؤها لمكافحة T2R4 الضد الأرنب بولكلونل والأرنب المضادة للT2R43 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة من العلم الحرارية (بيتسبرغ، PA). تم شراؤها اليكسا 488 مترافق السم الكوليرا واليكسا 568 البشرية مترافق نقل مستقبلات من إينفيتروجن (كارلسباد، كاليفورنيا). وكان الأرنب بولكلونل المضادة للpolycystin-1 هدية من الدكتور أوكسانا Ibraghimov-Beskrovnaya (شركة جنزايم). كان الأرنب بولكلونل مكافحة polycystin-2 الأجسام المضادة هدية من الدكتور ستيفان Somlo (جامعة ييل)، والدكتور غريغوري Pazour (مدرسة الطب بجامعة ماساتشوستس).

جيل من Bbs7 الفئران خروج المغلوب

تم استخدام PCR لتضخيم 5 'و 3' مناطق Bbs7 الجينات من 129 / SVJ الحمض النووي الجيني والمستنسخة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC). تم خطي ناقلات و electroporated إلى R1 الجذعية الجنينية (ES) خلايا (129 × 1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). كما تم عرض G418 واستنساخ مقاومة للganciclovir التي كتبها بعيد المدى PCR لتحديد خطوط الخلايا ES المستهدفة بشكل صحيح. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES مستقلة لإنتاج الوهم. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Bbs7 الفئران متخالف على خلفية وراثية مختلطة من قبل التزاوج مع C57BL / 6J الفئران. تم intercrossed الفئران متخالف، وكان التنميط الجيني لسلالة بواسطة PCR. جميع الدراسات انضمت إلى المبادئ التوجيهية الموضوعة لرعاية واستخدام حيوانات التجارب وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR

تم عزل الحمض النووي الريبي من العمر 2.5 شهرا من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين الماوس باستخدام TRIzol كاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). وقد أعد كدنا] من 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مرتفع الثالث الناسخ العكسي (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا).

تحليل لطخة غربية

من النوع البري وBbs7 تعطلت الخصيتين متحولة من قبل TISSUEMISER (فيشر العلمية، بيتسبرغ، PA) في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100 و مثبط البروتياز من روش، انديانابوليس، IN). تم تجميد الأنسجة تعطلت في النيتروجين السائل وإذابة في حمام الماء درجة حرارة الغرفة. وتكررت هذه الدورة تجميد أذاب ثلاث مرات. ثم تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة وتم قياس تركيز supernatants باستخدام بيو راد العاصمة فحص البروتين (هرقل، CA).
تم فصل البروتينات عن طريق الكهربائي باستخدام 4-12٪ المواد الهلامية NuPAGE مكرر تريس (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا)، يليه نقل إلى الأغشية النيتروسليلوز وتم الكشف عنها من قبل SuperSignal دورا مددت الركيزة (بيرس، روكفورد، IL).

التحليل النسيجي للBbs7 - / - الفئران

الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ العينين والخصيتين من العمر 4-8 شهرا Bbs7 أجريت متحولة والعمر كعينة ضابطة من حد وصفه. أقسام الدماغ الاكليلية من 60-100 ميكرون من العمر 4-8 شهرا Bbs7 - - / كانت ملطخة الحيوانات والعمر كعينة ضابطة مع محايد الأحمر وصورت مع stereomicroscope أوليمبوس SZX12 كما هو موضح (ديفيس وآخرون، 2007.).

دراسات الوزن

تناول الطعام في قفص فردي Bbs7 - - / تم مقارنتها مع الحيوانات Bbs7 +/- والحيوانات البرية من نوع السيطرة تتراوح أعمارهم 4-28 أسابيع باستخدام متوسط ​​ستة حيوانات في كل مجموعة. تم تسجيل الوزن بداية الأسبوعية عند الفطام.

نقل الإلكترون المجهري

تم perfused الفئران مع نصف القوة تثبيتي Karnovsky وتم تشريح الأنسجة وإصلاحها في نصف القوة تثبيتي Karnovsky لعدة ساعات قبل الأوسيميوم بعد التثبيت، والجفاف، وتضمينها في الإي بي 812. نقل الميكروسكوب الإلكتروني اتخذت كما هو موضح سابقا (سويديرسكي وآخرون آل.، 2007).

جيل من BBS2 البشري وBBS7 متحولة بنيات الحذف والطفرات نقطة

تم إنشاء BBS7 المسوخ الحذف عن طريق PCR والمستنسخة في التعبير الثدييات ناقلات pCS2 +. وتم التحقق من كل المسوخ الحذف عن طريق التسلسل المباشر. تم إنشاؤها الطفرات نقطة BBS7 بواسطة الطفرات موقع الموجه (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا) باستخدام N-محطة الموسومة FLAG من النوع البري BBS7 كقالب والتحقق من التسلسل.

مناعي

تفاضلي الموسومة الجينات BBS الإنسان و transfected المشارك في الخلايا 293T. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت هي lysed الخلايا في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100، ومثبط البروتياز، روش، انديانابوليس، IN) ونسج في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تم مسح supernatants من قبل الحضانة مع حبات بروتين G (بيرس، روكفورد، IL). وحضنت لست] مسح مع الأجسام المضادة ضد علامات المقابلة لمدة 4 ساعات. وبعد ذلك يضاف بروتين G الخرز والمحتضنة لمدة 4 ساعات أخرى. تم غسلها حبات أربع مرات مع العازلة تحلل وتم الكشف عن التفاعلات التي النشاف الغربي.

المناعي المجهري

تم إصلاح الخلايا في 4٪ paraformaldhyde في برنامج تلفزيوني أو ثابتة مع الميثانول البارد لمدة 5 دقائق (ل-γ تويولين صمة عار) وpermeabilized مع 0.2٪ تريتون X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. تم غسلها الخلايا 3 × PBS وسدوا مع عازلة تمنع (1٪ BSA في PBS). وكانت مخففة الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تم غسلها الخلايا 3 × PBS، سدت مع عازلة تمنع، ثم حضنت مع فلور اليكسا 488 أو فلور اليكسا 568 المسمى الأجسام المضادة الثانوية (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). كانت ملطخة النوى مع دابي (سيغما، سانت لويس، MO).

كلية زراعة الخلايا الأولية

الكلى من النوع البري وBbs7 - / - تم تشريح الفئران وتعقيمها قبل التنسيب إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 ثوان، ثم مفروم مع مقص. تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 دون المصل. 20 مل من pronase (1 ملغ / مل، روش، انديانابوليس، IN) وأضيف إلى الأنسجة والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 وحضنت مع 20 مل 1-× التربسين EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. تم مكعبات الأنسجة في 500 غ لمدة 5 دقائق وإعادة علقت في 30 مل DMEM / F-12 مع 10٪ مصل. كانت مطلية الأنسجة إعادة علقت في ثلاثة أطباق 10 سم مغلفة بولي-L-ليسين (سيغما، سانت لويس، MO).

السم الكوليرا وترانسفيرين مستقبلات الإلتقام

أجريت السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة المقايسات الإلتقام كما وصفها هسياو وآخرون. (هسياو وآخرون 2009).

التصوير الكالسيوم

تم إجراء التصوير الكالسيوم كما هو موضح سابقا (شاه وآخرون، 2009). خلايا الكلى مثقف من النوع البري وBbs7 - / - تم تحميل الفئران مع 1 ميكرومتر Fura2 صباحا، تم تقييم التغييرات تركيز الكالسيوم في ظهائر باستخدام مجهر مقلوب (نيكون الكسوف TE200، نيكون انسترومنتس، ميلفيل، NY)، والبيانات تم تحليلها باستخدام برنامج شيكل، عناصر (نيكون). تم تطبيق ديناتونيوم apically في تركيزات المشار إليها. تم استخدام برنامج تلفزيوني عن السيطرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #4  
قديم 11-23-2015, 09:28 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي استقلاب الطاقة في متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.nature.com/ijo/journal/v2.../0802420a.html

لخص

مقدمة: السمنة هي ميزة عرض ثابت من متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، وهو اضطراب وراثي ناجم عن خلل جيني واحد. وهذا يتناقض بشكل حاد مع السمنة العامة التي، على الرغم من عنصر وراثي قوي، لديه المسببات المرضية سياقاتها. لBBS، والتوصيف المظهري من مكونات توازن الطاقة وآثار ذلك على إدارتها لا يزال لا يتم التحقيق نسبيا.
الهدف: دراسة الحالات والشواهد لتحديد ما إذا كان استقلاب الطاقة في الموضوعات مع BBS يختلف من الضوابط السمنة يقابل وإبلاغ إدارة السريرية لهؤلاء المرضى.
الطريقة: ما مجموعه 20 شخصا يعانون من السمنة المفرطة وزيادة الوزن مع BBS (11 إناث و 9 ذكور) يقابل بالنسبة للعمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم ل20 شخصا دون BBS. وقد تم قياس معدل الأيض يستريح (RMR) من خلال الكالوري غير المباشرة، والنشاط الجسدي من قبل accelerometry CSA، وتكوين الجسم عن طريق تقنية الديوتيريوم تخفيف والمدخول الغذائي من خلال السجلات الطعام لمدة 7 أيام.
النتائج: كان هناك اختلاف كبير بين BBS والسيطرة المواضيع في الدهون في الجسم (الذكور:٪ من الدهون = 38، SD 2.8 مقابل 34، SD 9.1، الإناث:٪ من الدهون = 45، SD 5.9 مقابل 44، SD 8.1؛ P = 0.46] أو RMR المطلق. (الذكور: 6.95، SD 1.55 MJ / يوم مقابل 7.19، SD 1.28 MJ / يوم؛ P = 0.6) بعد التعديل للمساواة بين الجنسين والعمر والكتلة الخالية من الدهون وكتلة الدهون، لم يكن هناك اختلاف كبير في RMR بين BBS ومراقبة المواد (F (1، 30) = 0.91؛ P = 0.35). وقد لوحظ انخفاض مستوى النشاط البدني في المواد BBS (الأنابيب النانوية الكربونية متوسط ​​/ دقيقة 259، الربعية = 153) مقارنة بالمجموعة الضابطة (الأنابيب النانوية الكربونية متوسط ​​/ دقيقة = 306، الربعية = 119، P = 0.02). استهلاك الطاقة المبلغ عنها، وتكوين المغذيات الكبيرة وضخامة في الإبلاغ كانت مماثلة في المجموعتين.
الخلاصة: هذه الدراسة تكشف أي دليل على الاختلافات المنهجية في استقلاب الطاقة في الموضوعات مع BBS النسبي للأفراد يعانون من السمنة المفرطة الآخرين، مما يدل على أن الأساس الجيني للBBS لا يرتبط مع تشوهات معينة في عملية التمثيل الغذائي للطاقة. هذا اكتشاف مهم لإدارة السريرية ويدعم استخدام الوصفات الطاقة على أساس RMR للسكان يعانون من السمنة المفرطة العام مضافا إليه بدل المناسب للحصول على الطاقة التي أنفقت عبر النشاط البدني. هناك حاجة إلى مزيد من البحوث بشأن النشاط البدني في BBS.
الكلمات الدالة:

متلازمة بارديه-بيدل، توازن الطاقة، وتكوين الجسم، والتدبير العلاجي السريري

أعلى الصفحة مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب المتنحية autosomally تتميز الضمور قضيب مخروط، polydactyl خلف المحور، وصعوبات التعلم، وقصور الغدد التناسلية، تشوهات الكلى والسمنة. ويقدر انتشار BBS في سكان المملكة المتحدة في 1: 125 000 (Beales، بيانات غير منشورة)، على الرغم من معدلات أعلى من ذلك بكثير وقد لوحظ في السكان المعزولين محدد حيث القرابة هي ظواهر أكثر شيوعا، على سبيل المثال، 1:17 500 في نيو فاوند لاند ، 1 01:13 500 في البدو العرب. 2
A انتشار أعلى بكثير من السمنة (BMI ومن المعروف 30KG / م 2) موجودة في الموضوعات مع BBS (52٪) 3 مقارنة لعموم السكان (20٪) 4، ويفترض أن هذا يرتبط أيضا مع أمراض المصاحبة خطيرة. جمعية BBS (www.lmbbs.org.uk) وقد حددت السمنة باعتبارها واحدة من أهم السمات المؤلمة من متلازمة مع طلبات متكررة للمساعدة في إدارتها (باركر، اتصال شخصي، 1996).
على الرغم من هذه الأهمية، ولا يعرف سوى القليل من المسببات المرضية للسمنة في BBS، ولا سيما فيما يتعلق استقلاب الطاقة. فهم أكثر وضوحا من العوامل التي تقوم عليها التقلبات الطاقة قد يسمح بتطوير استراتيجيات إدارة أكثر يتناسب لاستخدامها في هذه الفئة من السكان فريدة من نوعها وكذلك امكانية توفير قدر أكبر من التبصر في المسببات المرضية للسمنة بهم.
السابق البحوث توازن الطاقة في حالة وراثية قابلة للمقارنة، متلازمة برادر ويلي (PWS)، قد توفر أدلة إلى العوامل الكامنة وراء المشاركة في السمنة المرتبطة BBS. وكان الدافع البحث في استقلاب الطاقة في PWS في البداية من قبل التقارير القصصية من الموضوعات التي تتطلب جدا مآخذ الطاقة المنخفضة لتسهيل فقدان الوزن. وتوجد تقارير مماثلة في BBS (Beales، اتصال شخصي، 1996).
في دراسة واحدة، ومجموع نفقات الطاقة (TEE)، وتقاس باستخدام الماء وصفت على نحو مضاعف، وجدت لتكون أقل 47٪ في الموضوعات مع PWS من نظيراتها يعانون من السمنة المفرطة (PWS، 8.27 MJ / يوم، SD 2.42 مقابل الضوابط يعانون من السمنة المفرطة، 15.47 MJ / اليوم، SD 3.42). 5 أكدت باقي مزيد من العمل مؤخرا هذه النتائج في البالغين PWS 6 والأطفال. 7 ومن الواضح أن هذه النتائج لها آثار في إدارة PWS السمنة مع انخفاض كبير الوصفات الطاقة اللازمة لإنقاص الوزن والصيانة. 8 ومع ذلك، هناك أيضا تقارير عن تخفيضات كبيرة في يستريح نفقات الطاقة بالنسبة لضوابط؛ على سبيل المثال، كان استهلاك الطاقة يستريح المطلق 5.36 1.18 MJ في PWS المراهقين مقارنة مع 6.38 1.55 MJ في الضوابط السمنة يقابل. 7 يعكس وخلص المحققون عموما أن أقل TEE لا تعكس الاختلافات في التمثيل الغذائي للطاقة، وخفض بدلا معدل الأيض يستريح المطلق تشوهات في تكوين الجسم مع انخفاض الكتلة الخالية من الدهون (بعثة تقصي الحقائق) لعمر في PWS مقارنة تتأثر الموضوعات. 5، 6 في الواقع عندما تطبيع لأصغر بعثة تقصي الحقائق، وقلص الفارق في RMR إلى 14٪. 5
وقد أكدت الأبحاث اللاحقة نسبة غير عادية من الدهون حر في كتلة الدهون (FM) في PWS. أظهر الكلي تحليل الجسم عن طريق المزدوج للطاقة الأشعة السينية قياس امتصاص (DXA) لبعثة تقصي الحقائق أقل من ذلك بكثير في مواضيع PWS البدينات مقارنة مع الوزن الطبيعي، والموضوعات nonaffected يعانون من السمنة المفرطة، مع ندرة قوسين أو أدنى من الأنسجة العجاف في الأطراف. 9 وبالمثل، وهي نسبة أعلى تم العثور على الدهون في الجسم في الدراسات التي تقارن PWS لضوابط السمنة 6، 9، 10 مع الدهون الزائدة المودعة غير معتادة في الأطراف البعيدة، وكذلك المنطقة جذعي. 11
كثيرا ما توضع التشابه بين PWS وBBS في إدارة السمنة مع وصفات الطاقة والاستراتيجيات الغذائية لاستخدامها في PWS تطبق عادة لإدارة الوزن في BBS، ولكن لا يوجد دليل على دعم لهذه الممارسة.
على حد علمنا، وهذا هو أول دراسة للتحقيق في استقلاب الطاقة في الموضوعات مع BBS. قياس استهلاك الطاقة يستريح المطلق، جنبا إلى جنب مع التدابير من النشاط البدني، ويسمح تقديرات الاحتياجات من الطاقة وهذا له تطبيقات سريرية هامة في إدارة السمنة في BBS. قياس مكونات الجسم يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للعوامل المحتملة التي ينطوي عليها التقلبات الطاقة المفترضة في BBS. وأخيرا، وتقييم استهلاك الطاقة المبلغ عنها وتكوين المغذيات الكبيرة في النظام الغذائي قد توفر بعض الأفكار في وجود أو طبيعة اختلالات تناول الطعام في BBS.

أعلى الصفحة المواد والأساليب

تصميم الدراسة والموضوعات

هذه الدراسة الحالات والشواهد قياس معدل الأيض يستريح، وتكوين هيئة والنشاط البدني وذكرت استهلاك الطاقة في المواد BBS والموضوعات السمنة nonaffected يقابل بالنسبة للعمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم.
تم الحصول على الموافقة الأخلاقية في ديسمبر 1996 من شرق لندن ولجنة أخلاقيات البحوث سلطة مدينة دبي الطبية. كما كانت جميع المواد BBS المكفوفين أو ضعاف البصر بشدة، وكانت كل المعلومات المتاحة على دراسة audiocassette وكذلك شكل ورقة الطباعة القياسية والكبيرة. ونظرا لصعوبات التعلم الخاصة بهم، والحرص الشديد، في وجود عامل قريب أو الرعاية، لشرح الدراسة وضمان أبلغت أن موافقة جيدا بما فيه الكفاية.
المواضيع

تطوع ما مجموعه 24 شخصا مع BBS للمشاركة في الدراسة وجود يجري تحديدها من قبل المحققين (CG، PB) من قاعدة بيانات جمعتها سابقا من 61 محتملة مؤهلة البالغين BBS. تم فحص جميع المواد للتأكد من أنها تستوفي المعايير التشخيصية لBBS، 3 ومعايير اختيار دراسة: BMI 25 كجم / م 2 والعمر 18 ص، ووزن الجسم 2 كغ في 2 أشهر المتابعة، أي حالة طبية أو الأدوية التي قد تؤثر على وزن الجسم، وتوازن السوائل أو عملية التمثيل الغذائي (مثل المنشطات، مدرات البول، والودي، هرمون الغدة الدرقية).
أربع مواد مع BBS لم تستوف معايير الاختيار واستبعدت للأسباب التالية: تشخيص مرض السكري من النوع الثاني (ن = 1)، العلاج ببدائل الغدة الدرقية (ن = 2)، وكبير تغير الوزن (ن = 1).
في كل شيء، 22 شخصا الملائمة للعمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم، ولكن يتأثر BBS أو متلازمات أخرى محددة وراثيا المرتبطة بالسمنة، تطوعت للمشاركة التالية دعوة مباشرة والإعلان الملصق في عيادة السمنة في مستشفى لندن الملكي. تم استبعاد موضوعين بسبب فقدان الوزن كبيرة في الشهرين السابقين والعلاج ببدائل الغدة الدرقية.
القياسات

تم تسجيل وزن الجسم والطول مع المواد ارتداء ملابس خفيفة وليس الأحذية. وقد تم قياس وزن الجسم باستخدام مقياس رقمي الإلكترونية (سيكا ألفا سلسلة 770) بسعة 200 كجم ودقيقة لأقرب 0.1 كجم. وقد تم قياس ارتفاع استخدام Holtain الحائط صتدمتر دقيقة لأقرب 0.5 سم. وقد تم قياس محيط الخصر في منتصف الطريق في خط منتصف الإبط بين أدنى حافة القفص الصدري وعرف الحرقفة. 12
وقدرت كتلة الدهون وبعثة تقصي الحقائق باستخدام تقنية التخفيف الديوتيريوم لقياس ماء الجسم الكلي. 13 وقد تم قياس Predose تخصيب الديوتيريوم في الماء الجسم في عينة اللعاب الأساسية التي تم الحصول عليها من كل موضوع باستخدام salivette. ثم اعطيت الموضوعات للشرب، وذلك باستخدام القش، ما يقرب من 0.35 مول 2 H 2 O في 100 مل من الماء في زجاجة preweighed. على الانتهاء، وكان ممرود القشة في زجاجة فارغة وزجاجة reweighed. وسجلت وقت الجرعات الديوتيريوم وكمية معينة. في 4 ساعات بعد الجرعة، تم أخذ عينة اللعاب الثانية في وحدة البحوث. وقدمت المواضيع مع اثنين salivettes أخرى، وطلبت أن يتبع نفس الإجراء لجمع عينات من اللعاب في 5 و 6 ساعات. وقدم حزمة المدفوعة مسبقا للعودة العينات، التي تم طرد في وقت لاحق والمجمدة.
وقد تم قياس 2 H تخصيب اليورانيوم في عينات اللعاب في MRC الإنسان بحوث التغذية، كامبريدج، المملكة المتحدة باستخدام نسبة النظائر مطياف الكتلة بعد حالة توازن مع H 2 الغاز كما هو موضح في مكان آخر. 14 تم احتساب 2 H مساحة 2 التخفيف باستخدام معادلات نشرت سابقا 13 وانخفضت بنسبة 4٪ لحساب تبادل الديوتيريوم مع الهيدروجين لامائي. 15، 16 وكان من المفترض أيضا أن حسابات المياه عن 71.94٪ من بعثة تقصي الحقائق. تم حساب الدهون في الجسم والتي تمثل الفرق بين وزن الجسم وبعثة تقصي الحقائق.
وقد تم قياس RMR باستخدام منهجية سبق نشرها. 17 ومعايرة Deltatrac II جهاز التمثيل الغذائي باستخدام معايرة الغاز التلقائية ومحدد التدفق وضعت في مجموعة الكبار. تم إجراء القياس في الصباح الباكر، في غرفة هادئة على وحدة البحوث بعد المواد قد صام بين عشية وضحاها (12 ساعة أو أكثر دون المواد الغذائية والسوائل الحرارية أو السجائر).
ونصح المواضيع على ارتداء ملابس خفيفة والاسترخاء على الأريكة قبل بدء القياس بعد أن سبق إطلاع على المعدات. وقد تم قياس تبادل الغازات في الجهاز التنفسي أكثر من 30 دقيقة.
وقد تم قياس النشاط البدني باستخدام نموذج actigraph CSA سئل 7164. الموضوعات لارتداء الشاشة من وقت يتزايد فيه في الصباح حتى الذهاب إلى الفراش في المساء لمدة 7 أيام متتالية. وأعرب عن البيانات التي تم جمعها كما تهم النشاط في الدقيقة (الأنابيب النانوية الكربونية / دقيقة).
كان استهلاك الطاقة باستخدام طعام يومية لمدة 7 أيام، تتزامن مع تدابير النشاط البدني المبلغ عنها ذاتيا. وطلب من الموضوعات لجعل سجلات مفصلة لجميع المواد الغذائية والمشروبات في وقت الاستهلاك. 18 وكان تعديل أسلوب اليوميات الغذاء القياسية اللازمة في موضوعات BBS بسبب الصعوبات التي يواجهونها البصرية. سجلت الموضوعات تناول طعامهم لمدة 7 أيام باستخدام الإملاء 19، 20، وكان كتب من المعلومات من قبل المحقق (CG). ومن المسلم به أن هذا التعديل قد أدخلت خطأ عشوائي إضافية. وقدرت أحجام جزء باستخدام التدابير المنزلية وإذا لم يكن جزء حجم المتاحة، وجرى الاستعاضة عن متوسط ​​أحجام جزء. وقد تم تحليل سجلات النظام الغذائي باستخدام الإصدار Microdiet 8 برنامج للحصول على الطاقة الإجمالية، من اجمالي الكربوهيدرات والدهون والبروتين.
تم تقييم معقولية من الطاقة المأخوذة أفادت باستخدام غولدبرغ قطع. 21 وأفاد متوسط ​​EI (EI ممثل) للمجموعتين ومقارنة مع PAL المتوقع للسكان. كما خطأ متأصل في قياس RMR، EI وPAL، حسبت حدود الثقة باستخدام الصيغة التي سبق وصفها. 21
فقط 16 من أصل 20 موضوعا BBS الانتهاء مرض الديوتيريوم تخفيف تقييم تكوين الجسم. تستند البيانات المتعلقة RMR تعديل لتكوين الجسم على بيانات من 16 شخصا BBS و 20 الضابطة. وأبلغ جميع البيانات الأخرى لجميع المواد الدراسية 20 مع BBS وضوابطها يقابل.
كانت دقة القياسات نسبة النظائر لعينات predose 0.19 جزء في المليون جرعة بمتوسط ​​قيمة 151.6 جزء في المليون. وكانت القيم المقابلة للجرعة عينات آخر 0.55 جزء في المليون التنمية المستدامة في 291.9 جزء في المليون.
تم احتساب دقة بعثة تقصي الحقائق والجسم قياسات الدهون حيث بلغ متوسط ​​السيرة الذاتية٪ من القيم المحسوبة من القياسات 4 و 5 و 6 ساعات من النظائر التخفيف. وكانت القيم 1.1٪ لبعثة تقصي الحقائق و 1.8٪ للFM.
القياس الإحصائي

وقد أجريت جميع التحاليل الإحصائية باستخدام SPSS النسخة 10 (SPSS، UK المحدودة).
تم استخدام النمذجة الخطية لوصف العلاقة الرياضية بين متغير النتيجة RMR وcovariables أخرى مثل العمر والجنس وأيضا لتحديد ما إذا كان تشخيص BBS تمثل أي اختلافات في RMR.
في التحليل وحيد المتغير التباين، تم إدخالها RMR كما تعتمد متغير والتشخيص ونوع الجنس كعوامل، والعمر، وبعثة تقصي الحقائق FM كمتغيرات. تم تقييم التفاعلات أيضا بين الجنسين وتكوين الجسم ومجموعة والمتغيرات تكوين الجسم.
تم استخدام ر -test مستقلة لتحديد ما إذا كان أي وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين BBS والضابطة في استهلاك الطاقة المبلغ عنها أو تكوين المغذيات الكبيرة من النظام الغذائي. تم حساب RMR لكل مجموعة ومقارنتها مع قطع من غولدبرغ لتحديد مدى نقص التقرير: إن متوسط ​​EI ممثل واحد. ونظرا لطبيعة اللامعلمية للبيانات النشاط، تم استخدام مان ويتني U -test لتقييم الفروق بين مستويات النشاط في المجموعتين.

أعلى الصفحة النتائج

الجدول 1 يوضح الخصائص عرض من الموضوعات مع BBS وضوابطها يقابل. كما هو مخطط لها، لم يلاحظ أي اختلاف كبير بين المجموعتين في العمر، الوزن أو الطول. لم يتم العثور على الاختلافات بين الجنسين ضمن المجموعة BBS أو السيطرة على الوزن، والعمر، ومؤشر كتلة الجسم أو الخصر.
الجدول 1 - الخصائص الفيزيائية للBBS والضابطة.

الجدول الكامل

الشكل 1 يوضح أنه لا يوجد اختلاف كبير في RMR المطلق بين BBS والضابطة (يعني RMR = 6.95، SD 1.55 MJ، 7.19، SD 1.28 MJ على التوالي، P = 0.6). كان وزير الخارجية وبعثة تقصي الحقائق أيضا مماثلة في المجموعتين (الذكور:٪ من الدهون = 38، SD 2.8 مقابل 34، SD 9.1، الإناث:٪ من الدهون = 45، SD 5.9 مقابل 44، SD 8.1؛ P = 0.46) (انظر الجدول 2) . عندما تم تصحيح RMR لبعثة تقصي الحقائق، لم يكن هناك اختلاف منهجي في الأيض بين المجموعات كما هو موضح في الشكل 2 (F (1، 33] = 0.13؛ P = 0.72).
الشكل 1.

Boxplot من RMR دون تصحيح categerised من قبل المجموعة.
الرقم الكامل وأسطورة (34 K)

الرقم 2.

العلاقة بين RMR وبعثة تقصي الحقائق من قبل المجموعة.
الرقم الكامل وأسطورة (63 K)

الجدول 2 - بيانات تكوين الجسم لBBS ومراقبة المواد تقاس تقنية الديوتيريوم التخفيف.

الجدول الكامل

وأجري تحليل وحيد المتغير التباين مع المتغيرات بعثة تقصي الحقائق، وزير الخارجية والسن والعوامل الجنس والفئة. وأوضح المتغيرات معا 64٪ من التباين في RMR، مع عدم وجود تباين إضافي يتم شرحه من قبل BBS (F (1، 30) = 0.91؛ P = 0.35). تم العثور على نوع الجنس وبعثة تقصي الحقائق أن يكون لها تأثيرات رئيسية كبيرة على RMR (F (1،30) = 27.1، P <0.001؛ F (1، 30) = 34.59، P <0.001 على التوالي). وكان وزير الخارجية على الشريط الحدودي دلالة (F (1، 30) = 3.84؛ P = 0.06).
بعد إزالة سن المتغيرات nonsignificant والتشخيص من التحليل، ونموذج يفسر 65٪ من التباين في RMR ويتضمن بعثة تقصي الحقائق المتغيرات وFM وعامل الجنسين.
بالإضافة إلى تقييم التأثيرات الرئيسية لكل عامل، أجري مزيد من التحليل لتحديد ما إذا كانت هناك تفاعل بين العوامل. بعد التعديل المناسب، لم يلاحظ أي اختلاف آثار بعثة تقصي الحقائق وFM على RMR بين BBS والضابطة (F (1، 26) = 0.04، P = 0.85؛ F (1، 26) = 0.29، P = 0.60 على التوالي ). وبالمثل، لم يكن هناك تفاعل كبير بين FM أو بعثة تقصي الحقائق والجنس (F (1، 26) = 0.41؛ P = 0.53، F (1، 26) = 0.11؛ P = 0.75).
وقد تم الحصول على بيانات غير كاملة بشأن النشاط البدني من actigraph والوحيدة تدابير من الموضوعات مع 5 أيام على الأقل وأدرجت ما لا يقل عن 9 ساعات تسجيل في التحليل. وقد رفضت بيانات من خمس (13٪) الموضوعات. من تلك الموضوعات المدرجة في التحليل، كان يرتديها الشاشة لمدة متوسطها 14.5 1.43 ساعة / يوم. ولوحظ وجود انخفاض مستوى النشاط البدني في المواد BBS [الأنابيب النانوية الكربونية متوسط ​​/ دقيقة 259، الربعية = 153) مقارنة بالمجموعة الضابطة (الأنابيب النانوية الكربونية متوسط ​​/ دقيقة = 306، الربعية = 119، P = 0.02).
كانت بيانات استهلاك الطاقة تقييم نقدي باستخدام غولدبرغ قطع. ويعني EI مندوب: BMR اللازمة لتتجاوز 1.43 في مواضيع BBS و 1.42 في الضابطة لالمدخول الغذائي للنظر معقولة خلال فترة التسجيل. ان وجود كمية الطاقة في الإبلاغ مقارنة بين المجموعتين مع متوسط ​​EI: RMR = 1.24، SD 0.3 في المجموعة BBS وEI: RMR = 1.11، SD 0.35 في السيطرة على المجموعة. استخدام ر مستقلة -test، لم يلاحظ أي فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط ​​ذكرت استهلاك الطاقة بين BBS والضابطة في أي الذكور (P = 0.06) أو مواضيع الإناث (P = 0.1) (يعني ذكرت EI: الإناث BBS 7.78 MJ، الإناث السيطرة 7.09 MJ، BBS الذكور 9.03 MJ، ومراقبة ذكور 8.75 MJ). لم يكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية بين المجموعات في تكوين المغذيات الكبيرة في النظام الغذائي، والطاقة نسبة من البروتين، (BBS 15٪ مقابل السيطرة 15.6٪، P = 0.44)، والطاقة نسبة من الدهون (BBS 40.3٪ مقابل الضوابط 38٪، P = 0.98 ) والطاقة نسبة من الكربوهيدرات (BBS 41.8٪ مقابل 42.2٪ في الضوابط، (P = 0.49).

أعلى الصفحة نقاش

BBS هو متلازمة حيث تعتبر التشوهات الجينية العوامل الأساسية في تطوير البدانة. على الرغم من هذا، هناك معلومات ضئيلة عن كيف يمكن لهذا الاستعداد الوراثي هو واضح من حيث التشوهات الفسيولوجية والبيوكيميائية.
وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة للتحقيق في استقلاب الطاقة في الموضوعات مع BBS. منذ RMR هو المحدد الرئيسي لاستهلاك الطاقة، توفر قياس RMR نظرة مفيدة في متطلبات الطاقة المقدرة في BBS. بسبب الظواهر معترف بها من دون الإبلاغ عن استهلاك الطاقة وخاصة في السمنة، فمن المستحسن عموما أن الغذائية المشورة إدارة الوزن يقوم على تقديرات نفقات الطاقة بدلا من ذكرت استهلاك الطاقة. 22 ولذلك فمن المهم للمهنيين الصحيين المعنيين في إدارة تشوه السمنة أن تكون مجهزة المعرفة القائمة على الأدلة من نفقات الطاقة في هذه المجموعة.
لا توجد اختلافات كبيرة عند مقارنة RMR المطلق في BBS والضوابط يعانون من السمنة المفرطة (6.96، SD 1.56 MJ مقابل 7.19، SD 1.28 MJ، على التوالي) أو بعد التعديل لتكوين الجسم. هذا هو على النقيض من استهلاك الطاقة في PWS، حيث لوحظ على RMR إلى حد كبير أقل المطلق ما يقرب من 20-50٪. 23 تصميم الدراسة ويوفر أكثر من 90٪ من الطاقة للكشف عن مثل هذا الفارق الكبير إذا كانت موجودة في BBS. في الواقع، وكان يعمل لكشف الفروق في نفقات الطاقة أكبر من 17٪، ​​ما يقرب من ضعف السيرة الذاتية ليستريح معدل الأيض في الاشخاص الاصحاء. ومع ذلك، فمن المسلم به أن الاختلافات أكثر دهاء في يستريح نفقات الطاقة بين BBS والضابطة، أقل من 17٪، قد لا يتم الكشف.
معدل الأيض المنخفض نسبيا في PWS هو في جزء تفسير تخفيضات متناسبة في بعثة تقصي الحقائق، 5، 6 لكن لا يوجد مثل هذه الاختلافات في تكوين الجسم بين الموضوعات مع BBS ووحظت في هذه الدراسة الضوابط، على الرغم من استخدام أسلوب المرجعية لقياس مكونات الجسم . وتشير الاختلافات البارزة في استهلاك الطاقة بين الموضوعات مع BBS وPWS أن الوصفات الطاقة مقارنة غير ملائمة. نظرا للتشابه في تكوين الجسم والعناصر الأرضية النادرة بين BBS والضوابط يعانون من السمنة المفرطة، وهذا يعني أن عملية احتساب الوصفات الطاقة يجب أن تكون مطابقة لتلك المستخدمة في عموم السكان.
هناك، ومع ذلك، بعض الأدلة الأولية من انخفاض مستوى النشاط البدني في BBS بالنسبة لمواضيع السمنة nonaffected. تخفيضات في النشاط البدني هي معقولة بالنظر إلى المعوقات المادية المرتبطة BBS، وهذا قد تخفف من إجمالي احتياجاتها من الطاقة.
لم تعالج هذه الدراسة الحالات والشواهد على وجه التحديد أساس السببي للسمنة في BBS، ولكنها توفر بعض وجهات النظر الهامة للبحث في المستقبل. وقد تم قياس RMR في المواضيع حيث تأسست السمنة بالفعل وأنه لا يمكن استبعاد أن انخفاض RMR يمكن أن تشارك في التنمية في وقت مبكر من السمنة في BBS. لا يمكن تحويل بيانات عن النشاط البدني في الاختلافات الكمية في استهلاك الطاقة، لكنها تشير إلى أن محدودية استهلاك الطاقة ذات الصلة النشاط قد يكون من العوامل الهامة في تطوير البدانة في BBS.
بدلا من ذلك، أي أساس التمثيل الغذائي للبدانة في BBS قد تكون ذات صلة أكثر إلى خلل في تنظيم الشهية مما يؤدي إلى فرط الأكل وتناول المفرط للطاقة بدلا من تشوهات في استهلاك الطاقة بوساطة، على سبيل المثال، من خلال متعاطفة ظيفة الجهاز العصبي أو التمثيل الغذائي في العضلات والهيكل العظمي. 24
ومن اللافت للنظر النظريات السلوكية التي تؤثر على التحكم في تناول الطعام أو ممارسة النشاط البدني. وقد اقترحت النظريات البيئية والاجتماعية المختلفة التي قد تساهم جزئيا في تفسير الجمعيات المستقلة بين صعوبات التعلم وتطوير السمنة في المجموعات السكانية الأخرى. ومع ذلك، لا توجد بيانات وبائية شاملة عن مدى انتشار المسببات المرضية أو السمنة في الذين يعانون من صعوبات التعلم. ومن المؤكد أن هناك مجموعات معينة (BBS، 3 PWS 25 ومتلازمة داون 26) حيث ارتفاع معدل انتشار السمنة صعوبات التعلم والتعايش، ولكن يبقى من غير الواضح ما إذا كانت هذه العلاقة السببية. وتشمل التفسيرات المحتملة محدودة المعرفة الغذائية، ونوع من الذين يعيشون الترتيب والمرافق النظام الغذائي والنشاط أنماط، روح حول ممارسات التغذية، وتقييد الغذاء والنشاط أو الاعتماد على الآخرين للإشراف على النظام الغذائي وممارسة الرياضة بشكل مناسب. 27، 28، 29
النتائج المستخلصة من هذه الدراسة مهمة في التدبير العلاجي السريري من السمنة في BBS. وتقترح أن هناك حاجة إلى مزيد من البحث في إجمالي احتياجات الطاقة من الموضوعات مع BBS، ولكن في الوقت الحاضر يرسم المهنيين الصحيين بعيدا عن تقديم المشورة للغاية حمية منخفضة الطاقة، كما تستخدم في PWS. في PWS، وتستخدم الوجبات الغذائية 4.18 MJ أو أقل شيوعا، وسيكون تطبيق المبادئ التوجيهية مماثلة لBBS وضع مواضيع في العجز في الطاقة كبير وربما بخرق الالتزام على المدى الطويل والذي يعرف إلى تحسين مع تقييد متواضع الطاقة. 30 وحتى بيانات عن TEE هي متوفرة، فمن أكثر ملاءمة للاستخدام تقديرات نفقات الطاقة يستريح على السكان يعانون من السمنة المفرطة العام مع بدل المناسب لممارسة النشاط البدني استنادا إلى الظروف الفردية والقدرات البدنية.

أعلى الصفحة المراجع

  • JS الخضراء، Parfrey PS، هارنيت دينار، فريد NR، كريمر BC، جونسون G، هيث O، McManamon PJ، أوليري E، Pryse فيليبس W. المظاهر الأساسية للمتلازمة بارديه-بيدل، وهو شكل من ورانس-Moon- . بيدل متلازمة ن ي ميد 1989؛ 321: 1002-1009. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • فرج TI، الطيبي AS. ارتفاع عدد حالات متلازمة بارديه-بيدل بين البدو كلين جينيه 1989؛ 36: 463-465. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • Beales PL، Elciolglu N، ولف AS، باركر D، Flinter FA. معايير جديدة لتحسين تشخيص متلازمة بارديه-بيدل: نتائج مسح السكان J ميد جينيه 1999؛ 36: 437-446. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • المسح الصحي لانكلترا: الجداول المرجعية الكبار المتاحة من www.doh.gov/stats/trends1.htm.
  • SCHOELLER DA، فيتسكي LL، بانديني LG، ديتز WW، الإنفاق Walczak A. الطاقة وتكوين الجسم في متلازمة برادر ويلي الأيض 1988؛ 37: 115-120. | مجلات |
  • Brynes AE، غولدستون AP، توماس EL، بل دينار، هولندا A، بلوم ريال، يتم تقليل فروست G. معدل الأيض يستريح في متلازمة برادر ويلي نتيجة لتغير تكوين الجسم (ملخص) بروك البندق شركة نفط الجنوب 1998؛ 57: 100A .
  • فان ميل EA، Westerterp KR، Gerver WJ، Curfs LM، Schrander-Stumpel CT، كيستر AD، ساريس WH. وأوضح نفقات الطاقة في الراحة وأثناء النوم عند الأطفال المصابين بمتلازمة برادر ويلي من خلال تكوين الجسم آم J كلين نوتر 2000؛ 71: 752-756. | مجلات |
  • مارشال BD، شيخ J، O'Bosky D، C والاس، والعلاج السلوكي ليبرمان R. متلازمة برادر ويلي Behav ذر 1979؛ 2: 22.
  • برامبيا P، بوثيو L، مانزوني P، Pietrobelli P، بيكاريا L، وتكوين هيئة Chiumello G. غريب في المرضى الذين يعانون من متلازمة برادر ويلي-Labhart-ي صباحا كلين نوتر 1997؛ 65: 1369-1374. | مجلات | ChemPort |
  • Bakke BL، Draheim CC، مندوزا W، Serfass RC. معدل الأيض أثناء الراحة وممارسة الرياضة في البالغين الذين يعانون من متلازمة برادر ويلي. المؤتمر السنوي العاشر العلمي للجمعية متلازمة برادر ويلي [الولايات المتحدة الأمريكية] سياتل، واشنطن آم J ميد جينيه 1995؛ 64: 577.
  • Meaney FJ، بتلر MG. Charactersiation السمنة في متلازمة برادر-Labhart-ويلي: الزخرفة السمنة ميد Anthropol الكوارت 1989؛ 3: 294-305.
  • Bjorntorp P. تصنيف مرضى السمنة والمضاعفات المتعلقة بتوزيع فائض الدهون آم J كلين نوتر 1987؛ 45: 1120-1125. | مجلات |
  • Pullicino E، الجبان WA، ستابس RJ، ايليا M. السرير والتقنيات الميدانية لتقييم تكوين الجسم: مقارنة مع تقنية الديوتيريوم تخفيف يورو J كلين نوتر 1990؛ 44: 753-762. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • هوفمان DJ، صوايا AL، الجبان WA وآخرون. نفقات الطاقة من الفتيان والفتيات يعانون من التقزم وnonstunted الذين يعيشون في مدن الصفيح في ساو باولو، البرازيل آم J كلين نوتر 2000؛ 72: 1025-1031. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • SCHOELLER DA، فان سانتين E، بيترسون DW، ديتز D، Jaspen J، كلاين PD. مجموع قياسات الماء في جسم الإنسان مع 18 O و 2 H صفت الماء صباحا J كلين نوتر 1980؛ 33: 2686-2693. | مجلات | ISI | ChemPort |
  • جبان WA، باركنسون SA، Murgatroyd PR. قياسات تكوين الجسم لتغذية البحوث البن

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #5  
قديم 11-23-2015, 09:34 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تباين داخل الأسرة من النمط الظاهري في متلازمة بارديه-بيدل

 

http://bjo.bmj.com/content/81/5/378.full



يهدف إلى وصف اختلاف النمط الظاهري ضمن الأسر التي لديها العديد من الأفراد الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل.
طرق والظواهر من الأشقاء المتضررين في 11 عائلة الاسكندنافية تمت مقارنة مع اثنين أو أكثر من أعضاء الذين لديهم لا يقل عن ثلاثة من الميزات: ضمور شبكية العين، polydactyly، والسمنة، ونقص الأعضاء التناسلية، والتخلف العقلي. تم استبعاد الأفراد دون ضمور شبكية العين.
النتائج: الاختلاف داخل الأسرة من التعبيرية من الميزات السمنة، polydactyly، تم العثور radiograms غير طبيعية في الأطراف، نقص الأعضاء التناسلية، قصر القامة، والشلل النصفي، وتشوهات الأسنان. وضمور الشبكية اختلفت فيما يتعلق بكل من ظهور الأعراض ومسار المرض. مورفولوجية قاع، ومع ذلك، كان ثابت داخل الأسر. أظهر اضطراب الربط الجينية ذات دلالة إحصائية في موضع BBS4 على الصبغي 15 في الأشقاء المتضررة في اثنين من الأسر، إلا أن المظاهر السريرية في هؤلاء المرضى لا تختلف عن غيرها من حالات متلازمة بارديه-بيدل.
أظهرت مقارنة الخلاصة من الأشقاء مع متلازمة بارديه-بيدل الاختلاف من المظاهر التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، وبالطبع من ضمور الشبكية تختلف. لم يتم العثور على المظاهر السريرية المميزة للفصل بين النمط الظاهري BBS4 من المرضى المتبقية.
لا يزال يستند تشخيص المتلازمات أساسا على الفحص السريري الدقيق. وقوع حالات مماثلة داخل الأسرة يوضح كذلك وجود كيان تصنيف الأمراض.
تاريخ ترسيم متلازمة بارديه-بيدل (BBS) معقد.
سوليس كوهين وايس 1 مقارنة ملاحظاتهم مع تلك لورانس والقمر 2 وبيدل، 3 وتعريف متلازمة لورنس-بيدل مع الميزات الرئيسية التهاب الشبكية الصباغي، والسمنة، ونقص الأعضاء التناسلية، وبولي / قصر الأصابع، والتخلف العقلي (الجدول 1). اسم بارديه، 4 الذي وصف ثلاث حالات مماثلة في عام 1920، وأضيف لاحقا إلى متلازمة. هاتشينسون، 5 ومع ذلك، إعادة النظر في المرضى وصفها لورنس والقمر وجدت أعراض عصبية في ثلاثة من أصل أربعة أشقاء. هذه الحالات، وبالتالي، يعتبر متميزا عن حالات بارديه وبيدل 6 وفقا لفصل متلازمة في متلازمة لورنس مون وبارديه-بيدل. في وقت لاحق Alström وزملاء العمل صفت مرض السكري والصمم العصبي مع ضمور شبكية العين، والسمنة، وقصور الغدد التناسلية في ثلاثة من أفراد عائلتين ذات الصلة. 7 وقد دعا هذا الكيان السريري الجديد في وقت لاحق متلازمة Alström.

الجدول 1
ملامح من المرضى في الأسر التي وصفها مختلف المجموعات

وهكذا جرت العادة لتحديد المرضى الذين يعانون من ضمور في شبكية العين، والسمنة، ونقص الأعضاء التناسلية في لورنس مون، بارديه-بيدل، ومتلازمات Alström. وترد الظواهر تؤخذ عادة لتعريف كل في الجدول 2.

الجدول 2
المظاهر التقليدية في لورنس مون، بارديه-بيدل، ومتلازمات Alström

وفي الوقت نفسه، فإن العديد من هؤلاء المرضى أظهرت تباين كبير في التعبير السريري. 8-15
وقد أظهرت الدراسات الجينية الجزيئية الحديثة أن مرضى تحديدها مع BBS زيارتها الاضطرابات الوراثية المعينة إلى أربع صبغيات مختلفة. 16-19 وقد يطلق على مواضع الجينات BBS1، BBS2، BBS3، وBBS4.
والغرض من هذا التقرير هو تقييم دقة التعريف السريري للBBS بمقارنة الظواهر في الأشقاء الذين لديهم ضمور شبكية العين زائد اثنين على الأقل أكثر من ما تبقى من علامات الكاردينال التقليدية من BBS: السمنة، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية، والتخلف العقلي.
منذ تعيين اضطراب في أربعة مرضى من اثنين من الأسر إلى مكان BBS4 على الصبغي 15، وصفنا على حدة النمط الظاهري في كل من هذه الأفراد.
المواد والأساليب

وقد تم تحديد ما مجموعه 44 أفراد الاسكندنافية وجود BBS إذا كان لديهم ضمور شبكية العين زائد اثنين على الأقل أكثر من ما تبقى من علامات الكاردينال التقليدية من متلازمة (السمنة، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية، والتخلف العقلي) (الجدول 2). وكان من بينهم 11 عائلة (أربعة الدانماركية، السويدية اثنين، وخمسة النرويجية) مع اثنين أو أكثر تأثرا الأشقاء. قبلنا علامتين باعتباره كافيا لتشخيص إذا كان الأخوة الثلاثة من علامات الكاردينال. واعتبر ضمور شبكية العين واجبة العثور على 20؛ وبالتالي، تم استبعاد الأفراد دون هذا التوقيع.
وتشمل هذه الدراسة 25 شخصا المتضررين: 16 ذكور وتسع إناث بمتوسط ​​عمر 24.8 عاما (SD 11.4، ومجموعة 3-39). كان زواج الأقارب الحالي في ثلاثة من أسرة (الشكل 1). أسر V، VII، X، والحادي عشر والدنماركية. الأسر الثاني والرابع والسادس والثامن، والتاسع النرويجية. والأول والثالث السويدية (الشكل 1).

الشكل 1
الأنساب من 11 عائلة الاسكندنافية مع 25 حالة مع متلازمة بارديه-بيدل.

وتقع الأفراد والاتصال من خلال سجلات RP السويدية والدنماركية والجمعية النرويجية LMBB ودعوتهم للمشاركة في فحص المرضى الخارجيين 1 يوم من قبل متخصصين في طب العيون (RR وKT)، الكهربية (SA)، وطب الأسنان (MKB) في عيادة العيون الجامعي في لوند، السويد.
تم الحصول على البيانات عن طريق المعلومات من المرضى والسجلات الأقارب والأطباء والمستشفيات والمدارس الخاصة بهم، والتحقيق السريري الحالي.
فحص العيون تتكون تقييم أفضل تصحيح حدة الإبصار وتنظير الشبكية مشلول العضلة الهدبية. وأعرب عن انكسار في حكمه كروية بإضافة نصف لتصحيح أسطواني إلى كروية. وقد درس الجزء الأمامي عن طريق الفحص شق مصباح. واستكملت تنظير العين مباشرة وغير مباشرة عن طريق الصور قاع. Electroretinograms 21 تم الحصول عليها في جميع الأفراد ما عدا اثنين، الذين رفضوا المشاركة. تمت دراسة مسار ضمور شبكية العين بأثر رجعي من كل ستة أطفال المتضررين من ثلاث أسر.
تم نقل الأعمار للمشي ويتحدث كمؤشر للتنمية النفسي خلال الطفولة. واستند تقدير للحالة العقلية في اختبارات الذكاء من السجلات السابقة ومستوى المدرسة والأداء الاجتماعي. أدلى ببيانات إضافية من الحالة العقلية إلا في حالات التخلف العقلي واضح.
الفحص المنهجي العام يتألف قياسات الطول والوزن. وقدرت وجود ترنح والشلل النصفي عن طريق التفتيش من المشي وبواسطة الإصبع لاختبار الأنف. تم تقييم القضيب عن طريق التفتيش على القضيب في ست حالات، بينما تم استجواب الذكور المتبقية أو أقاربهم عن حجم. وقد تم تعريف نقص الأعضاء التناسلية لدى الرجال كما القضيب سم أقل من 04/03 في الأولاد قبل البلوغ، وأقل من 9 سم في البالغين 22 و / أو الإبقاء على الخصيتين. وأكد وجود سابق من polydactyly عن طريق التفتيش من الندوب الجراحية تكملها radiograms. 23 تم فحص الأسنان سريريا وشعاعيا. 24
تم تنقية DNA لرسم خرائط الربط الجينية من الأساليب المذكورة في أماكن أخرى 25 تم تحليل وخلايا الدم البيضاء للشذوذ صبغي. بالإضافة إلى ذلك، تم قياس الكرياتينين في مصل الدم وهرمون تستوستيرون (في ثمانية ذكور).
وتم استجواب الآباء والأمهات والمرضى حول ظهور المشاكل البصرية، وأمراض الكلى، ومرض السكري، والصمم.
وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجان الأخلاقيات في الدنمارك، والنرويج، والسويد، وشارك المرضى في هذه الدراسة بعد استلام المعلومات الكتابية واللفظية.

النتائج

النتائج OCULAR

تم تشخيص ضمور شبكية العين في جميع الحالات وفقا للمعايير التخصيص للدراسة.
كان لسن أول بادرة من العمى الليلي في المتوسط ​​4.6 سنوات (N 25، SD 3.9، ومجموعة 0-16) مع أقصى قدر من الاختلاف داخل الأسرة زائد أو ناقص 6 سنوات. كان العمر لأول علامة على ضعف البصر أثناء النهار 6.6 سنوات (N 24، SD 3.8، ومجموعة 0-16) مع اختلاف داخل الأسرة زائد أو ناقص 14 عاما. في الحادي عشر الأسرة أبلغت جميع الأشقاء المتضررين فقدان الرؤية المركزية قبل أو بالتزامن مع فقدان الرؤية الليلة. في الأسرة السابع، أظهر أخ واحد علامات بصرية ضعف والعمى الليلي في وقت واحد في سن 1، للرؤية الليلية المفقودة آخر يبلغ من العمر 5 و أصبح ضعف البصر في سن 15، والثالث وضعاف البصر في 5 بينما الليل عرض العمى نفسه في سن 7 (الجدول 3).

الجدول 3
نتائج العين في المرضى في 11 عائلة مع اثنين أو أكثر sibs مع متلازمة بارديه-بيدل

معدل الانخفاض في حدة البصر (الشكل 2 هو موضح) من خلال دراسة استطلاعية 9 سنوات لستة أطفال المتضررين من الأسر الثاني والرابع، والثامن مع اختلاف داخل الأسرة من التعبيرية للأسرة الرابعة.

الرقم 2
حدة البصر المتصلة بالعمر قياس مع فاصل 9 سنوات في ثلاث عائلات مع اثنين من الأشقاء المتضررة. مسار المرض يختلف في الأسرة الرابعة.

في الأسر II، لوحظ والرابع والسابع، والتاسع قصر النظر في جميع أعضاء المتضررين (تعريف من قصر النظر: ما يعادل كروية أقل من -0.5 D)، في حين مثلت مد البصر، قصر النظر، وسواء البصر داخل الأسر العاشر والحادي عشر (الجدول 3).
من خلال فحص قاع العين لاحظنا الاختلاف في حجم وشكل صبغات وكمية من ضمور الشبكية والمشيمية بين ولكن ليس داخل الأسر، عندما اتخذ سن بعين الاعتبار (الشكلان 3 و 4) (الجدول 3).

الشكل (3)
قاع العين من ثلاثة أشقاء مع BBS (VII الأسرة) مع شمعي شاحب القرص البصري، ضمور المشيمية والأوعية الضيقة أو طمس، وتصبغ غير نمطية في المحيط.


الرقم 4
قاع العين اثنين من الأشقاء مع BBS (الأسرة I) مع شويكات العظام النموذجية (غير واضحة بسبب إعتام عدسة العين).

وأظهرت الكاملة تسجيلات مخطط كهربية المجال لا ردود قضيب إلى ضوء خافت الأزرق في أي من المرضى، ولكن مع تقنية النطاق الضيق والمتوسط ​​الكمبيوتر، يمكن قياس ردود مخروط المتبقية في عين واحدة على الأقل في 15 من الأفراد. 21 لا الاختلاف داخل الأسرة من ولوحظ في electroretinograms (الشكل 5).

الرقم 5
electroretinograms حقل كامل من ثلاثة أشقاء المتضررة (XI الأسرة). 21 يمكن الحصول على أية استجابات قضيب إلى ضوء خافت الأزرق. كانت السعة مخروط وميض أقل من 0.8 μV، وهو استجابة انخفاض حاد أو غير قابلة للكشف حتى مع وجود ممر الموجة مرشح. الاختلافات الصغيرة في سعة ليست كبيرة.
DEVELOPMENT النفسي والمخابرات

لم ثلاثة أشخاص من ثلاث عائلات مختلفة لا يدخلون في سن 3 سنوات و / أو لم تتحدث في 4 سنوات من العمر. شخص واحد يعاني من الاختناق ما حول الولادة والشلل الرباعي التشنجي وليس لديه اللغة المحكية في وقت الفحص وهذا هو، عندما كان عمره 7 سنوات.
تسعة أفراد أسرهم V، VII، X، والحادي عشر قد تصنف على أنها المتخلفين عقليا عن طريق اختبارات الذكاء في المدرسة، ولكن الكبار الأداء الاجتماعي للمرضى في الأسر VII، X، والحادي عشر لم تؤكد هذا التصنيف. عموما، كان لدينا انطباع بأن الغالبية العظمى من 25 فردا تعمل بها ضمن المعدل الطبيعي للذكاء مع عدم وجود اختلافات واضحة بين الأشقاء المتضررين. في الأسرة IV حضر كل من المرضى المدارس الثانوية الاسكندنافية القياسية. الذكور في الأسرة وعملت في شركة كمبيوتر واحد من المرضى في الأسرة التاسعة عملت في لوحة مفاتيح في مستشفى (جدول 4).

الجدول 4
العلامات السريرية في المرضى في 11 عائلة مع اثنين أو أكثر sibs مع متلازمة بارديه-بيدل
الطول والوزن، ومؤشر كتلة الجسم

وكان ارتفاع أقل من المئين 2.5 في عضو واحد من عائلة V واحد من عائلة X (جدول 4).
السمنة، التي يحددها مؤشر كتلة الجسم (BMI)> 28 كجم / م 2، وقد وجدت في 22 من 25 حالة. وكان الأشخاص الثلاثة مع الوزن الطبيعي أفراد أسرهم السابع والعاشر (جدول 4).
أيدي والأقدام

كان عشرين فردا polydactyly عند الولادة (الشكل 6). من خمسة أفراد المتبقية دون polydactyly ينتمون إلى عائلات الأول والثالث والخامس والثامن، والحادي عشر (الجدول 4).

الشكل (6)
Polydactyly في أصغر مريض في الأسرة الثالثة. وكان شقيقه المتضررين لا polydactyly.

النتائج Radiographical من اليدين والقدمين تضم سنعي قصيرة وعريضة والسلاميات، انحراف الأصابع، تم العثور على أو أعران في جميع الأسر. 23 ومع ذلك، في أسر الثالث والسابع لدينا حالات موثقة مع وبدون تشوهات radiographical (جدول 4). لم يتم العثور على نمط الأسرة معين.
الكلى والمسالك البولية PATHWAYS

في الحادي عشر عائلة كانت جميع الأشقاء الثلاثة النقرس. أحد أفراد الأسر III، V زيارتها، X، والحادي عشر أي شذوذ خلقي أو انخفاض وظائف الكلى (جدول 4) التحقق من فحص radiographical أو زيادة الكرياتينين في مصل الدم، على التوالي.
النتائج العصبية

كان واحدا من الأشقاء في الأسرة التاسعة حلقة من شلل جزئي من أطرافه السفلى الناجمة عن تضيق العمود الفقري، في حين أن شقيقه المصاب لا يوجد تاريخ من شلل جزئي. وكان كل من السمنة ونقص الأعضاء التناسلية، polydactyly، وضمور الشبكية (جدول 4).
الأعضاء التناسلية

ثلاثة عشر من أصل 16 ذكور كان (الشكل قضيب صغير 7). ومن بين هؤلاء، كان سبعة عدم نزول الخصيتين وكان اثنان من اختفاء الخصية مع القضيب الطبيعي. تم تخفيض هرمون تستوستيرون في ثلاثة أشقاء في الحادي عشر الأسرة وكان طبيعيا في الذكور البالغين في الأسر، كان VII، IX، وX. جميع النساء البالغات I عدم انتظام فترات الحيض. قد الأنثى في الأسرة السابع أنجبت طفلا. وكان إخوتها أثرت على القضيب طبيعي ولكن كان واحد اختفاء الخصية. وذكرت المرأة في الأسرة V لديها أعضاء تناسلية صغيرة والشعرانية المعتدل (جدول 4).

الرقم 7
في الذكور في الأسرة أولا لوحظ صغر القضيب لا نقص الأعضاء التناسلية في أخته المتضررين.
أسنان

وأظهر فحص الأسنان ترددات أعلى من الأسنان الصغيرة، نقص الأسنان (الأسنان المفقودة خلقيا)، وجذور قصيرة. 24 في الأسرة وعثر السابع نقص الأسنان في كل من الذكور المتضررة (الشكل 8) ولكن ليس في الشقيقة المتضررين. في الأسر V والحادي عشر وجدنا أيضا الأشقاء المتضررة مع وبدون شذوذ الأسنان (جدول 4).

الرقم 8
مشقوق (الأسنان المفقودة خلقيا) في واحدة من الذكور المتضررة في السابع الأسرة. وكان شقيقة تتأثر أي شذوذ الأسنان.
ضعف السمع

وكان كل الأشقاء في الأسرة V فقدان السمع الادراك ومؤشرات داء السكري من النوع 2 مع هامشيا اختبار تحمل الجلوكوز، وزيادة طليعة الأنسولين، وHBA 1C في مصل الدم. كانت الأنثى polydactyly. وكان كل من ضمور شبكية العين مع الضياء من سن 2 سنة، والعمى الليلي في 4-5 سنوات، وضعف البصر من سن 6-8 سنوات. كانوا المتخلفين عقليا، السمنة، وكان نقص الأعضاء التناسلية (جدول 4). وكان أحد أفراد الأسرة التاسع من ضعف في السمع غير الادراك في أذن واحدة.
مرض السكري

وكان الأشقاء اثنين في الأسرة V مع ضعف السمع والأخوة الإناث في الأسرة X ضعف تحمل الجلوكوز. وكان هذا الأخير السمع.
الحالات المرضية الأخرى

وسجلت واحدة من كل واحد من اضطرابات الإضافية التالية في مختلف المرضى: الورم الحميد في الغدة النخامية، حنف القدم، والكيس الشرج، والسكتة الدماغية الدماغ، وسرطان الخصية.
MAPPING الربط الجينية وتحليل كروموسوم

يتم تضمين أسر الحالية في دراسة أكبر من خرائط الربط في 29 عائلة BBS. 25 يتم تحديد أسرنا كما BB12، 14، 18، 22، 23، 24، 25/26، 27، 28، 30، و 31 في هذه الدراسة . وتظهر قيم احتمال إدراج أو استبعاد الربط إلى مواضع BBS على الكروموسومات 11 (BBS1)، 15 (BBS4)، أو 16 (BBS2) في الجدول 5. ولم يعثر على أي ارتباط في أي من الأسر إلى مكان BBS على كروموسوم 3 (BBS3).

الجدول 5
استبعاد وإدراج الربط BBS مواضع على الكروموسومات 11 (BBS1)، 15 (BBS4)، و 16 (BBS2) في 11 عائلة الاسكندنافية مع 2-3 أعضاء المتضررين. 25 ويرد احتمال الربط الكروموسوم أشار بين قوسين

دلالة إحصائية الربط الجيني (اللد بنتيجة 3 أو أكثر) تم العثور على مكان BBS4 على الصبغي 15 في المرضى الذين يعانون من الثامن العائلة والأسرة التاسع. وأظهرت النتائج السريرية في كل من هؤلاء المرضى الأربعة في الجدول 6. تم العثور على أدلة محتملة من الربط إلى مكان BBS4 للأسر الثالث والعاشر وكانت النتائج لأسر الفردية المتبقية التي ليست غنية بالمعلومات.

الجدول 6
جميع العلامات السريرية المسجلة في اثنين من أزواج من الأشقاء في الأسر الثامن والتاسع مع اضطراب مرتبطة وراثيا إلى مكان BBS4 على الصبغي 15

وأظهر تحليل ارتفاع القرار كروموسوم أي شذوذ.

نقاش

مقيدة الدراسات على الأمراض المتنحية في الدول الاسكندنافية التي كتبها انخفاض معدل زواج الأقارب وعدد قليل من الأطفال، والذي يمنع الدلالة الإحصائية للنتائج السريرية والجينية لكل عائلة. من ناحية أخرى تسهل السكان الاسكندنافية الصغيرة وكذلك تعريف متابعة الدراسات. دراستنا من 11 عائلة BBS مع 2-3 أعضاء المتضررين هي، على حد علمنا، أكبر رأيت من قبل نفس المحققين.
تصف الدراسة التباين داخل الأسرة من النمط الظاهري من BBS من خلال المقارنة بين الأشقاء المتضررة في كل من هذه العائلات.
ولدينا انطباع بأن الأفراد المدرجة في دراستنا هي ممثل من هؤلاء المرضى الذين شخصت سريريا. مثل مؤلفين آخرين 17 رأيناها ضرورية ثلاثة من علامات الكاردينال التقليدية (ضمور شبكية العين، والسمنة، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية، والتخلف العقلي) لإدراجها في الدراسة، حيث يتم تشخيص نقص الأعضاء التناسلية بشكل رئيسي في الرجال، وقد شكك التخلف العقلي باعتباره علامة الكاردينال. 11 قبلنا بيان Schachat وMaumenee، 20 أن ضمور شبكية العين هو الحاضر دائما في المرضى الذين يعانون من BBS. كان كل الأشقاء المتضررين في أرج غير طبيعي، في حين تم الإبلاغ عن أي علامات على BBS في الأشقاء العادية. تم تشخيص جميع المرضى كحالات BBS على الرغم من تداخل لورانس مون والمتلازمات Alström (أو متلازمة ادواردز ترتبط ارتباطا وثيقا 26) لوحظ. تداخل لورانس مون وAlström المتلازمات وصفت في الدراسات BBS أخرى. 13-15 27
وأظهرت المقارنة بين الأشقاء BBS في دراستنا الاختلاف داخل الأسرة لالتعبيرية من السمنة، والتشوهات الهيكلية في الأطراف، نقص الأعضاء التناسلية، قصر القامة، والشلل النصفي، تشوهات الأسنان، وللدورة من ضمور شبكية العين. عدم تجانس السريري هو أكثر انتشارا داخل الأسر BBS لدينا مما ذكرت من قبل مؤلفين آخرين 11 الذي، مع ذلك، وصفت الاختلاف داخل الأسرة من التخلف العقلي. في دراستنا كانت درجة منخفضة من اختبار الذكاء في المدرسة لا تتفق مع مستوى الأداء الاجتماعي في وقت لاحق في الحياة في المرضى من الأسر VII، X، والحادي عشر، الذي أصبح كل الذاتي الداعمة. وقد لوحظ أيضا هذا التغيير مع تقدم العمر من الحالة النفسية لدى الأفراد BBS من قبل مؤلفين آخرين. 9 لذلك يجب أن تفسر نتائجنا على التخلف العقلي بحذر ويمكن إجراء أي بيان بشأن تباين داخل الأسرة.
وجدنا الاختلاف من وقت ظهور الأعراض العين ومسار المرض في شبكية العين. وأفاد الوقت لظهور أعراض ضمور الشبكية بدقة وولوحظ عندما غاب عن لعب الأطفال في ضوء خافت أو كان غير قادر على اللعب في الأماكن المظلمة. الاختلاف موجود في أسر الرابع والسادس والسابع، والثامن، والعاشر (الجدول 2 ولذا القائم) على معلومات دقيقة أساسا من الوالدين. في الأسرة السابع، على سبيل المثال، أصبح أخ واحد في وقت واحد أعمى يلة وضعاف البصر أثناء النهار، في حين أن الأخوة أخرى مشكلات بصرية في وضح النهار لأول مرة، وأصبح الليل أعمى في وقت لاحق، ووضعت الثالث الأعراض في ترتيب عكسي (الجدول 2). و، على حد علمنا، لاحظ هذا الاختلاف من ظهور أعراض ضمور شبكية العين للمرة الأولى.
مسار ضمور شبكية العين، ويتضح من معدل الانخفاض في حدة البصر ومتنوعة في اثنين من الأشقاء في الأسرة الرابعة (الشكل 2). لم نعثر على أي تباين الصورة قاع داخل الأسر. ومع ذلك، فقد لوحظ الظواهر المتباينة سريريا ضمن العائلة الواحدة في المرضى الذين يعانون من ضمور الشبكية، الذي كان الحذف في peripherin / RDS الجينات. 28
كما تم وصفها الاختلاف داخل الأسرة من التعبيرية من العلامات السريرية في متلازمة كوهين، 29 والذي يرتبط ارتباطا وثيقا BBS.
وكانت نتيجة رسم الخرائط الربط الجيني في كل لدينا 11 عائلة ذات دلالة إحصائية للربط إلى مكان BBS4 على الصبغي 15 في اثنين من الأسر، وبالتالي تؤكد النتائج السابقة. 17 وقد رسمت كتاب آخرون الأسر BBS إلى مواضع على الكروموسومات 3 (BBS2)، 18 11 (BBS1)، 16 26، و 16 (BBS3)، 19 25 وقد أشارت وأنه حتى مواضع أكثر الوراثية موجودة. 25 والنتائج السريرية في منطقتنا كروموسوم 15 مريضا تراوحت ما يقرب من جميع جوانب هذا الاضطراب. وكان مترجم في polydactyly في القدم أو غائبة تماما في الثامن الأسرة واليد في الأسرة التاسعة. كانت السمنة المرضية في الثامن الأسرة، ولكن كانت أبعد من مجرد الطبيعي (BMI 28) في الأسرة التاسعة. ذلك لا يمكننا تأكيد النتائج من كرمي وزملاء العمل، 30 الذي اقترح أن الطفرات في النتيجة موضع BBS4 في آخر polydactyly المحوري في الغالب من الأطراف العلوية. وكانت بتشوهات في الأسنان وقصر الأصابع استنتاجات مشتركة، ولكن لاحظ هذه الميزات عموما في المرضى الذين يعانون BBS، 11 24، وبالتالي لا تسهم في توصيف السريري من نوع كروموسوم 15.
وقد أثبتت متلازمة بارديه-بيدل أن تكون أكثر سريريا وغير متجانسة وراثيا مما كان متوقعا في وقت سابق. لم يتم العثور على المظاهر السريرية في المرضى الذين لدينا التي يمكن أن تستخدم للتمييز بين عائلات مرتبطة كروموسوم 15 من المواد المتبقية، وقد وصفت أي تمييز السريرية للعائلات مرتبطة مواضع BBS الآخرين. ليبرت وزملاء العمل 16 لم تجد أي سمة معينة أو مجموعة فرعية من الصفات التي يمكن أن تميز فرعية من الأسر التي لديها عشرات اللد إيجابية لكروموسوم 11 من مجموعة مع عشرات اللد السلبية. Bruford وزملاء العمل 25 العثور على أي تمييز السريرية بين BBS1، BBS2، وBBS4 ربط الأسر في موادها من 29 عائلة BBS وأشار إلى أن نتائج كرمي وزملاء العمل 30 يمكن أن تتصل أكثر إلى حدوث طفرات معينة أو الخلفية الوراثية الفطرية مرضاهم من إلى موضع BBS نفسها.
كيف يمكن أن الأشقاء المتضررة، حتى داخل الأسرة نفسها BBS الذي يجب أن تشترك في نفس الطفرة، تظهر مثل هذا التباين في الظواهر؟ العمر أو الجنس وحده لا يظهر لشرح الاختلاف. ومع ذلك، فإن وراثة الأليلات مختلفة من جينات أخرى قد إما تخفيف أو تفاقم التعبير عن هذا المرض إذا كان المنتج هذه، غير معروفة حاليا، الجينات تتفاعل مع جينات المرض من BBS.
آلية تنوع السريرية والجينية في مرضى BBS لم يعرف بعد. مزيد من الدراسات السريرية والجينية متأنية من الأسر BBS مع العديد من الأفراد المتضررين يمكن أن تسهم في فهم أفضل لهذا الاضطراب المعقد.

شكر وتقدير

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #6  
قديم 11-23-2015, 09:40 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.nature.com/ejhg/journal/v...g2012115a.html

ملخص

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو نادر وراثي جسمي مقهور ciliopathy تتميز ضمور شبكية العين، والسمنة، polydactyly بعد المحوري، الفشل الكلوي، صعوبات التعلم وقصور الغدد التناسلية. العديد من الميزات الثانوية المتصلة بها يمكن أن تكون مفيدة في التوصل إلى تشخيص ومهمة في التدبير السريري للBBS. ويستند التشخيص على النتائج السريرية ويمكن التأكد من تسلسل الجينات المسببة للأمراض معروفة في 80٪ من المرضى. الجينات BBS ترميز البروتينات التي توطين للأهداب والجسم القاعدية وتشارك في نشوء حيوي أهداب وظيفة. طفرات تؤدي إلى المحاسبة أهداب المعيبة جزئيا عن الآثار عديد المظاهر التي لوحظت في BBS. ونحن نقدم لمحة عامة عن BBS بما في ذلك النتائج السريرية، الفهم الحالي للأهداب البيولوجيا، واتباع نهج عملي لتشخيص وتقديم المشورة الوراثية وما يصل إلى تاريخ الإدارة.
الكلمات الدالة:

متلازمة بارديه-بيدل. ciliopathies. الميراث مقهورة. الجينات BBS

أعلى الصفحة باختصار

  • ciliopathy مقهورة.
  • وقوع المقدر 1: 160   000 في السكان شمال أوروبا و01:13   500 في بعض الشعوب العربية.
  • ومن خلال تميزها ضمور شبكية العين، الفشل الكلوي، بعد محوري polydactyly، والسمنة، والعجز المعرفي ونقص الأعضاء التناسلية.
  • ويستند التشخيص على المظاهر السريرية.
  • الاختبارات الجينية الجزيئية متاحة ومعروفة 16 الجينات حاليا لتترافق مع متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، وهو ما يمثل حوالي 80٪ من المشخصة سريريا BBS.
  • وتشمل المراقبة التقييم العيون العادية، مونتورينغ الكلوي والكبد والجلوكوز، الدهون و ملفه الشخصي الغدد الصماء والوزن وضغط الدم القياسات العادية.

أعلى الصفحة مقدمة

في عام 1866، وصفه لورنس والقمر أسرة مكونة من أربعة أشقاء مع ضمور شبكية العين، والسمنة، خزل سفلي تشنجي والعجز المعرفي. 1 بارديه 2 وبيدل 3 ذكرت في وقت لاحق الأفراد بشكل منفصل على مزيد من المتضررين بالمثل الذي بالإضافة كان polydactyly بعد المحوري وتكرس حالة متلازمة لورنس-مون بارديه-بيدل. وغالبا ما تنقسم هذه المتلازمة إلى كيانين: متلازمة لورنس مون وبارديه-بيدل متلازمة (BBS)، ولكن هناك تداخل كبير المظهرية، مما يشير إلى أنها قد تكون أليلية. 4 BBS هو الآن على المدى القياسي في الاستعمال الشائع.
BBS هو اضطراب وراثي عديد المظاهر مع interfamilial كبير والاختلاف داخل الأسرة. 5، 6 تعتبر الوراثة تقليديا مقهورة، على الرغم من وجود استثناءات ملحوظة، حيث BBS قد يكون اضطراب قليل الجينات. 7 انتشار BBS يختلف بشكل ملحوظ بين السكان. من 1: 160   000 في الشعوب الأوروبية الشمالية 5 ل01:13   500 و01:17   5000، على التوالي، في مجتمعات معزولة في الكويت ونيو فاوند لاند، حيث يسود مستوى أعلى من زواج الأقارب. 8، 9 كشفت دراسات على أسر المتضررة في نيوفاوندلاند مع BBS لا تقل عن ستة BBS المكاني وثمانية الطفرات BBS مختلفة، وبالتالي لا يمكن أن يعزى ارتفاع معدل انتشار لمؤسس واحد. 10

أعلى الصفحة نظرة عامة السريرية

النمط الظاهري BBS يتطور ببطء طوال العقد الأول من العمر، على الرغم من أن هناك تفاوتا كبيرا. ونتيجة لذلك، يتم تشخيص معظم المرضى في مرحلة الطفولة المتأخرة أو مرحلة البلوغ المبكر. polydactyly بعد المحوري هو شائع، وربما تكون الوحيدة ميزة تشوه واضحة عند الولادة. قد تؤثر على هذه الأطراف الأربعة أو الأطراف العلوية أو السفلية فقط ويمكن أن يحدث بالتزامن مع قصر الأصابع و / أو syndactlyly.
مقبض التشخيص دفع التحقيق الأكثر شيوعا لBBS هو تطوير ضمور قضيب مخروط. ويتبع الخسارة الأولية من المستقبلات الضوئية قضيب قبل زوال في وقت لاحق من مبصرات مخروط. 11 وهذا يمثل باعتبارها التهاب الشبكية الصباغي شاذة بمشاركة البقعي في وقت مبكر. 12 المظاهر السريرية هو ظهور تدريجي من العمى الليلي، تليها الضياء وفقدان الرؤية المركزية واللون. 11 وقد وصفت العديد من المتغيرات من النمط الظاهري لطب العيون في BBS وبعض المرضى تطوير تسلسل العكس من الأحداث المرضية مع فقدان في وقت مبكر من مبصرات مخروط تليها مبصرات قضيب. 4 تخطيط كهربية الشبكية هو التحقيق في الاختيار، وقد تظهر تغيرات مبكرة في غضون العامين الأولين من الحياة، على الرغم من أن تغييرات كبيرة ونادرا ما تكون مرئية قبل سن الخامسة. 12 الأعراض تتطور عادة في العقد الأول من العمر، ومعظم المرضى مصابون بالعمي بحلول العقد الثاني أو الثالث، 13 على الرغم من أشكال معتدلة من المرض لا وجود لها. تشوهات العين الأخرى مثل إعتام عدسة العين والعيوب الانكسارية هي أيضا منتشرة في BBS.
السمنة هي النتائج السريرية رئيسي آخر والتقرير عن حالات أن يكون 72-86٪ من السكان BBS. 4، 6، 14، 15، 16، 17 الوزن عند الولادة عادة ضمن المعدل الطبيعي، على الرغم من وجود أدلة على التوزيع المختل نحو الخطوط المئوية العليا. 18 ثلث الأشخاص الذين يعانون من وزن الولادة الطبيعية تطوير البدانة في سن واحدة. 18 على الرغم من أن البدانة في مرحلة البلوغ تميل إلى أن تكون جذعي، يبدو أنها واسعة الانتشار ونزع فتيل في مرحلة الطفولة.
تطوير مرض السكري من النوع 2 هي السائدة بين المرضى. قد تكون ذات صلة إلى مستوى السمنة وكثيرا ما وجدت ذلك بالتعاون مع غيرها من علامات متلازمة التمثيل الغذائي.
قصور الغدد التناسلية قد تظهر كما تأخر سن البلوغ أو نقص الأعضاء التناسلية عند الذكور وتشوهات في الأعضاء التناسلية للإناث. 4، 17، 19 قد يحدث هذا بشكل مستقل أو بالاشتراك مع قصور الغدد التناسلية والكيمياء الحيوية. وقد لوحظت مجموعة واسعة من تشوهات في الأعضاء التناسلية للإناث، والمساهمة في انخفاض معدلات الخصوبة في BBS. الذكور هم دائما تقريبا يعانون من العقم.
تأخر في النمو والعجز المعرفي شائعة في BBS. تأخير في كثير من الأحيان العالمي ولكن قد تكون محددة في مناطق معينة من التنمية. 12 وفي لفيف من 109 مريضا، أفيد العجز المعرفي لدى 62٪ وحضر نصف هؤلاء المرضى مدرسة خاصة. 4 يتم الإبلاغ عن الأطفال الذين يعانون من BBS في كثير من الأحيان أن يكون السلوك عطوب مع نوبات من الإحباط. 4، 17، 19 يفضل كثير أن يكون روتين ثابت وربما عناصر السلوك القهري وعدم هيمنة الاجتماعية. 4 آخرون النمط الظاهري سلوكية حادة وتطوير اضطراب طيف التوحد أو الذهان. 4
يمكن تشوهات الكلى يكون سببا رئيسيا للمراضة والوفيات في BBS. 20 والنمط الظاهري الكلوي هو كشوف متغير ولكن بشكل كلاسيكي مع المرض أنبوبي الكيسي والتشوهات التشريحية. 18 عيوب تركيز البولية هي السائدة حتى في المرضى الذين يعانون من شبه طبيعية وظائف الكلى وليس الخراجات الرئيسية. 21
تم الإبلاغ عن العجز خطاب في 60٪ من المرضى. 22 يتكون هذا أساسا من خطاب عالي النبرة الأنف والأطفال في كثير من الأحيان لا تتطور خطاب واضح قبل سن الرابعة. وقد اقترح أن استبدال الحرف الساكن الأول من الكلمة قد تكون مميزة. 4 صعوبات الكلام قد يصعب فقدان السمع، والتي يتم عرضها في 17-21٪ من المرضى. 4، 19 معظم المرضى يعانون من فقدان السمع التوصيلي الثانوية إلى التهاب الأذن الوسطى المزمن. 4 تأخير الكلام في الأطفال الذين يعانون من BBS عموما استجابة للعلاج النطق. 4
ويلاحظ أيضا تورط أجهزة الجسم الأخرى مثل القلب والجهاز الهضمي. نوع من تشوهات قلبية لوحظ في BBS متغير بدرجة كبيرة. كشفت دراسة تخطيط صدى القلب من 22 فردا من ثلاث عائلات البدو الأقارب عالية التردد عيوب القلب بنسبة 50٪. 23 Beales وآخرون 4 العثور على تردد 7٪ فقط في دراسة استندت على 109 مريضا. وتشمل تشوهات قلبية التضيق الصمامات، وبراءات الاختراع القناة arteriosis وبعضلة القلب. 4 يتراوح مشاركة الكبدي من التليف الكيسي للتوسع في القناة الصفراوية، داخل الكبد ومساحات خارج الكبد. 12 وقد تم توثيق مرض Hirschsprungs في BBS لكن وقوع هذه الجمعية غير معروف. 24
الازدحام الأسنان والحنك عالية مقوسة شائعة. وتشمل تشوهات أخرى مشقوق، سوء الإطباق والمينا تنسج. 5 وقد وصفت الشم الملاحظات التالية في نموذج الفأر. في دراسة أجريت على 19 مريضا BBS، كان تسعة الشم / نقص الشم. 25
العديد من الأفراد المصابين يعانون من درجة من الحماقات و 40٪ من فئة واحدة تصف علامات ترنح وضعف التنسيق. 4 خلل تناوبية الحركات ويشير الماضية شائعة (79٪) وكذلك صعوبات في المشي جنبا إلى جنب واختبار فوغ. 4
هناك تداخل كبير في المظاهر السريرية داخل الطيف مرض ciliopathy. على الرغم من الميزات الكلاسيكية المرتبطة BBS موثقة جيدا، وقد اقترح أن النمط الظاهري BBS قد تكون أكثر حتى متموجة مع ciliopathies الأخرى مثل Alström وMcKusick-كوفمان المتلازمات مما ذكر سابقا. 19 عادة ما يميز متلازمة Alström من BBS عن وجود فقدان وغياب polydactyly السمع وصعوبات التعلم. المرضى الذين يعانون من متلازمة McKusick-كوفمان لديهم ارتفاع معدل انتشار الشذوذ البولي التناسلي ولكنها تفتقر عادة ضمور السمنة، قضيب مخروط، وصعوبات التعلم مميزة من BBS. صعوبات التشخيص تثور هذه الميزات في BBS تعتمد على العمر. 26
حاملين BBS لا يبدو أن تكون في خطر متزايد من ارتفاع ضغط الدم أو مرض السكري، 4، 10 على الرغم من وجود أدلة متضاربة بشأن امكانية زيادة مخاطر البدانة في ناقلات. 4، 10، 27، 28 زيادة في سرطانات الكلى والتشوهات، 29 وكذلك ضعف في شبكية العين، 30 وقد ورد في شركات تلزم.
من المذكرة، وتحليل طفرة في غير BBS-الخالية من الدهون والسمنة المرضى قوقازي كشف وجود ارتباط بين الأشكال واحدة النوكليوتيدات في BBS2، BBS4 وBBS6 والسمنة المشتركة. 31

أعلى الصفحة نهج التشخيص

ما لم يشتبه في التشخيص قبل الولادة على أساس التصوير يكشف polydactyly وتشوهات الكلى الهيكلية، وعادة ما يتم تشخيص BBS قبل أن يبدأ المريض لتطوير مشاكل بصرية مميزة من ضمور قضيب مخروط. على الرغم من أن هناك بعض الملامح تشوه المميزة مثل فرط، midface تنسج وretrognathia، وهذه موجودة بشكل غير متسق ويمكن أن تكون خفية. الشكل 1 يوضح الاختلاف من ملامح الوجه ينظر في BBS. معايير التشخيص تعديلها من قبل Beales وآخرون 4 توحي بأن إما أربعة ملامح أساسية أو ثلاثة الابتدائية والثانوية اثنين من الميزات المطلوبة لإجراء التشخيص السريري. الجدول 1 يلخص المظاهر السريرية الرئيسية والثانوية ومعدل الإصابة بها في BBS.
الشكل 1.

صور من المرضى مما يدل على ملامح تشوه المرتبطة BBS. (أ - د) يثبتن ملامح الوجه نموذجية. هذه غالبا ما تكون خفية وليست دائما موجودة. وتشمل الميزات عميقة بين مجموعة عيون، فرط، الهبوطية شقوق مائلة جفني، جسر الأنف مسطح وفم صغير، وجني تنسج وretrognathia. (ه) قصر الأصابع وندوب من الاستئصال من الأرقام التبعية. (و) اكتظاظ الأسنان. (ز) عالية مقوس الحنك. (ح) تنظير القاع مما يدل على ضمور قضيب مخروط.
الرقم الكامل وأسطورة (209 K)

الجدول 1 - ميزات التشخيص وانتشار في BBS.

الجدول الكامل

تأكيدا الجزيئي للتشخيص يمكن الحصول عليها في ما يقرب من 80٪ عن طريق التسلسل المباشر للجينات BBS. بيلينغسلي وآخرون 32 وقد اقترح اتباع نهج عملي لفحص تغيري حيث الأولوية التسلسل وفقا للتردد من الطفرات المسببة للأمراض بين وداخل الجينات BBS من أجل تقديم خدمة تتسم بالكفاءة والفعالية من حيث التكلفة.

أعلى الصفحة الأساس الجيني للمرض

شهد العقد الماضي توسعا سريعا في البحث في هذه المتلازمة، مما أدى إلى اكتشاف 16 الجينات BBS تمثل ما يقرب من 80٪ من المشخصة سريريا BBS ( الجدول 2). تم العثور على معظم الطفرات المسببة للأمراض في BBS1 وBBS10، وهو ما يمثل 23.2٪ و 20٪ على التوالي، 5 على الرغم من بعض التباين الإقليمي في انتشار موجودا. 15 ويبدو أن بعض الجينات لديهم قدر أكبر من تردد معين العرقي من غيرها، على الرغم من أن يتم العثور على الجين المتحول حصرا في عدد سكانها العرقي واحد. في الأفراد شمال أوروبا، BBS1 M390R وBBS10 C91LfsX5 هي الأليلات الأكثر شيوعا، في حين تعتبر أساسا الطفرات في BBS4، BBS5 وTTC8 في المرضى الذين يعانون من الشرق الأوسط وشمال أفريقيا النسب. 32 على الرغم من أن تعتبر تقليديا جسمية حالة المتنحية، وهناك العديد من الحالات المبلغ عنها من وضع triallelic من الميراث حيث هناك حاجة إلى ثلاث طفرات الجينات في BBS قبل أن يصبح النمط الظاهري واضح، أو بدلا من ذلك حيث الثالثة الأفعال موضع المرض كما لتعديل المرض. 7، 33، 34، 35، 36
الجدول 2 - الجينات BBS.

الجدول الكامل

فضلا عن المظهرية التداخلات عرضت بين ciliopathies، هناك شواهد تشير إلى أن الجينات الطافرة في BBS وciliopathies الآخر يحمل بعض التداخل الوراثي. 37 على سبيل المثال، تم تحديد الطفرات في BBS2، BBS4 وBBS6 في المرضى الذين يعانون من متلازمة ميكل. 38 وبالمثل، والطفرات في MKS1، والتي تؤدي عادة إلى متلازمة ميكل، قد تترافق مع النمط الظاهري BBS والطفرات في MKS3 تم تحديدها في المرضى الذين يعانون من متلازمة BBS وجوبير. 39 ويبدو أن النمط الظاهري ciliopathy يعكس كلا من مواضع تحور معين ومجموع الحمل تغيري. 39، 40
راثى-النمط الظاهري علاقة

الارتباط الوراثي، النمط الظاهري سيئة، على الرغم من أن دراسة واحدة تشير إلى النمط الظاهري أكثر اعتدالا المرتبطة طفرة M390R شيوعا وجدت في BBS1. 15 وقد اقترحت دراسات أخرى أن الظواهر العينية محددة 41، 42 وأكثر شدة التشوهات الرقمية 42 قد تكون مرتبطة BBS2، BBS3 وBBS4 الطفرات. والدراسات على نطاق واسع لا يدعم هذه النتائج، وتتفاقم مزيد من التكهنات حول علاقة بها interfamilial كبير وتقلب المظهري داخل الأسرة. وهذا يدعم فرضية أن البروتينات BBS تتفاعل في عملية الخلوية المشتركة، مما يجعل المورثات تمييزه سريريا. 37
تقديم BBS الجينات المتغيرات إلى قواعد البيانات العامة مثل Mutadatabase (www.mutadatabase.org) قد تساعد في مزيد من ترسيم الارتباط الوراثي، النمط الظاهري.

أعلى الصفحة بيولوجيا المرض

يتم حفظها للغاية أهداب الهياكل الخلوية إسقاط من السطح القمي معظم الخلايا في العمود الفقري. انها تندرج في فئتين: متحرك وimmotile (الابتدائي) أهداب. 12، 14 يتم تنظيم أهداب متحركة في '9 + 2 "تكوين أنيبيب فيه تسعة أزواج أنيبيب تحيط صدرة المركزية. هذه الأهداب توليد التدفق أو حركة السوائل. الشكل 2 يوضح هيكل هدب متحرك وimmotile. أهداب متحركة خلل يمكن أن يؤدي إلى خلل الحركة الهدبية الابتدائية يظهر مع توسع القصبات، والعقم وعدم التماثل بين اليسار واليمين. 43 ويعتقد Immotile (الابتدائي) أهداب لتعمل أساسا عضية الحسية التي تنظم مسارات نقل الإشارة ويكون تكوين '9 + 0'، في بنية مماثلة لأهداب متحركة ولكن من دون زوج المركزي. 12، 14، 44 وتتميز العيوب في immotile أهداب سريريا من قبل التهاب الشبكية الصباغي، polydactyly، بتوضع مقلوب، صعوبات التعلم والكلى الكيسي والكبد والبنكرياس. 39 BBS هو مرض من أهداب immotile.
الرقم 2.

بنية هدب. رسم تخطيطي يوضح مقطع طولي من هدب الأساسي بما في ذلك توطين البروتينات المشفرة بواسطة الجينات المسببة للأمراض في بارديه-بيدل متلازمة. مجمع chaperonin يتوسط تجميع BBSome، الذي يتفاعل مع BBS3 (أ GTPase) وأعضاء الأسرة راب لتنظيم تكون الأهداب والحفاظ على هدب. يوضح وجهة النظر المقطع العرضي تكوين أهداب متحركة (9 + 2) وأهداب immotile (9 + 0).
الرقم الكامل وأسطورة (137 K)

يرتكز على هدب في الجسم القاعدية، وهو مريكز المتخصصة التي تعمل بمثابة مركز تنظيم أنيبيب. ومدبرة تكون الأهداب والصيانة عبر الجسم القاعدية التي تعمل بانسجام مع BBSome، والتي بدورها عن طريق التضمين مجمع chaperonin وأفراد الأسرة راب من البروتينات. 43 معا هذه البروتينات تسهيل النقل intraflagellar (IFT). هذه العملية الخلوية الحركة ثنائية الاتجاه من جزيئات يسهل تشكيل وصيانة هدب ( الشكل 2).
BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9 تشكيل مجمع BBSome 45، 46، 47 وBBS6، BBS10 وBBS12 تشكيل مجمع chaperonin. 48 المتبقية المعروف الجينات المسببة للأمراض ومتغير توقع ظائف على النحو المبين في الجدول 2. وقد تم التأكد من وجود فرق المظهري بين المرضى إيواء الطفرات المسببة للمرض في الجينات المرتبطة BBSome مقارنة مع الأشخاص الذين يعانون الطفرات في الجينات المرتبطة مجمع chaperonin.
وقد تم توضيح المرضية الجزيئية من الآثار عديد المظاهر من BBS جزئيا فقط. السمنة لوحظ في BBS هي متعددة العوامل في الأصل. استقلاب الطاقة ويبدو أن تكون مشابهة في المرضى الذين يعانون BBS ويقابل المرضى يعانون من السمنة المفرطة في عموم السكان. 49 نماذج الماوس تظهر وجود علاقة بين نقص BBS، وزيادة الاستهلاك الغذائي وانخفاض النشاط البدني، وليس هناك دليل على مقاومة اللبتين الطرفية. 50 اللبتين هو هرمون الشبع الذي يعمل عن طريق الالتصاق بمستقبلات هرمون الليبتين في منطقة ما تحت المهاد. الفئران BBS-متحولة زادت مستويات هرمون الليبتين. تبين التجارب المشتركة مناعي أن البروتين BBS1 يتفاعل مباشرة مع مستقبلات هرمون الليبتين وأن الطفرة M390R المشتركة يعطل هذا التفاعل. 51، 52
ماريون وآخرون 53 وجدت أن أهداب الابتدائية موجودة عابر في التفريق ما قبل الخلايا الشحمية وتحتوي على مستقبلات للWNT ومسارات القنفذ. هذه المسارات يشير الحفظ جدا جزء لا يتجزأ من التطور الطبيعي ويكون بمثابة جهري من تكون الشحم. تثبيط BBS10 وBBS12 يدفع تكون الشحم وأشار إلى أن هذا أمر ثانوي لتعطيل إشارات Wnt، التي لا يمكن الكشف عن بعد BBS نهدم. 53
ويعتقد ضمور قضيب مخروط أن يكون لذلك الاتجار غير طبيعي عبر أهداب تعديل معيب يربط بين قطاعات الداخلية والخارجية من خلايا مستقبلة للضوء مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج. 50، 54، 55
تم العثور على مستقبلات الإشارات الصوتية القنفذ على أهداب في براعم الأطراف النامية. 55 ويعتقد أن البروتينات IFT لتعديل هذا المسار 39 ارتبط والتقلبات مع تشوهات الأطراف التي لوحظت في ciliopathies. 56
وrapamycin mTOR س إشارات المانع ينقذ الكيسات الكلوية وجدت في BBS morphants الزرد، تورط في مسارات الإشارات المنبع من mTOR س في BBS أمراض الكلى. 57
ويمكن أن يعزى نقص الشم / الشم إلى معيبة الظهارة الشمية مهدبة وضعف الخصوبة في جزء منه إلى خلل في أهداب الخلايا المنوية / ناقلة البيضات.
وارتبط BBS أول من اختلال وظيفي الهدبي عقب تحديد BBS8، التي localises للهياكل مهدبة والهيئات القاعدية وcentrosomes في الخلايا. 58 ومنذ ذلك الحين وقد أكدت عدة نماذج حيوانية هذه النتائج، وقد عززت الفهم الحالي للوظيفة البروتينات BBS. وقد حددت الماوس ونماذج الزرد دور البروتينات BBS في WNT ومسارات القنفذ سونيك، وكذلك مسارات إشارات أخرى. 39 وقد ثبت أن بروتينات BBS لتنظيم IFT والدهون homoeostasis في الديدان وتعدل الاتجار داخل الخلايا وظيفة centrosomal في الزرد. 59 نماذج الماوس تشترك العديد من الميزات المظهرية لوحظ في البشر المصابين BBS، وبالتالي تكون بمثابة نموذج الثدييات ممتازة للمرض. سيمونز وآخرون 60 أثبت هذا مع العلاج الجيني الناجح تمنع الموت مستقبلة للضوء في نموذج الفئران-BBS4 فارغة. وعلاوة على ذلك، فإن التقدم في فهم الأساس البيولوجي للسمنة في نماذج الفئران يمكن أن يؤدي إلى العلاج بالعقاقير المستهدفة لإدارة السمنة في المرضى الذين يعانون BBS. 28، 52

أعلى الصفحة إدارة

مطلوب نهج متعدد التخصصات لتحقيق إدارة فعالة هذا الشرط عديد المظاهر. على الرغم من أن الأبحاث جارية، لا يوجد حتى الآن علاج استهدافا لBBS. المضاعفات المرتبطة BBS ينبغي أن يعامل عرضيا كما هو الحال في عامة السكان. الشكل 3A الخطوط العريضة لإدارة المرضى الذين يعانون من BBS. الشكل 3B يحدد مسار التقييم المناسب للمرضى الذين يعانون من BBS المشتبه بهم والذين لا يستوفون معايير التشخيص المعدلة لBBS.
الرقم 3.

إدارة المرضى الذين يعانون من المشتبه بهم وأكد BBS. (أ) الخطوط العريضة لإدارة المرضى الذين يعانون من تشخيصها سريريا BBS. (ب) يحدد مسار التقييم المناسب للمرضى الذين يعانون من BBS المشتبه بهم والذين لا يستوفون المعايير السريرية معدلة لBBS.
الرقم الكامل وأسطورة (139 K)

يجب قياس ضغط الدم كل ستة أشهر أو أكثر في كثير من الأحيان إذا كان هناك دليل على ارتفاع ضغط الدم. يجب أن يوصف خافضات ضغط الدم ودهون، تخفيض الدواء حسب الاقتضاء. فمن المستحسن أن جميع المرضى الذين لديهم الموجات فوق الصوتية واحد على الأقل الكلوي الأساسي لاستبعاد أي تشوهات واضحة. استجواب تركيزا فيما يتعلق بأي من أعراض مرض السكري الكاذب هو مفيد في كثير من الأحيان ينظر إلى هذا الكيان كثيرا ما يغفل في المرضى الذين يعانون من BBS. المرضى الذين يعانون من الفشل الكلوي ينبغي أن تحال إلى أمراض الكلى.
مطلوب تقييم لطب العيون مفصل بما في ذلك مخطط كهربية لتحديد بداية ودرجة ضمور قضيب مخروط وللكشف عن العيوب البصرية الأخرى مثل الأخطاء الانكسارية، اعتلال الشبكية السكري أو إعتام عدسة العين. يمكن المعينات البصرية والتدريب التنقل بشكل ملحوظ تحسين نوعية الحياة لأولئك الذين يعانون من ضعف البصر.
إدارة الوزن فعالة أمر حتمي لتجنب الإصابة بالأمراض المرتبطة مثل متلازمة الأيض التي المرضى الذين يعانون من BBS قد تكون عرضة بشكل خاص. ممارسة الرياضة وعلم التغذية المراجعة يمكن أن تساعد في توفير استراتيجية انقاص الوزن.
مطلوب تقييم التنموي والتربوي منتظم لضمان حصول المرضى الحصول على النحو الأمثل من بيئة التعلم. ومن الجدير بالذكر أنه على الرغم من التقييم المبكر مفيد في وضع الطفل في بيئة تعليمية أفضل، فإنه ليس دائما مؤشرا على إمكانية الكبار الكاملة. 4 يستفيد كثير من المرضى من مراجعة من قبل طبيب نفسي للمساعدة في القلق، والاكتئاب أو سلوكية القضايا، التي هي أكثر شيوعا في BBS.
ويجب أن يشمل تقييم الغدد الصماء التقييم لتحديد أي علامات وأعراض مرض السكري عن طريق الفم مع احق اختبار تحمل الغلوكوز إذا كان ذلك مناسبا. تقييم وظيفة الغدة الدرقية، لمحة الدهون وتطوير الخصائص الجنسية الثانوية هو المهم. إذا يمكن أن يتم المناسب، مزيد من الغدة النخامية اختبار وظيفة والعلاج بالهرمونات البديلة حرض.
اعتمادا على حاجة الفرد، والإحالة إلى أخصائي تقويم الأسنان لتقييم الأسنان الزحام / نقص الأسنان أو طبيب القلب للتحقيق من أي تشوهات قلبية الهيكلية قد يكون مناسبا.
الاستشارة الوراثية

ورثت BBS عموما بطريقة مقهورة. على الرغم من أن هناك حالات متعددة من الميراث triallelic، هذه الحالات يصعب تحديد ويعتقد أن تمثل أقل من 10٪ من جميع الحالات. 5 ولذلك فمن المناسب للمرضى محامي والأسر وفقا لراثي خطر تكرار المتنحية التقليدي. وبالتالي، فإن أي أخ من الطفل المصاب لديه خطر 25٪ من التأثر ومخاطر 50٪ من كونه الناقل من اعراض و 25٪ بأنهم غير متأثر وليس الناقل.
في العائلات التي لا يعرف الطفرات المسببة للأمراض، ما قبل الزرع التشخيص الوراثي أو اختبارات ما قبل الولادة قد يكون ممكنا. بدلا من ذلك، في الأسر المعرضة للخطر حيث طفرة غير معروف، استهدف الهجوم الثاني بالموجات فوق الصوتية الثلث يجوز تطبيق التصور من polydactyly بعد المحوري وتشوهات الكلى الإرشادية للتشخيص BBS. 61، 62
ينبغي نصح المرضى وأولياء الأمور لطبيعة غير المتجانسة للحالة. وinterfamilial كبير والاختلاف داخل الأسرة يعيق التوقعات حول الإنجازات التعليمية الفردية، وتدهور البصرية أو غيرها من الصعوبات المرتبطة BBS. على الرغم من أن العقم هو القاعدة، وهذا لا يمكن الافتراض كما أن هناك العديد من التقارير لكل من الرجال والنساء مع BBS الذين لديهم أطفال. 4

أعلى الصفحة استنتاج

منذ تم التعرف على الجين الأول للBBS منذ أكثر من عقد من الزمان، كانت هناك تطورات واسعة في هذا المجال. وقد تم حتى الآن اكتشاف ما مجموعه 16 الجينات المسببة للأمراض وفهمنا للخصائص الوظيفية سهلت نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء الظواهر الهدبية بشكل عام وBBS على وجه الخصوص. في السنوات المقبلة، فمن المرجح أن يتم تحديد الجينات الأخرى المسببة للمرض والتي سيكون هناك مزيد من التحسن في الخدمات التشخيصية السريرية السماح لتشخيص أسرع واختبارات ما قبل الولادة.
القدرة على التنبؤ بدقة أكبر مستوى للعجز الفرد المتضررين من المرجح أن تجربة يمكن تحسينها من خلال تعزيز فهمنا للعمليات الجزيئية التي تؤدي إلى التباين المظهري. وفهم العوامل جينية قد تفسر التباين داخل الأسرة والمعدلات الأخرى في حالة يتحتم في هذه العملية.
توضيح من التسبب الجزيئي للالمظاهر السريرية لBBS والبحوث في علم التداوي قد تسفر عن خيارات العلاج الرواية التي تستهدف جوانب الجهاز محددة من الشرط، مثل الكيسات الكلوية أو انحطاط قضيب مخروط، أو يكون لها تأثير تحوير أعم على عدة جوانب لهذه الحالة.

أعلى الصفحة تضارب المصالح

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

أعلى الصفحة المراجع

  • لورانس JZ، القمر RC: أربع حالات من "التهاب الشبكية الصباغي" التي تحدث في نفس العائلة، ويرافقه عيوب العامة للتنمية الإجسام سمنة الدقة 1995؛ 3: 400-403. | مجلات | ISI |
  • بارديه G: في متلازمة السمنة الخلقية مع polydactyly والتهاب الشبكية الصباغي (مساهمة في دراسة الأشكال السريرية للسمنة نخامية) الإجسام سمنة الدقة 1995؛ 3: 387-399. | مجلات |
  • بيدل A: زوج من الأشقاء مع adiposo-التناسلية ضمور الإجسام سمنة الدقة 1995؛ 3: 404. | مجلات | CAS |
  • Beales PL، Elcioglu N، ولف AS، باركر D، Flinter FA: معايير جديدة لتحسين تشخيص متلازمة بارديه-بيدل: نتائج مسح السكان J ميد جينيه 1999؛ 36: 437-446. | مجلات | ISI | CAS |
  • مياه AM، Beales PL: بارديه-بيدل متلازمة؛ GeneReviews [الإنترنت] 1993-2003 (حدثت في 2011).
  • ريسه R، Andreasson S، Borgastrom MK آخرون. تباين داخل الأسرة من النمط الظاهري في بارديه-بيدل متلازمة برازيلي J Ophthalmol 1997؛ 81: 378-385. | المادة | مجلات |
  • Katsanis N، انسلي SJ، Badano JL آخرون. . الميراث Triallelic في متلازمة بارديه-بيدل، وهو اضطراب المتنحية مندلية العلوم 2001؛ 293: 2256-2259. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • فرج TI، الطيبي AS: ارتفاع عدد حالات متلازمة بارديه بيدل بين البدو كلين جينيه 1989؛ 36: 463-464. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • الأخضر JS، Parfrey PS، هارنيت دينار وآخرون. المظاهر الأساسية للمتلازمة بارديه-بيدل، وهو شكل من متلازمة لورنس-مون بيدل ن ي ميد 1989؛ 321: 1002-1009. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • ويب MP، ديكس EL، أخضر JS آخرون. متلازمة مقهورة بارديه-بيدل: أقارب من الدرجة الأولى ليس لديها استعداد لالأيضية والاضطرابات الكلوية الكلى كثافة العمليات 2009؛ 76: 215-223. | المادة | مجلات | CAS |
  • . هامل CP: المخروط قضيب ضمور J Orphanet نادر ديس 2007؛ 2: 7. | المادة | مجلات |
  • بيكر K، Beales PL: بمعنى جعل من أهداب في المرض: ciliopathies البشري آم J ميد جينيه C سيمين ميد جينيه 2009؛ 151C: 281-295.
  • آدامز NA، Awadein A، توما HS: إن ciliopathies الشبكية جينيه العيون 2007؛ 28: 113-125. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • . توبين JL، Beales PL: متلازمة بارديه-بيدل: ما وراء هدب Pediatr Nephrol 2007؛ 22: 926-936. | المادة | مجلات | ISI |
  • Hjortshoj TD، Gronskov K، فيلب AR آخرون. متلازمة بارديه-بيدل في الدنمارك - تقرير 13 الاختلافات تسلسل الرواية في ستة جينات هوم Mutat 2010؛ 31: 429-436. | المادة | مجلات |
  • Rooryck C، D لاكومب: متلازمة بارديه-بيدل آن Endocrinol (باريس) عام 2008؛ 69: 463-471. | المادة | مجلات |
  • مور SJ، أخضر JS، فان Y آخرون. علم الأوبئة السريرية والجينية لمتلازمة بارديه-بيدل في نيو فاوند لاند: لمدة 22 المحتملين على السكان، دراسة، فوج آم J ميد جينيه A 2005؛ 132: 352-360. | مجلات |
  • Putoux A، Attie-Bitach T، مارتينوفيتش J، غوبلر- MC: التباين المظهري من متلازمة بارديه-بيدل: التركيز على الكلى Pediatr Nephrol 2012؛ 27: 7-15. | المادة | مجلات |
  • Deveault C، G بيلينغسلي، دنكان JL آخرون. BBS التقييم الوراثي، النمط الظاهري للأتراب المرضى متعددة الأعراق يدعو إلى إعادة النظر في تعريف مرض هوم Mutat 2011؛ ​​32: 610-619. | المادة | مجلات |
  • أوديا D، Parfrey PS، هارنيت دينار، Hefferton D، كريمر BC، أخضر J: أهمية القصور الكلوي في التاريخ الطبيعي للمرض بارديه-بيدل آم J الكلى ديس 1996؛ 27: 776-783. | المادة | مجلات | CAS |
  • ماريون V، SCHLICHT D، A Mockel وآخرون. متلازمة بارديه-بيدل يسلط الضوء على الدور الرئيسي للهدب الأساسي في كفاءة استيعاب المياه الكلى كثافة العمليات 2011؛ ​​79: 1013-1025. | المادة | مجلات |
  • Beales PL، وارنر AM، قاتل GA، Thakker R، Flinter FA: متلازمة بارديه-بيدل: دراسة جزيئية والمظهرية من 18 عائلة J ميد جينيه 1997؛ 34: 92-98. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • Elbedour K، زوكر N، Zalzstein E، بركي Y، كرمي R: تشوهات القلب في متلازمة بارديه-بيدل: دراسات تخطيط صدى القلب من 22 مريضا آم J ميد جينيه 1994؛ 52: 164-169. | المادة | مجلات | ISI | CAS |
  • دي Pontual L، زغلول NA، توماس S وآخرون. قشوة بين الطفرات المتقاعد وBBS ينظم تعصيب المعوي ويسبب المرض هيرشسبرونغ المتلازمة بروك Natl أكاد العلوم الولايات المتحدة الأمريكية عام 2009؛ 106: 13921-13926. | المادة | مجلات |
  • Kulaga HM، ليتش CC، Eichers ER وآخرون. فقدان البروتينات BBS يسبب

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #7  
قديم 11-23-2015, 09:44 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بارديه-بيدل الجينات متلازمة مهمة في الاتجار داخل الخلايا إلى الوراء وظيفة الحويصلة أهداب كوبفر

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/15/5/667.full



وتتميز متلازمة بارديه-بيدل (BBS) عن السمنة، واعتلال الشبكية، polydactyly وضعف الإدراك، الكلى والتشوهات القلبية وكذلك ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري. لا تظهر تسعة جينات BBS المعروفة تنتمي إلى نفس الفئة الوظيفية؛ بعد طفرة من هذه الجينات يؤدي إلى النمط الظاهري عديد المظاهر متطابقة تقريبا. على الرغم من أن وظائف محددة من البروتينات BBS لم يتحدد بعد، البيانات الحالية تدعم دور في وظيفة الأهداب والنقل intraflagellar. للحصول على نظرة ثاقبة على العمليات البيولوجية التي تسيطر عليها الجينات BBS، شرعنا في الدراسات ستة orthologues BBS من الزرد. ضربة قاضية من bbs2، bbs4، bbs5، bbs6، bbs7 أو bbs8 النتائج الزرد في تعطيل الحويصلة كوبفر (KV)، وهو جهاز مهدبة يعتقد أن تلعب دورا في تنميط بين اليسار واليمين. هي العيوب KV بسبب الفقدان التدريجي للأهداب داخل الحويصلة ويؤدي إلى تغييرات لاحقة لتجانب الجهاز. نلاحظ أيضا وجود خلل معين تغيير وسائل النقل جسيم ميلانيني الوراء. هذه الدراسات هي الاولى لمقارنة شاملة لمجموعة متنوعة من الجينات BBS بالتوازي ويبرهن على وجود دور مشترك في الاتجار داخل الخلايا، مما يدل على أن تشارك البروتينات BBS في الاتجار العام عضية.
مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS، MIM 209 900) هو اضطراب عديد المظاهر وراثيا غير متجانسة تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، والتشوهات الكلى والتشوهات الوظيفية، وصعوبات التعلم ونقص الأعضاء التناسلية (1 - 3). المرضى الذين لديهم BBS أيضا زيادة في حدوث مرض السكري وارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب الخلقية (1، 4، 5). حتى الآن، وقد تم تحديد تسعة جينات BBS (+6 - +17). فهم الفيزيولوجيا المرضية لمتلازمة BBS هي ذات أهمية كبيرة نظرا لحقيقة أن مكونات النمط الظاهري تنتشر في عموم السكان.
على الرغم من أن تم تحديد تسعة جينات BBS، لا يعرف الكثير عن الآليات الجزيئية لهذا الاضطراب وظيفة محددة من البروتينات BBS. BBS4 وBBS8 احتواء tetratricopeptide تكرار (TPR) المجالات، مشيرا إلى أن تتفاعل مع بروتينات أخرى (6، 13). BBS6 (المعروف أيضا باسم MKKS) وتناظر تسلسل لالوحيدات ألفا من Thermoplasma acidophilum thermosome (18)، وهو مجمع chaperonin بدائيات النواة مع تشابه إلى chaperonin حقيقية النواة يسمى المعقد تعقيدا حلقة ببتيد العديم الذيل (19). البروتين BBS3 ينتمي إلى ARF / الأسرة ARL من GTP ملزم بروتينات صغيرة، بعض منها على الأقل يشاركون في الاتجار البروتينات المرتبطة الحويصلة (14، 16). البروتين BBS9 حددت مؤخرا (المعروف أيضا باسم B1) لا يوجد لديه التشابه مع غيرها من البروتينات المعروفة BBS وظيفة غير معروف (17). البروتينات BBS الأخرى المعروفة (BBS1، BBS2، BBS5 وBBS7) هي أيضا البروتينات رواية (7، 11، 12، 15).
العمل مؤخرا يشير إلى أن سمة مشتركة من الجينات BBS هي أنها تشارك في وظائف الهدبية والنقل intraflagellar (IFT). ويدعم هذه الفرضية من خلال حقيقة أن homologs الحفظ جدا من البروتينات BBS توجد في الكائنات الحية مهدبة (14، 15، 20، 21) وثبت العديد من المنتجات الجينات BBS في توطين إلى الهيئات القاعدية في انواع معينة ايليجانس (13، 15، 16 ، 22). وقد تبين BBS4 في توطين للأقمار الصناعية مريكزي من centrosomes والهيئات القاعدية للأهداب الابتدائي، حيث يتفاعل مع مكونات الآلات النقل داينين ​​(23). وعلاوة على ذلك، C. ايليجانس المسوخ من BBS7 وBBS8 جود عيوب في IFT (13، 22). فشل نماذج الماوس خروج المغلوب من BBS2، BBS4 وBBS6 لتشكيل سياط خلال تكوين الحيوانات المنوية، على الرغم من أن هذه الحيوانات تطوير الأهداب الأخرى. إسكات BBS5 في كلاميدوموناس يؤدي إلى غياب سياط (15). غياب الماوس Bbs2، Bbs4 أو Bbs6 لا يعطل تشكيل أهداب في المستقبلات الضوئية، والخلايا المهدبة الحسية في شبكية العين. ومع ذلك، يبدو أن هذه البروتينات لازما لصيانة مستقبلة للضوء (21، 24، 25)، وغياب الماوس Bbs2 أو Bbs6 النتائج في mislocalization من رودوبسين، مشيرا إلى وجود خلل في الاتجار داخل الخلايا و / أو IFT (24، 25).
وأحد الجوانب المثيرة للفضول BBS هو حقيقة أنه على الرغم من كل شكل الجزيئي للأمراض يسلك النمط الظاهري مشابهة جدا، والمنتجات الجين لا تملك تناظر تسلسل مكثفة مع بعضها البعض، ويبدو أنها لا تتفاعل مباشرة جسديا، ولا تنتمي إلى نفس الفئة الوظيفية البروتينات. لا تزال العديد من الأسئلة المتعلقة بدور منتجات الجين BBS، بما في ذلك ما إذا كانت وظيفة هذه البروتينات محدودة لIFT، أو ما إذا كانت هذه البروتينات تلعب دورا أكثر عمومية في الاتجار داخل الخلايا. سواء تشارك هذه البروتينات في الاتجار ثنائي الاتجاه بين الخلايا وIFT وما إذا كانت هذه البروتينات تلعب دورا في الاتجار عضية. من أجل الإجابة على هذه الأسئلة والحصول على مزيد من التبصر في العمليات البيولوجية التي تتقاسمها هذه الجينات، حددنا ortholog الزرد ستة جينات BBS (bbs2، bbs4، bbs5، bbs6، bbs7 وbbs8)، وتستخدم أليغنوكليوتيد] العقاقير morpholino (موس) لضربة قاضية على حدة التعبير عن كل وتقييم التأثير على العمليات التنموية والفسيولوجية متعددة. ركزنا في البداية هذه الدراسة على bbs7 الزرد ثم مدد الدراسة إلى خمسة جينات BBS إضافية. لاحظنا الظواهر المتداخلة لافت للنظر في الأجنة morphant، بما في ذلك الحويصلة كوبفر (KV) اضطراب يؤدي إلى تغييرات في اليسار واليمين (ل-ص) التباين. هذا الخلل لا يؤثر تشكيل أهداب في وقت مبكر بل ويعرض نفسه على تخفيض تدريجي في عدد من أهداب داخل KV مع مرور الوقت. ومن الجدير بالذكر، فإننا نلاحظ أيضا دورا حاسما للبروتينات BBS في الاتجار داخل الخلايا من عضيات (الصباغية). تظهر خسارة وظيفة من بين كل الجينات BBS أن تؤثر في الغالب النقل الوراء الأجسام الصباغية، مشيرا إلى دور وظيفي في مجال النقل حويصلة. بياناتنا تؤدي إلى فرضية موحدة أن يشارك كل البروتينات BBS في نقل الخلايا إلى الوراء. هذه الدراسة من العمليات التنموية والفسيولوجية متعددة في الحيوان كله يكشف بعض المتطلبات الجديدة لوظيفة BBS في الفقاريات، ويمكن استخدامها لخيوط مشتركة لالفيزيولوجيا المرضية المرض.

المواد والأساليب

الزرد BBS الاستنساخ ortholog

أجرينا تحليل BLAST الجينات BBS ضد EMBL / بنك الجينات ومشروع الجينوم (مركز سانجر) قواعد البيانات والكشف عن تسلسل الزرد المتجانسة للغاية لكل من الجينات BBS البشرية المعروفة. وقد صممت الاشعال محددة لتضخيم متواليات BBS الزرد من مكتبات كدنا] (المواد التكميلية، تسلسل التمهيدي). بلغ مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الأجنة التي تم جمعها في مراحل نمو محددة باستخدام TRIzole® كاشف (GibcoBRL) بولي (A) المختارة وعكس كتب (مرتفع TM II، إينفيتروجن). تم استنساخ المنتجات PCR في pSTBlue ناقلات (ميرك) والتحقق من التسلسل على المنظم ABI3730.

جبل بأكمله في الموقع التهجين

كانت ثابتة الأجنة مع 4٪ لامتصاص العرق / الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بين عشية وضحاها. وعولج الأجنة> 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) مع الصباغ المانع. تم توليفها والشعور العقاقير تحقيقات digoxigenin-UTP RNA (روش) من القوالب خطي [bbs2، bbs4، bbs6 وbbs7 العقاقير يتفاعل مع سال الأول، وتوليفها مع T7 RNA البلمرة. وللتحقيقات المعنى، بام مرحبا هضمها وكتب مع SP6 RNA البلمرة]. تحقيقات الأخرى المستخدمة ما يلي: شارون (بام مرحبا، SP6)، nkx2.5، (ايكو RI، T7)، LFT-1 (MLU I، T7)، LFT-2 (MLU I، T7) وfkd2 (ابا I، T3 ). تم تنفيذ جبل بأكمله في الموقع التهجين (WMISH) كما وصفها طويل وريباغلياتي (26).

Morpholino أليغنوكليوتيد] العقاقير

تم تصميم العقاقير MO والتي تم شراؤها من أدوات الجينات، LLC (المواد التكميلية، تسلسل MO). تم microinjected المنظمات الأعضاء في 7:59 الأجنة الخلية بتركيزات تتراوح بين 200-500 μ م.

سلسلة من ردود الفعل العكسي الناسخ، البلمرة

مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من morphants حجب لصق (10-15 الأجنة / المرحلة) في العصور التالية: 14-16، 24، 30، 48، 70-72، 96، و 120 HPF، وقد تمت صياغتها في شكل كدنا] وتتضخم مع الجينات المحددة الاشعال المرافقة اكسون تستهدف bbs2، bbs6 وbbs7. تم تحليل التعبير عن β-الأكتين باعتبارها الرقابة الداخلية (المواد التكميلية، الاشعال تسلسل).

إنقاذ الظواهر ضربة قاضية

وsubcloned Morpholino مقاومة للالبرية من نوع BBS RNA إلى pCS2 + ناقلات التعبير (27). وقدم RNA الاصطناعية مع AMBION mMessage mMachine ذات العائد المرتفع توج RNA عدة نسخ. كان مرنا (50 نانوغرام / ميكرولتر bbs6 وكل من 50 و 100 نانوغرام / bbs7 ميكرولتر) شارك في حقن MO المناسب أو خمسة عدم تطابق-المنظمات الأعضاء.

تحليل KV وأهداب

تم تصوير الأجنة الحية باستخدام كاميرا زايس Axiocam. والحويصلات في الأجنة التي يبلغ قطرها أقل من ثلث أن من النوع البري يعتبر انخفاض وتم سجل الأجنة التي الحويصلات لا يمكن تحديد شكليا كما تغيب. لimmunolocalization، تم إصلاحها الأجنة. تم إجراء المناعي وفقا لبروتوكول قياسي باستخدام الماوس المضادة الأسيتيل الأجسام المضادة تويولين وحيدة النسيلة (سيغما T 6793، 1: 800 تمييع) والضد الثانوية، اليكسا 488 مترافق الضد الماعز المضادة للماوس (الجزيئية تحقيقات A-11001، 1: 200 تمييع)، تليها نوى counterstaining TO-PRO ® -3 (الجزيئية تحقيقات T-3605). تم تصوير الأجنة على المسح الضوئي ليزر نظام المجهر متحد البؤر ايكا SP2 AOBS مع 63 × التكبير و 4 × التكبير.

فحص النقل جسيم ميلانيني

تعرض يوم 5 اليرقات إلى ادرينالين (50 ملغ / مل، سيجما، E4375) تضاف إلى الجنين المتوسطة (28) لتركيز النهائي من 500 ميكروغرام / مل. تم رصد جسيم ميلانيني تراجع باستمرار تحت المجهر وسجل نقطة النهاية عندما كانت جميع الأجسام الصباغية في الرأس والجذع محيط بالنواة. لتقييم حركة تقدمي، تعرضت اليرقات إلى ادرينالين للحث على جسيم ميلانيني التراجع، وغسلها مع فائض المتوسطة الجنين ومن ثم عادوا إلى حاضنة مظلمة مع المراقبة الدورية أو يتعرضون لمادة الكافيين (1 ملغ / مل، ودرجة الحموضة 7.0). كانت بعض الزرد تعامل مسبقا مع brefeldin A (2.5 ميكروغرام / مل) لمدة 45 دقيقة.

الأنسجة العين والتركيب الدقيق

كانت ثابتة خمسة أيام بعد الإخصاب (5 DPF) يرقات مع 4٪ لامتصاص العرق أعدت في 10 م م PBS ل~2 ساعة. تم تشطف الأجنة في برنامج تلفزيوني وكانت تسللت في 30٪ محلول السكروز في برنامج تلفزيوني لعدة ساعات. وبعد ذلك جزءا لا يتجزأ من الأجنة في مجمع الأمثل درجة حرارة القطع وcryosectioned. تم جمع الأقسام في 7 ميكرون وكانت ملطخة الهيماتوكسيلين / يوزين وصمة عار. للانتقال المجهر الإلكتروني (TEM) أو 5 أو 6 يرقات DPF تم إصلاحها عن طريق الغمر في تثبيتي قوة نصف Karnovsky ل(29). العينات كانت ثابتة بعد في tetraoxide الأوسيميوم، المجففة وجزءا لا يتجزأ من الراتنج سبير. تم جمع أقسام سامسونج من خلال مستوى فنجان العين مبصرة لتقييم التركيب الدقيق. واعتبرت أقسام على JEOL 1230 TEM والصور الرقمية التي تم جمعها.

النتائج

تحديد orthologs BBS الزرد

من أجل تحديد orthologs الزرد، أجرينا تحليل BLAST الجينات BBS على قاعدة بيانات الجينوم Ensembl لدانيو rerio، تصميم الاشعال الجينات المحددة واستنساخ الجينات BBS الزرد. ترجمة المفاهيم والمواءمة مع تسلسل BBS الإنسان تبين أن الجينات BBS الزرد لديهم مستويات عالية من التماثل إلى الجينات البشرية (الجدول 1). أجرينا WMISH مع كل من الجينات BBS وأظهرت التعبير الأمهات كل من هذه الجينات مع استمرار التعبير في كل مكان من هذه الجينات. الشكل 1 يوضح هذه البيانات لbbs7. كل من الأم (الشكل 1 أ) والتعبير اقحي (الشكل 1 لوحظ C) مقارنة مع الأجنة سيطرة الشعور (الشكل 1 B و D). bbs7 التعبير في وأثرى 36 HPF في مجال الأمامي، بما في ذلك الدماغ و الحقول العين والمنطقة التامور (الشكل 1 E). في 48 HPF، لوحظ التعبير في قائما الدماغ والعينين وتعبير قوي أيضا في برعم الطرف النامي (الشكل 1 G). يواصل التعبير عن النصوص bbs7 الزرد طوال اليوم الجنينية 5، على النحو الذي يحدده RT-PCR (الشكل 1 I). يبدو التعبير عن BBS أخرى النصوص الزرد (bbs2، bbs4 وbbs6) في كل مكان في 0-24 HPF (على النحو الذي يحدده جبل بأكمله في الموقع) وغير قابل للكشف بواسطة RT-PCR طوال اليوم الجنينية 5 (لا تظهر البيانات).

الشكل 1. BBS الزرد التعبير في كل مكان، والنتائج لصق كتلة MO في محضر تغير. التعبير الزماني والمكاني للbbs7 تحليلها من قبل WMISH مع العقاقير في (A) 16 خلية، (C) 24 HPF، (E) 36 HPF و(G) 48 HPF مراحل وبمعنى التحكم في (B) 16 خلية، (D ) 24 HPF، (F) 36 إدارة الشرطة الاتحادية و(H) 48 HPF مراحل. الحيوان رأي قطب في (A) و (B)، النظر الجانبي، الأمامي إلى اليمين في (C-H). (I) لمحة التنموي bbs7 بواسطة RT-PCR 14-120 HPF (J) منتجات RT-PCR من bbs7 لصق كتلة الأجنة المحقونة MO. وقدمت مكتبات كدنا] من بين مجموعة من 10 الأجنة في 30 و 70 و 120 HPF والمحلية من النوع البري الفرقة تهاجر في 786 سنة مضت ونص غيرت في 877 سنة مضت. ويظهر ممر أسفل سيطرة التضخيم β الأكتين.


الجدول 1.
استنساخ BBS الزرد

ضربة قاضية من BBS الزرد التعبير الجيني

من أجل تقييم ما إذا كان فقدان الزرد النتائج ظيفة BBS في العيوب الجنينية، استخدمنا مختلف MO العقاقير لتعطيل ترجمة استهداف ميثيونين المبادر وتعطيل معالجة RNA استهداف المواقع الواصلة لكل من الجينات BBS تقييمها في هذه الدراسة (bbs2، bbs4 ، bbs5، bbs6، bbs7 وbbs8). الموسومة فلوريسئين تظهر توزع BBS في الأجنة الزرد المنظمات الأعضاء حقن الصغرى موحد حتى ما بعد 48 HPF على BBS المنظمات الأعضاء لصق الجهات المانحة تحفز تخطي من الإكسونات المستهدفة والمنظمات الأعضاء لصق متقبل لحث إنترون إدراج، سواء الناتجة في محاضر لصق الشاذة. تم استنساخ أشكال لصق الشاذة والتحقق من تسلسل. ويعاير أشكال لصق الشاذة التي كتبها RT-PCR لتأكيد فعالية ضربة قاضية الناجم عن MO التعبير الذاتية. وكمثال على نجاح فعالية ضربة قاضية، ضربة قاضية كاملة من bbs7 في 30 HPF (الشكل 1 تم تحقيق J) في الأجنة التي تظهر الظواهر المورفولوجية. نلاحظ ضربة قاضية كاملة تصل إلى 36 HPF (لا تظهر البيانات). استمرت MO بوساطة ضربة قاضية الجينات طوال 120 HPF، ولكن بنسبة 70 HPF، ويلاحظ من النوع البري bbs7 النص مع نص الشاذة. واستخدمت سكان الأجنة تتأثر مع فقدان تام للbbs7 للتحاليل للكشف عن أدوار أساسية في العمليات التنموية الرئيسية. التحقق من صحة وتمديد bbs7 الخسارة من وظيفة الدراسات، تم تقييم الظواهر ضربة قاضية من BBS جينات إضافية (bbs2، bbs4، bbs5، bbs6 وbbs8). أجرينا فحص الصرفي الإجمالي، ولم الأجنة morphant لا تختلف في حجم الجسم العام ومورفولوجية مقارنة بالمجموعة الضابطة. ولوحظ عدم وجود فروق فيما يتعلق الرأس والعين، على الرغم من أن بعض الأجنة عرض تجويف التامور الموسع.

تعطل BBS الزرد يعمل النتائج في العيوب KV

أول النمط الظاهري المورفولوجية نتيجة لضربة قاضية BBS الجين هو تغيير في وقت مبكر تشكيل حويصلة المهدبة. KV هو بنية تحتوي عابرة monocilia ويقترح أن يكون وظيفة مماثلة إلى عقدة الماوس نسبة إلى L-R محور التماثل (30 - 33). وKV ينشأ من الخلايا الظهرية سباقة أثناء تكون المعيدة، تتمدد حويصلة كروية خلال مراحل الجسيدة ويمكن ملاحظته بسهولة في منطقة الذيل برعم (+34 - 36).
تم تقييم morphants bbs7 لإجراء تعديلات على تشكيل KV. في مرحلة 10-13 الجسيدة، KV في morphants غير المعالجة والسيطرة هو بيضوي الشكل التعرف بسهولة على شكل حويصلة في خط الوسط الخلفي، مع متوسط ​​قطرها 60 ميكرومتر (الشكل 2 A، شريط النطاق الأبيض من 100 ميكرون). في هذه المرحلة، قد وصلت إلى أقصى KV قطر التقريبي الذي يرتد تدريجيا في حجم بعد مرحلة 15 الجسيدة. في morphants bbs7 تحليلها في مرحلة 10-13 الجسيدة، 28٪ من الأجنة قد خفضت بشدة قطر KV إلى أقل من ثلث حجم عناصر التحكم (الشكل 2 B) أو غياب الصرفي كاملة من KV (الشكل 2 C) . كان الأجنة Morphant حقن مع تركيز أقل من bbs7 MO تأثير انخفاض على KV مورفولوجيا (7٪، الشكل 2 D)، ودعم استجابة تعتمد على الجرعة لضربة قاضية. كما عرض الأجنة المحقونة مع bbs2، bbs4، bbs5، bbs6 وbbs8 المنظمات الأعضاء عيب KV، وهذا العيب غير موجود في morphants التحكم (الجدول 2، المواد التكميلية، الشكل S1). تم احتساب أهمية في P <0.001 لكل BBS morphant على أساس اختبار فيشر الدقيق. كما تورطت BBS ظيفة البروتين في أهداب نشوء حيوي، وبحثنا القادم مركز KV أهداب في BBS morphants.

يدفع الشكل 2. BBS ضربة قاضية العيوب أهداب KV. ظهور KV في morphants bbs7 الحية محمولة مع (A) من النوع البري مثل (B) خفضت و(C) حويصلة غائبة شكليا (شريط حجم 100 ميكرون). رأس السهم يشير موقع حويصلة في مؤخرة الذيل برعم إلى الحبل الظهري، الأمامي إلى اليمين. (D) التمثيل البياني لنسبة KV تغير عن كل معاملة. ويلاحظ حجم العينة على المحور السينية ويلاحظ أن نسبة تغيير في الجزء العلوي من كل شريط. (E - M) صور مجهرية متحد البؤر المضادة للالأسيتيل تويولين تلطيخ KV أهداب (الأخضر) counterstained للنواة (أحمر) وشريط حجم 8.0 ميكرون. morphant السيطرة على (E) 5-7 الجسيدة، (F) 10/08 الجسيدة و(G) 11-13 مراحل الجسيدة. morphants bbs7 مع انخفاض KV في (H) 06:55 الجسيدة، (I) 8-10 الجسيدة و (J) 11-13 مراحل الجسيدة. bbs7 morphant مع عدم وجود KV في (K) 06:55 الجسيدة، (L) 10/08 الجسيدة و(M) 11-13 الجسيدة مراحل.


الجدول 2.
KV النمط الظاهري

morphants BBS يكون عيوب KV أهداب

يحتوي KV عدد سكانها جاحظ أهداب التي يمكن أن تكون مزينة تويولين لمكافحة الأسيتيل. تم إجراء تقييم للتنظيم أهداب في morphants bbs7 التي كتبها المناعية في ثلاث مراحل تنموية متميزة: 5-7 مرحلة الجسيدة، عندما يصبح KV مرئية شكليا، مرحلة 8-10 الجسيدة، عندما KV عادة ما تتزايد في القطر و11-13 مرحلة الجسيدة، المرحلة التي نستخدمها ليسجل الخلل KV الصرفي. في البرية من نوع والسيطرة morphants (الشكل 2 E-G)، أهداب يمكن ملاحظة في نمط كروية في منطقة KV. أهداب عدد وطول والشاملة زيادة مساحة KV مع التقدم في السن التنموي. وسجل morphants bbs7 إلى انخفاض KV تظهر مشابهة لمن النوع البري في مرحلة 5-7 الجسيدة (الشكل 2 H) ولكن لديها مجال خفض جزئيا الجسيدة 10/08 المرحلة (الشكل 2 I) وانخفاض ملحوظ عدد أهداب والمجال من قبل مرحلة 11-13 الجسيدة (الشكل 2 J). ومن المثير للاهتمام، في morphants bbs7 دون KV مرئية شكليا، أهداب موجودة ولكن يبدو أن تجميع في مجال صغير في مرحلة 5-7 الجسيدة (الشكل 2 K). قبل مرحلة 8-10 الجسيدة، تظهر أهداب أقصر وتفرقوا (الشكل 2 L)، وعدد قليل من أهداب، إن وجدت، هي الحاضرة في مرحلة 11-13 الجسيدة (الشكل 2 M). وبالمثل، كشف تحليل المناعى من bbs2، bbs4 وbbs6 morphants عدد قليل أو أي أهداب في مرحلة الجسيدة 10-13 (المواد التكميلية، الشكل S2). في المراحل الأولى لتكوين KV، ونمط أهداب يشبه في البرية من نوع وmorphants bbs7. ومع ذلك، فإن عددا من أهداب يرتد أو يختفي مع تقدم العمر التنموي. هذه البيانات متوافقة مع البيانات الماوس مبصرة انحطاط (21، 24، 25) وتشير إلى أن وظيفة BBS مطلوب من أجل الصيانة المستمرة للأهداب و / أو بقاء الخلايا المهدبة. على الرغم ضربة قاضية كاملة خلال هذه المراحل، لا يمكننا أن نستبعد إمكانية البروتين الأمهات المساهمة في تشكيل أهداب.

ضربة قاضية من BBS يغير الجوانب الجزيئية من التباين ل-ص

تم أهداب غير منظمة المذكورة سابقا في سياق فقدت وظيفة العقدي، مما أدى إلى انخفاض KV أو غائبة (37). وحددت مؤخرا العقدي خصم، كارون، وقد تبين أن تكون حاسمة لمناسبة الزخرفة L-R في الأجنة الزرد، ويتم ترجمة نص شارون إلى الخلايا المحيطة KV (38). في مرحلة 10-13 الجسيدة، هناك عادة حدوة حصان على شكل شارون مجال -expression المرافقة KV الخلفي (الشكل 3 A). التعبير شارون ما زال موجودا في bbs2، bbs4، bbs6 وbbs7 morphant الأجنة، وإن لم يكن في تنميط الشكل، كما هو موضح مع morphant BBS 7 مع عدم وجود KV مرئية شكليا (الشكل 3 B، التكميلية المواد، الشكل S1). وهكذا، والاحتفاظ التعبير شارون في morphants يشير إلى أن الخلايا التي تخيم على المنطقة الخلفية من KV لا تزال موجودة. عدم وجود شكل نموذج أولي يبدو أن نتيجة لKV المنهار، وهو ما يتسق مع التعديلات أهداب لوحظ في morphants.

الشكل 3. BBS ضربة قاضية يؤهب الأجنة إلى عيوب تجانب. WMISH من شارون في 10-13 الأجنة الجسيدة: سيطرة (A) وmorphant bbs7 (B) مع عدم وجود KV مرئية شكليا. عرض الخلفي، الأمامي إلى اليسار. الظهرية نظرا لLFT-1 و LFT-2 التعبير في 21-23 مراحل الجسيدة في bbs7. لا morphants KV تظهر (C) في الجانب الايسر التعبير في اللوحة الجانبية (نجمة) والدماغ (السهم)، (D) التعبير الثنائي و(E) التعبير في الجانب الأيمن في لوحة جانبية (نجمة) والدماغ (السهم). التعبير nkx2.5 في morphants bbs7 عرض (F) الهجرة اليسار أنبوب القلب، (G) أي الهجرة و(H) عكس الهجرة إلى اليمين. ويشير السهم الأسود موقع أنبوب القلب بالنسبة للعيون (L، يسار، R، يمين) في طريقة عرض البطنية. (I) نسبة غيرت الهجرة أنبوب القلب (الركض) باللون الأزرق وحلقات باللون الأحمر بالنسبة لمجموع السكان من morphants bbs7. (J) وجود عيوب الركض في فئة لا KV. وأشارت العلاج وحجم العينة على X -axis وأشارت نسبة المتغيرة في الجزء العلوي من كل شريط.

نحن ثم نحدد ما إذا كان يتم تغيير المكونات الجزيئية للتنميط L-R في BBS morphants. راقبنا تعبير عن (LFT-1) واليساري 2 (LFT-2) الجينات 1 اليساري، فئة فرعية من تحويل النمو عامل بيتا البروتينات الهامة لعدم التماثل ل-ص (مراجعة في أكثر خجلا، 2003). في الزرد 21-23 الجسيدة مرحلة الجنين، LFT-1 و LFT-2 يتم التعبير عنها في اليسار لوحة جانبية الأديم المتوسط، مجال القلب والدماغ، وله LFT-1 أيضا التعبير في خط الوسط من الجنين (الشكل 3 C) . في bbs7 سجل morphants كما KV غائبا، LFT-1 وسقط LFT-2 التعبير إلى ثلاث فئات: أظهرت 55٪ العادي التعبير في الجانب الايسر، أظهرت 36٪ التعبير الثنائي في لوحة الجانبية والدماغ (الشكل 3 D)، و 9٪ قد عكس الجانب الأيمن التعبير (الشكل 3 E). وقد لوحظ الثنائي وعكس LFT-1 و LFT-2 التعبير أيضا في morphants bbs6، في حين morphants السيطرة أظهرت 100٪ جانب اليسار LFT-1 و LFT-2 التعبير.

وميالا morphants BBS عيوب تجانب الجهاز

وBBS ضربة قاضية الناجم عن KV والعيوب أهداب وكذلك تغيير شارون وLFT التعبير دعم دور للوظيفة BBS في تجانب الجهاز. في 22-24 HPF، وأنبوب القلب يستطيل من خط الوسط ويهاجر (وهو ما يسمى "الركض") إلى اليسار. هذه هي واحدة من أولى المؤشرات المورفولوجية للالتباين ل-R والأجنة يمكن سجل لليسار وارد (الشكل 3 F) انقر بزر الماوس الأيمن جناح (الشكل 3 H) أو أي تحيز تجانب (الشكل 3 G). تم تقييم الركض قلب كل من التشكل وWMISH باستخدام مسبار القلب محدد، nkx2.5 (39). عند تقييم جميع سكان morphants bbs7، لاحظنا الركض غير طبيعي (أي هرول هرول أو عكس) في 14٪ من الأجنة المحقونة بالمقارنة مع 1-3٪ الركض غير طبيعي في morphants uninjected أو التحكم (الشكل 3 I). استمر أنبوب القلب للخضوع التشكل وبين 36 و 48 HPF حلقات إلى تنميط S-الشكل، ووضع الأمامي البطين وإلى اليمين من الأذين (كما يشار إلى D-حلقات). وقد لوحظت اثنين تعديلات على حلقات القلب،-حلقات L (اتجاه المعاكس من البطين بالنسبة إلى الأذين) وبلا حلقات (أنبوب القلب على التوالي). أظهر morphants bbs7 تردد 14٪ من حلقات غير طبيعية.
لتحديد ما إذا كانت مرتبطة عيب KV لتغير تجانب الجهاز، وقد تم اختيار مجموعة فرعية من morphants bbs7 الذي عرض KV تغير وتحليلها لقلب حلقات والركض. بين الأجنة المحقونة MO bbs7 مع عدم وجود KV الصرفي أو عرضه 59٪ غيرت الركض القلب، في حين خفضت الأجنة KV أظهرت 34٪ الركض غير طبيعي (الشكل 3 J). الأجنة التي تظهر الركض اليسرى شكلت عادة D حلقة، في حين شكلت اليمين جناح الركض وL-حلقة ولا هرول عرض حلقات التوزيع العشوائي (الشكل 3 I). لوحظ الركض تغيير وحلقات في bbs4، bbs5، bbs6 وbbs8 morphants مع مجموعة من انتفاذ (8-20٪ للركض و5-29٪ للحلقات، الجدول 3). وتشير هذه البيانات إلى أن تجانب القلب وخطر في BBS morphants وترتبط أن الركض وحلقات (الجدول 3).

الجدول 3.
الركض القلب وحلقات

تغير تجانب القلب لاحظ لbbs7 أقل الحقن MO الجرعة في تردد يعادل ذلك الذي لوحظ في جرعة أعلى. هذه النتيجة تشير إلى أن أهداب في خفض الدرجة KV يستمر في التدهور ويؤدي في مرحلة لاحقة-عيوب تجانب الجهاز. القناة الهضمية حلقات سجل في للخطر أيضا في morphants bbs7 48 HPF (المواد التكميلية، الشكل S3). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الزرد وظيفة BBS مطلوب للمظهر صرفي من KV والخسارة من وظيفة يدفع تعطل أهداب ويهيئ الأجنة عيوب تجانب الجهاز.

BBS الجيني النتائج في تأخر نقل الخلايا إلى الوراء ضربة قاضية

من أجل تحديد ما إذا كان مطلوب وظيفة BBS لعمليات النقل الخلوية العامة، راقبنا النقل في السكان الخلية غير مهدبة. الزرد يغير تصبغ الجلد عن طريق الاتجار الأجسام الصباغية داخل melanophores ردا على الإشارات البصرية والمحفزات الهرمونية. وجسيم ميلانيني هو عضية المتعلقة يحلول، ويتم تنفيذ ثنائي الاتجاه في رحلات مكوكية بين محيط الخلية ومنطقة محيط بالنواة بها المحركات الجزيئية القائمة على أنيبيب، كينيسين الثاني وداينين. كينيسين الثاني هو المحرك موجهة زائد نهاية مسؤولة عن تشتت الأجسام الصباغية إلى محيط الخلية (تقدمي)، في حين داينين ​​هو محرك الموجهة ناقص نهاية مسؤولة عن جسيم ميلانيني التراجع إلى منطقة محيط بالنواة (رجعية) (+40 - 43). الاستفادة من الصباغ الزرد، وبالطبع وقت نقل المواقع عضية في الحيوان كله يمكن ملاحظة. تجميع الصباغ (الوراء) أو التشتت (تقدمي) يمكن حفز في غضون دقائق على العلاج مع الادرينالين والكافيين، على التوالي (44).
في مقايسة لدينا، 5 يرقات DPF هي لإبداء أكبر قدر ممكن تشتت خلايا الميلانية (الشكل تكييفها داكنة 4 A). تعرض مرة واحدة إلى ادرينالين، والأجسام الصباغية ينكمش بسرعة ويمكن تقييم بصريا عن انخفاض في حجم الصباغ (الشكل 4 B). نقطة النهاية هو واضح عندما تظهر جميع الخلايا الصبغية تراكم محيط بالنواة الأجسام الصباغية (الشكل 4 B و E). الأجنة حقن السيطرة وغير المعالجة يتراجع بسرعة الأجسام الصباغية بها (الشكل 4 C-E) (ر = 1.6 و 1.7 دقيقة، على التوالي)، في حين morphants bbs7 قد تأخر كثيرا جسيم ميلانيني تراجع (ر = 6.6 دقيقة، P <0.001). morphants bbs7 تقع في فئتين؛ فئة واحدة يبادر تراجع لكن تبقى الأجسام الصباغية تفرقوا بعد 4.9 و 5.5 دقيقة من التعرض (الشكل 4 G و H، على التوالي)، ولكن تصل في النهاية إلى نقطة النهاية في 7.2 دقيقة. فئة أخرى من bbs7 الأجنة المحقونة MO تظهر تراجع جزئي (الشكل 4 J) ولكن لا تخطي هذه النقطة حتى بعد 20 دقيقة من التعرض (الشكل 4 K). أسفرت عن الجينات BBS ترسيتها في هذه الدراسة (bbs2، bbs4، bbs5، bbs6، bbs7 وbbs8) في تأخيرات كبيرة في جسيم ميلانيني النقل (الجدول 4، الشكل 4 L). وكان ضعف رؤية أي أثر على وسائل النقل التي يسببها هرمونيا لأن القضاء على التعبير عن مخروط قضيب homeobox الجينات، CRX، يولد وظيفيا يرقة العمياء (45، 46) التي وردت للعلاج الادرينالين في نفس معدل morphants التحكم (لا تظهر البيانات).

الرقم 4. BBS ضربة قاضية النتائج في يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني تراجع تأخير. من النوع البري 5 يرقات DPF قبل العلاج (A) وبعد التعرض للادرينالين (B). مربع يدل المنطقة في أعلى التكبير (40 ×) (C - K). من النوع البري 5 يرقات DPF قبل العلاج (C)، 1.0 دقيقة بعد إضافة ادرينالين (D) وعند نقطة 1.3 دقيقة (E). bbs7 morphant مع انخفاض KV قبل العلاج (F)، في 4.9 دقيقة بعد إضافة ادرينالين (G) وعند 5.5 دقيقة (H). كانت نقطة النهاية 7،15 دقيقة لهذه اليرقة محددة، لا يظهر. الظهرية نظرا لbbs7 morphant مع عدم وجود KV قبل العلاج (I) في 11.25 دقيقة بعد ادرينالين إضافة (J) وفي 27 دقيقة (K). (L) التمثيل البياني مع أشرطة الخطأ يدل على تأخير كبير من جسيم ميلانيني الاتجار الناجم عن ادرينالين الوراء بالمقارنة مع من النوع البري والضوابط. يلاحظ العلاج (مراقبة أو BBS -morphant) على س -axis ومتوسط ​​زمن الاستجابة في غضون دقائق ويلاحظ على -axis ذ.


جدول (4).
جسيم ميلانيني حركة رجعية وتقدمي

يمكن تقييمها النقل تقدمي من وقت الشفاء الى كامل تشتت الصباغ بعد اليرقات يتم وضعها في وسائل الإعلام خالية من الادرينالين أو عندما تعامل مع الكافيين. عند اختبارها للاستجابة التقدمي، BBS morphants تستجيب في نفس المعدل كما ان من النوع البري والسيطرة morphants تقييمها مع الانتعاش الطبيعي والناجم عن الكافيين الصباغ التشتت (جدول 4).
العيوب المتداخلة التي لاحظها ضربة قاضية من عدة أعضاء من الأسرة الجينات BBS تشير إلى أن البروتينات BBS تلعب دورا في النقل داخل الخلايا. اذا كان العيب غير محددة إلى الوراء النقل، ينبغي لنا أن نسخة مظهرية وBBS ضربة قاضية الناجم عن خلل جسيم ميلانيني التي كتبها المساس النقل عبر كاشف آخر. Brefeldin A هو المستقلب الفطرية الذي يمنع النقل الخلوي (47، 48). من النوع البري أو السيطرة morphant الأجنة، وتعامل مسبقا مع brefeldin A ثم تتعرض لعرض ادرينالين تراجع تأخير، انقباض جزئي ولكن لم تصل إلى نقطة النهاية محيط بالنواة أو أي رد على الإطلاق (التكميلي المواد، الجدول S1). Brefeldin والعلاج هو عكسها، وبعد الغسيل خارج المخدرات والأجنة تستجيب للعلاج الادرينالين. في هذا الاختبار، brefeldin والعلاج، والتي أيضا يمنع الغالب النقل الوراء داخل الخلايا، يحاكي BBS الخسارة من وظيفة النمط الظاهري.

BBS morphants ومورفولوجيا العين والتركيب الدقيق

التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو سمة أساسية من BBS ويؤدي إلى العمى في المرضى من البشر. لتقييم الأنسجة العين من BBS MO الأجنة ضربة قاضية، كانت ثابتة bbs7 حقن MO الأجنة مرتبة حسب عيب KV في 5-6 DPF، وهو السن الذي مبصرة التشكل جار (49).أقسام الأنسجة من خلال عيون bbs7 الأجنة MO حقن عرض خلية محددة بوضوح العقدة، ضفيري الداخلية والطاقة النووية الداخلية، ضفيري الخارجي وطبقات النووية الخارجي. على الرغم من أن طبقة ضفيري الداخلية لم تظهر الموهن في بعض الحالات، والهندسة المعمارية الشاملة للشبكية العين ظهرت طبيعية في bbs7 morphants (الشكل 5 B) بالمقارنة مع النوع البري (الشكل 5 A). اكتشفنا كذلك وضع شرائح الخارجي مع TEM ووجد أن التركيب الدقيق للا KV bbs7 morphant (الشكل 5 D) يبدو طبيعيا شكليا، مع مبصرة محددة جيدا قطاعات الخارجية والأقراص غشائي (مقارنة الشكل 5 C) .

الرقم 5. الأنسجة العين والتركيب الدقيق في bbs7 الأجنة المحقونة MO. صور Brightfield من H & E الملون المقاطع العرضية التي تم جمعها من خلال عيون من 5 DPF (A) من النوع البري و(B) bbs7 morphant وتصويرها على 20 ×. لاحظ ظهور العدسة والشبكية، مع بارزة طبقة ضفيري الداخلية (الظاهرة كما شكل نصف دائرة وردي في كل من الأجنة). وقد لوحظ التمايز في شبكية العين الطبيعي في هذه اليرقات. تحليل TEM 5-6 DPF (C) من النوع البري و(D) bbs7 morphant سامسونج أقسام جمعها وصفت لشبكية العين الظهارة الصبغية (RPE)، شرائح الخارجي (OS) وطبقة النووية الخارجي (ONL). وقد لوحظ طبيعي التشكل الجزء الخارجي. شريط النطاق في (C و D) هو 2 ميكرون.

إنقاذ BBS morphant الظواهر

للتأكد من أن الظواهر الموصوفة سابقا كانت BBS -specific، bbs2، bbs6 وbbs7 كانت الأجنة المحقونة MO شارك في حقن مقاومة للMO BBS RNA. من النوع البري bbs2، bbs6 وbbs7 RNA خفضت بشكل ملحوظ من حدوث تشوهات KV إلى المستويات التي سجلت في الأجنة المحقونة التحكم (الشكل 6 A). نحن أيضا لوحظ تحسن كبير إحصائيا في معدل جسيم ميلانيني التراجع الناجم عن ادرينالين (الشكل 6 B، المواد التكميلية، الشكل. S4).

الرقم 6. إنقاذ الظواهر عنيف bbs7 RNA. (A) التمثيل البياني لنسبة الأجنة مع انخفاض أو أي KV لuninjected WT (البرية من نوع)، ومراقبة MO وbbs7 الأجنة المحقونة MO. السيطرة MO حقن شارك في مختلطة مع bbs7 RNA عرض العيوب KV قريبة WT 1،6-2،6٪. bbs7 نتائج حقن MO في ~30٪ العيوب KV. شارك في حقن bbs7 RNA مع bbs7 النتائج MO في عمليات الإنقاذ الجزئي (14.5٪) مع 50 نانوغرام / ميكرولتر من bbs7 RNA و 94٪ الإنقاذ مع 100 نانوغرام / ميكرولتر من bbs7 RNA. (B) التمثيل البياني مما يدل متوسط ​​زمن الاستجابة من جسيم ميلانيني حركة تراجعية الناجم عن الادرينالين. متوسط ​​زمن الاستجابة مع أشرطة الخطأ وأشار في الجزء العلوي من كل معاملة. لاحظ انخفاض معدل الاستجابة مع زملاء حقن bbs7 RNA. وأشار حجم العينة في (). لجميع الحقن، bbs7 جرعات MO هي 500 μ م.

نقاش

من أجل البحث عن القرائن إلى دور البيولوجي مشترك أو وظيفة مشتركة من البروتينات BBS، كنا الدراسات التنموية في الزرد لنموذج BBS. وأحد الجوانب المثيرة للفضول BBS هو حقيقة أن تحور كل من التسعة المعروفة BBS الجينات يؤدي إلى النمط الظاهري مشابهة جدا في البشر، على الرغم من أن منتجات الجين لا تملك تناظر تسلسل مكثفة مع بعضها البعض ولا تنتمي إلى الفئة الوظيفية المشتركة من البروتينات (6 - +17). هذه هي أول دراسة للمقارنة بين الخسارة من وظيفة الظواهر متعددة الجينات BBS بالتوازي في نموذج الفقاريات. لدينا الخسارة من وظيفة دراسات مع ستة الزرد BBS الجينات (bbs2، bbs4، bbs5، bbs6، bbs7 وbbs8) تظهر لافت للنظر الظواهر المتداخلة وتشير مسار بيولوجي مشترك لجميع الجينات BBS. بالإضافة إلى ذلك، التعبير الذاتية للالزرد BBS محاضر في تطوير الدماغ والعين وبراعم الأطراف والمناطق القلب والأوعية الدموية ويتسق مع الأنسجة التي تثبت وجود عيوب في متلازمة الإنسان، بما في ذلك اعتلال الشبكية، polydactyly، صعوبات التعلم، وارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب الخلقية. ومن المثير للاهتمام، وجود خلل في النقل إلى الوراء، التي كشفت عنها الدراسات ضربة قاضية لدينا في الزرد، هو سمة مشتركة بين جميع الجينات BBS ستة اختبارها.
وظيفة BBS في أهداب

يتم حفظها البروتينات BBS غاية في الكائنات مهدبة (14، 15، 20، 21)، وBBS4 يموضع للأقمار الصناعية مريكزي من centrosomes والهيئات القاعدية للأهداب الابتدائي (23). وكانت دراسات سابقة تدعم دور البروتينات BBS في وظيفة الأهداب. في الفئران خروج المغلوب، يطلب من البروتينات BBS لتشكيل سياط خلال تكوين الحيوانات المنوية ولكن ليس هناك حاجة لتشكيل آخرين أهداب متحركة أو الأساسي (21، 24، 25). أدلة من دراسات في C. ايليجانس يشير إلى أن BBS7 وBBS8 اللازمة لتوطين العادي للبروتينات IFT محددة وأن الطفرات الجينية للBBS7 وBBS8 نتيجة عيوب في الهدبية (13، 22). من أجل تقييم شامل على مثل هذه وظيفة البروتينات BBS في الفقاريات، شرعنا في ضربة قاضية وظيفة ستة orthologs BBS الزرد. في هذه الدراسة، وأوجه القصور BBS تغير تشكيل الصرفي من حويصلة المهدبة في الجنين في وقت مبكر. علينا أن نظهر وجود أهداب في وقت مبكر في عملية التنمية، تليها المبكرة التقدمية انحطاط / فقدان هذه الأهداب داخل KV. نلاحظ أيضا عيوب تجانب القلب واختلال الواسمات الجزيئية من تجانب في مجال الجهاز المفترض وكذلك في الدماغ. ومع ذلك، في البشر، وعيوب تجانب ليست عنصرا يلاحظ عموما من BBS. وبالنظر إلى أن الثدييات المشيمية تتطلب القلب وظيفية البقاء على قيد الحياة في الرحم، وتواتر العيوب تجانب وحظ قد لا تعكس التردد الفعلي للحدوث. ودعما لهذا الاحتمال، التزاوج متخالف من BBS خروج المغلوب الفئران تؤدي إلى نسل متماثل ~15٪ بدلا من المتوقع بنسبة 25٪ (21، 24، 25). ونظرا لصغر حجمها ووضع البيض الخارجي، يمكن أن الأجنة الزرد البقاء على قيد الحياة في مراحل اليرقات في وقت مبكر بلا قلب الوظيفي ونظام القلب والأوعية الدموية ويمكن أن تكشف عن وجود دور للبروتينات BBS لم يلاحظ عادة في الثدييات المشيمية.
فمن غير المرجح أن غياب الفردية BBS البروتينات النتائج في أهداب تماما غير وظيفية. الاختلافات بين النمط الظاهري BBS والظواهر ينسب عادة إلى عيوب في أهداب متحركة تشير إلى أن النمط الظاهري BBS لا يمكن تفسيره فقط من خلال تعطيل أهداب الحركة. على سبيل المثال، المرضى الذين يعانون من اختلال وظيفي الهدبية الابتدائية يكون عادة القصبات والتهاب الجيوب الأنفية، في حين لم يتم التعرف على هذه الأعراض كما السمات المشتركة من BBS. الأجنة الزرد مع العيوب أهداب يبرهن على وجود انحناء الجسم مميزة والخراجات في أنبوب القناة الهضمية (50، 51)، عيوب لم يتم العثور على وجه التحديد في BBS ضربة قاضية الأجنة.

وظيفة BBS والنقل داخل الخلايا

من أجل تحديد ما إذا كانت تشارك البروتينات BBS في النقل داخل الخلايا العام، بدلا من مجرد وظيفة IFT، قمنا بتقييم BBS الخسارة من وظيفة الأجنة الزرد لعيوب النقل داخل الخلايا. تحقيقا لهذه الغاية، فإننا مراقبة النقل جسيم ميلانيني في melanophores، والتي يمكن أن يسببها الادرينالين. الأجسام الصباغية المنتسبين مع الأنابيب الدقيقة وتكون قادرة على نقلها في الاتجاهين إما عن طريق كينيسين II (تقدمي) أو داينين ​​(رجعية) محركات (41). ضربة قاضية للتعبير عن كل الزرد BBS أسفرت الجينات في تأخير كبير في وسائل النقل جسيم ميلانيني إلى الوراء، في حين لم تتغير النقل تقدمي. تثبيط النقل إلى الوراء إلى أن منتجات الجين BBS لها دور في النقل داخل الخلايا، وتحديدا الحويصلة إلى الوراء والنقل عضية. نحن تحاكي الخلل النقل جسيم ميلانيني الوراء عن طريق العلاج الدوائي مع brefeldin A، المستقلب الفطرية التي تمنع نقل الخلايا إلى الوراء. على الرغم من أن الدور الدقيق للبروتينات BBS في عملية النقل غير معروف، يمكن لهذه البروتينات تلعب دورا في الحفاظ على العمارة أنيبيب، تساهم بشكل مباشر في وظيفة أو كفاءة المحركات الجزيئية نفسها، خدمة لتحميل البضائع على المحركات الجزيئية أو تعمل على فصل البضائع من خيوط الأكتين قبل النقل. ومن الممكن أيضا أن بعض الجينات BBS قد تلعب دورا تنظيميا في واحد أو أكثر من هذه العمليات. على سبيل المثال، BBS3 ينتمي إلى فئة من البروتينات التي تنظم مجموعة واسعة من العمليات الخلوية بما في ذلك النقل داخل الخلايا (14).
يتم اعتماد الدور المهيمن للجينات BBS في النقل إلى الوراء بالمقارنة مع وسائل النقل تقدمي عن عيوب معروفة في جسيم ميلانيني التشتت داخل الخلايا لدى البشر والفئران. العيوب المعروفة في نتيجة النقل التقدمي في عدم الإبقاء على التوزيع المحيطي الأجسام الصباغية، مما أدى إلى المهق والشعر تشوهات جزئية اللون (44، 52، 53)، والنتائج غير المرتبطة BBS. كما هو موضح هنا، وليس من المتوقع أن تؤدي إلى لون الشعر أو المهق الظواهر النقل تقدمي سليمة ولكن النقل إلى الوراء معيب. النقل جسيم ميلانيني هو نموذج عام لدراسة النقل داخل الخلايا عضيات والحويصلات. نتائج هذه الدراسة تؤدي إلى استنتاج مفاده أن على الأقل بعض مكونات نتيجة النمط الظاهري BBS من خلل في الحويصلة أحادي الاتجاه والنقل عضية والنقل على وجه التحديد داينين ​​التي تعتمد على قرب نهاية ناقص من الأنابيب الدقيقة. نتائجنا لا يستبعد احتمال وجود تأثير خفية في وسائل النقل تقدمي (22).
إذا BBS تدق هبوطا تستهدف مسار مشترك، فإننا نتوقع أن العيب KV ينبغي ربط بإحكام على عيب جسيم ميلانيني النقل. في الواقع، وفئة لا KV من BBS morphant (سجل قبل 15 HPF) لديه أعظم تأخير في النقل (لوحظ في 120 HPF). وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذه العيوب محددة اللذين تم انقاذهم من قبل مقاومة للMO BBS RNA.
RP هو سمة أساسية من BBS ويؤدي إلى العمى في المرضى من البشر. وبالنظر إلى تشكيل أهداب عادية نسبيا ومن ثم الضمور في KV، فإننا نتوقع أن BBS حقن MO الزرد سيكون تطوير شبكية العين العادية ولكن تبين فيما بعد انحطاط مبصرة. ملاحظتنا أن مبصرة الجزء الخارجي التشكل لا ضعف شديد في BBS ضربة قاضية تتفق مع Bbs2، Bbs4 وBbs6 البيانات خروج المغلوب الفئران التي تدلل على تطوير شبكية العين العادية ولكن الموت أفكارك في وقت لاحق من خلايا مستقبلة للضوء (21، 24).
وباختصار، فإن البيانات المقدمة هنا تثبت أن كل الجينات BBS ستة درس ضرورية لتشكيل هيكل مهدبة المعروفة باسم KV. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن وظيفة BBS لا يكون لها دور عام في تفريق أو تطوير الخلايا المهدبة أو لتشكيل أهداب أنفسهم، والأنسجة المهدبة أخرى مثل القناة الهضمية والعين لا تتأثر. ولكن بدلا من ذلك، البيانات المتوفرة لدينا هي داعمة لدور وظيفي من البروتين BBS في الحفاظ على أهداب أو في بقاء بعض الخلايا المهدبة، أو كليهما. ضربة قاضية شاملة لهذه البروتينات في نتائج الزرد في الظواهر بما يتفق مع دور في وظيفة الأهداب، وهذا العمل هو أول من تعرف على وجه التحديد شرطا لوظيفة BBS في وظيفة KV أهداب واللاحقة عيوب تجانب الجهاز. نظهر أيضا أن جميع الجينات BBS درس تلعب دورا في نقل الخلايا، مع تأثير أكثر عمقا في وسائل النقل إلى الوراء. لدينا البيانات يدل على تأخير كبير في نقل الخلايا إلى الوراء الأجسام الصباغية مع ضربة قاضية للتعبير عن كل من البروتينات ستة BBS تشير إلى أن تشارك الجينات BBS في عضية ومحددة غشاء الحويصلة النقل داخل الخلايا. ونقترح أن جميع البروتينات BBS تلعب دورا العام في الاتجار داخل الخلايا إلى الوراء من الحويصلات بغشاء والعضيات وجود خلل في الاتجار داخل الخلايا يؤدي إلى ضعف وفقدان أهداب وفي بعض الحالات، يؤدي في نهاية المطاف إلى الموت من أنواع معينة من الخلايا. فإن الآليات التفصيلية التي عيوب النقل داخل الخلايا تؤدي إلى عناصر محددة من النمط الظاهري BBS تتطلب دراسة إضافية

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #8  
قديم 11-23-2015, 09:49 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بارديه-بيدل الصغيرة GTPase ARL6 (BBS3) وظائف متلازمة المرتبطة في أو بالقرب من بوابة الهدبية وينظم WNT اشارة *

 

http://www.jbc.org/content/285/21/16218.full



ومن المعروف أن عائلة موسعة من metazoan عامل ADP-ribosylation وADP-ribosylation عامل مثل GTPases صغيرة للعب أدوار أساسية في تحوير الوظائف الاتجار الغشاء وهيكل الخلية. هنا، نقدم التركيب البلوري للARL6، والطفرات التي تسبب متلازمة بارديه-بيدل (BBS3)، وتكشف مثل حلقة فريدة من نوعها التعريب في نهاية البعيدة الهيئات القاعدية، على مقربة من ما يسمى بوابة الهدبية حيث الحويصلات تحمل فتيل البضائع الهدبي مع الغشاء. الإفراط في GDP- أو أنواع من ARL6 / BBS3 GTP تخوض في الجسم الحي التأثيرات طول هدب الابتدائي وفرة. كما ينظم ARL6 / BBS3 يشير WNT، طريقا نقل الإشارة التي بالاشتراك مع أهداب في الفقاريات خرجت لتوها. الأهم من ذلك، يتم فقدان هذه الوظيفة في اشارة الى المتغيرات ARL6 تحتوي على الطفرات نقطة BBS المصاحب. من خلال تحديد هيكل متجهة الى GTP ARL6 / BBS3، إلى جانب المقايسات الفنية، ونحن نقدم التفسير الآلي لهذه التعديلات المسببة للأمراض، وهي غيرت النوكليوتيدات ملزمة. وبالتالي النتائج التي توصلنا إليها إنشاء دور لم تكن معروفة سابقا لARL6 / BBS3 في الهدبية الثدييات (ديس) تجميع وإشارات Wnt وتوفير المعلومات الأولى الهيكلية للبروتين BBS.
مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) 4 هو اضطراب البشري غير المتجانسة وراثيا تتميز مجموعة واسعة من الظواهر، بما في ذلك السمنة، وأمراض الكلى المتعدد الكيسات، تنكس الشبكية، polydactyly، والإعاقات الحسية (1، -، 4). وهو يمثل نموذجا للciliopathies، فئة من الاضطرابات الجينية وتقاسم المسببات شيوعا من الجسم القاعدية و / أو اختلال وظيفي أهداب (5، -، 9). أهمية الفسيولوجية للأهداب، والعضيات متحركة و / أو حسية موجودة على معظم أنواع الخلايا الفقاريات، وأكد من قبل عدد متزايد من الأمراض عديد المظاهر التي تنتمي إلى هذه الطبقة، التي بالإضافة إلى BBS تشمل متلازمة Alström ترتبط ارتباطا وثيقا، وكذلك متلازمة ميكل ومتلازمة جوبير، ومتلازمة العليا-لوكن.
فكر مرة واحدة ليكون عضية أثرية، والآن أنشأت امتحرك (الابتدائي) هدب فضلا عن كونها ضرورية لتنبيغ الكيميائية والبصرية، والمحفزات الحسية الميكانيكية، والغشاء مستقبلات رصع به ينسق عدد من أجهزة الطرد المركزي إشارات هامة وضرورية لحيوان فقاري التنمية، بما في ذلك القنفذ، WNT، وPDGFRαα الإشارات (6، 10، -، 12).
يتم تجميعها الهدبية الخيط المحوري القائم على أنيبيب في النهاية البعيدة من الجسم القاعدية، بنية مشتقة من مريكز الأم التي الاحواض في غشاء البلازما قبل تكون الأهداب (13، 14). تقريبا كلها مبنية أهداب وصيانتها من قبل وسائل النقل intraflagellar multiprotein (IFT) الآلية التي تحشد البضائع الهدبية، على سبيل المثال المكونات الهيكلية، والمستقبلات، وجزيئات الإشارة، في عضية عبر كينيسين السيارات تقدمي وينقل المكونات إلى قاعدة عن طريق محرك داينين ​​الوراء (15، -، 18). ويعتقد أن آلية IFT أن ترسو بالقرب من النصائح من الألياف الانتقالية، والتي هي هياكل التكوين معروف أن تشكيل-membered تسعة مجموعة شعاعي تشبه المروحة أن تنضم إلى النهاية البعيدة من الجسم القاعدية لغشاء الهدبية (19، 20) . بالقرب من هذا الموقع، على نحو فعال "بوابة الهدبية،" الاتجار في مرحلة ما بعد جولجي من الشحنات حويصلي متجهة إلى هدب إنهاء الانصهار مع الغشاء. نقل الشحنات التي تطلق في عضية ويمكن بعد ذلك بتسهيل من الآلات IFT (21، -، 23).
ومن المعروف أن عدد قليل من العوامل الخلوية للمشاركة في عملية التحول الوظيفي من الاتجار حويصلي للاتجار الهدبية (24) أو ربما، في عملية عكسية حيث يتم الاتجار مكونات الهدبية من العضية. على الرغم من أن الاتجار الهدبي هو nonvesicular، فإنه يعتمد على IFT مفارز البروتين التي تشترك طبولوجيا بيتا المروحة / الملف اللولبي (والظاهر وظائف) مماثلة لتلك التي معطف البروتينات المرتبطة الحويصلة (23، 25، 26). مجموعتنا اكتشف سابقا عضوا في الأسرة ARF تشبه من GTPases صغيرة، ARL6، التي يمكن أن امتلاك تصور هذه الوظيفة الاتجار. ويرتبط ARL6 مع بارديه-بيدل نوع متلازمة 3 (BBS3) (27، 28)، مما يجعل الوقت الحاضر هو 1 من 14 البروتينات المرتبطة BBS (4). في انواع معينة ايليجانس أهداب الحسية، وقد تبين ARL6 للخضوع IFT (28). وعلاوة على ذلك، والبروتينات ARF الشبيهة، والتي تورط عموما في الاتجار الغشاء وتنظيم العمليات المرتبطة أنيبيب (29، -، 32)، واثنين من أعضاء على الأقل أن المشهودة وظائف الهدبية. orthologues ARL3 من الليشمانيا، C. ترتبط ايليجانس، والفئران مع وظائف أهداب / الهدبية مستقبلة للضوء (33، -، 35)؛ وبالمثل، ARL13B يموضع خصيصا لأهداب في C. ايليجانس، والماوس أنها تشارك في تشكيل هدب والقنفذ الإشارات (34، 36). وجود الحصري لARL6 في الكائنات الحية التي تمتلك الأهداب وارتباطه IFT (28 ول) يشير إلى وجود دور محتمل لهذا GTPase صغير في تنسيق أو تسهيل سد الوظيفي الاتجار intraciliary مع الاتجار حويصلي.
على الرغم من أن جميع البروتينات BBS درس حتى الآن يبدو أن تلعب دورا هاما في أي تهريب البضائع إلى القاعدية الجسم / الجسيم المركزي أو خلال أهداب عبر IFT (2)، ويقترح ARL6 / BBS3 أن يكون لها وظيفة يحتمل أن تكون متميزة عن أن مجموعة أساسية من BBS البروتينات التي تجمع في مجمع، وصفه BBSome (37). وتنشأ هذه الفكرة من هذا الاكتشاف أن BBSome، التي تتكون من بروتين معقد فصل كيميائيا تحتوي على BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، والبروتينات BBS9، لا تشارك في يجزئ مع BBS3 في التدرج السكروز (37). ومن المثير للاهتمام، يتفاعل عنصر واحد من BBSome (BBS1) مع Rabin8، وهو عامل الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP لRAB8 GTPase صغيرة. Rabin8 المشارك يموضع مع BBSome في الجسيم المركزي / الجسم القاعدية ويؤثر على الدراجات النوكليوتيدات من RAB8، الذي يدخل هدب في ولاية محددة GTP لها وضروري لتكون الأهداب (37). كما تبين RAB8 مؤخرا للتفاعل مع Rabaptin5، الذي يموضع في الجسم القاعدية، والزميلة مع البروتين IFT يطلق Elipsa / DYF-11 (38، 39). نظرا للدور راسخة من Rabaptin5 باعتباره المستجيب RAB5 في الإلتقام، واقترح أن هذا Rabaptin5-RAB8-Elipsa / DYF-11 الثلاثي قد توفر التفاعلات الحيوية الوظيفية بين الغشاء الهدبي (أو الحويصلات المرتبطة أهداب) وآلية IFT ( 39). في C. ايليجانس، RAB-5 وعرض نفسه للتركيز في قاعدة الأهداب إلى جانب مجمع المرتبطة الاندوسوم أوائل STAM-ساعة الذي ينظم إزالة polycystin-1 / polycystin-2 البروتين من أهداب (40). كيف BBSome البروتينات، التي هي في حد ذاتها المرتبطة مع كل من الهيئة القاعدية وIFT، المشاركة في هذه العملية الفرز الاتجار الجسم الهدبي القاعدية لا يزال بعيد المنال، ودور BBS3، يحتمل أن تكون متميزة عن مكونات BBSome الأساسية، غير معروف في الوقت الحاضر.
لتسليط الضوء على وظائف الجزيئية والخلوية من ARL6 / BBS3، توصلنا لأول مرة التركيب البلوري للشكل محدد GTP من البروتين البشري. هيكل ARL6 / BBS3 يمثل أول من حلها لBBS أو البروتين IFT ويعرض خصائص فريدة لا توجد في GTPases الصغيرة الأخرى. في تركيبة مع GTP ملزمة المقايسات الفنية، يوضح هيكل كيف احد بقايا الطفرات كشفت في المرضى BBS إلغاء النوكليوتيدات ملزمة وبالتالي وظيفة البروتين. وعلاوة على ذلك، علينا أن نظهر الآن أن ARL6 في خلايا الثدييات المهدبة يموضع إلى الهيئات القاعدية النهاية البعيدة، قرب أو على الألياف التي تمر بمرحلة انتقالية، وبالتالي على مقربة من موقع حويصلة لرسو السفن / الانصهار في قاعدة الأهداب. وانسجاما مع دور للARL6 في هذا الموقع التحت خلوية، وتبين لنا أن يعطل وظيفتها الخلوية، عن طريق الإفراط في GDP- أو أشكال غير الساحلية GTP، يؤدي إلى الشذوذ الهدبية في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، الزائد الخلوي من النوع البري ARL6 يسبب التنظيم تتكون من إشارات Wnt. الأهم من ذلك، هو لم يلاحظ هذا التأثير مع المتغيرات المسببة للأمراض من ARL6 / BBS3. معا، وتكشف النتائج التي توصلنا إليها أن بروتين BBS ليس مباشرة (أو بإحكام) المرتبطة BBSome يموضع إلى موقع الرواية في المنطقة الجسم القاعدية، حيث يمكن أن تنظم أهداب (ديس) تجميع وربما نتيجة لذلك، الهدبية يشير أحداث لاحقة . ونقترح أن ARL6 / BBS3 قد تؤدي هذا الدور عن طريق تحوير الاتجار الغشاء عند قاعدة العضية الهدبية.

إجراءات تجريبية

الاستنساخ، تعبير البروتين، وتنقية

للدراسات البلورات، وبقايا الأحماض الأمينية 16-186 من ARL6 من استنساخ الثدييات الجينوم مجموعة (الإحداثيات Geneservice AT30-A7) تم تضخيمها من قبل PCR وsubcloned في ناقلات pET28a-LIC (GI: 145307000)، وذلك باستخدام و-فيوجن PCR نظام الاستنساخ (Clontech). تم تحويل بناء إلى سلالة القولونية BL21-CodonPlus (DE3) -RIL (Stratagene)، وكانت تزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في رائع مرق إلى A 600 3.0 باستخدام نظام محتدما LEX. تم تخفيض حمام الماء إلى 15 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل الاستقراء باستخدام 1 م م الآيزوبروبيل 1-ثيو-β- د -galactopyranoside وثم غادرت عند 15 درجة مئوية خلال الليل. حصاد، تم طرد الخلايا، في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 ° C-المجمدة فلاش. ومعلق الكريات الخلايا إذابة من 1.8 لتر من ثقافة في 100 مل من تحلل العازلة (10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.5 متر كلوريد الصوديوم، 5 م م إميدازول) مع 1 م م phenylmethylsulfonyl الفلوريد، و 0.5٪ CHAPS و lysed مع صدر microfluidizer في 20000 رطل مسح طاف من خلال عمود تبادل أنيون DE52 (هتما) معايرتها قبل مع تحلل العازلة ومن ثم تحميلها على 5 مل HisTrap HP (GE للرعاية الصحية) عمود أيضا قبل معايرتها مع العازلة تحلل. ومزال البروتين الهدف مع التدرج إميدازول 50-500 م م في 50 مل. تم جمع الكسور بروتين مزال، تجميع، وتنقيته من خلال تبني الترشيح هلام (Superdex 75) العمود معايرتها قبل مع العازلة التي تحتوي على 20 م م HEPES، ودرجة الحموضة 8.0، 500 م م كلوريد الصوديوم، و 1 م م dithiothreitol. تم تعديل الكسور البروتين التي تم جمعها لاحتواء 5 م م MgCl 2 ثم حضنت مع 5 × بروتين تركيز المولية من الناتج المحلي الإجمالي لمدة 1 ساعة. ثم تركزت البروتين باستخدام الترا Amicon 15 فلتر الطرد المركزي لتركيز النهائي من 79.2 ملغ / مل. كان البروتين النقي كتلة من 21،354.8 دا.
بلورة وتحديد الهيكل التنظيمي

وقد نمت بلورات الانعراج باستخدام يجلس انخفاض التبخر في درجة حرارة الغرفة. احتوى المحلول الام 2 م (NH 4) 2 SO 4، 0،2 م كلوريد الصوديوم، 0.1 م كاكوديلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.5. يبدو الكريستال ركوب بعد 2 أيام. تم جمع البيانات حيود في النحاس الدورية مصدر الأنود (RIGAKU FR-E) ومعالجتها باستخدام HKL2000 (41) برمجيات. تم إجراء استبدال الجزيئي باستخدام PHASER البرنامج (42) مع فرقة من الهياكل اثنين (رموز PDB 1ZD9 و2H16) كنموذج البحث. تم بناء نموذج ARL6 الأولي تلقائيا في ARP / السدى (43)، تليها عدة جولات من ضبط النفس تنسيق وعامل درجة الحرارة التحسينات في REFMAC (44)، والمصادقة الهندسة في MOLPROBITY (45 الخادم)، ودليل التكيف في الطير المائي (46). وتلخيص البيانات الحيود والإحصاءات نموذج في الجدول 1. وقد تم إيداع الإحداثيات وعامل سعة هيكل في PDB كرمز 2H57 (47).
GTP ملزم الفحص

البرية من نوع الإنسان العاقل ARL6 كدنا] (بنك الجينات TM عدد الانضمام NM_032146 تم استنساخ) في pRSET-6A (48). وقد أعدت كل المسوخ ARL6 بطريقة الطفرات موقع الموجه المعدلة المعروفة باسم SLIM (49). للحصول على البروتين GST الموسومة، تم استنساخ كامل طول ARL6 إلى pGEX-6P-1 (أمرشام العلوم البيولوجية).
واستخدمت BL21 (DE3) خلايا pLysS للتعبير عن غير محدد (pRSET) أو الموسومة GST (pGEX) من النوع البري وARL6 متحولة. تحولت E. وكانت القولونية الخلايا المستزرعة في 50 مل من مرق LB التي تحتوي على 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين عند 37 درجة مئوية حتى A 600 = 0.6. استميلت الثقافات مع 0.4 م م الآيزوبروبيل 1-ثيو-β- بين عشية وضحاها -galactopyranoside د في درجة حرارة الغرفة. إلى الحصاد، ومكعبات الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 5000 × ز لمدة 10 دقيقة، وعلقت في غسل العازلة (50 م م ناه 2 PO 4، 2 م م dithiothreitol، 0.3٪ توين 20، 4 μ م ATP)، و lysed صوتنة. تم فصل الأجزاء القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 20000 × ز لمدة 10 دقيقة. وقد أجريت فحوصات ملزمة GTP كما هو موضح سابقا (50، 51). لفحص الكسر القابلة للذوبان، ورصدت 10 ميكرولتر من المحللة على غشاء النيتروسليلوز، الذي تم غسلها بعد ذلك في غسل العازلة وسمح لاحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة العازلة في ملزمة (50 م م ناه 2 PO 4، 2 م م dithiothreitol، 0.3٪ توين 20، 4 μ م ATP، 2.5 م م MgCl 2) مع 2 μCi من GTP / مل. التالي ملزمة، وتشطف الغشاء في غسل العازلة ويتعرض لتصوير أو شاشة الفوسفور. لفحص جزء بيليه، علقت البروتين في Laemmli عينة العازلة ومفصولة SDS-PAGE. وغارقة هلام في 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، مع 20٪ الجلسرين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونقل السائل على نتروسليلوز. وقد تم TLC كما هو موضح سابقا (50).
زراعة الخلايا الثديية

النسر الأساسية الدنيا والمتوسطة (إينفيتروجن كان يستخدم) للحفاظ على HEK-293 الخلايا، و1: خليط 1 من المعدل المتوسط ​​Dulbecco والنسر وهام في F-12 المتوسطة (إينفيتروجن كانت تستخدم) لزراعة الخلايا IMCD3 وhTERT-RPE. واستكملت كلا النوعين من وسائل الإعلام مع 10٪ مصل بقري جنيني، وكانت تزرع جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. لعلاج المخدرات، علقت نوكودازول في DMSO وتستخدم بتركيز نهائي من 0،1 ميكروغرام / مل لمدة 1 ساعة أو طوال الليل. كان MYC -tagged بناء P50 dynamitin التعبير هدية عينية من ريتشارد فالي (جامعة كولومبيا) وكان transfected في الخلايا IMCD3 باستخدام Lipofectamine2000 (إينفيتروجن) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وكذلك كل البنى الأخرى المستخدمة.
مناعية ومضان المجهر

لجميع التجارب مناعية، كانت تزرع الخلايا على coverslips الزجاج وتشطف مع الفوسفات مخزنة المالحة قبل التثبيت. تم إصلاح الخلايا إما عن طريق الحضانة 10 دقيقة في -20 درجة مئوية الميثانول، تليها الإماهة 10 دقيقة في TBS-T (20 م م تريس قاعدة، ودرجة الحموضة 7.5، 150 م م كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20)، أو عن طريق تثبيت 30 دقيقة مع 2٪ امتصاص العرق في PHEM (0.05 م أنابيب، 0.025 م HEPES، 0.01 م EGTA، 0.01 م MgCl 2، ودرجة الحموضة 7.2)، تليها استخراج 2-مين مع 0.1٪ تريتون X-100 في PHEM. بعد التثبيت، وخلايا منعت إما لمدة 1 ساعة في TBS-T تستكمل مع 1٪ البقري ألبومين المصل قبل الحضانة الأجسام المضادة الأولية أو المحتضنة مباشرة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الأجسام المضادة الأولية ذات الصلة مخففة في TBS-T. ثم تم غسلها الخلايا في TBS-T وحضنت 60 دقيقة أخرى في الضد الثانوية المناسب. تم counterstained نوى التي يحتضنها coverslips الزجاج في 100 ن م 4، 6-diamidino-2-phenylindole لمدة 5 دقائق في TBS-T في درجة حرارة الغرفة. وقد شنت الشرائح في إطالة مكافحة تتلاشى كاشف (المسابر الجزيئية) والتي لاحظها مضان المجهر باستخدام epifluorescence القياسي، لايكا LSM 410 مبائر، أو لايكا TCS أنظمة المجهر SP متحد البؤر. أجريت مناعي المجهري متحد البؤر الرقمي وdeconvolution كما هو موضح سابقا (52).
تم تنفيذ المناعية للأنسجة الخصية الماوس على الماوس جزءا لا يتجزأ من أكتوبر وسريعة المجمدة قبل باجتزاء. تم الحصول على أقسام الكلى الماوس من INOVA تشخيص، سان دييغو (الكتالوج رقم 508385)، والتي تم الحصول عليها قرد أقسام الدماغ من ميديكا، إنسينيتاس، CA (الكتالوج رقم 0608-BR). وقد أجريت تلطيخ والتصوير كما هو موضح أعلاه لخلايا ثقافة أنسجة الثدييات.
وتشمل الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في مناعية مضادة للARL6C ومضادة للARL6N (Abgent)، ومكافحة γ تويولين (سيغما)، ومكافحة الأسيتيل تويولين (سيغما)، ومكافحة α تويولين (سيغما)، ومكافحة PCM1 (هدية من الدكتور أندرياس Merdes، جامعة ادنبره). وتشمل الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة الأرنب والفأر مفتش مترافق مع فلور اليكسا 488 و 594 (المسابر الجزيئية).
تحاليل احصائية

تم حساب الاختلافات في طول أهداب باستخدام ر اختبار الطالب، في حين تم حساب الاختلافات في النسبة المئوية للخلايا مع أهداب باستخدام اختبار χ 2.
WNT luciferase المراسل فحوصات

خلايا كلوة-293T معربا عن ثابت مراسل pTOPflash (53 كانت المصنفة) والخلايا hTERT-RPE في مناطق ذات كثافة من 10 4 خلايا لكل بئر في لوحة 24-جيدا. بعد 24 ساعة، و transfected الخلايا مع ما مجموعه 1 ميكروغرام من الحمض النووي (Renilla السيطرة luciferase المراسل، البلازميد من الاهتمام، ومراسل pTOPflash البلازميد عند الضرورة) باستخدام FuGENE 6 (روش العلوم التطبيقية) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم استنساخ BBS3 من النوع البري وأليل متحولة إلى pCMV وpcDNA 6.2 بروتين الفلورية الخضراء العمود الفقري واختبارها مع ناقلات الرقابة المناسبة على التوالي. وقد حفز الخلايا مع Wnt3a المتوسطة مكيفة (54) 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن وتحصد 24 ساعة بعد التحفيز. تم قياس luciferase النشاط باستخدام طقم المزدوج luciferase المراسل مراسل الفحص (PROMEGA) على TECAN Genios برو luminometer وBMG LABTECH FLUOstar أوميغا لوحة القارئ.

النتائج

هيكل الكريستال من ARL6 يعرض خصائص فريدة من نوعها، ويقترح إلغاؤها النكليوتيد ملزم للالممرضة المتغيرات

لإلقاء الضوء على وظيفة الجزيئية للARL6 / BBS3 وتسهيل الدراسات هيكل وظيفة، توصلنا إلى هيكل عالية الدقة من هذا GTPase صغير. باستخدام طريقة الجلوس انخفاض التبخر القياسية، حصلنا على بلورات الانعراج على ما يصل الى 2 قرار Å لشكل اقتطاع N-محطة من ARL6 (بقايا 16-186) في ولاية محددة GTP (ARL6-GTP) (الجدول 1). ثم تم حلها البنية البلورية للبروتين عن طريق استبدال الجزيئي، كما هو موضح في إطار "إجراءات تجريبية".

الجدول 1
بيانات حيود والإحصاءات نموذج البلورات
rmsd، جذر متوسط ​​الانحراف مربع.

هيكل مجمع ARL6-BBS3-GTP يظهر GTPase نموذجي أضعاف مع ورقة β المركزية الذين تقطعت بهم السبل ستة تحيط بها خمس سنوات اللوالب ألفا (الشكل 1 A)، لكنه يختلف عن معظم GTPases الصغيرة التي يتحلل عادة GTP المربوطة وغالبا ما توجد في ولاية محددة الناتج المحلي الإجمالي. وعلى الرغم من التشابه بين ARL6-GTP إلى أخرى رأس GTPases الصغيرة الفصيلة في ولايات محددة التماثلية GTP أو GTP nonhydrolyzable، بما في ذلك التشكل من خمس الحفاظ G-مربع (G1-5) تسلسل (55)، وثلاثة عناصر الهيكلية للARL6-GTP ، لا سيما في التبديل الأول، التبديل الثاني، والمناطق interswitch، وأظهرت الخلافات بتكوين مثيرة من ذلك من ARF1 في ولاية محددة الناتج المحلي الإجمالي (ARF1 الناتج المحلي الإجمالي) (الشكل 1 B). اعتمدت منطقة التبديل لي التشكل الموسعة غير النظامية التي تنسجم مع التقيد GTP ولم تشكل β حبلا إلى الزوج مع β3 كما هو الحال في ARF1 الناتج المحلي الإجمالي (الشكل 1 B). المنطقة I التحول من ARL6 هي اثنين من مخلفات أطول من أعضاء نموذجي آخرين من العائلة ARF، وتشكيل 3 10 -helix في بقايا 40-42 (الشكل 1 B). مجموعة أميد من الغليسين-72 في منطقة التبديل II تشكل السندات الهيدروجين مع مجموعة γ-فوسفات GTP ويتم نقل بزيادة 7.5 Å بالمقارنة مع المقابلة بقايا الغليسين-70 من ARF1 الناتج المحلي الإجمالي (الشكل 1 C)؛ هذا التغيير مهم المحتمل للربط تفضيلية من GTP. في المطابقة لحركة بقايا التبديل الثاني الغليسين-72، وβ-دبوس الشعر من المنطقة interswitch (خيوط β2-β3) ويمتد ومعرضة للمذيب (56). ومن المثير للاهتمام، ARL6 هو العضو الوحيد في GTPases أسرة المنتدى والصغيرة التي لديها سيرين (بقايا سر-71) في المركز الثاني من X عزر D XX G للتبديل المنطقة الثانية؛ كل GTPases ARF الشبيهة الأخرى لديها الجلايسين في نفس الموقف (57). اقترحت مجموعة الهيدروكسيل سلسلة من الجانب سر-71 سندات أشكال الهيدروجين مع مجموعة أميد من GLN-73 وجزيء الماء لمهاجمة جماعة γ الفوسفات من GTP خلال التحلل (الشكل 2 A). وتمشيا مع انخفاض درجة الحرارة عامل توزيع ARL6-GTP (الشكل 1 D)، وهذه الروابط الهيدروجينية إضافية تجعل الشبكة بالكامل التفاعل التي تنطوي على المغنيسيوم 2+ وGTP، وخصوصا التبديل الأول والتبديل II المناطق، أكثر جمودا مقارنة GTP- الآخر GTPases المنتدى الاقليمى للاسيان ملزمة. من ناحية أخرى، وحلقة ربط β2 وβ3 أكثر مرونة مقارنة GTPases ARF الأخرى (الشكل 1 D).

الشكل 1.
التركيب البلوري للARL6 / BBS3 GTPase صغير. A، تمثيل اسطوانة من هيكل ARL6 في شكل محدد GTP لها. يتم تلوين عناصر الهيكل التي تخضع لتغييرات جوهرية على دورة النقد الناتج المحلي الإجمالي / GTP الأرجواني لتبديل I، II الأزرق للتبديل، والأحمر للinterswitch. يتم عرض حلقة P باللون الأصفر، ويظهر GTP ملزمة في التمثيل عصا. B، مقارنة بنية محددة GTP ARL6 GTPase (رمز PDB 2H57) مع الالتزام الناتج المحلي الإجمالي كامل طول ARF1 GTPase (PDB كود 1HUR). عناصر الهيكل التي تمر بمرحلة تغير التشكل الأساسي في دورة الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP، والتبديل الأول، التبديل الثاني، وinterswitch، واللون الأرجواني، والأزرق، والأحمر للARL6 والسماوي والأزرق البنفسجي، والشوكولاته الأحمر في ARF1. يتم عرض جميع عناصر البنية الثانوية الأخرى من ARL6 في الشريط (القمح)، على الرغم من ARF1 يظهر فقط Cα التتبع (الخضراء). C، تغيير متعلق بتكوين الرئيسي في المنطقة التبديل الثاني عند تغيير الدول النوكليوتيدات المربوطة بين ARL6 (محددة GTP) و ARF1 (متجهة إلى الناتج المحلي الإجمالي). نظام الألوان هو نفسه كما هو الحال في A. 70 الغليسين من ARF1 تظهر ذرات Cα من الغليسين-72 من ARL6 والمقابلة كما المجالات. D، والمرونة التشكل الإقليمية محددة GTP ARF1 (يسار، PDB كود 1O3Y) مقارنة مع تلك التي منضم GTP ARL6 (رمز PDB الصحيح 2H57). يتم تلوين شرائط وفقا لB -factor قريب من ذرات Cα، حيث يتم تلوين ذرات Cα مع أعلى B -factor الأحمر، ويتم تلوين ذرات Cα مع أدنى B -factor الأزرق.


الشكل 2.
التركيب البلوري للARL6 / BBS3 يسلط الضوء على الإمراضية من المتغيرات وجدت في المرضى الذين يعانون BBS. A، عرض ستيريو شبكة التفاعل حول موقع نشط من GTPase صغير ARL6. وتظهر جزيئات الماء في 2+ أيون الأزرق والمغنيسيوم في البرتقال. وتظهر التفاعلات القطبية تتعامل مع الهجوم على جزيء الماء وسر-71 تقدم اللاعب خطوط حمراء. بقايا الثريونين-31، تحور الذي يسبب BBS، هو المسمى في أرجواني. B، عرض ستيريو لشبكة الرابطة الهيدروجينية حول صناديق G4 و G5 وكذلك الغليسين-169 من ARL6. وتظهر السلاسل الجانبية ذات الصلة ARL6 في التمثيل العصا، وتظهر العصي لGTP مع دائرة نصف قطرها أرق. وصفت الروابط الهيدروجينية التي تنطوي على جزيء GTP كخطوط متقطع السوداء. وصفت الروابط الهيدروجينية التي تنطوي على الغليسين-169 باللون الأحمر، والسندات الآخرين الهيدروجين التي تنطوي على بقايا لG4 و G5 هي باللون الأصفر. C، الأساسية مسعور حول لوي-170 من ARL6. وتظهر السلاسل الجانبية من لوي-37، إيل 33، الفنيل ألانين-128، ولوي-170 كما المجالات.

حل التركيب البلوري للARL6 / BBS3 وليس فقط سمح لنا لتوصيف بنية البروتين من النوع البري، ولكنها قدمت أفكارا بالحالة المرضية للبدائل حمض أميني واحد (T31M، T31R، G169A، وL170W) لدينا وذكرت المجموعة أن تسبب BBS في المرضى (28). عدة مجموعات الأميد في مربع G1 (GX4GKT)، المعروف أيضا باسم P-حلقة، وتشكل روابط هيدروجينية الحاسمة مع triphosphates من النوكليوتيدات GTP. على وجه الخصوص، تساهم المجموعة سلسلة الهيدروكسيل منتدى المجالس الرومانسية-31 الجانب للتنسيق من المغنيسيوم 2+، β- وγ الفوسفات من GTP، جزيء الماء مجانا، وجزيء الماء سد لآسيا والمحيط الهادئ-69، عن أهمية حاسمة للنشاط GTPase من ARL6 (الشكل 2 A). فمن الممكن أن تحور منتدى المجالس الرومانسية-31 إلى أرجينين يوفر بقايا الحفازة اللازمة في رابطة الدول المستقلة، وبالتالي يزيد من نشاط GTPase من ARL6. بدلا من ذلك، تحور منتدى المجالس الرومانسية-31 إلى الميثيونين قد تعيق ملزم من المغنيسيوم 2+ وγ-الفوسفات بسبب طبيعة مسعور من سلسلة الجانب الميثيونين. تم العثور على طفرة من بقايا الغليسين-169 إلى ألانين في بارديه-بيدل متلازمة 3 مرضى. بقايا الغليسين-169 تقع ضمن مربع G5 الحفظ (بقايا 162-165)، الذي يربط ليس فقط في حلقة جوانين GTP مباشرة ولكن أيضا تشكل شبكة الهيدروجين الترابط مع مخلفات مربع G4 والمخلفات التالية مربع G5. وتساهم هذه السندات الهيدروجين لتحقيق الاستقرار في النوكليوتيدات المربوطة (الشكل 2 B). ومن المثير للاهتمام، وبقايا الغليسين-169 يساهم في هذه الشبكة الرابطة الهيدروجينية، وتشكيل روابط هيدروجينية مع حمض الغلوتاميك-172 والغليسين-173 (الشكل 2 B). وأخيرا، تم العثور على بقايا لوي-170 لتكون جزءا من نواة مسعور مع سلاسل جانب إيل-33 ولوي-37 (الشكل 2 C). سوف تحور في بقايا لوي-170 إلى التربتوفان المرجح يعطل التعبئة والتغليف لهذه النواة مسعور وزعزعة استقرار البروتين.
ولذلك، التحليلات البنيوية لدينا ويتوقع أن الثريونين-31 الطفرات من المحتمل أن تؤثر على وجه التحديد النوكليوتيدات ملزمة، في حين توقع الغليسين-169 ولوي-170 الطفرات تؤثر في المقام الأول طي البروتين، مما أدى إلى عدم القدرة على ربط النوكليوتيدات والتحلل بواسطة الخلية الآلات. علاوة على ذلك، توقع كل الطفرات أن يؤدي إلى خسارة من وظيفة.
الإمراض ARL6 المتغيرات العرض المتغير النكليوتيد العيوب التجليد

للتحقق من صحة تجريبيا البيانات البلورات، أجرينا فحوصات ملزمة النوكليوتيدات على البروتينات المؤتلف ARL6. تم اختبار من النوع البري ومتحولة البروتينات ARL6 الموسومة GST في المقايسات نقطة وصمة عار للربط إلى [α- 32 P] GTP، وذلك باستخدام GST وحدها كوسيلة لمراقبة سلبية. كما هو الحال مع GST وحده، وARL6 الموسومة GST (T31M) وARL6 (G169A) المسوخ عرض ضئيلة أو معدومة ملزمة بالمقارنة مع من النوع البري ARL6، في حين أن ARL6 (T31R) متحولة ملزمة مستويات أعلى بكثير من النوكليوتيدات (التكميلي الشكل 1 ، A-C). على الرغم من أن [α- 32 P] تم استخدام GTP، وكمية صغيرة من [α- 32 P] الناتج المحلي الإجمالي موجود في قارورة المصدر. لذلك، لتحديد طبيعة النوكليوتيدات المربوطة، قدمنا ​​أيضا المتغيرات الموسومة ب [γ- 32 P] GTP، وفي هذه الحالة فقط من النوع البري ARL6 عرض النشاط ملزم النوكليوتيدات فوق ضبط GST حدها (التكميلي الشكل 1 D ). على الرغم من أن هذه النتائج قابلة للمقارنة مع تلك التي نشرت مؤخرا من قبل كوباياشي وآخرون (57)، الذي كان FLAG- أو البروتينات الموسومة GST، فمن المعروف أن GTPases الصغيرة غالبا ما تكون حساسة لإضافة الترميز المنطقة في اجتماعهم N أو C محطة و أن هذا يمكن أن تتداخل مع الاستقرار و / أو وظائفهم. لهذا السبب، نحن كما نفذت الدراسات التي تستخدم إصدارات لازال من النوع البري والبروتينات ARL6 متحولة (الشكل 3، A و B). وعلى غرار النتائج المقدمة أعلاه، ARL6 (T31M)، ARL6 (G169A)، وARL6 (L170W) المسوخ أظهرت ضئيلة أو معدومة ملزمة من النوكليوتيدات الموجودة في [α- 32 P] خليط GTP، في مقابل ARL6 (T31R) ، الذي عرض تقارب أعلى بكثير لالنوكليوتيدات (الشكل 3، C وF). وبعد ذلك تستخدم TLC لتحديد طبيعة النوكليوتيدات المسمى بد أن ARL6. أظهرت النتائج أنه على الرغم من النوع البري ARL6 لا بد في المقام الأول إلى GTP، ARL6 (T31R) يبدو المنضم بدقة إلى الناتج المحلي الإجمالي (الشكل 3 D). وبالتالي تظهر لدينا البلورات والبيوكيميائية النتائج مجتمعة أن كل من الخيارين ARL6 المسببة للأمراض يفترض، في الشكل الذي سيكون موجودا في المرضى (أي غير محدد)، عرض ألغى النوكليوتيدات ملزم، مع ضئيلة أو معدومة ملزمة في حالة ARL6 (T31M)، ARL6 (G169A)، وARL6 (L170W) وعلى سبيل الحصر في الناتج المحلي الإجمالي في حالة ARL6 (T31R) (الشكل 3 F).

الشكل 3.
BBS3 المتغيرات المسببة للأمراض تمتلك تلغى الأنشطة ملزمة النوكليوتيدات. A، Coomassie الملطخة جل SDS يظهر تحريض GST وحدها، غير محدد النوع البري ARL6، وT31M، T31R، وG169A المتغيرات ARL6. B، Coomassie الملون جل SDS-بولكرلميد يظهر على وقد رصدت نسبة من إجمالي المحللة خلية (T) التي لا تزال في جزء قابل للذوبان (S) لعينات من A بعد 3-ح الاستقراء. C، قسامة من الكسور القابلة للذوبان من B على نتروسليلوز وبحث مع [α- 32 P] GTP. GST، سيطرة سلبية، لا يلزم النوكليوتيدات، في حين ARL6 يربط. ARL6 (T31R) يربط أكثر بكثير من النوع البري ARL6، وT31M وG169A المتغيرات ربط ضعيف جدا. D، TLC تبين طبيعة النوكليوتيدات رديولبلد بد أن للذوبان ARL6 أو البديل أشكال ازال من ARL6. من النوع البري (غير محدد) ARL6 يربط كل من الناتج المحلي الإجمالي وGTP، ولكن المسوخ لازال (T31M وT31R) ربط أساسا الناتج المحلي الإجمالي. E، Coomassie الملطخة SDS هلام تظهر الكسور بيليه من النوع البري والبديل أشكال (T31M، T31R، G169A، L170W ) من البروتين ARL6، بفعل مماثل إلى A في تجربة منفصلة. F، كما هو الحال مع E إلا أنه بعد SDS-PAGE تم تحويل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز، سمح لإعادة أضعاف، وبحث مع [α- 32 P] GTP .
ARL6 يموضع إلى هيكل حلقة تشبه في القاصي نهاية الهيئات القاعدية في خلايا مهدبة

حتى الآن، تم العثور على جميع البروتينات BBS الثدييات درس في توطين إما في الجسيم المركزي / الجسم القاعدية أو في الأقمار الصناعية مريكزي المجاورة، التي تمثل مواقع رئيسية للبروتينات ذات دور الهدبية. على وجه التحديد، BBS2، BBS5، وBBS13 / MKS1 شارك في توطين مع الجسيم المركزي / القاعدية علامة الجسم γ تويولين (38، 58، -، 60)؛ BBS4، BBS8، وBBS14 / CEP290 شارك في توطين مع PCM1 في الأقمار الصناعية مريكزي (61، -، 63)؛ ويوجد BBS6 داخل أنبوب المحيطة centrioles المادية محيط بالمريكز (64). لدهشتنا، واثنين من الدراسات السابقة المتمركزة الأخضر الفلورسنت ARL6 البروتين الموسومة وهيماغلوتينين الموسومة في جولجي (65) أو في العصارة الخلوية (66) من خلايا nonciliated، على التوالي. لذا سعينا لتحديد توطين التحت خلوية من ARL6 الذاتية في خط خلايا مهدبة.
لإجراء تجارب مناعية لدينا، نحن العاملين الأجسام المضادة الموجهة ضد N- والحواتم C-الطرفية من ARL6 الإنسان (المسمى ARL6N وARL6C، على التوالي). من خلال تحليل لطخة غربية، سواء الاعتراف ARL6 لكن ليس البروتين ARF6 ترتبط ارتباطا وثيقا، وتستخدم كعنصر تحكم للخصوصية (الشكل التكميلي. 2).في الماوس النخاع جمع الخلايا الظهارية اصق (IMCD3)، وهما أضداد ARL6 وصمة عار على وجه التحديد نقاط وهما شبه النووية التي شاركت في توطين مع علامة centrosomal γ تويولين (الشكل 4، A وB). ويمكن ملاحظة إشارة ARL6 في centrosomes طوال دورة الخلية، مما يشير إلى وجود ارتباط محددة مع ديناميكية مركز أنيبيب المنظمة. في الطور البيني الخلايا، ارتبط ARL6 مع الجسم القاعدية، الذي الرياضية هدب أن يتم الكشف عن استخدام أجسام مضادة ضد تويولين الأسيتيل (الشكل 4 B). أكدنا على centrosomal / القاعدية توطين جثة ARL6 في خط خلايا مهدبة الثاني، الخلايا الظهارية الصباغية وهي الشبكية (hTERT-RPE) (الشكل 5). الأهم من ذلك، نحن أيضا لاحظ شارك في توطين ARL6 مع الهيئات القاعدية في عدة أقسام أنسجة الثدييات مهدبة، بما في ذلك الخصية والمخ والكلى (التكميلي الشكل 3، A-C). تظهر هذه البيانات التي الزميلة ARL6 / BBS3 مع الهياكل مريكزي / الهيئات القاعدية في مجموعة متنوعة من الخلايا المهدبة في الجسم الحي.

الشكل (4).
ARL6 هو حسن النية / القاعدية البروتين المرتبط الجسم centrosomal أن يموضع بشكل مستقل عن الشبكة أنيبيب أو المحرك الجزيئي داينين. A، ARL6 الذاتية، لاحظ باستخدام الأجسام المضادة ARL6C (الحمراء) في الخلايا IMCD3 مهدبة، لوحظ في نقاط وشبه النووية أن شارك في توطين مع γ تويولين (الخضراء)، وcentrosomal / القاعدية علامة الجسم (الصفراء في الصورة المدمجة). أقحم، 2 × التكبير من المنطقة الموضحة. اتسخت DNA الأزرق مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole. النصال أشر إلى ARL6 توطين لcentrosomes. B، ARL6 الذاتية (تصور باستخدام الأجسام المضادة ARL6N في الخلايا IMCD3؛ أحمر) لا يزال يرتبط مع الجسيم المركزي (ملحوظ باستخدام الأجسام المضادة ضد γ تويولين؛ الأخضر) في جميع مراحل دورة الخلية (الصفراء إشارة في الصورة المدمجة). لاحظ أن الخلية البيني ومهدبة (ملطخة الأجسام المضادة ضد الأسيتيل (ACET) تويولين؛ الأخضر). C والعلاج نوكودازول، ولكن ليس العلاج التحكم (DMSO)، إما 1 ساعة أو بين عشية وضحاها (O / N)، غير كافية ل تدمير شبكة أنيبيب في الخلايا IMCD3 يعاير كل α تويولين تلطيخ (الأخضر)، لكنه لا يملك أي تأثير على ARL6 (الأحمر) الترجمة. النصال أشر إلى ARL6 المترجمة إلى centrosomes في الخلايا تعامل مع بين عشية وضحاها نوكودازول. D، وتثبيط المحرك الجزيئي ويتحقق داينين ​​من خلال overexpression من الأخضر الفلورسنت الموسومة البروتين P50-dynamitin (الأخضر) الذي أبداه القدرة على mislocalize PCM1 (اللوحة اليمنى)، وهو بروتين المعروف أن تعتمد على داينين ​​للتوطين في centrosomal (لاحظ تلطيخ المشتتين في الخلايا معربا P50-dynamitin مقارنة مع الخلايا لا تعبر عن المانع داينين). ARL6 (اللوحة اليسرى لم يتم mislocalized) عندما هى overexpressed P50 dynamitin. النصال تشير إلى توطين السليم للARL6 في الخلايا معربا عن P50-dynamitin.


الشكل 5.
ARL6 يموضع في النهاية البعيدة من الجسم القاعدية في نمط على شكل حلقة. A، مناعية باستخدام الأجسام المضادة ARL6C يظهر ARL6 توطين إلى النهاية البعيدة من centrioles الأم والهيئات القاعدية في الخلايا hTERT-RPE. أقحم، صورة مكبرة للاختيار المنطقة. B والصور المجهري متحد البؤر باستخدام الأجسام المضادة ARL6N في الخلايا hTERT-RPE يدل على أن ARL6 يموضع في نمط يشبه عصابة، تماما البعيدة إلى centrioles الأم، في الخلايا nonciliated والمهدبة.

على غرار BBS6 (64)، ولكن على عكس BBS4 ومن البروتين التفاعل PCM1 (63)، وتوطين ARL6 إلى الجسيم المركزي / الجسم القاعدية هو-أنيبيب مستقل، وعلاج الخلايا IMCD3 مع أنيبيب depolymerizing نوكودازول المخدرات لا يؤثر هذا التعريب (الشكل 4 C). وعلاوة على ذلك، فإن توطين ARL6 هو أيضا يتأثر في الخلايا حيث تعطلت داينين ​​السيارات إلى الوراء من قبل overexpression من P50-dynamitin (الشكل 4 D). معا، وهذه النتائج تدعم بقوة فكرة أن ARL6 الذاتية / البروتين BBS3 هو حسن النية البروتين المرتبط مريكز التي هي موجودة في أنيبيب تنظيم مركز في تقسيم الخلايا وفي الجسم القاعدية في الخلايا المهدبة، في microtubule- وdynein- بطريقة مستقلة.
بهدف تحديد بدقة موقف ARL6 داخل الجسم القاعدية، أجرينا التصوير متحد البؤر على الخلايا hTERT-RPE ملطخة الأجسام المضادة على حد سواء المضادة للARL6. ومن المثير للاهتمام، تم العثور على بروتين ARL6 إلى التركز في نهاية واحدة من الهيكل القائم على أنيبيب. على وجه التحديد، والخلايا البيني تفتقر إلى هدب في وقت تظهر تثبيت ARL6 توطين في نمط تشبه الحلبة في نهاية البعيدة للمريكز واحد فقط، من المفترض ان مريكز الأم. للخلايا التي لا تمتلك هدب، يتم وضع حلقة من ARL6 مماثل، وتحديدا عند تقاطع بين الجسم القاعدية والخيط المحوري الهدبية (الشكل 5، A وB). هذه النتائج تشير إلى أن ARL6، وهي ليست موجودة في مجمع BBSome (37)، وتعمل ضمن منطقة متميزة وفريدة من نوعها من الجسم القاعدية مقارنة مع جميع البروتينات BBS مدروسة الأخرى. توطين موضوعه متفقا مع كونها قريبة أو في الألياف الانتقالية، التي تشكل جزءا من ما يسمى بوابة الهدبية.
التعبير عن نوع البرية وARL6 سلبي مهيمن / BBS3 المتغيرات النتائج في سيليا العيوب

اقترح توطين فريد من ARL6 الثدييات / BBS3 في قاعدة أهداب أن هذا GTPase صغيرة تمتلك دورا في تشكيل هدب في خلايا الثدييات، وربما عن طريق الاتجار الغشاء الهدبي. لتحقيق هذا الاحتمال، اتخذنا الاستفادة من حقيقة أن الإفراط في GTPase صغير أشكال متحولة غالبا ما تستخدم لتحقيقاتها في الجسم الحي وظائف (67). مصادفة، والطفرات المقابلة لبقايا الثريونين-31، التي وجدناها سابقا في ولاية متماثل في المرضى الذين يعانون BBS (28) ويؤدي إلى بروتين غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي (الشكل 3 D)، ويشيع استخدام كأشكال السلبية المهيمنة. ولذلك نحن على استعداد لبناء التعبير الثدييات لARL6 (T31R)، وكذلك تحمل طفرة آخر واحد من الأحماض الأمينية في GLN-73، وتوقع أن تسفر عن والشكل غير الساحلية GTP نشط بشكل جوهري من البروتين (68). وإن كان في معظم الحالات أشكال غير الساحلية GTP خلق GTPases صغيرة نشطة بشكل جوهري، في بعض الحالات يبدو أن هذا هو ركوب الدراجات من النوكليوتيدات ما هو ضروري من أجل وظيفة البروتين. في تلك الحالات، وشكل غير الساحلية GTP يتصرف أشبه سلبية المهيمنة، يشبه إلى حد كبير شكل غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي، كما هو الحال بالنسبة لشكل غير الساحلية GTP من ARL6 (انظر أدناه). ومن المثير للاهتمام، وشكل غير الساحلية GTP من ARF6 (Q67L)، والذي يحدث أيضا أن تكون GTPase صغيرة المنتدى الاقليمى للاسيان وفقا لأعلى درجة من الهوية إلى ARL6، يعرض أيضا هذه الخاصية (69، -، 71).
الإفراط في البرية من نوع ARL6، أو أي من المتغيرات، لم ARL6 (T31R) أو ARL6 (Q73L)، في الخلايا hTERT-RPE لا يؤدي إلى تغييرات ملموسة على الانقسام، أنيبيب الهيكل الخلوي، أو مورفولوجيا الخلايا مقارنة بالمجموعة الضابطة ( لا تظهر البيانات). ومع ذلك، باستخدام تويولين الأسيتيل كعلامة للأهداب، لاحظنا نسبة أعلى بكثير من الخلايا التي تملك أهداب في تلك مع transfected إما ARL6 (T31R) أو ARL6 (Q73L) بنيات overexpression بالمقارنة مع الخلايا السيطرة (41.5 ± 3.5 و 54.5 ± 6.5٪ مقابل 25 ± 4٪، ع <0.001 مقارنة مع الشاهد) (الشكل 6. A). ومن اللافت للنظر، تم الكشف عن النمط الظاهري المعاكس، وهي نسبة أقل دلالة إحصائية الخلايا مع أهداب، في تلك مع transfected من النوع البري ARL6 بناء (9 ± 2 مقابل 25 ± 4٪، ع <0.001 مقارنة مع الشاهد) (الشكل 6. A). كان النمط الظاهري آخر لاحظت فرقا كبيرا في طول الأهداب في الخلايا معربا عن أشكال متحولة من ARL6. في حين كان متوسط ​​طول أهداب من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع من النوع البري ARL6 لا يختلف كثيرا عن السيطرة، وأهداب من ARL6 (T31R) - كانت وARL6 (Q73L) خلايا -transfected لفترة أطول كثيرا (4.79 ± 0.19 و 5.21 ± 0.36 ميكرون مقابل 2.4 ± 0.09 ميكرومتر، ص <0.001) (الشكل 6. B). معا، وتشير هذه النتائج إلى أن BBS3 يعمل على تعديل وجود وبنية أهداب الابتدائي؛ من النوع البري النتائج BBS3 الزائدة في الخلايا المهدبة أقل، في حين أن إلغاء وظيفتها يؤدي إلى نسبة أكبر من الخلايا المهدبة مع أهداب طويلة.

الشكل 6.
overexpression من النوع البري ARL6 / BBS3 والمتغيرات النتائج في الشذوذ الهدبية. و transfected الخلايا hTERT-RPE مع واحدة من ثلاث بنيات، pCMV-BBS3 (overexpressing من النوع البري غير محدد وBBS3)، pCMV-T31R، أو pCMV-Q73L (overexpressing المتغيرات ازال). وتم قياس كمية الظواهر الناتجة أيام 2 بعد ترنسفكأيشن. A، تم تحديد نسبة الخلايا التي تمتلك هدب عن طريق عد عشوائيا> 100 خلية من كل السكان. وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري بين تجارب مكررة. B، تم تحديد طول هدب عن طريق قياس> 30 أهداب عشوائي من السكان. وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري بين تجارب مكررة. النجمة تمثل فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة مع الشاهد. C، صور تمثيلية تظهر الاختلافات في طول هدب بين الخلايا hTERT-RPE التي كانت وهمية transfected (السيطرة) أو transfected للتعبير عن إصدارات لازال من النوع البري ARL6، ARL6 (T31R)، أو ARL6 (Q73L) المتغيرات. دابي، 4، 6-diamidino-2-phenylindole.
من النوع البري ARL6، ولكن ليس المتغيرات المسببة للأمراض، ينظم إشارات Wnt

اكتشاف أن أهداب هي المركزية لمختلف مسارات الإشارات قد عززت بشكل كبير من فهمنا لدور هذه العضيات في التنمية والمرض. كجزء من وظيفتها في الإشارات بين الخلايا، وهدب يقمع بشكل طبيعي، β-تعتمد على catenin إشارات WNT الكنسي (72، 73) ومطلوب لnoncanonical، β-catenin مستقل يشير WNT. فقدان العديد من البروتينات BBS، بما في ذلك BBS2، BBS4، وBBS6، يؤدي إلى زيادة بيتا catenin النشاط النسخي عندما تحفزها إشارة Wnt3a الكنسي (73)، في حين لم يقم overexpression من BBS4 تأثير العلني على النشاط β-catenin. 5
لاستكشاف الدور المحتمل للARL6 / BBS3 في إشارات Wnt، عبرنا عن ARL6 / BBS3 في خط الخلية hTERT-RPE1 مع transfected مراسل البلازميد pTOPflash (الشكل 7) وخط HEK293T مستقر خلية مراسل WNT (التكميلي الشكل 4 A ). ومن المثير للاهتمام، وتأثير ARL6 / BBS3 على النشاط β-catenin هو تعتمد على الجرعة، لأن overexpression يؤدي إلى التقريبية 2- أو 6 أضعاف زيادة استجابة Wnt3a في hTERT-RPE1 (الشكل 7) وHEK293T (التكميلي الشكل 4 A) خط الخلية مقارنة مع خلايا من النوع البري، على التوالي. في المقابل، overexpression من ARL6 (T31R) وARL6 (Q73L)، التي تعرف الآن أن تسبب التشوهات الهدبية (الشكل 6)، لم يكن لديها تأثير على β-catenin النشاط النسخي (الشكل 7). على الرغم من ARL6 (T31R) يمثل طفرة المسببة للأمراض، ARL6 (Q73L) ليست طفرة المحددة في المرضى BBS3. لذلك، لمواصلة التحقيق أم لا يشير WNT قد تلغى في المرضى الذين يعانون BBS، اختبرنا ردا على Wnt3a يجند في متغيرات إضافية ARL6 overexpressed المسببة للأمراض، وهي ARL6 (G169A) وARL6 (L170W). وعلى غرار ARL6 (T31R) وARL6 (Q73L)، لاحظنا فقدان responsivity للإشارة Wnt3a وβ-catenin النشاط النسخي مقارنة عندما هى overexpressed من النوع البري ARL6 (التكميلي الشكل 4 B). معا، تظهر هذه النتائج أن ARL6 / BBS3 يمكن أن تعدل إشارات Wnt في خلايا الثدييات والتي قد يكون لها تأثير مختلف عن البروتينات BBS الأخرى (انظر أدناه).

الشكل 7.
overexpression من النوع البري ولكن ليس متحولة أشكال ARL6 / BBS3 يغير الاستجابة لWnt3a يجند. في الخلايا مراسل hTERT-RPE TOPflash، overexpression من ARL6 / BBS3 يؤدي إلى زيادة النشاط β-catenin ردا على Wnt3a يجند ولكن لا ديسريغولاتيون العالمي للβ يشير -catenin. في المقابل، overexpression من ARL6 (T31R) وARL6 (Q73L) ليس له تأثير ملحوظ على β-catenin النشاط النسخي. الخلايا باستمرار 70-80٪ متكدسة ومهدب كما لوحظ من قبل تلطيخ مع مضاد للالأسيتيل تويولين الأضداد (لا تظهر البيانات). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. فقط النوع البري (BBS3 WT عينات) تختلف إحصائيا من مكافحة ناقلات الفارغة (ع <0.05).

نقاش

BBS3 تمتلك الميزات الهيكلية الفريدة والخصائص النكليوتيد التجليد

هنا، نقدم التركيب البلوري للARL6 / BBS3، أول المعلومات الهيكلية عالية الدقة لبروتين BBS أو IFT. لأن GTPases المنتدى الاقليمى للاسيان وعادة ما يكون تقارب أعلى للناتج المحلي الإجمالي من GTP (على سبيل المثال ARL5A، رموز PDB 2H16 / 2H17؛ ARL8A، رموز PDB 2H18 / 1ZD9؛ ARL8B، رمز PDB 2AL7؛ وSAR1A، PDB كود 2GAO)، البيانات الهيكلية لدينا على ARL6 كانت غير متوقعة، خاصة وأننا كنا قادرين على حل هيكلها في ولاية محددة GTP (74). أحد الأسباب المحتملة لهذا العقار تبدو فريدة من ARL6 هو أن منطقتها التبديل II تفضل التشكل محددة GTP بسبب الرابطة الهيدروجينية بين سلسلة الجانب سر-71، والتي هي فريدة من نوعها بين GTPases صغيرة / ARF مثل المنتدى الاقليمى للاسيان، وأميد مجموعة من GLN-73 (الشكل 2 A). وبالتالي، قد يكون ARL6 أعلى النسب للGTP من الناتج المحلي الإجمالي، وهو الاكتشاف الذي يتم اعتماد كيميائيا (الشكل 3 والشكل التكميلي 1). بالإضافة إلى ذلك، فمن المتوقع لليسين الغنية N-14 محطة بقايا ARL6، لم يكن موجودا في كياننا لتشكيل مسعور α-الحلزون بدلا من الحلزون متقابلة الزمر، كما هو الحال مع غيرها من GTPases الصغيرة الأسرة المنتدى الاقليمى للاسيان. ومن المتوقع myristoylation من بقايا الغليسين-2 في ARL6 أيضا أن يكون من غير المحتمل (32). وبالتالي، فمن الممكن أن كلا من النوكليوتيدات خصائص الملزمة ARL6، وكذلك الطريقة التي الغشاء ينظم ملزمة، قد تكون مختلفة عن تلك التي أفراد الأسرة الآخرين.
الأهم من ذلك أن بيانات التركيب البلوري شرح تأثير الطفرات المسببة للأمراض قد أن على البروتين ARL6 / BBS3. هذه الطفرات إما تؤثر بقايا الحرجة اللازمة لGTP ملزم، أي الثريونين-31، أو أنها تؤثر على روابط هيدروجينية ضمجزيئي في مثل هذه الطريقة ربما لسبب misfolding المحلية / العالمية كذلك، أي الغليسين-169 ولوي-170. لدينا دراسات وظيفية تتفق مع هذه الفكرة. وARL6 (T31M)، ARL6 (G169A)، وARL6 (L170W) المتغيرات عرض ضئيلة أو معدومة النوكليوتيدات ملزمة، في حين لوحظ ARL6 (T31R) البديل في حالة غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي تختلف عن نظيرتها من النوع البري، الذي كان أساسا GTP محددة (الشكل 3). في ظل هذه الظروف، ومن المتوقع أنشطة GTPase صغير قد انخفضت، وهو احتمال، كما هو مذكور أدناه، أكدنا من خلال مراقبة الهدبية ويشير الظواهر.
ARL6 / BBS3 هو بروتين رواية بصل الهيئة التي يموضع في مدخل الهدبية حجرة

وتوضح النتائج التي توصلنا إليها أن ARL6 / BBS3 وجدت في نمط تشبه الحلبة في النهاية البعيدة من الجسم القاعدية ومعظم المنطقة القريبة من الخيط المحوري الهدبية (الشكل 5). هذا التعريب الجسم القاعدية للARL6 / BBS3 يتسق مع النتائج السابقة للبروتينات BBS الأخرى (38، 58، 60، -، 63). ومع ذلك، فإن الموقف الدقيق للARL6 / BBS3 في النهاية البعيدة من الهيئات القاعدية هي فريدة من نوعها بين البروتينات BBS لكن مماثلة لتلك التي ذكرت لالتهاب الشبكية الصباغي 2 (RP2) نديد في C. ايليجانس (34) والمثقبيات البروسية (75)، والتي تشكل أيضا هياكل على شكل حلقة في قاعدة الأهداب. ومن المثير للاهتمام، ومن المعروف RP2 للتفاعل معها، ويكون بمثابة-المنشط GTPase ل، وGTPase ARL3 صغيرة (76)، وظيفتها في تشكيل هدب تم توثيقه في الكائنات الحية المختلفة (33، -، 35).
الملاحظ أيضا هو حقيقة أن الموقع التحت خلوية عمل ARL6 إما في، أو على مقربة، والألياف الانتقالية في النهاية البعيدة من جميع الهيئات القاعدية. نصائح من هذه الألياف، التي تنضم إلى الغشاء الهدبي، يعتقد أنها مواقع لرسو السفن لجزيئات IFT (19، 22). وبالنظر إلى أن C. ايليجانس ARL-6 / BBS-3، مثل كل اختبار آخر C. ايليجانس البروتينات BBS (BBS-1، -2، -5، -7، و-8) (77، 78)، وشركاء مع الآلات IFT (أي تحركات بطريقة تشبه IFT في أهداب الحسية)، ونحن التكهن بأن ARL6 / BBS3 قد تتفاعل مع البروتينات BBS الأخرى والآلات IFT قرب أو في هذه المنطقة الألياف الانتقالية. تساعد الألياف أيضا تشكيل بوابة الهدبية، مما يحد من دخول الحويصلات في الفضاء الهدبي، مثل أن حويصلات جولجي المستمدة من تحمل قفص الاتهام البضائع الهدبي والصمامات على مقربة من الألياف (21، 22). لذلك، نظرا للدور أنشئت للبروتينات BBS في الاتجار داخل خلايا الجسم، وIFT في أهداب، يمكن ARL6 / BBS3 تسهيل تصور / تعدل الانتقال بين حويصلي والاتجار intraciliary. سيكون تحديا من نوع خاص لتشريح وظائف محددة من ARL6 / BBS3، باعتبارها واحدة سوف تحتاج إلى أن تأخذ في الاعتبار قبل القاعدية الجسم / الهدبية الاتجار غشاء فضلا عن الاتجار intraciliary (IFT) عمليات -associated. على الأرجح السابق يتضمن العديد من GTPases الصغيرة، بما في ذلك RAB8، RAB17، وRAB23، وربما لمجموعة فرعية من البروتينات (التي تحتوي على V X PX الزخارف)، ARF4 وRAB11 (37، 79، 80)؛ يعتمد هذا الأخير على مجموعة من اللاعبين الناشئة، بما في ذلك البروتينات RAB IFT25، RAB8، والإفتاء-2، فضلا عن ARL13B (34، 36، 37، 39).
ARL6 / BBS3 مايو تعدل هدب التفكيك و / أو طول تحكم

من خلال فائض الانتاج في الخلايا المهدبة كلا من النوع البري ARL6 وشكلين متحولة من GTPase صغير ARL6، وكشف لنا دور محتمل لهذا GTPase صغيرة في هدب التفكيك. على وجه التحديد، overexpression من النوع البري النتائج ARL6 إلى انخفاض في تشكيل هدب، لاحظ النمط الظاهري أيضا على الصغيرة بالتدخل RNA ضربة قاضية من BBS3 في مسح لجميع BBS الجينات (80)؛ من ناحية أخرى، overexpression من ARL6 (T31R) وARL6 (Q73L)، التي تمنع نشاط ARL6 الذاتية، يسبب زيادة في تشكيل هدب وطول (الشكل 6).
من هذه النتائج، فإننا نقترح أن ARL6 قد تسهل، يحتمل أن تكون من خلال تهريب بعض البضائع الهدبية، وارتشاف من الأهداب. مطلوب هذه العملية لتحرير centrioles (الجسم القاعدية)، لاستخدامها كمراكز أنيبيب المنظمة، قبل دورة الخلية إعادة دخول (81). على الرغم من أن هذه وظيفة ستكون الأولى من نوعها البروتينات BBS، البروتينات IFT هي ثيقا المعنية في ارتشاف الهدبية (17).
ومن المثير للاهتمام، الإفراط في ما يعادل (يفترض أن الناتج المحلي الإجمالي مقفلة) أشكال متحولة من ARL6 (T31R) (الشكل 6 B) وRAB8 (T22N) (37) وتنتج عيوب الهدبية المعاكس أساسا، مشيرا إلى وظائف معارضة لاثنين من GTPases الصغيرة. ومن المحتمل ذات الصلة التي في الشاشة الزرد عن التفاعلات الوراثية بين BBS الجينات، ARL6 تم العثور على التفاعل مع BBS1 (82)، الذين المنتج الزميلة جسديا مع RAB8 (الجين 37). على العموم، تشير هذه البيانات إلى جمعيات الوظيفية المحتملة بين BBSome، ARL6 / BBS3، وRAB8 في التوسط تكون الأهداب وهدب ارتشاف. الآن هناك علاقة بين BBSome والهدبية ارتشاف. وقد تبين أن البروتين BBIP10 BBSome المصاحب للتفاعل مع HDAC6، الذي أستلة أنيبيب النشاط يؤثر الهدبية التفكيك (83، 84). بالإضافة إلى ذلك، وتورط البروتينات BBS أيضا في إزالة البروتينات من أهداب في كلاميدوموناس (100)، بما يتفق مع دور محتمل في ارتشاف.
بدلا من ذلك، يمكن أن BBS3 المشاركة في هدب السيطرة طول، وهي عملية نعرف أن ينظم بإحكام في كلاميدوموناس reinhardtii. عندما كلاميدوموناس يتم تحفيز الخلايا لاستئصال الآفة، ويتم إجراء بدلاء لهم إلى ما قبل deflagellation أطوال في أقل من 2 ساعة (85). وعلاوة على ذلك، عندما يتم بتر السوط واحد فقط، فإن السوط المتبقية تقصير حتى يصل نظيرتها بنفس الطول، في الوقت الذي كل من سياط تنمو إلى طول محدد مسبقا من (85). لا يقل عن سبعة البروتينات، المشفرة بواسطة أربعة سياط طويلة (LF) وثلاثة أسواط (قصيرة الموجات الدقيقة) الجينات، وتنظيم هذه العملية في C. reinhardtii (86، -، 89). يتم وضع BBS3 من الناحية المثالية، عند أو بالقرب من بوابة الهدبية، لتعمل في مراقبة طول الهدبية. على وجه التحديد، فقد تم الافتراض أن الألياف الانتقالية والآلات الموجودة في هذه المنطقة قد فرض رقابة صارمة على حركة المكونات داخل وخارج المقصورة الهدبية، على سبيل المثال البروتينات IFT، بطريقة مماثلة لتلك التي من مجمع المسام النووي (19) .
ARL6 / BBS3 ينظم إشارات Wnt

فقدان البروتينات BBS، بما في ذلك BBS1، BBS4، وBBS6، يؤدي إلى استجابة تضاف إلى إشارات الكنسي WNT مثل Wnt3a مقاسا β-catenin النشاط النسخي (73). وبالنظر إلى هذه النتائج، فإنه لم يكن متوقعا أن overexpression، وليس ضربة قاضية، من بروتين آخر BBS، وهي BBS3، أدى إلى رد فعل المعزز مماثلة لWnt3a يجند الكنسي (الشكل 7). نقترح أن زيادة النشاط β-catenin ينظر في البرية من نوع الخلايا overexpressing BBS3 مرتبط نسبتهم أقل من أهداب (الشكل 6 A). وقد اقترح أن أهداب تؤثر على التوازن بين الإشارات WNT الكنسي وnoncanonical داخل الخلية من خلال تفضيل المسار noncanonical (73)؛ وبالتالي، زيادة التفكيك الأهداب في الخلايا overexpressing من النوع البري BBS3 يفضلون يشير WNT الكنسي، كما لاحظنا.
على الرغم من أن قد يتوقع المرء أن يرى أثر عكسي، انخفضت هما النشاط بيتا catenin في الخلايا overexpressing وARL6 (T31R) وARL6 (Q73L) المتغيرات، التي تبين أيضا هنا أن تسفر عن الظواهر الهدبية، لاحظنا أي تأثير كبير على β -catenin النشاط النسخي من overexpression من هذه الطفرات السائدة (الشكل 7). على الرغم من أن هذه النتيجة ليست بديهية على الفور، فإنه لا تتناسب مع دورنا المفترضة لBBS3، وهو ذلك الجزء من وظيفتها قد يكون للمساعدة في تهريب مكونات الغشاء الهدبي للخروج من مقصورة الهدبية. لتحقيق التوازن الديناميكي بين كل من WNT مسارات إشارات الكنسي وnoncanonical، والهدبية "التبديل" يجب أن تعمل بشكل صحيح، وأنه من المرجح أن يتطلب الاتجار الصحيح للمكونات الغشاء الهدبي ليس فقط في، ولكن أيضا من ومقصورة الهدبية. إذا مكونات الهدبية للمسار WNT (على سبيل المثال inversin) (90، -، 92) و، لا يتم الاتجار بهم بشكل صحيح من هدب، ومن المرجح أن يكون ضعف التحول إلى إشارات noncanonical، والنوع البري مستويات النشاط β-catenin يكون لاحظت، كما هو الحال مع نتائجنا. قد يوحي هذا أن التحول الهدبية التي تفضل قد يكون noncanonical إشارات Wnt مختلة عند منسوخ BBS3، وهو احتمال يحتاج إلى مزيد من التحقيق.
على الرغم من أن نتائجنا تتفق مع النماذج الحالية تشير إلى دور للأهداب في إشارات Wnt، فإنه سيكون فقط المناسب أن نعترف أن شرط أهداب في كبح إشارات WNT الكنسي لا يزال مثيرا للجدل. ينبع الخلاف من النتائج التي تظهر نماذج الماوس IFT معيب ونماذج الزرد-الأهداب أقل تظهر من النوع البري من أنماط التعبير الكنسي WNT مكونات الإشارات وتستجيب عادة للالكنسي WNT يجند (93، 94). لكن، وكما هوانغ وشير (94) الاعتراف، ضربة قاضية لهذه المكونات IFT النتائج حصرا في العيوب أهداب ويترك الجسم القاعدية أكثر أو أقل سليمة. لأن البروتينات BBS غالبا ما تكون القاعدية في المقام الأول، وفي بعض الحالات يشاركون في الاتجار العناصر الحاسمة centrosomal (المرتبط الجسم 61، 63)، فإنه يمكن أن تورط البروتينات BBS في إشارة WNT له علاقة مع دورها في الهيئات القاعدية، الأساس الذي بنيت أهداب. ولذلك، فإننا نؤكد أنه إذا لم أهداب ثم الهيئات القاعدية على أقل تقدير حاسمة لتقييد الكنسي إشارات Wnt من خلال التأثير على توازن ديناميكي بين الكنسي وnoncanonical إشارات Wnt.
ومن المثير للاهتمام، تعطلت التعبير عن Wnt3a في الخلايا العصبية في القلب قبل الهجرة قمة الزرد مع بوساطة morpholino ضربة قاضية من البروتين التفاعل ARL6 (ARL6IP) (95). وعلاوة على ذلك، فقد ARL6IP تحاكي العديد من الظواهر التي لوحظت في ضربة قاضية للبروتينات BBS في دانيو rerio، وهي تشوهات القحفي، وعيوب في التنمية برعم الطرف، عيوب القلب، وتصبغ غير طبيعي، وتنكس الشبكية (82، 95، -، 97). وبالتالي يمكن أن طبيعة هذا التفاعل الوظيفي بين ARL6 وARL6IP يثبت أنه مفيد لفهمنا العمليات الخلوية والجزيئية التي تنظم وظيفة هدب، وارتباطه مع إشارات Wnt.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
إضافة رد

« الموضوع السابق | الموضوع التالي »

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك
BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة
الانتقال السريع

 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع |  المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية


الساعة الآن 06:10 PM.

الاتصال بنا - موقع أطفال الخليج ذوي الاحتياجات الخاصة - الأرشيف - الأعلى

Powered by vBulletin® Version 3.8.2
Copyright ©2000 - 2025, Jelsoft Enterprises Ltd

a.d - i.s.s.w