متلازمة بارديه-بيدل

[رافت ابراهيم]

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/22/19/3858.full

أهداب الأولية هي الزوائد الخلوية مهمة لنقل الإشارة والاستشعار عن بعد في البيئة. بارديه-بيدل البروتينات متلازمة شكل مجمع وهذا أمر مهم لعدة عمليات تتعلق الهيكل الخلوي مثل تكون الأهداب، والهجرة الخلية والانقسام. ومع ذلك، فإن الآليات التي البروتينات BBS قد تنظيم الهيكل الخلوي لا تزال غير واضحة. اكتشفنا أن Bbs4- وBbs6 الخلايا النخاعية الكلى -deficient عرض السلوك المميز تضم الفقراء والهجرة، والالتصاق والانقسام مع عدم القدرة على تشكيل ملحقات lamellipodial وfilopodial. وعلاوة على ذلك، تم المهدبة خلايا متحولة أقل [48٪ ± 6 لالبرية من نوع (WT) خلايا مقابل 23٪ ± 7 لخلايا فارغة Bbs4؛ P <0.0001] وأهداب بهم كانوا أقصر (2.55 ميكرون ± 0.41 لخلايا WT مقابل 2.16 ميكرون ± 0.23 لخلايا فارغة Bbs4؛ P <0.0001). في حين أن الهيكل الخلوي microtubular والأكتين القشرية كانت سليمة، وتعطل تشكيل ألياف الأكتين الإجهاد الشديد، وتشكيل الشاذة قمي المجاميع الألياف الإجهاد. وعلاوة على ذلك، لاحظنا الالتصاقات البؤرية الإفراط في وفرة (FAS) في Bbs4-، Bbs6- والخلايا -deficient Bbs8. في ضوء هذه النتائج، ودور RhoA في تنظيم خيوط الأكتين البلمرة، أظهرنا أن مستويات RhoA-GTP تم upregulated غاية في غياب البروتينات BBS. على علاج Bbs4 خلايا -deficient مع مثبطات الكيميائية للRhoA، كنا قادرين على استعادة طول الأهداب وعدد وكذلك سلامة الهيكل الخلوي الأكتين. معا هذه النتائج تشير إلى أن البروتينات BBS تلعب دورا مركزيا في تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين والسيطرة على طول الأهداب من خلال تغيير في مستويات RhoA.

القسم السابق القسم التالي

مقدمة

أهداب الأولية هي الزوائد قمي الانفرادي موجودة على معظم الخلايا في الجسم. الأدلة الأخيرة حددت أنهم بعيدون عن أثري، بدلا يعمل كما هوائيات لنقل الإشارة. العمليات التي تنظم تكون الأهداب والإشارات بدأت بالظهور، إلى حد كبير نتيجة لدراسة نماذج الأمراض الحيوانية واضطرابات الإنسان.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو عديد المظاهر السريرية، واضطراب وراثي جسمي مقهور في المقام الأول يتألف من السمنة، والتقدمية تنكس الشبكية المبكر يصيب، polydactyly، نقص الأعضاء التناسلية وضعف الإدراك والنمو الشاذ الكلى (1 - +4). وقد ارتبط هذا التناذر غير متجانسة مع الطفرات في لا يقل عن 15 BBS الجينات المسببة لل(5). ترتبط البروتينات وما شابه ذلك لالهدبي، الجسم القاعدية أو اختلال وظيفي centrosomal وبعض وقد ثبت أن تعدل النقل intraflagellar (IFT) (6). ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الدقيقة لهذه الإجراءات لا تزال بعيدة المنال.
نحو فهم أفضل لدور البروتينات BBS في وظيفة الخلوية، وأظهرنا سابقا أن BBS4 مطلوب للIFT الوراء من مكونات centrosomal الرئيسية مثل PCM1 (مطلوب لتشكيل أهداب)، وبالتالي يتصرف بوصفه البروتين محول لتحميل البضائع على داينين المحركات الجزيئية (7). نحن أول من اقترح وظيفة الهدبية للبروتينات BBS بعد اكتشاف BBS8، وهو بروتين وهو ما يعبر عنه في ظهائر مهدبة والخلايا العصبية المهدبة في انواع معينة ايليجانس. وقد ثبت BBS7 وBBS8 لتنسيق المحركات الجزيئية خلال IFT في C. ايليجانس (6). كشفت دراسة تنقية جنبا إلى جنب تقارب أن سبعة البروتينات BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، TTC8 / BBS8 وBBS9) تشكل المعقدة (ويشار إلى أن BBSome)، والمشاركة في نقل حويصلي الخلايا في تركيبة مع Rab8a، وهي مطلوب مباشرة لتكون الأهداب (8). هناك وظائف الجزيئية الأخرى المقترحة للبروتينات BBS، مثل دور البروتينات BBS في كل من غير المقبول والمتعارف عليها إشارات Wnt (9، 10). ومؤخرا، على ضرورة DISC1 الفسفرة محددة لتجنيد البروتينات BBS إلى الجسيم المركزي وفقدان BBS1 يؤدي إلى عيوب في هجرة الخلايا العصبية، وإن كان بعض الآليات الجزيئية وغير معروف (11).
نحن ذكرت مؤخرا ان morphants الزرد bbs8 زيارتها المعيبة العصبية الهجرة الخلية قمة كما تفعل BBS8 خلايا -depleted، مشيرا إلى أن هناك حاجة أيضا البروتينات BBS لحركية الخلية (12). للحصول على فهم أفضل للآليات الأساسية المسؤولة لهذه العيوب الخلوية على ما يبدو أهداب المستقلة، درسنا آثار BBS استنزاف البروتين على الهيكل الخلوي الخلوي.
يبدو تنظيم الهيكل الخلوي أكتين أن يكون لها دور رئيسي في اثنين على الأقل من السمات الأساسية للBBS. لعسر تصنع الكلى، فقد أفيد لتنظيم الكلوي تكون الكيسة وخلية رجلاء ديناميات (+13 - 15). وعلاوة على ذلك، هناك أدلة قوية على الجينات المسؤولة عن تنكس الشبكية، مثل RPGR، التي تنظم تشكيل أهداب والاستقرار الأكتين (16).
هنا، ونحن التقرير أن Bbs4- وBbs6 الخلايا النخاعية الكلى -deficient تهاجر نحو رديء، تحمل أهداب أقل وأقصر ولها الهيكل الخلوي الأكتين التي تأثرت بشدة. وعلاوة على ذلك، لاحظنا على مدى وفرة الالتصاقات البؤرية (FAS) في Bbs4-، Bbs6- وBbs8 خلايا -deficient مرتبطة بزيادة مستويات مستويات RhoA-GTP. على علاج Bbs4 خلايا -deficient مع مثبطات ممر RhoA، كنا قادرين على استعادة طول الأهداب وعدد وكذلك سلامة الهيكل الخلوي الأكتين. نقترح دورا جديدا للبروتينات BBS في تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين التي بدورها تنظم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية لشرح النمط الظاهري واسعة الطيف المرتبطة مع العديد من ciliopathies.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

عرض BBS التي تعاني من نقص خلايا الكلى الحركة والانقسام السيتوبلازمي العيوب

في ضوء الملاحظات السابقة لدينا حيث يطلب من البروتينات BBS لحركية خلية في الزرد، ونحن التحقيق في سلوك الخلوي للخلايا النخاع الكلى المأخوذة من Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (17، 18). في حالة غير متموجة، Bbs4 - / - وBbs6 - / - أظهرت الخلايا الأولية تأخر الحركة والانقسام والانقسام السيتوبلازمي وكانت بطيئة لأعد إلى الركيزة بعد الانقسام، ونحن سبق وصفه في خلايا BBS8 متحولة الإنسان (12) (الشكل . 1 A). على توثيق التفتيش، كان واضحا أن الخلايا الطافرة شكلت اعتقلت مجموعات مع ندرة أقدام صفاحية أو أرجل كاذبة خيطية، من المرجح أن تؤثر على قدرتها على الهجرة (الشكل 1 A، التكميلية المادة، أفلام 1-3). اختبرنا المقبل سلوك خلايا متكدسة في الصفر ('التئام الجروح') المقايسات. كما كانت الهجرة المتوقع المعيبة في Bbs4 - / - وBbs6 - / - ثقافات مقارنة مع فحوصات السيطرة (الشكل 1 B و C). هذه البيانات متفقة مع الملاحظات السابقة للخلايا -depleted Bbs8 (12).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الشكل 1.

خلايا متحولة BBS تفتقر التنقل. (A) الأطر الزمنية الفاصل بين من خلايا الكلى غير متموجة. Bbs4 خلايا الكلى -deficient (رأس السهم الأبيض) لديها ندرة lamellopodia وأرجل كاذبة خيطية والهجرة بطيئة (انظر المواد التكميلية، فيلم 1). شريط نطاق 50 ميكرون. (B) Phalloidin (أحمر) ودابي (الأزرق) تلطيخ يظهر فحص التئام الجروح. مقارنة مع خلايا WT، تظهر Bbs4 وBbs6 خلايا فارغة الهجرة قصور وتأخر إغلاق الجرح. شريط على نطاق واسع 200 ميكرون. شريط صغيرة الحجم 50 ميكرون. (C). منطقة الانتعاش بعد فحص التئام الجروح. خلايا WT عرض مبلغا أكبر من سطح تعافى (286400 ميكرون 2) أو 86٪ من إغلاق الفجوة، بينما Bbs4 وBbs6 خلايا فارغة التعافي فقط 253500 ميكرون 2 و 255700 ميكرون 2 أي ما نسبته 74٪ و 75٪ من الإغلاق التام. WT مقابل خلايا متحولة Bbs4 P <0.001، WT مقابل Bbs6 خلايا متحولة P <0.001.

مطلوبة البروتينات BBS لتنظيم هيكل الخلية أكتين

لتحديد أساس عدم وجود تمديد lamellopodial والهجرة الخلية، ونحن التحقيق بجانب الهيكل الخلوي في الخلايا الليفية متحولة. ومن المثير للاهتمام، ونحن لم يكشف عن أي خلل في الهياكل microtubular على المناعية من tubulins (لا تظهر البيانات). نحن الملون بجانب هذه الخلايا مع phalloidin. في حين البرية من نوع (WT) خلايا عرضت ألياف الأكتين الإجهاد موازية تعقد بانتظام، لم تراع هذه في Bbs4 - / - وBbs6 - / - الخلايا. وعلاوة على ذلك، ونحن أيضا لاحظ الفوضى الإجمالي من الهيكل الخلوي الأكتين، وخاصة في المنطقة القمية من Bbs4 - / - وBbs6 - / - خلايا متكدسة (الشكل 2 A). ولوحظ وجود النمط الظاهري مشابهة جدا عندما يتم استنفاد Bbs8 بواسطة shRNAs في الخلايا NIH3T3 (الشكل 2 B)، كما هو موضح سابقا في (12). هناك يبدو أن الإفراط في وفرة من ألياف الإجهاد المحلية، حيث يبدو حزم من خيوط الأكتين أن ترتكز على الغشاء. خيوط الأكتين شكلت خطي مميزة مثل محور ميزة (19) مع الألياف الصغيرة المنبثقة عمودي على حزمة الألياف الرئيسية، تختلف تماما لترتيب نموذجي في خلايا WT، كما هو موضح في الشكل 2 C.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 2.

BBS الخلايا المنضب لديها الهيكل الخلوي أكتين معيب. (A و B) Phalloidin (أبيض) ودابي (الأزرق) تلطيخ (A) Bbs4- وBbs6 خلايا الكلى الأولية -deficient تنتج المجاميع أكتين في المنطقة القمية للخلية، مقارنة مع الخلايا WT. تظهر رؤوس سهام المجاميع أكتين على apically في الخلية (الأسهم الخضراء). (B) وبالمثل، خلايا NIH3T3 المنضب لBbs8 تظهر تعطل الأكتين مماثل بالمقارنة مع خطوط خلايا غير transfected. شريط النطاق الأبيض 20 ميكرون. أسود شريط نطاق 50 ميكرون (السهم الأخضر). (C) Phalloidin (الخضراء) ودابي (الأزرق) تظهر تلطيخ أن خيوط الأكتين الشاذة تنشأ من غشاء الخلية. التمثيل التصويري تبين درجات مختلفة من بلمرة خيوط الأكتين متفرعة حديثا ينتهي، وتشكيل هيكل يشبه مركزا على قمة الخلية. شريط نطاق 20 ميكرون. (D) لقطات من أكتين-GFP transfected WT وBbs4 خلايا -deficient (انظر المواد التكميلية والأفلام 3 و 4 و 5)، والتي تبين تجميع الأكتين على قمة خلايا فارغة Bbs4. صور إعادة الإعمار متحد البؤر (E) 3D تظهر المنظمة الأكتين في WT وBbs4 خلايا فارغة في التعليق التالي تلطيخ مع رودامين-phalloidin. لم تكن هناك اختلافات واضحة في تنظيم الأكتين القشرية بين Bbs4 - الخلايا وWT - /.

من أجل التحقيق في كيفية هذه الباقات شكلت في الجسم الحي، WT وBbs4 - / - و transfected الخلايا للتعبير عن الأكتين-GFP. اتخذت متحد البؤر الأفلام الوقت الفاصل بين ووحظت التراكمات الأكتين تشكيل في القرب من غشاء الخلية في الجانب قمي للخلية. وبالتالي قد تكون هذه المجاميع بمثابة المراسي، وتعطيل وظيفة طبيعية من الهيكل الخلوي كله (الشكل 2 C والمواد التكميلية، أفلام 4-6).
لاختبار ما إذا كان هذا النمط الظاهري الأكتين مستقلة من التفاعل خارج الخلية، قمنا بتحليل الأكتين في الخلايا في التعليق. وعلى النقيض من الخلايا الملتصقة، لم يكن هناك اختلاف في تنظيم الأكتين بين WT وBbs4 - / - الخلايا، وكلا عرضت توزيع القشرية منقط مماثل (الشكل 2 D). من أجل مزيد من الدراسة سلامة الأكتين القشرية في الخلايا BBS-ناقص، استخدمنا تقنية تطلع micropipette على الخلايا مع وقف التنفيذ. طموح Micropipette هو الاسلوب الذي يقيس الميكانيكا الحيوية من الغشاء الخلوي. تطبيق التحميل الميكانيكية يؤثر على تنظيم الأكتين من الغشاء، مما يسمح لنا لدراسة معدل الاسترداد والتي تعتمد على ديناميات البلمرة أكتين. يوفر هذا الأسلوب راسخة تقديرا لمعامل الخلايا الإجمالي الذي يعتمد على سلامة وديناميات الهيكل الخلوي الأكتين (20). في هذا الإعداد، تعطلت الأكتين القشرية بعد العلاج مع نتائج مثبط حركة الخلايا D في تشويه للخلية في micropipette، وتتميز انخفاض في معامل التوازن الخلية (21). WT وBbs4 - / - الخلايا، مع أو بدون ترنسفكأيشن مع أكتين-GFP (لاستبعاد أي تأثير الأكتين على التعبير)، تم تحليلها في نظام الطموح pipetting لالجزئي (. المواد التكميلية، الشكل S1 والتكميلية المادة، أفلام 7 -10). لم نعثر على أي اختلاف في معامل التوازن بين WT وBbs4 - / - الخلايا، أو بين الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل أو untransfected (الشكل 3 B). وتشير هذه البيانات إلى أن النمط الظاهري يتعلق فقط إلى تكوين ألياف التوتر بدلا من تنظيم الأكتين القشرية. لاختبار هذا، ونحن المصنف الخلايا وثابتة لهم، بعد تمسكهم الركيزة، تلطيخ لهم phalloidin-رودامين. أولا، لاحظنا تشكيلات الأكتين الشاذة في Bbs4 - / - الخلايا في بداية ألياف الإجهاد البلمرة (الشكل 3 A). ثم، حسبنا النسبة المئوية للخلايا في كل مجال تقديم ملحقات lamellopodia التي تعتمد على الأكتين في 3 و 4 و 5 ساعة بعد البذر الخلايا. يتم زيادة النسبة المئوية للخلايا تقديم lamellopodia في كل نقطة زمنية، كما هو متوقع. ومع ذلك، لاحظنا أقل ملحقات في خلايا فارغة Bbs4، مقارنة مع الخلايا WT (الشكل 3 C).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 3.

النمط الظاهري الأكتين هيكل الخلية يعطل البلمرة أكتين حشوية ولكن ليس الأكتين القشرية. (A) خلايا تمتد lamellopodia 5 ساعات بعد البذر. كانت ملطخة F-الأكتين مع phalloidin لإظهار ألياف الإجهاد تشكيل. بعد 5 ساعات، Bbs4 - / - خلايا كانت قد بدأت تتشكل خيوط الأكتين بلمرة خطأ (رأس السهم). (B) Micropipetting الخلايا مع وقف التنفيذ لم تظهر أي فروق ذات دلالة إحصائية في معامل التوازن بين الخلايا -deficient WT وBbs4 أو بين Bbs4 خلايا -deficient والخلايا -deficient Bbs4 تعامل مع مثبط Y27632 RhoA (مان-ويتني اثنين من الذيل، P> 0.05). (C) النسبة المئوية للخلايا في كل مجال الرؤية التي تحتوي على مجموعات الخلايا خلية / تطوير ملحقات lamellopodia. علقت WT وBbs4 - / - تم المصنف coverslips على وتم إصلاحها 3 و 4 و 5 ساعات بعد ذلك. وBbs4 - / - الخلايا لديها نسبة إحصائية بدرجة كبيرة من الخلايا مع lamellopodia في كل نقطة زمنية [-values ​​P لمدة 3 ساعات (P <0.027)، 4 ح (P <0.0185) و 5 ح (P <0.0277)] postseeding .

راقبنا بجانب انتعاش الأكتين التالية التحلل باستخدام مثبط حركة الخلايا دقائق D. عشرون بعد العلاج، لاحظنا تأخر والانتعاش الشاذة من الهيكل الخلوي الأكتين في Bbs4 - / - خلايا الفئران الطافرة مقارنة مع الضوابط (المواد التكميلية، الشكل S2.). على ترنسفكأيشن من خلايا mIMCD3 مع Bbs4 وBbs6 كامل طول بنيات التعبير (pCMV-Bbs4-HA وpCMV-Bbs6-cmyc)، اكتشفنا فشل خيوط الأكتين البلمرة بالمقارنة مع خلايا untransfected (الشكل 4)، لافتا نحو دور كابح خلال البلمرة أكتين. وتشير هذه النتائج إلى أن مستويات البروتين BBS ومتوازنة بدقة لتنظيم تشكيل ألياف الأكتين.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 4.

أدى overexpression من Bbs4 -HA وBbs6 -cmyc يبني تلطيخ Phalloidin-رودامين (الصفراء) وoverexpression من Bbs4 -HA وBbs6 -myc الموسومة (أبيض) (A) overexpression من Bbs4-HA أو Bbs6-MYC في البلمرة ناقصة من cytoplasmatic F -actin (arrohead أبيض)، مما يعوق بلمرة خيوط الأكتين، مقارنة مع الخلايا untransfected المجاورة (السهام البيضاء). تلك mIMCD3 خلايا متكدسة untransfected (السهام البيضاء) تظهر النمط العادي للألياف الإجهاد. (B) ترنسفكأيشن مع فارغة البلازميدات السيطرة هكتار أو ج myc لا يعطل البلمرة، ويتم بلمرة خيوط الأكتين بشكل صحيح. شريط نطاق 20 ميكرون.

يتم التعبير عن Bbs8 وBbs9 في الالتصاقات البؤرية ويترافق مع زيادة بلمرة الأكتين

وقد وصفت BBSome ومجمع من سبعة جينات BBS المطلوبة لتكون الأهداب التي BBS4 هي مجرد واحدة من المكونات (8، +22 - +24). وبالتالي فإننا التحقيق شركاء BBSome الآخرين، Bbs8 وBbs9، للقيام بأدوار المفترضة في تنظيم الأكتين. نحن مصممون التوزيع غير متوقع من Bbs8 وBbs9 في محيط الخلية، واصفة خيوط الخطية تشبه الأكتين (الشكل 5 A). لم هذه البروتينات لا التسمية بالاشتراك مع F-الأكتين ولكن بدلا من ذلك تم المرتبطة بشكل وثيق مع Vinculin التي بقع على وجه التحديد اتفاقات الصيد (الشكل 5 B و D). نحن أيضا لاحظ الجسيم المركزي / القاعدية توطين جثة Bbs8 وBbs9 في متموجة خلايا mIMCD3، بالإضافة إلى التعبير FA.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 5.

يتم التعبير عن Bbs8 وBbs9 في اتفاقات الصيد. يتم التعبير (A) Bbs8 وBbs9 في السيتوبلازم بطريقة شعاعي (السهام البيضاء) في الخلايا mIMCD3 الهجرة غير متموجة. شريط نطاق 20 ميكرون. وcoexpressed (B و C) كل من Bbs8 وBbs9 مع vinculin في اتفاقات الصيد. شريط نطاق 20 ميكرون. (D) Bbs8 وBbs9 توطين في بداية خيوط F-أكتين (رأس السهم). شريط نطاق 20 ميكرون. (E) لاحظ أن اتفاقات الصيد تتمركز في Bbs4- والخلايا ناقصة Bbs8- (السهام) مقارنة مع الخلايا WT حيث اتفاقات الصيد وغلبة في محيط الخلية (السهام). شريط نطاق 20 ميكرون. Vinculin تلطيخ للاتفاقات الصيد. النشاط (F) RhoA في خطوط BBS التي تعاني من نقص. ارتفاع كبير في مستويات المنشط RhoA في خلايا متحولة، على سبيل المثال هناك زيادة بنسبة 2 أضعاف للخلايا فارغة Bbs6 (SEM ± 0.07)؛ 2.5 أضعاف لخلايا فارغة Bbs4 (SEM ± 0.12) و 2.6 أضعاف لBbs8 -shRNA استنزاف الخلايا (SEM ± 0.09). بيانات تطبيع للنشاط WT RhoA. (G-J) الكمي لنسبة الأكتين F / G في Bbs8 -shRNA المنضب خلايا NIH3T3 وBbs4 خلايا الكلى لاغية الأساسي. استخدمت Phalloidin-رودامين والدناز I-اليكسا 488 لقياس مضان المنبعثة وحساب النسبة. وهذه النسبة أعلى في خطوط الخلايا الطافرة (WT 1.54 ± 0.28 مقابل Bbs4 باطل 1.96 ± 0.24؛ P <0.001 shRNA السيطرة 0.65 ± 0.17 مقابل Bbs8 -shRNA 1.12 ± 0.21؛ P <0.001). *** P <0.001. شريط نطاق 20 ميكرون.

اتفاقات الصيد هي مجمع محددة جيدا من البروتينات التي تصل المصفوفة خارج الخلية مع الهيكل الخلوي الأكتين ولعب دورا نشطا في الحركة الخلوية والأكتين البلمرة (إعادة النظر في (25)). وينظم شبكة الأكتين في أقدام صفاحية، أرجل كاذبة خيطية والإجهاد الألياف كبير من قبل اتحاد كرة القدم، وترتكز ألياف الأكتين الإجهاد في كرة القدم (25). يتم التعبير عن Bbs8 وBbs9 يبدو أن تلك النقطة التي يتم فيها بلمرة خيوط الأكتين (الشكل 5 D والتكميلية المواد، الشكل S3)، مما يدعم الافتراض المسبق لدينا التي تشارك البروتينات BBS في تنظيم الأكتين. لم يوجد فرق في توطين Bbs8 وBbs9 في Bbs4 - / - أو Bbs6 - / - الخلايا (. المواد التكميلية، الشكل S4 و S5)، ودعم فكرة أن Bbs4 هي المكون الأخير تجميعها في BBSome (26) وهذا النمط الظاهري وجدت في Bbs4 - / - وBbs6 - / - الخلايا لا يرجع إلى BBSome mislocalization كله.
هذه الملاحظات مع العيوب الهجرة في خلايا متحولة BBS تشير وجود صلة بين BBS، البلمرة أكتين وFA. لذا قمنا بحساب عدد فاس لكل خلية موجودة في غير متموجة-Bbs4 - / - خلايا الكلى الأولية والخلايا NIH3T3 ناقصة لBbs8 (shRNA) (12). في المتوسط، لاحظنا أن عدد فاس كان أعلى في الخلايا -deficient BBS مقارنة مع الضوابط (126 ± 8.725 N = 15 لBbs4 - / - خلايا مقابل 104.9 ± 3.867 N = 15 لخلايا WT: P <0.05) و (106 ± 4.057 N = 15 لخلايا Bbs8 shRNA مقابل 85.79 ± 2.158 N = 15 لخلايا تحكم؛ P <0.001)، من المحتمل تؤثر والتداخل مع الحركة الطبيعية للخلايا. وعلاوة على ذلك، قمنا بتحليل مسافة كل اتفاقات الصيد إلى غشاء في كل نوع من الخلايا الاكتشاف الذي Bbs4 - / - الخلايا والخلايا Bbs8 shRNA لديها اتفاقات الصيد توزيع أكثر مركزيا (6.594 ميكرون ± 0.1011 N = 123 لBbs4 - / - خلايا مقابل 5.406 ميكرون ± 0.2358 N = 107 للخلايا WT؛ P <0.001، وميكرون 13.02 ± 0.3518 N = 101 للخلايا Bbs8- shRNA مقابل 10.49 ميكرومتر ± 0.3521 N = 92 لخلايا تحكم؛ P <0.001). (الشكل 5 E والتكميلية المواد، الشكل. S6).
لاختبار هذه الفرضية أيضا، تم احتساب النسبة بين G-الأكتين وF-الأكتين في الخلايا متحولة مقارنة مع الضوابط. عن طريق قياس كثافة مضان النسبية phalloidin-رودامين (F-الأكتين) وDnaseI-488 (G-الأكتين) (الشكل 5 G-J)، وجدنا زيادة كبيرة في مستويات F-أكتين في Bbs4 - / - وBbs8 -shRNA خلايا تدل على زيادة في بلمرة الأكتين في الخلايا متحولة.

وبوساطة العيوب التحلل الأكتين وتكون الأهداب عن طريق زيادة النشاط RhoA الخلوي في خلايا متحولة BBS

وتشارك RhoGTPases في تنظيم ديناميات الأكتين وتشكيل فاس (19، 27، 28)؛ ولا سيما زيادة في النشاط النتائج RhoA في زيادة التجمع FA والبلمرة F-أكتين. للتحقيق في سبب زيادة مستويات FA، قمنا بقياس مستويات نشط RhoA-GTP باستخدام الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم في Bbs4 - / - وBbs6 - / - خلايا الكلى والخلايا Bbs8 -shRNA NIH3T3. ولوحظ وجود زيادة كبيرة في نشاط RhoA في الخلايا BBS المنضب بالمقارنة مع WT، وبالتالي يحتمل شرح الزيادة في تشكيل الاتحاد الانجليزي والبلمرة F-أكتين (الشكل 5 F).
بشكل جماعي، وتشير كل هذه المعطيات وجود صلة قوية بين الجينات BBS وتنظيم الأكتين هيكل الخلية البلمرة، التي ارتبطت في السابق مع تكون الأهداب (29). بعد تحديد سبب من الهيكل الخلوي الأكتين تعطلت، نحن شكك بجوار طبيعة العلاقة مع هدب الابتدائي وظيفة الهدبية. نحن التحقيق أهداب الابتدائي في Bbs4 - / - خلايا الكلى مشيرا الى انخفاض عدد كبير من الخلايا المهدبة (23٪ Bbs4 - / - مقابل 48٪ WT؛ P <0.001) بعد المجاعة في الدم وانخفاض في متوسط ​​طول أهداب مقارنة مع الشاهد الخلايا (الشكل 6 A-C). على علاج Bbs4 - / - الخلايا مع مثبط حركة الخلايا D، ونحن أيضا لوحظ استعادة كبيرا في أعداد طبيعية من الخلايا المهدبة ويصاحب ذلك زيادة في متوسط ​​طول الأهداب (الشكل 6 A-C). وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن الجينات BBS تنظم تكون الأهداب من خلال تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين، وهذه النتائج متسقة مع دراسة حديثة تربط جهري تكون الأهداب مع ديناميات الأكتين، حيث تعطل الهيكل الخلوي الأكتين الترويج تكون الأهداب (29).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 6.

استرداد عدد أهداب التالية التحلل (A). السيطرة ومثبط حركة الخلايا D تعامل WT وBbs4 الخلايا الأولية الكلى فارغة. منظر عام لميدان متكدسة وأهداب ممثل (الشكل). المعاملة مع مثبط حركة الخلايا D يسترد أرقام أهداب وطول في خلايا فارغة Bbs4 (رأس السهم الأبيض) مقارنة مع الخلايا WT (السهام البيضاء). شريط نطاق 20 ميكرون. أقحم مقياس شريط 10 ميكرون. (B) التمثيل البياني للطول أهداب الخلايا فارغة WT وBbs4 المعالجة وغير المعالجة. الخلايا غير المعالجة WT (2.55 ميكرون ± 0.41)، وخلايا WT المعالجة (4.67 ميكرون ± 0.53)، وخلايا فارغة Bbs4 غير المعالجة (2.16 ميكرون ± 0.23)، وتعامل خلايا فارغة Bbs4 (7.58 ميكرون ± 0.62). (C) النسبة المئوية للخلايا مهدبة فيما يتعلق العدد الكلي للخلايا. الخلايا غير المعالجة WT (48٪ ± 6.1)، وخلايا WT المعالجة (51٪ ± 3.2)، الخلايا غير المعالجة Bbs4 فارغة (23.01٪ ± 7.02)، وتعامل خلايا فارغة Bbs4 (49.29٪ ± 3.9). لاحظ أنه لا توجد زيادة في نسبة الخلايا المهدبة WT بعد العلاج مع مثبط حركة الخلايا (D)؛ ومع ذلك تعامل خلايا فارغة Bbs4 التعافي إلى مستويات WT. *** P <0.001، * P <0.05، نانوثانية. أهمية not-.

للتحقيق في ما إذا كانت زيادة النشاط RhoA قد توسط هذه العيوب التي تعتمد على الأكتين في تكون الأهداب، عرضنا Bbs4 - / - الخلايا الظهارية الكلوية لاثنين RhoA مثبطات ممر، Y27632 (مثبط محدد من رو المصاحب ملفوف لفائف تشكيل البروتين سيرين / ثريونين كيناز (ROCK) أسرة من تحركات البروتينات) وC3 ترانسفيراز (وهو إنزيم براني الذي يمنع المجال RhoA المستجيب ملزم للGTPase على وجه التحديد). ونتيجة لذلك وبما يتفق مع النتائج التي توصلنا إليها، أهداب تطول وزيادة عدد الخلايا المهدبة بشكل ملحوظ (الشكل 7 A-C والتكميلية المواد، الشكل. S7A وB). تم العثور على إنقاذ مماثل للطول الأهداب وأهداب عدد عندما Bbs6 - تعرضت الخلايا لY27632 - / (الشكل 7 D و E). ومن المثير للاهتمام، ونحن أيضا لوحظ إطالة أهداب الخلايا السيطرة. وعلاوة على ذلك، وعلاج Bbs4 - / - الخلايا مع Y27632 وC3 ترانسفيراز تشكيل تحول دون ألياف الإجهاد قمي (30) (الشكل 7 F والمواد التكميلية، الشكل 7C.). ولوحظ وجود ما يصاحب ذلك انخفاض 2 أضعاف في مستويات RhoA تنشيط (الشكل 7 G والمواد التكميلية، الشكل 7D).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 7.

تثبيط مسار RhoA مع Y27632 ينقذ الهيكل الخلوي الأكتين وطول الأهداب في الخلايا فارغة Bbs4. كانت (A و B) سيليا من WT المصل تجويع الخلايا المعالجة مع Y27632 أطول (4.256 ميكرون ± 0.2367) من الخلايا غير المعالجة (2.746 ميكرون ± 0.1527). وبالمثل في Y27632 تعامل خلايا فارغة Bbs4، كانت أهداب الخلايا تقريبا ضعف المدة غير المعالجة كما (3.429 ميكرون ± 0.2355 مقابل 1.923 ميكرون ± 0.1321؛ P <0.001). شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (C) عدد مهدبة خلايا فارغة Bbs4 (43٪ ± 1.95) يتعافى إلى مستويات WT (54٪ ± 0.99) عندما تعامل مع Y27632، P <0.0001. (D) نتيجة مماثلة تم الحصول عليها عندما تم علاج خلايا فارغة Bbs6 مع Y27632. كانت أهداب مرة أخرى لفترة أطول WT المعاملة (4.276 ميكرون ± 0.04531 N = 29) من الخلايا غير المعالجة (2.883 ميكرون ± 0.04899 N = 32). وبالمثل في Y27632 تعامل خلايا فارغة Bbs6، أهداب يتضاعف طول مقارنة مع الخلايا غير المعالجة (3.445 ميكرون ± 0.1529 N = 31 مقابل 1.224 ميكرون ± 0.08055 N = 24؛ P <0.001). (E) عدد مهدبة خلايا فارغة Bbs6 (16٪ ± 1.38) يتعافى إلى مستويات WT (44٪ ± 0.99) عندما تعامل مع Y27632، P <0.0001. (F) هناك انخفاض في تشكيل مجموع الألياف الإجهاد في خلايا فارغة Bbs4 بعد التعرض لY27632. مقياس شريط 30 ميكرون. النشاط (G) RhoA من الخلايا المعالجة مع 10 م م Y27632 لمدة 30 دقيقة. تم تطبيع كافة البيانات عن النشاط WT RhoA. بعد العلاج، تم تخفيض مستويات تنشيط RhoA إلى النصف في الخلايا WT المعاملة (0.4614 ± 0.05629). وجدنا نفس الحد من النشاط RhoA في خلايا فارغة Bbs4، من 1.788 ± 0،095-،7475 ± 0.0053. *** P <0.001.

عندما Bbs4 - / - تم علاج الخلايا في تعليق مع Y27632، تم حساب معامل التوازن التالية تقنية تطلع micropipette. لم يتم العثور على الفرق بين المعالجة وغير المعالجة في Bbs4 - / - الخلايا (الشكل 3 A). وهذا يشير إلى أن الإنقاذ لوحظ في الخلايا الملتصقة غير محددة لدور Bbs4 في ألياف الإجهاد وليس هو المسؤول عن اضطراب طبيعة الأكتين القشرية.
من أجل التحقيق في ما إذا كان تفعيل RhoA قد تكون ذات صلة الظواهر الموجودة في BBS، نحن اختبار ما إذا كان تثبيط RhoA بعد العلاج مع Y27632 يمكن إنقاذ الأجنة الزرد التي BBS الجينات كانت طرقت إلى أسفل. وقد استخدمت الزرد نطاق واسع لنموذج ciliopathies، وكما نحن وغيرنا قد ذكرت سابقا (17، 31، 32)، وجدنا أن ضربة قاضية من bbs6 أو bbs9 باستخدام أسفرت morpholinos التحقق من صحتها من قبل في الظواهر الهدبية نموذجية، بما في ذلك انحناء الجسم غير طبيعي، وعيون صغيرة والكلوية (سليفة الكلوة) الخراجات. نحن أيضا اختبار bbs4 وbbs8 morpholinos، ولكن وجدت أن الظواهر الناتجة كانت أقل اتساقا، وذلك ركزنا جهودنا لاحقة على bbs6 وbbs9. لأن علاج الأجنة الزرد مع Y27632 من المراحل الأولى للتنمية قاتلة (33)، اخترنا لعلاج الأجنة 24-48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) باستخدام محلول مخفف من 100 ن م، وبعد ذلك كانت المخدرات washed- من والأجنة سمحت لتطوير حتى 4 أيام بعد الإخصاب.
استخدمنا العديد من المعلمات لقياس تأثير RhoA تثبيط على BBS morphants، بما في ذلك القطر من العين، وزاوية انحناء الجسم ومجال الخراجات سليفة الكلوة. وجدنا أن العلاج مع Y27632 أسفرت عن استرداد جميع الجوانب الثلاثة من النمط الظاهري. لmorphants bbs6 تعامل مع Y27632، لاحظنا انتعاشا 43٪ من القطر العين (39.66 ميكرون مقابل 56.74 ميكرون؛ P <0.0001) مقارنة مع morphants المعالجة السيارة، انحناء خفض الجسم (11.52 ° مقابل 4.072 °؛ P = 0.0176) و انخفاض معتدل في مجال الخراجات سليفة الكلوة (21.54 ميكرون 2 مقابل 14.30 ميكرون 2؛ P = 0.0407). تم العثور على نتائج مماثلة لmorphants bbs9 قطر العين (44.07 ميكرون الإقليم الشمالي مقابل 79.18 ميكرون؛ P <0.0001)، انحناء الجسم (9،682 ° الإقليم الشمالي مقابل 3.993 °؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر P = 0.038) ومنطقة الكيسي (17.89 ميكرون 2 الإقليم الشمالي مقابل 9.131 ميكرون 2؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر؛ P = 0.0038 -value) (الشكل 8 والتكميلية المواد، الشكل 9.). كما وجدنا أن هناك انتعاشا في عرض القطع البدنية النمطية (bbs6 مو 30.0 ميكرون ± 1.19 مقابل مو bbs6 تعامل 43.0 ميكرون ± 0.668 وbbs9 مو 43.9 ميكرون ± 0.914 مقابل bbs9 مو تعامل 49.6 ميكرون ± 0.849)، والتي تتطلب بشكل خاص على درجة عالية نظمت الأكتين الهيكل الخلوي، رغم عدم وجود تغيير كبير في الزاوية التي شكلتها و somites (المواد التكميلية، الشكل 10).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 8.

الكمي من القطر العين، وزاوية الجسم ومنطقة الكيس سليفة الكلوة في تعامل bbs6 وbbs9 morphants. (A) تمثيل المقاييس المستخدمة لتحديد النمط الظاهري الزرد. اتخذت: ثلاثة قياسات مختلفة في 4 DPF الأجنة قطر العين من بطني لالظهرية، مجال الخراجات سليفة الكلوة إذا كان موجودا وزاوية من أعلى نقطة في جنين والجسم يعود إلى تمثيل للانحناء الجسم. ثم قارنا Y27632 morphants المعالجة وغير المعالجة مع اختبار ر -student. (B - D) الرسوم البيانية شريط تمثل آثار التعرض Y27632. (B) العلاج لا يؤثر على انحناء الأجنة WT (4،355 ° الإقليم الشمالي مقابل 5.198 ° ر)، وفي الوقت نفسه زاوية الجسم من bbs6 (11.52 ° الإقليم الشمالي مقابل 4.072 ° ر) وbbs9 (9،682 ° الإقليم الشمالي مقابل 3.993 ° ر) في المعالجة يتم استرداد الأجنة إلى المستويات العادية. (C) هناك انخفاض معتدل ولكن كبير في المنطقة التي الخراجات غطت في bbs6 المعالجة (21.54 ميكرون 2 الإقليم الشمالي مقابل 14.30 ميكرون 2 ر) وbbs9 (17.89 ميكرون 2 الإقليم الشمالي مقابل 9.131 ميكرون 2 ر) morphants. (D) وقطره العين لا يتأثر في الأجنة WT المعالجة (91.10 ميكرون الإقليم الشمالي مقابل 89.41 ميكرون ر)، ولكن يتم استرداد في bbs6 المعالجة (39.66 ميكرون الإقليم الشمالي مقابل 56.74 ميكرون ر) وbbs9 morphants (44.07 ميكرون الإقليم الشمالي مقابل 79.18 ميكرون ر). أرقام الأجنة WT لا تعامل ن = 52، morphants bbs6 الأجنة لا تعامل ن = 59، morphants bbs9 الأجنة لا تعامل ن = 51، وتعامل WT الأجنة ن = 43، bbs6 morphants الأجنة تعامل ن = 48، bbs9 morphants الأجنة تعامل ن = 43. P -values ​​موجز. قطر العين: WT الإقليم الشمالي مقابل WT ر P = 0.7219؛ bbs6 الإقليم الشمالي مقابل bbs6 ر P <0.0001؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر P <0.0001. منطقة كيس؛ bbs6 الإقليم الشمالي مقابل bbs6 ر P = 0.0407؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر؛ P = 0.0038. زاوية الجسم: WT الإقليم الشمالي مقابل WT ر P = 0.093؛ bbs6 الإقليم الشمالي مقابل bbs6 ر P = 0.0176؛ bbs9 الإقليم الشمالي مقابل bbs9 ر P = 0.038. ر، وتعامل. الإقليم الشمالي، لم يتم علاجها.

وقد تبين رودوبسين النبات إلى هدب لينظم إلى حد كبير من البروتينات استنادا Arf4، مثل ASAP1. استنزاف هذه البروتينات يقود الفشل إلى رودوبسين للوصول إلى هدب، الذي يرتبط الأكتين تراكم غنية في جميع أنحاء هدب المقبل لرودوبسين التعبير misslocalised (34). لذا رصدنا rho2 :: GFP الإيجابية في BBS morphants التالية Y27632 العلاج (35).فضلا عن الانتعاش من قطر العين، bbs6 أظهر morphants تعامل مع Y27632 الأرقام لم يزد من المستقبلات الضوئية، وفقا لتقييم رودوبسين التعبير، ولا سيما في الجزء البطني من شبكية العين (المواد التكميلية، الشكل S11).

القسم السابق القسم التالي

نقاش

وpathomechanisms دقيقة الكامنة ciliopathies تتطلب مزيدا من الوضوح. ومع ذلك، فإننا نعرف أن إشراك مسارات الإشارات الرئيسية المرتبطة هدب الأساسي، وتشمل القنفذ الإشارات (36، 37)، وغير متعارف عليه الخلية القطبية WNT / مستو (PCP) الطريق (9) وmechanotransduction من خلال إشارات الكالسيوم (38) بين الآخرين. ولذلك فإنه ليس من المستغرب تماما أن البروتينات هامة لتكون الأهداب قد يكون لها أيضا أدوار إضافية رئيسية في العمليات الخلوية مثل الانقسام السيتوبلازمي، الهجرة و / أو تنظيم الأكتين هيكل الخلية.
البيانات المقدمة هنا هي متسقة مع فرضيتنا السابقة التي زادت البلمرة أكتين، من خلال RhoA التقلبات، يعطل وظيفة طبيعية من أهداب الابتدائي ويكمن وراء التسبب في BBS وciliopathies ربما آخرين. ويدعم هذه الملاحظات مزيد من الدراسات الأخرى حيث meckelin (MKS3)، من خلال التفاعل مع Nesprin-2، وينظم أيضا الهيكل الخلوي الأكتين (39، 40)؛ فقدان وظيفة البروتين ciliopathy، TMEM216 يؤدي إلى معيبة تكون الأهداب والالتحام centrosomal، مع ما يصاحب ذلك من hyperactivation RhoA وDishevelled (41)؛ والخلايا RPGR ناقصة خفضت أعداد أهداب، أبطأ تقدم دورة الخلية، وضعف التعلق الركيزة وزيادة الاستقرار FA (16). وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن شكل الخلايا وانقباض تنظم تكون الأهداب (42).
يتم التعبير عن البروتينات BBS في القاعدية الهيئات، centrosomes وaxonemes أهداب ومجموعة فرعية تشكيل مجمع ظيفية البروتين (BBSome) المطلوبة لتكون الأهداب (7، 43، 44). والمثير للدهشة، لاحظنا في هذه الدراسة أن Bbs8 وBbs9، سواء مكونات BBSome يتم التعبير، على مقربة من اتفاقات الصيد، مما يشير إلى وظيفة جديدة لهذه البروتينات في هذا الموقع. وصلة وظيفية بين اتفاقات الصيد والتجمع الأكتين هو راسخة (إعادة النظر في (45))؛ ومع ذلك، فإن إعادة توزيع الملاحظة (مركزيا) فاس في BBS-نقص الخلايا المهاجرة يشير إلى دور أكثر المحلي للبروتينات BBS في اتفاقات الصيد ربما الاستقرار. وبالنظر إلى حقيقة أن استنزاف النتائج RPGR في أكثر FA النضج (16) والتي RPGR يتفاعل مع الاتجار حويصلة البروتين Rab8 (المشار حاليا منصب Rab8a)، كما يفعل أعضاء BBSome، وتصل إلى تكون الأهداب وتنظيم طول الأهداب قد يكون أكثر وضوحا مما كان يعتقد سابقا.
ربما لدينا النتيجة الأكثر لفتا هي زيادة كمية نشط RhoA وجدت في Bbs4، Bbs6 وBbs8 خلايا متحولة. RhoA هو ضروري لبناء الأكتين قمي الزمنية شبكة لرسو السفن الجسم القاعدية والخيط المحوري النمو. في دراسة قام بها عموم وآخرون. (46)، منعوا تشكيل شبكة الإنترنت القمي والالتحام الجسم القاعدية من قبل انقطاع الأكتين إعادة عرض وكانوا يعتمدون على تفعيل RhoA. هذا النموذج هو يتفق مع النتائج في هذه الدراسة الحالية ومع تقرير سابق لدينا على الهجرة الجسم الأساسية، وعيوب لرسو السفن وتنظيم أكتين المعيبة عند فقدان bbs8 والبروتين PCP، vangl2 (42). وهذا، بدوره، يربط إلى دليل على وجود جهاز الإشارات المشترك يقودها أشعث الذي يحكم كلا قمي لرسو السفن ومستو استقطاب الهيئات القاعدية (47).
وخلاصة القول، توضح هذه الدراسة أن البروتينات BBS تلعب دورا مركزيا في تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين من خلال تغيير في مستويات RhoA وتشكيل فاس. وعلاوة على ذلك، ديسريغولاتيون من هذه العملية يؤدي إلى انخفاض تكون الأهداب وبالتالي مختلف الاضطرابات مسار الإشارات التي تدعم الظواهر ciliopathy نموذجية. ولعل المستوى النسبي لهذا الاضطراب يشير خلال تطوير حسابات للحصول على درجة عالية من التباين الملاحظ في المرضى المصابين داخل وبين العائلات على حد سواء. بل انه قد يذهب بعض طريقة لشرح الاختلاف الأليلي شائع بين متلازمات.
هناك حاجة لدراسات مستقبلية لفهم الآلية الدقيقة التي الأكتين التحلل يؤثر تكون الأهداب. ومن الجدير بالذكر أن BBS4، BBS8 وBBS9 عنصران من مجمع BBSome، اللازمة لتكون الأهداب (23) والتي BBS4 وBBS8 تعدل PCP (17، 32) توفير رابط مؤقت.

القسم السابق القسم التالي

المواد والطرق

زراعة الخلايا

تم الحصول على خلايا متحولة الأولية من Bbs4 وBbs6 الكلى الفئران فارغة. وقد نمت الخلايا والحفاظ في DMEM-Glutamax، 10٪ مصل وP / S. في التجارب التجويع المصل، كانت تزرع الخلايا حتى جوعا confluency ثم المصل لمدة 24 ساعة. الإنسان Bbs4 وBbs6 تم استنساخ السلطات الوطنية المعينة التكميلية في pCMV-HA ويبني pCMV-MYC وtransfected التالية Effectene ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN) تعليمات. Bbs8 كان -shRNA سابقا تصميم والتحقق من صحتها في (12) وتبع بروتوكول ترنسفكأيشن نفسه.

أفلام

كانت مطلية خلايا الكلى الأولية غير متكدسة لمدة 12 ساعة في لوحات ستة جيدا قبل الحصول على الأفلام. وتم تشكيل لLSM 710 المجهر بمحركات مع الهدف × 63 حتى تأخذ إطار كل 10 دقيقة. تم استخدام البرمجيات Volocity (التايم، PERKINELMER) للسيطرة على المجهر وتحليل الأفلام.
للأفلام الأكتين مرور الزمن، كانت الخلايا غير المصنفة متموجة وtransfected في الزجاج 48-جيدا لوحات أسفل مع 10 ميكرولتر مع CellLight ™ أكتين-GFP * BacMam (إينفيتروجن). انتظرنا لمدة 48 ساعة، ومتحد البؤر Timelapse (متحد البؤر زايس 710 × 40 الهدف المياه) الصور أخذت كل 30 ثانية لمدة 1 ساعة.
للتجارب التئام الجروح وقد أخذت صور في بداية ونهاية التجربة. تم تحجيمها أربعة وثلاثون من هذه الصور وتم قياس السطح الفجوة استخدام برامج صورة J. وقد استخدم الفرق بين الأولى والنقطة الأخيرة أو مساحة تعافى من قبل الخلايا لأداء ر -test بين العينات.

المناعية

كان المثقف خلايا coverslips على وغسلها مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) قبل التثبيت. بعد غسلها 15 دقيقة في الخلايا الفورمالديهايد 3.7٪ في PBS مرتين. تم منع الخلايا مع 1٪ ألبومين المصل البقري في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة وحضنت مع الأجسام المضادة الأولية المخفف في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تم غسلها الخلايا عدة مرات مع برنامج تلفزيوني والمحتضنة لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المناسبة (إينفيتروجن اليكسا فلور). تمت إضافة Phalloidin-رودامين لمدة 20 دقيقة قبل دابي نوى تلطيخ. وأثيرت الأجسام المضادة ضد BBS9 وBBS8 في أرنب باستخدام الببتيدات محددة؛ SPHPAKTGDGAQAEDC لBBS9 وGFLRPSTQSGRPGTME لBBS8 (كما نشرت سابقا في (44) الأجسام المضادة تم اختبار خصوصية لطخة الغربية في الأنسجة المختلفة، واستخراج الخلايا كانت تركيزات الأجسام المضادة المستخدمة لمناعي:. جاما تويولين (Abcam GTU88) 1/200، تويولين الأسيتيل (سيغما T6793) 1/500، GAPDH (Abcam 9485) طخة غربية 1/1000، Vinculin (سيغما) 1/50، ومكافحة Bbs8 1/100 لالمناعي و1/200 لطخة غربية، ومكافحة Bbs9 1/100 و 1/200 لطخة غربية. لمثبط حركة الخلايا D (سيغما) التجارب، 1 م م كانت ثابتة أضيف من مثبط حركة الخلايا D إلى الآبار لمدة 5 دقائق، وغسلها مع متوسطة جديدة وسمح لاستعادة ل5 و 15 و 20 دقيقة. الخلايا مع 3.7٪ الفورمالديهايد وملطخة phalloidin-رودامين للحصول على أهداب طول مثبط حركة الخلايا D التجربة (100 ن م) وأضيف لمدة 24 ساعة. الخلايا كانت ثابتة والملون مع تويولين الضد الأسيتيل.

التنسيق الكمي التصاقات وقياسات مستوى F / G

وقد تم الحصول على Vinculin FA الصور المناعي من خلايا مفردة غير متموجة باستخدام فلوري المجهر زايس Z1 IMAGER مع كاميرا AxioCam MRM والبرمجيات Axiovision. تمت معالجة كل صورة يدويا وجميع اتفاقات الصيد لكل خلية حساب. لحساب المسافة بين اتفاقات الصيد وغشاء الخلية، واستخدمت صورا لخلايا Vinculin الملون. قمنا بقياس المسافة بين الجزء الأكثر البعيدة كل FA وأقرب غشاء الخلية. لquantifications الأكتين F / G، وقد استخدم نفس الإعداد المجهر. تم تجهيز جميع العينات معا لتجنب التغيرات في شدة. تم تأمين التعرض إلى 100 مللي من أجل اتخاذ جميع عمليات الاستحواذ لجميع العينات باستخدام نفس التعرض. تم استخدام صورة J البرمجيات لقياس كثافة كل من القنوات باستخدام المجال الكامل من كل صورة. تم استخدام هذه الكثافة لحساب نسبة الأكتين F / G.

قياس ميكانيكا الخلية باستخدام تطلع micropipette

تم استخدام نظام الطموح micropipette بالتزامن مع متحد البؤر المسح بالليزر المجهر (SP2، لايكا، UK) إلى نضح فرد WT وBbs4 - / - الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك تم إجراء المزيد من الدراسات باستخدام Bbs4 - / - الخلايا المعالجة مع المانع RhoA، Y27632. كان المثقف جميع الخلايا في أحادي الطبقة ومن ثم trypsinized واختبارها في تعليق. وشيدت على بال micropipettes من الزجاج الشعيرات الدموية (G-1، Narisinghe الدولية، المملكة المتحدة) وتكسرت إلى القطر الداخلي (على) من 6،5-7،5 ميكرون وظيفة جدار (φ) 2.1. تم تطبيق Sigmacote (سيغما، MO، الولايات المتحدة الأمريكية) لمنع التصاق الخلية إلى بال micropipettes. ويوضع تعليق خلية من 106 خلية / مل في غرفة مخصصة بنيت على مرحلة من مراحل المجهر المقلوب. وقد تم اختيار خلية فردية وضغط الفارغة من 1 سم H 2 O تطبيق لوضع الخلية في غيض من micropipette. ويستنشق الخلايا إلى أقصى الضغوط من 7 سم H 2 O بمعدل 5.48 سم H 2 O / ثانية. وسجلت الصور متحد البؤر GFPactin وما يقابلها من الصور brightfield كل 1.63 ق ل 180 ق باستخدام × 63 / 1،4 NA الهدف غمر النفط العائد الصور بحجم بكسل: 0.11 × 0.11 ملم. ويتكرر هذا الإجراء لمدة 10 خلايا من كل مجموعة. Bbs8 وBbs9 تم اختبار الأجسام المضادة خصوصية على الخلية لست] مختلفة البقع الغربية (التكميلي المواد، الشكل 8).
لكل خلية، وطول الطموح (L تم قياس) في micropipette من الصور brightfield وتآمر ضد الزمن. تم استخدام ماتلاب لتناسب التعبير التالي إلى البيانات استنادا إلى بولتزمان الصلبة الخطي قياسي (BSLS) نموذج اللزجة (48). ونتجت عن ذلك معامل التوازن الخلوي) التي تم استخدامها لتحديد صلابة من كل خلية.

RhoA فحص

لتفعيل الفحص RhoA، استخدمنا RhoA G-LISA ™ عدة تفعيل الفحص (الهيكل الخلوي BK124) باستخدام مجموع استخراج البروتين من الخلايا متموجة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. في المقايسات تثبيط RhoA، تم علاج الخلايا مع تركيز 10 م م من Y27632 (سيغما) لمدة 30 دقيقة، وغسلها مع برنامج تلفزيوني وتجهيزها لالمناعي أو استخراج البروتين. للتجارب ترانسفيراز C3، 2 ميكروغرام / مل رو المانع I ADP ribosylation رو الأسباراجين-41 (الهيكل الخلوي، CT04) في المصل خالية المتوسطة. للتجارب الأكتين هيكل الخلية، تم إصلاح الخلايا بعد 5 ساعات، وللتجارب طول أهداب الخلايا كانت ثابتة بعد 3 ساعات. تم العثور على البيانات الخام من هذه التجارب في التكميلية المواد، الجدول.

morpholinos الزرد

تم حقن morpholinos الزرد في الأجنة خلايا مرحلة واحدة. تسلسل morpholino والتراكيز المستخدمة هي؛ bbs6 ATG 5'-GCTTCTTCTTACTAATGCGAGACAT-3؛ 4 نانوغرام / جنين، bbs9 ATG 5'-GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAG-3؛ 4 NGR / جنين.
لعلاج Y27632، وdechoroniated الأجنة المحقونة في 24 HPF وفصلها في الآبار بمحلول مكون من 100 نيوتن متر من Y27632. بعد 24 ساعة (48 HPF) تم غسلها مرتين مع المياه العذبة وسمح لتطوير لمدة يومين آخرين. لكانت ثابتة الأجنة تلطيخ phalloidin رودامين مع 4٪ PFA بين عشية وضحاها، وغسلها مع برنامج تلفزيوني / توين 20 بنسبة 0.05٪ وملطخة بين عشية وضحاها بمحلول مكون من phalloidin-رودامين. تم الأجنة التي شنت شقة في Cytofluor وتم الحصول عليها أكوام متحد البؤر. تم استخدام صورة J البرمجيات لقياس عرض وزاوية و somites. للتعبير رودوبسين، استخدمنا خط المعدلة وراثيا تيراغرام (rho2: EGFP) CU3 الزرد التعبير عن EGFP كما هو موضح سابقا (35).

 

[رافت ابراهيم]

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/12/14/1651.full

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب وراثي عديد المظاهر مع التباين المشترك بين وداخل الأسرة الكبير، الذي يعرض أيضا عدم التجانس الوراثي ملحوظا، مع سبعة تعيين مواضع BBS في الجينوم البشري. وقد أظهرت البيانات الأخيرة أن BBS قد تكون موروثة إما بسيط مندلية المتنحية أو سمة قليل الجينات، منذ الطفرات في اثنين مواضع مطلوبة في بعض الأحيان لالمرضية. وتشير هذه الملاحظة أن التفاعلات الوراثية بين BBS مواضع مختلفة قد تعدل النمط الظاهري، مما يسهم في تقلب السريري من BBS. نقدم ثلاث عائلات مع اثنين من الطفرات في أي BBS1 أو BBS2، والتي بعض وليس كل المرضى تحمل الطفرة الثالثة في BBS1، BBS2 أو BBS6 chaperonin المفترضة. في كل سبيل المثال، وجود ثلاثة أليل متحولة يرتبط النمط الظاهري أكثر شدة. واحدة من الأليلات مغلطة، علينا أن نظهر أيضا أن إدخال طفرة في خلايا الثدييات يسبب mislocalization مثيرة من البروتين مقارنة مع من النوع البري. وتشير هذه البيانات إلى أن الطفرات triallelic ليست دائما ضرورية لمظاهر المرض، ولكن قد تحفيز النمط الظاهري الذي يحدث من قبل اثنين من الطفرات المتنحية في أي مكان مستقل، وبالتالي إدخال طبقة إضافية من التعقيد على النمذجة الجيني للoligogenicity.

القسم السابق القسم التالي

مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS؛ OMIM 209900) هو اضطراب وراثي multisystemic تتميز التدريجي ضمور شبكية العين، polydactyly خلف المحور، والسمنة، والتشوهات الكلى والتعلم تأخير (1). وقد أثبتت الربط التقليدي والدراسات عزر البروتين سيليكون وعدم التجانس الوراثي كبير في BBS. وتم رسم لا يقل عن سبعة مواضع مستقلة في الجينوم البشري (BBS1 - BBS7)، خمسة منها تم استنساخ (BBS1، BBS2، BBS4، BBS6 وBBS7) (+2 - +12).
ترجمة المفاهيمية من هذه الجينات الخمسة BBS توفر بعض القرائن وظيفية، لأن أيا من هذه النصوص بترميز البروتين وظيفة معروفة (إعادة النظر في 13 - 15). ومع ذلك، فقد أشارت تحليلات طفرة وراثية أن وجهة النظر التاريخية التي BBS هو قد يكون اضطراب المتنحية مندلية التبسيط الشديد، منذ ذلك الحين، على الأقل في بعض الحالات، هناك حاجة إلى ثلاث طفرات على اثنين من BBS مواضع (الميراث triallelic) لإظهار المرض (16 - 18).
الأسس الجينية والجزيئية للسلوك قليل الجينات، ومن أمثلته BBS لكن الحالية أيضا في عدة اضطرابات وراثية أخرى، غير مفهومة (15، 19). في البداية، واقترح أن التباين الوراثي كبير في BBS قد تسهم في التباين المظهري العام (16). ومع ذلك، لم يدعم هذه الفرضية من خلال بيانات طفرة وراثية، حيث يمكن تمييزها عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين المظهرية المرضى إيواء الطفرات في مواضع مختلفة (+20 - 23). أثار اكتشاف الإرث triallelic، فيها بعض الأفراد المتضررين تأوي ثلاثة طفرات في اثنين مواضع، وهي إمكانية بديلة أن عدد الطفرات قد تعدل النتيجة السريرية. ومع ذلك، لم مقارنات المظهرية لأسر triallelic لا تظهر اختلافات جوهرية بين الأفراد أو الأسر التي لديها اثنان أو ثلاثة من الطفرات. في جميع الحالات الموثقة حتى الآن، كان مطلوبا من الطفرة الثالثة لتطوير BBS، وبدعم من وجود الأشقاء أعراض مع اثنين من الطفرات في مكان واحد (+16 - +18).
نحن تقديم أدلة وراثية والجزيئية التي تشير إلى أن بعض الطفرات BBS قد تمارس تأثير روكبي على النمط الظاهري BBS عن طريق تعديل بداية و/ أو شدة جوانب مختلفة من هذا الاضطراب. نفيدكم ثلاث عائلات مع اثنين من الطفرات في أي BBS1 أو BBS2، والذي تحور في جين الثالثة BBS الثاني موجودة في بعض، ولكن ليس كل المرضى وفي كل حالة يرتبط النمط الظاهري أكثر شدة. طبيعة والحفظ التطوري و، في حالة واحدة، وتقييم immunocytochemical من هذه الأليلات تشير إلى أن لديهم تأثير ضار على البروتين وليس من المرجح أن تكون الأشكال المحايدة. وبناء على هذه المعطيات، فإننا نقترح أن الأولي "تشغيل / إيقاف" نموذجا للtriallelism (17) قد تتطلب التعديل ونقترح أن الطفرات قليل الجينات قد تؤثر إما أو كل من انتفاذ والتعبيرية من النمط الظاهري BBS.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

الفصل الغامض من الطفرات triallelic

كجزء من جهودنا لتأسيس النمط الجيني لجميع الجينات BBS المعروفة في لفيف متعددة الأعراق كبيرة، أجرينا تحليل تسلسل شامل عبر الإكسونات ترميز جميع الجينات BBS الخمسة المعروفة. خلال هذه الدراسات، حددنا ثلاث عائلات، AR768، PB009 وPB061 التي تفصل اثنين من الطفرات في أي BBS1 (AR768، PB009) أو BBS2 (PB061)، في نمط ثابت مع الميراث مقهورة. في AR768 الأسرة، حددنا اثنين المسببة للأمراض المرجح الترميز التعديلات تسلسل. الأول هو T إلى G تبدال في اكسون 12، والتي من خلال النتائج المفاهيمية الترجمة في تغيير مغلطة من ميثيونين إلى أرجينين في موقف 390 (M390R؛ الشكل 1 A). تم الإبلاغ عن هذا الخيار في السابق باسم تغيير الإمراض الأكثر شيوعا في BBS1، لأنه يمثل 18-32٪ من جميع الطفرات BBS1 (12، 16، 24). بالإضافة إلى ذلك، كما يحمل كل فرد من المتضررين ورثت أمومي 1 بي بي حذف (1650ΔC) في اكسون 16 من BBS1 الذي يسبب المفهوم، انزياح الإطار في ليسين 548 وتعطي إنهاء السابق لأوانه في كودون 579 (L548fsX579؛ الشكل 1 A). هذا التغيير عزلها مع المرض في هذه العائلة وغير موجود في 192 الكروموسومات السيطرة عرقيا يقابل. في الأسرة الثانية، PB009، وجدنا كل من sibs الثلاثة المتأثرة أن يكون متماثل لطفرة M390R المشتركة (الشكل 1 B). وأخيرا في الأسرة الثالثة، PB061، حددنا طفرة هراء متماثل R275X في BBS2 (الشكل 1 C) والتي كما ارتبط سابقا مع اضطراب (17).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الشكل 1. Triallelic الميراث في ثلاث عائلات BBS. (A) في AR768 الأسرة، وقد ورثت كل فرد يتأثر اثنين من التعديلات في BBS1: أ M390R متخالف (الأب) طفرة في اكسون 12 و 1 سنة مضت (الأمهات) الحذف في اكسون 16. الفرد أكثر تضررا، -04، يحمل الثالث (الأب) تغيير في BBS6، والثريونين للبرو الاستبدال في موقف 325 (T325P). (B) في PB009 الأسرة، جميع الأفراد المتضررين ثلاث -03، -04 -05 ويكون الطفرات M390R متماثل في BBS1. -03 و-04 قد ورثت طفرة L349W إضافية في BBS2 وتقديم النمط الظاهري الشبكية أكثر شدة. (C) نمط مماثل لتوزيع أليل في PB061 الأسرة؛ كلا -03 -04 وهي متماثل لهراء R275X BBS2 الطفرة، ولكن فقط في السيب أكثر تضررا -04 لديه تحور متخالف لصق تقاطع إضافية (IVS115 + 2T → C) في BBS1. وأكد طفرة BBS2 R275X من قبل BSL I الهضم، حيث لمن النوع البري الأليل، والمشقوق وamplicon 339 نقطة أساس إلى قسمين شظايا من 141 و 198 نقطة أساس، على التوالي، في حين أن الطفرة R275X ألغت موقع بي إس I.

وأشارت بيانات حديثة أن الطفرات BBS1 يقترن قد يكون كافيا للتسبب متلازمة بارديه-بيدل (12، 24)، على الرغم من أن التحليلات اللاحقة كشفت أن BBS1 تشارك أيضا في الميراث معقدة ولكن على تردد أقل من بعض الآخرين BBS مواضع معروفة (16). وكانت لدينا بيانات طفرية لكل عائلة تتفق مبدئيا مع الوراثة جسمية متنحية. ومع ذلك، فقد قدمت البيانات السابقة لدينا العديد من الأمثلة التي الطفرات المتنحية على ما يبدو هي في الواقع جزء من نمط الميراث معقد وفيه ثلاثة الأليلات الطافرة على اثنين من مواضع ضرورية لإمراض (+16 - +18، +25). وتمشيا مع هذه الملاحظة، وجدنا الأليلات المحرضة في موضع BBS الثاني في كل من العائلات الثلاث. ومع ذلك، في كل حالة، الطفرة الثالثة لم تعزل بين المصابين بهذا الاضطراب منذ واحد السيب المتضررة في كل أسرة قامت سوى اثنين BBS1 أو BBS2 الطفرات.
في قوقازي AR768 الأسرة، اكتشفنا تبدال 973 ألف → C في اكسون 3 من BBS6 التي كتبها ترجمة المفاهيم يؤدي إلى تغيير مغلطة غير متحفظ من ثريونين إلى البرولين (T325P). عواقب الهيكلية المحتملة لهذا التعديل والحفظ التطوري للثريونين (الشكل 3 تشير أ) أن هذا التحول هو على الارجح المسببة للأمراض. يتفق مع هذا التنبؤ، لم نجد هذا البديل في 192 الكروموسومات السيطرة عرقيا يقابل. هذا الأليل، ومع ذلك، لا تعزل بين المصابين بهذا الاضطراب. أنها تنتقل من الأب تتأثر (الذي هو بالتالي متغايرة مزدوجة لBBS1 وBBS6) واحد فقط من نسل المتضررين، -04؛ الأخوة المتضررين الآخرين، -03، يحمل البرية أليل نوع BBS6 (الشكل 1 A). على هذا النحو، وتغيير T325P لا يمكن أن يسبب النمط الظاهري.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الشكل 2. النمط الظاهري الشبكية من PB009. (A، B) العمر من ظهور اعتلال الشبكية وحدة الإبصار النسبية في PB009 الأسرة؛ ملاحظة الاختلافات بين sibs 'triallelic' -03 -04 ومع -05، الذي فقد اثنين من الطفرات BBS1 ولكن هو من النوع البري لBBS2. (C) توزيع التباين داخل الأسرة في عصر ظهور اعتلال الشبكية. تأسست سن بداية لكل فرد المتضررين في 10 عائلات مع اثنين أو أكثر تأثرا sibs تحمل واحدة على الأقل طفرة M390R في BBS1 وأي دليل على المتغيرات المسببة للأمراض في مواضع أخرى. على النقيض من ذلك إلى تباين متوسط ​​2.3 سنوات، لوحظ وجود تباين الحد الأقصى من 19 عاما في PB009 الأسرة.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الشكل 3. حفظ الطفرات مغلطة. (A) وثريونين يتم حفظها 325 موقف في كل orthologs BBS6 معروف؛ HS = الإنسان، BT = بقرة، آر = الفئران، مم = الماوس. BBS6 ليس التعرف عليها بسهولة في الكائنات الدنيا. (B) المحافظة على يسين في موقف 349 من BBS2. CF = الكلب، زز = الدجاج، د = ذبابة الفاكهة، AG = البعوض، قنفذ س = البحر، XL = القيطم، م = flatworm.Light الأزرق يدل على هوية الأحماض الأمينية. يصور الصفراء الأمينية تشابه حمض (بدائل الحفظ).

لاحظنا وجود نمط مماثل في الفصل قوقازي PB009 الأسرة، حيث بالإضافة إلى اثنين من الأليلات BBS1 M390R (واحد من كل من الوالدين)، sibs المتضررة -03 -04 ولقد ورثت تغيير L349W متخالف الأب في BBS2. ويمثل هذا الأليل إجراء تبديل غير متحفظ من بقايا الحفظ تطويريا (الشكل 3 B) لم يكن موجودا في 192 الكروموسومات السيطرة عرقيا المتطابقة، وبالتالي من المرجح أن تكون العدوى. ومع ذلك، فإن السيب الثالثة المتضررة، -05، لا ترث هذا البديل، وبالتالي يحمل على ما يبدو فقط الطفرات المتنحية BBS1 (الشكل 1 B).
وأخيرا، في PB061 الأسرة، فرد -04 ولكن ليس السيب المتضررة الأخرى -03 لديها طفرة الموروثة للأمهات في موقع لصق المانحة من اكسون 15 من BBS1 (IVS15 + 2T> C؛ الشكل 1 C). مثل الطفرة الثالثة في الأسرتين السابقة، وكان هذا البديل غير موجود في 192 الكروموسومات السيطرة عرقيا المتطابقة وربما له عواقب وخيمة على سلامة النص BBS1، لأن من المتوقع أن يسبب للقراءة من خلال إلى إنترون 15، وبلغت ذروتها في إنهاء السابق لأوانه كودون بعد 72 المخلفات.

أسر AR768، PB009 وPB061 تظهر التباين المظهري داخل الأسرة

أثارت بيانات دينا طفرة إمكانية أن أليل الثالث لوحظ في BBS1، BBS2 وBBS6 قد يكون لها تأثير تعديل على النمط الظاهري. افترضنا أن في كل أسرة المرضى الذين يعانون من الطفرات الثلاث قد يحمل النمط الظاهري أكثر حدة أو واسعة مقارنة مع sibs مع اثنين من الطفرات. لتحقيق ذلك، درسنا جميع البيانات السريرية المتاحة لكل مريض (الجداول 1 - ⇔ 3). لتجنب التحيز، تم إجراء هذا التحقيق من قبل RAL، PLB أو CC دون معرفة مسبقة من النمط الجيني.

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 1.

الاختلافات المظهرية بين AR768-03 و-04. تم التأكد من كل فرد لكل من الجوانب الرئيسية والثانوية من النمط الظاهري BBS. وعلى الرغم من فحص كل أخ على مدى عدة سنوات، كلما أمكن ذلك تمت مقارنة النمط الظاهري في نفس العمر

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 2.

ملخص الاختلافات المظهرية بين PB009-03، -04 و-05

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 3.

الاختلافات المظهرية بين PB061-03 و-04

AR768 الأسرة.

AR768 العائلة هي عائلة غير الأقارب من أصول أوروبية الشمالية. ومع ذلك، على الرغم من أن كلا sibs الميزات الواضحة نموذجية من BBS، والمريض تقل ثلاثة الطفرات، -04، ويقدم شكلا أكثر حدة بكثير من BBS مقارنة مع شقيقتها الأكبر سنا (الجدول 1). وضعت AR768-03 عادة، وعلى الرغم من انخفاض حدة البصر، وقالت انها حافظت على درجات جيدة في المدرسة الابتدائية، لديه معدل الذكاء اختبار 110، لا يوجد لديه خطاب أو صعوبات في التعلم، وليس البدانة. وعلى النقيض من أختها، -04، وأصبح يعاني من السمنة في السنة الأولى من العمر، وكان نقص التوتر الملحوظ، ودفع غرامة اتناسق السيارات، وكانت دائما أكبر من لها قواعد العمر المتطابقة. انها طرحت لأول مرة كلمتين معا بعد سن 3 سنوات، وبنسبة 5.5 سنوات يمكن التحدث مع الخطاب الذي كان التأويل فقط من قبل والديها. لها IQ هو 92. على الرغم من أن لها معالم الحركية كانت طبيعية، استمر نقص التوتر المعتدل. في سن 5،5 كان لها محيط الرأس (54 سم)> المئوي 97th (والمئوي ال50 ليبلغ من العمر 14 عاما)، وكان ارتفاع لها 122.1 سم (> المئوي 97th، المئوي ال50 لالبالغ من العمر 7.5)، ولها وزن 37.4 كجم (> المئوي 97، والمئوي ال50 لالبالغ من العمر 11 عاما).

PB009 الأسرة.

PB009 الأسرة هو الأوروبية الأسرة الشمالية، غير الأقارب فيها جميع sibs تتأثر أيضا ميزات اضح من الكلاسيكية BBS، ولكن هناك ضرب أيضا الاختلافات المظهرية في الوزن، والنمط الظاهري في شبكية العين وبعض الجوانب السلوكية (الجدول 2، الشكل 2 ألف وباء) . الأخوة الأول (PB009-03)، والآن 32 سنة، وأصبح قريبا من السمنة المفرطة بعد الفطام إلى الأطعمة الصلبة ولها مؤشر كتلة الجسم (BMI) هو الآن 33. وقد ظهرت عليها nyctalopia في سن 17، وقدم في وقت لاحق لأطباء العيون في 20 عاما مع " التهاب الشبكية الصباغي "، وحدة البصر من 6/12 وبراريق شفافة من القرص البصري الأيسر. حسب العمر 27 انخفضت حدة لها ل24/06 وأنها مسجلة الآن أعمى. الأخوة المقبل (PB009-04)، والآن 35 عاما، وأصبح أيضا يعانون من السمنة المفرطة في مرحلة الطفولة، ومثل أخته، له BMI تقف الآن عند 33. وضعت nyctalopia في سن 13 و 15 وكان رصيده حدة البصر 18/06. في ذلك الوقت تصبغ الشبكية متفرق مع وجود بقع Fuch لوحظت في تنظير القاع. لوحظت عيوب المجال كبيرة وأقراص شمعية شاحب في الفحص في سن 22. والتسجيل وكفيفة تم الانتهاء من 24 عاما. على النقيض من ذلك، شقيقة الأكبر (PB009-05)، والآن 37 عاما، هو أقل من زيادة الوزن من الأشقاء الثلاثة (BMI 29)، لم يقدم أي nyctalopia حتى أنها كانت 32 عاما وتم الكشف فقط العلامات المبكرة لاعتلال الشبكية عند 34 سنوات. وقالت انها لا تزال تتمتع بالقرب من حدة البصر مثالية بعد يوم.

PB061 الأسرة.

الأسرة الثالثة، PB061، هي عائلة غير الأقارب من المنطقة الجبلية في شمال إيطاليا. مثل العائلتين السابقة، سواء sibs يحمل BBS الكلاسيكية. ومع ذلك، أشار التقييم السريري مفصل فروق ذات دلالة إحصائية بين البلدين sibs المتضررة في التنمية وهيئة إدارة الوزن. تأخر التطور النفسي للPB061-03 أقل ما يقال ولكن ضمن المعدل الطبيعي: جلس في 9 أشهر، مشى في 15 شهرا، الكلمات الأولى تحدث في 12 شهرا، ولكن الجملتين الأولى لم تشكل حتى 3 سنوات. حاليا، وقالت انها نجحت بشكل جيد في المدرسة الثانوية مع دعم بسيط لضعف البصر. لها مؤشر كتلة الجسم هو 24.9 ولم تكن زيادة الوزن مشكلة كبيرة في أي مرحلة من مراحل حياتها. على النقيض من ذلك، PB061-02 (الذكور) من ذوي الخبرة تأخير كبير في مراحل تطور الطفل: جلس في 11 شهرا، وسار في 21 شهرا، الكلمات الأولى تحدث في عمر 2 سنة. ونظرا للصعوبات التعلم كبيرة، وتحتاج إلى دعم التعليم المستمر طوال سنوات الدراسة. وعلاوة على ذلك، شهدت PB061-03 زيادة الوزن على المدى الطويل منذ 3 سنوات من العمر؛ ويحتفظ له BMI الحالي بنجاح في 25، ولكن فقط مع نظام غذائي صارم.

النمط الظاهري في شبكية العين من طفرة BBS1 M390R

وتشير البيانات الطفرات والمظهرية لدينا أنه في كل عائلة الطفرة الثالثة تتزامن مع زيادة ملحوظة في شدة المرض من الميزات المظهرية محددة. ومع ذلك، فإن تقلب السريري موثقة في BBS (1، 13، 14، 21، 26، 27)، تشير إلى أن بعض هذه الاختلافات قد يكون راجعا إلى الأحداث العشوائية أو الأليلات في الآخرين، غير BBS مواضع. كنا تساءل عما إذا كان التباين ينظر في عائلاتنا نموذجية من BBS. ركزنا على النمط الظاهري الشبكية لسببين. أولا، واعتلال الشبكية هي السمة الأكثر ثابتة من BBS، وعلى النقيض من السمنة والتعلم / الظواهر السلوكية، الكمي لها هو أكثر موضوعية والتأثير البيئي وربما أقل وضوحا. ثانيا، والأسرة مع عرض النمط الظاهري الشبكية متميزة، PB009، هي M390R متماثل لBBS1. هذا الأليل هو الأكثر شيوعا طفرة BBS1 (12، 16، 24)، وتكفل لنا الفرصة لدراسة عدد كبير من المرضى الذين يعانون من واحدة أو متشابهة الأنماط الجينية. نحن مصممون على عمر البدء في 37 المرضى BBS من 23 عائلة الذين قاموا احد على الأقل طفرة M390R مع عدم وجود دليل على وجود طفرة ثالثة في مكان آخر. بما يتفق مع الدراسات الوبائية السابقة، وجدنا توزيع واسعة من ظهور اعتلال الشبكية، والتي تتراوح 1،5 حتي 23 عاما، على الرغم من أن متوسط ​​عمر ظهور في PB009 الأسرة كان غير نمطية لمتلازمة في 23 عاما، ويرجع ذلك أساسا إلى أواخر بشكل كبير سن بداية PB009-05 (34 عاما). نحن التحقيق بجانب الاختلاف في عمر البدء عن طريق اختيار جميع الأسر التي لديها BBS "المتنحية" واحد أو اثنين من الطفرات M390R في BBS1. في 10 عائلات المتاحة، كان فرق المتوسط ​​في سن بداية 2.3 سنوات مع انحراف معياري 1.7، في حين أنه في PB009 الأسرة كان الفارق في السن من بداية بقدر 19 عاما وخمسة الانحرافات المعيارية بعيدا عن أعلى قيمة (الشكل . 2C). والجدير بالذكر، كان الفارق في السن من بداية بين PB009-03 و-04 5 سنوات وضمن نطاق الاختلاف طبيعي. حتى عندما نحصر تحليلنا للأسر ذات التراكيب الوراثية BBS1 مماثلة لPB009 (أي M390R / M390R)، ما زلنا نلاحظ على خلاف قوي في متوسط ​​العمر من البداية. وعلى الرغم من أحجام عينة صغيرة، كنا قادرين على اختبار الفرضية القائلة بأن وسائل هاتين المجموعتين من المرضى متطابقة باستخدام heteroscedastic (الفروق غير متكافئة) الذيل اثنين ر -test، وحصل على -value P 0.052، وتوفير موحية الإحصائية دليل. عندما اختبرنا ما إذا كان المعارض PB009 زيادة كبيرة التباين في سن بداية مع F -test (F = 16.0؛ 2 و 5 مدافع)، ونحن أيضا الحصول على دليل إحصائي قوي نسبيا لمثل هذا التباين زيادة (P <0.014). الفرق في التباين المظهري أصبح كبيرا للغاية عندما تم إدراج جميع الأسر BBS1 المتنحية مع واحد طفرة M390R (P <0.05).

النمط الظاهري الخلوية من البديل BBS6 T325P

وعلى الرغم من ارتباط محتمل بين شدة السريرية وعدد الأليلات الطافرة في كل من ثلاث اسر، فضلا عن الطبيعة غير متحفظة من الطفرات مغلطة وغيابهم عن الصبغيات السيطرة عرقيا المتطابقة، تبقى إمكانية الرسمية التي L349W BBS2 والأليلات T325P BBS6 هي الأشكال حميدة. لطفرة BBS2، ونقص المعلومات عن البروتين يمنع حاليا تقييم وظيفي لها. على النقيض من ذلك، إنشاء توزيع الخلوية من النوع البري البروتين BBS6 (JCK وMRL والملاحظات غير منشورة) مكننا لفحص أي عيوب التعريب المحتملة في BBS6 التي تسببها طفرات BBS6.
BBS6 هو جين أعرب على نطاق واسع الذي يظهر التماثل إلى النوع الثاني chaperonins (ترجمة المفاهيمي 28). قد تورطت هذه أسطواني، المحرمين الجزيئية التي تعتمد على ATP في للطي من مجموعة واسعة من البروتينات الخلوية (29) ومرافقين وقد شاركت في العديد من الاضطرابات الإنسان (30). ومع ذلك، لا تزال هناك كل من أهمية وظيفية من هذا التشابه ودور الخلوية من البروتين BBS6 جهود إحباط غير محددة، وبالتالي لفحص إمكانية المسببة للأمراض من BBS6 متغيرات تسلسل.
عند النظر في التأثير المحتمل للأليل T325P على BBS6، ونحن افترضنا أن طبيعة التغيير قد يؤثر على بنية و / أو قدرة البروتين لأضعاف بشكل صحيح، والتي قد تؤدي بدورها إلى أي تدهور أو mislocalization من متحولة BBS6. لتقييم هذا الاحتمال، ونحن transfected خلايا هيلا مع يبني البلازميد التي تعبر عن MYC الموسومة البرية من نوع (وزن) BBS6 أو Myc على الموسومة T325P متحولة BBS6. وأظهر تحليل لطخة الغربي من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل التي يتم إنتاجها كل من البروتينات عند مستويات مماثلة وتظهر الحجم المتوقع من ~60 كيلو دالتون (الشكل 4 A). وتشير هذه الملاحظات أن البروتين BBS6 متحولة ليست معرضة بشكل خاص للتدهور. ثم تم تحديد أنماط توطين الخلوية من Myc على-BBS6 (بالوزن) وMyc على-BBS6 (T325P) البروتينات التي مناعية على خلايا هيلا مع الأجسام المضادة الأولية محددة ل13 الأحماض الأمينية Myc على العلامة والأجسام المضادة الثانوية إلى جانب وجود صبغة الفلورسنت الأخضر .

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 4. mislocalization الخلوي من BBS6 (T325P) متحولة البروتين. (A) تحليل لطخة غربية من خلايا هيلا التي كانت إما untransfected، أو مع transfected Myc على-BBS6 البرية من نوع (بالوزن) أو Myc على-BBS6 (T325P) بنيات متحولة باستخدام حيدة النسيلة الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. (B) سيتولوجية مناعية الخلايا معربا عن Myc على-BBS6 (بالوزن) أو MYC-BBS6 (T325P) يبني يستخدمون مضاد للMyc على وحيدة النسيلة الأولية الضد والضد الثانوية بالإضافة إلى فلور اليكسا 488 الصبغة. إشارات MYC-BBS6 خضراء، وملطخة النوى مع دابي (الأزرق). خلايا Untransfected عرض فقط تلطيخ دابي بارز (أي تلطيخ الأخضر)، كما يمكن أن يرى في بعض الخلايا الموجودة في الفريقين.

وأظهرت إشارات المناعي من البروتين Myc على-BBS6 (بالوزن) نمط تلطيخ عصاري خلوي مميز التي امتدت الخروج من النواة (الملون الأزرق مع دابي) وأصبح الخيطية ملحوظ بالقرب من محيط الخلية (الشكل 4 B، اللوحة العلوية). هذا النمط التعريب لا يمكن تمييزه عن أن من النوع البري BBS6 يخلو من علامة، ويختلف اختلافا كبيرا عن تلك التي chaperonin عصاري خلوي ترتبط ارتباطا وثيقا، CCT (مخطوطة قيد الإعداد). في المقابل، أظهرت جميع الخلايا معربا عن Myc على-BBS6 (T325P) البروتين نمط توطين مختلف جذريا (الشكل 4 B، اللوحة السفلية). وكانت خيوط BBS6 لم يعد تمييز، والأكثر من البروتين يبدو لتشكيل كتل أو مجاميع في المواقف المختلفة في السيتوبلازم في جميع الخلايا التي تم فحصها.

القسم السابق القسم التالي

نقاش

BBS هو اضطراب عديد المظاهر من التعقيد السريري والجزيئي كبير. وقد كشفت عمليات التقييم المشترك بين المظهرية واسعة والتباين داخل الأسرة (1، 21 - +23، 26، 27، 31). وكانت محاولات ربط الأنماط الجينية مع النمط الظاهري على أساس مكان التجانس غير حاسم، وكذلك الدراسات التي أخذت بعين الاعتبار وجود طفرات triallelic، مما يشير إلى نمط أكثر تعقيدا من التشكيل المظهري (17، 18).
لقد ذكرت هنا ثلاث عائلات فيها بعض، ولكن ليس كل شيء، فقد ورثت المرضى الثلاثة طفرات في اثنين من الجينات BBS. هذا النمط من الميراث لطفرة ثالثة غير متوافق مع السببية والتيار "تشغيل / إيقاف" نموذج triallelism. لذلك فإننا في ثلاثة بدائل ممكنة ويستبعد بعضها بعضا: (ط) أن أليل الثالث الكشف في كل من العائلتين هو تعدد الأشكال حميدة. (ب) أن أليل الثالث هو الإمراض ولكن الحاضر مصادفة في هؤلاء المرضى. أو (ج) أن أليل الثالث لا السببية في هذه الأسر ولكن يمارس تأثيرا المعدلة.
لا يمكن استبعاد الاحتمال الأول، لكننا نقترح أنه من غير المرجح على أساس ثلاثة أسطر من الأدلة. أولا، كل الطفرة إجراء تبديل غير المحافظين الذي يتوقع أن يكون لها تأثير كبير على البروتين: التغيير L349W BBS2 محل بقايا دهنية الحفظ جدا مع حلقة عطرية، يمكن أن تؤثر على الذوبان، ومن المتوقع أليل T325P BBS6 لإدراج شبك في البروتين، وبالتالي تغيير هيكلها ثلاثي الأبعاد وطفرة لصق في BBS1 يدخل وقف كودون المبكرة ويلغي BBS1 مرنا من الاضمحلال بوساطة هراء ربما. ثانيا، لم تكن أي من هذه التغييرات الحالي في 192 الكروموسومات السيطرة عرقيا المتطابقة وتشمل كلا التعديلات بقايا الحفظ جدا (الشكل 3). وأخيرا، على الرغم من أن النمط الظاهري الخلوية من L349W لا يمكن التأكد نظرا لتوزيع الخلوية غامضة من النوع البري BBS2، عندما قدمنا ​​البروتين BBS6 معربا عن البديل البرولين 325 في خلايا الثدييات، لاحظنا النمط الظاهري الخلوية المضربين، حيث يفقد البروتين القدرة على توطين بشكل صحيح في الخلية، وبدلا من تشكل الحصى واضحة في السيتوبلازم. هذا ومن المرجح أن تكون ضارة إلى وظيفة عادية.
وبالنظر إلى أن BBS6 T325P، BBS2 L349W وBBS1 لصق المتغيرات تقاطع ربما تضر البروتين، يصبح السؤال ما إذا كانت هذه غير فصل-المتغيرات المسببة للأمراض في جين BBS تؤثر على النمط الظاهري الناجمة عن اثنين من الطفرات في موضع آخر BBS. أن المرضى ذكرت يحملون قبيل الصدفة من BBS1، BBS2 أو BBS6 طفرة على التوالي هو المرجح، بالنظر إلى أن الطفرات يقترن في كل من BBS1، BBS2 وBBS6 وقد ثبت أن يسبب BBS (4، 8، 10، 12، 16، 24) والمشاركة في الميراث triallelic (16 - 18، 25). وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا سابقا أن انخفاض معدل BBS في القوقازيين (1: 100 000-1: 160 000) إلى جانب مساهمة صغيرة نسبيا من BBS2 وBBS6 الطفرات إلى متلازمة (18 و 6٪ على التوالي) تجعل إمكانية هؤلاء الأفراد يجري ناقلات محاسن تذكر (17). حتى لBBS1، موضع BBS الأكثر شيوعا في القوقازيين، وفرصة للشركات محاسن صغيرة (1: 380-1: 430 استنادا إلى مجموعة من التردد المرض بين 1: 100 000-1: 125 000). الأهم من ذلك، في حدود قدرتنا على قياس النمط الظاهري بدقة، والتباين داخل الأسرة الملحوظ الذي يحتمل الناجمة عن طفرة ثالثة أكبر بكثير من التباين داخل الأسرة في BBS بشكل عام. وبطبيعة الحال، لا يمكن تحديد مساهمة دقيقة من أليل الثالث في موضع الثاني إلى النمط الظاهري على وجه اليقين. فمن المحتمل أن بعض الاختلاف الملاحظ في التعبيرية هي نتاج ما تبقى من الجينوم، وكذلك البيئة. ومع ذلك، فإنه من غير المرجح أن في كل أسرة في فوج لدينا، العلاقة بين وجود طفرة الثالثة والنمط الظاهري أكثر حدة هو من قبيل الصدفة، على الرغم من أن يطلب من الأسر إضافية لفهم وترسيم تأثير الدقيق لمثل هذه الأليلات.
بناء على ملاحظاتنا، نقترح نموذجا حيث مثل هذه الأليلات غير فصل BBS تمارس تأثير التعديل على النمط الظاهري هو التفسير الأكثر قبولا البيانات المتوفرة لدينا. في الخلفية الوراثية توعية بالفعل، يمكن أن الطفرات إضافية في أي مكان BBS مستقلة تساهم في تقلب داخل الأسرة كبيرا لاحظ ينظر في BBS. على سبيل المثال، في PB009 الأسرة، كل من sibs الثلاثة المتأثرة يظهر BBS. ومع ذلك، فإن sibs اثنين مع ثلاثة تحولات لديها النمط الظاهري في شبكية العين بشكل ملحوظ أكثر شدة مع fundi معرض نموذجي "التهاب الشبكية الصباغي" علم الأمراض، في حين أن البكر السيب الثالث سوى تغيرات طفيفة قاعية في 37 سنة من العمر. مقارنات بين حدة البصر من sibs ثلاثة تتفق أيضا مع هذا الاختلاف، لأن كلا PB009-03 و-04 المكفوفين من الناحية القانونية، في حين -05 لديها الرؤية العادية. الأهم من ذلك أن الاختلاف في بداية اعتلال الشبكية في تلك العائلة هو أكبر بكثير من الاختلاف الملاحظ في 10 عائلات أخرى مع الطفرات المتنحية BBS1 على ما يبدو، واحدة منها على الأقل غير M390R.
وبناء على هذه الملاحظات، فإننا نقترح أن طبقة إضافية من التعقيد قد تكون موجودة في علم الوراثة من BBS. فرضية triallelic الأولية فيها ثلاثة الطفرات اللازمة لالمرضية قد تبسيط مساهمة حقيقية من كل مكان إلى النمط الظاهري. في حدود الدراسة ثلاثة الأسرة الحالية، نتائجنا تتسق مع فكرة أن الطفرات غير المندلية في أحد BBS مكان يمكن أن تسهم في تعديل النمط الظاهري BBS التي تسببها طفرات في مكان آخر. على هذا النحو، triallelism "نقية"، التي الأفراد مع اثنين من الطفرات في مكان واحد بدون أعراض ولكن الأفراد مع ثلاثة تحولات تتأثر، وتحديد واحدة من نهاية الطيف التي أليل متحولة في واحدة BBS مكان يمكن أن يكون لها تأثيرات متغيرة أو حتى المتطرفة على التعبيرية من الطفرات يقترن في موضع آخر (الشكل 5).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 5. المفاهيمي (المثالية) تمثيل تأثير الأليلات الطافرة على النمط الظاهري. ضمن مجموعة من السكان المريض، واثنين من الطفرات في مكان واحد يؤدي إلى مجموعة من الظواهر، من غير متناظرة / الإكلينيكي لBBS الشديد. إدخال أليل السببية الثالث (الخط المنقط الأزرق) يقلل أو يلغي عددا من الأفراد غير متناظرة ولكنها لا تؤثر في توزيع شدة الشامل للاضطراب. على النقيض من ذلك، وإدخال طفرة المعدلة (أحمر متقطع سطر) يزيد من شدة الشاملة للاضطراب وقد يسبب أيضا بعض الأفراد الذين لولا ذلك أعراض لإظهار شكل خفيف من المرض.

و"التدرج" النموذج أعلاه لتفاعلات الطفرات triallelic يتفق مع ملاحظة أن من بين الأسر BBS triallelic الإبلاغ عنها حتى الآن (17، 18)، وهناك المزيد من المرضى مع ثلاثة تحولات في اثنين مواضع من الأفراد تتأثر مع اثنين من الطفرات في واحد مكان. على الرغم من أن لدينا أي سبب للشك في أن يعود هذا التوزيع إلى أي تحيز واعية من التثبت أو التعيين (باستثناء تلك التي تتأثر السريرية)، والتفسير الأكثر قبولا هو أن ليس كل الطفرات triallelic ضرورية لالمرضية. بدلا من ذلك، قد تؤدي إلى تفاقم بعض جوانب النمط الظاهري.
وتوضيح الأثر النسبي لكل طفرة في كل مكان على أي جانب من جوانب النمط الظاهري BBS تكون صعبة، لأن: (ط) لحساب مواضع معين فقط حوالي 40٪ من جميع الأسر BBS، مشيرا إلى أن العديد من أكثر BBS مواضع تبقى uncloned. (ب) لا يتم التعرف على العديد من العوامل التي تنظم النمط الظاهري بعد؛ و (ج) غير مفهومة حتى الآن العلاقات بين والتفاعلات بين مكونات جينية معروفة من هذا الاضطراب. وهكذا، فإن كلا من تحديد الجينات المسببة إضافية BBS ودراسات النمط الظاهري النمط الجيني مفصلة عن أعداد الكبيرة ستكون حاسمة بالنسبة لنموذج الآلية الجزيئية (ق) من oligogenicity، وهو نوع من انتقال سمة ذات الصلة لفهم كلا مندلية والصفات البشرية المعقدة.

القسم السابق القسم التالي

المواد والأساليب

أسر بارديه-بيدل

تم التحقق من الأفراد مع BBS وفقا لمعايير محددة سلفا (1). في جميع الحالات، وأجريت مقابلات مفصلة من قبل محقق من ذوي الخبرة (RAL، CC أو PLB)؛ وطلب من جميع السجلات الطبية المتاحة ومراجعتها للتأكد من معايير التشخيص. تم فحص جميع أفراد المتضررين من كل عائلة من قبل الفاحص واحد (RAL، CC أو PLB)، الذي كان يرتدي قناعا على البيانات الوراثية. تمت الموافقة على هذه الدراسات من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للبحوث موضوع الإنسان في كلية بايلور للطب ولجنة استعراض أخلاقيات معهد صحة الطفل، جامعة كلية لندن.

فحص التحور

تم استخراج الدم والحمض النووي أعدت من الخلايا الليمفاوية وفقا للأساليب المنشورة (16). وتضخمت بكل exons من كل جين BBS وشملت كل amplicon كل من اكسون وكذلك تقاطعات لصق intronic كما هو موضح (4). وتنقيته المنتجات PCR تضخيمها من الحمض النووي للمرضى وأقاربهم مع عدة تنظيف إكسو-SAP (USB) والتسلسل مع صبغ التمهيدي أو صبغ فاصل الكيمياء على ABI 377 (النظم البيولوجية التطبيقية) أو MegaBACE 1000 (أمرشام العلوم البيولوجية) المنظم الآلي . وتمت مواءمة سلاسل الناتجة عنها، وتحليلها مع برنامج محاذاة تسلسل Sequencher (رموز الجينات). لPB061، بالإضافة إلى التسلسل، تقييد خلاصة BBS2 أجريت اكسون 8 من أصل. طفرة R275X تلغي لبي إس I موقع 141 نقطة أساس في جزء 339 سنة مضت.

إعداد بنيات

الترميز المنطقة بأسرها من البشر BBS6 تم تضخيم [كدنا بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) مع 'التمهيدي تحتوي على 5 سال موقع I (GTCGACCATGTCTCGTTTGGAAGCTAAG) و3' التمهيدي ايواء ليس موقع I (GCGGCCGCTTAGTTTTTATCTTCAATAAC). تم استيعاب المنتج مع سال الأول وليس أنا، وsubcloned إلى pCMV. Myc على ناقلات (BD العلوم البيولوجية). تم إنشاء نقطة متحولة T325P BBS6 مع موقع السريعة التغير عدة الطفرات الموجهة (Stratagene). تم التحقق من كل من يبني بواسطة التسلسل مزدوج الجديلة.

لطخة غربية وتحليل المناعية

كانت خلايا هيلا مثقف في 18 ملم coverslips إلى 80٪ confluency وعابر. مع Myc على الموسومة من النوع البري أو T325P BBS6 متحولة ناقلات التعبير مع Polyfect ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN). بعد ستة عشر ساعة ترنسفكأيشن، كانت ثابتة الخلايا في -20 درجة مئوية الميثانول، permeablized في 0.1٪ تريتون X-100، ومنعت بمحلول ملحي تريس مخزنة (TBS) تحتوي على 5.5٪ مصل الماعز. وحضنت الخلايا مع مكافحة Myc على الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (Clontech)، وغسلها في TBS، ثم حضنت مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق لاليكسا فلور 488 صبغ (المسابر الجزيئية). كانت ملطخة الخلايا مع دابي والتي شنت في إطالة Antifade كاشف (المسابر الجزيئية)، للمراقبة تحت المجهر أوليمبوس Vanox AHBS3. تم تجهيز الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج أدوبي فوتوشوب.

 

[رافت ابراهيم]

 

http://jmg.bmj.com/content/39/12/e76.full

متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، المعروف أيضا باسم متلازمة لورنس-مون بارديه-بيدل (LMBBS)، منذ فترة طويلة اعتباره شرطا مقهورة ولكن الأدلة الحديثة تشير الآن إلى نمط أكثر تعقيدا من الميراث. 1- 3 معدلات الانتشار مجموعة من 1 في 100 000-1 160 في 000، 4- 6. على الرغم من أن هناك المجتمعات التي BBS يبدو أن أكثر شيوعا نتيجة لزواج الأقارب 3، 7 BBS هو حالة وراثية غير متجانسة مع مواضع ستة جين معين إلى تاريخ: 11q13 (BBS1)، 8 16q21 (BBS2)، 9 3p12-13 (BBS3)، 10 15q23 (BBS4)، 11 2q31 (BBS5)، 12 و20p12 (BBS6 / MKKS). 13، 14 ثلاثة من هذه الجينات قد تم الآن التي تم تحديدها، BBS2، BBS4، وBBS6. 15 والنمط الظاهري من BBS يختلف من أسرة إلى أخرى وداخل الأسر، مع اختلاف فقط المظهرية خفية تتعلق جينات مختلفة تم تحديدها حتى الآن. 16، 17
وتشمل المعايير الرئيسية المقبولة لتشخيص ضمور شبكية العين، والسمنة، polydactyly، قصور الغدد التناسلية الذكور، والتخلف العقلي، والفشل الكلوي. 3 بالإضافة إلى الميزات الرئيسية، وعدد من الميزات الثانوية المرتبطة بها، بما في ذلك عصبية، والكلام، والعجز اللغوي، والصفات السلوكية ، وقد تم تحديد خلل البنية؛ شوهة الوجه، وشذوذ الأسنان. 18 وتشمل المشاكل السيارات التي تم تحديدها التأخر في اكتساب المهارات الحركية، مشية غير مستقرة، وترنح. 18 تأخر تطور اللغة في كثير من الحالات، على الرغم من أن هذا قد يكون يتناسب مع وظيفة الفكرية الشاملة، و هناك أيضا تقارير عن مشاكل في الكلام والتي تشمل صعوبات النطق وإغفال ساكن أو التشوهات، والتلفظ خنة مفرطة. 3، 4، 17- 19 وقد وصفت تأخر في النمو على نطاق واسع باعتباره سمة رئيسية من سمات BBS، مع الثلثين لثلاثة أرباع المرضى أداء في مجموعة التخلف العقلي على اختبار رسمي 4، 18، 20 (ولكن انظر الخضراء وآخرون 3 لاستثناء).
تم الإبلاغ عن اضطرابات في السلوك في بعض المرضى BBS. وتشمل السمات ذكرت عدم النضج العاطفي، ونوبات متكررة المتقلبة، السلوك غير اللائق والجرأة وعدم القدرة على التعرف على الاشارات الاجتماعية، وسطحية تؤثر. 3، 4، 18 وورد أن بعض المواد لإظهار الهوس / الميول القهري وتفضيل روتين ثابت. وقد أبلغ كل من غفلة وسهلة الانقياد، والاهتمام الذي لا يتزعزع. 18 ولكن، حتى الآن درسوا توجد دراسات منهجية النمط الظاهري السلوكي للمرضى الذين يعانون من BBS.
هناك اعتراف متزايد بأن الاضطرابات الوراثية قد يكون لها آثار معينة على السلوك. 21- 24 السلوكيات التي هي مشتركة ومحددة لاضطراب وراثي يفترض أن تشترك في الأصل الجيني الكامن وتم وصف الظواهر السلوكية. ومن المسلم به عموما أن مثل هذا السلوك لا فريدة من نوعها (ولا عالمي بالضرورة) لكل متلازمة وراثية بل أن هناك احتمال متزايد أو احتمال أن يخضع مع متلازمة سوف تظهر سلوك معين. 21، 25 وقد تم إحراز تقدم الأخيرة في توضيح من النمط الظاهري السلوكية العديد من المتلازمات الوراثية، بما في ذلك متلازمة ريت، 26، 27 متلازمة سميث Lemli-Optiz، 28 ومتلازمة FG. 29 والاعتراف الظواهر السلوكية في المتلازمات الوراثية مهم في مساعدة اعتراف سابق والتشخيص. قد يكون هذا أهمية خاصة في متلازمة مثل BBS حيث يعني معقد، وعرض متعدد الأوجه التشخيص غالبا ما يتم تأخير كبير. 18 الاعتراف الظواهر السلوكية المهم أيضا بالنسبة للإدارة الطبية والتعليمية، ويساعد في فهم الوالدين ل، والتكيف لوطفلهما.
النقاط الرئيسية

• على الرغم من الخصائص السلوكية، بما في ذلك السلوك الجرأة وعدم القدرة على التعرف على الاشارات الاجتماعية، والميول الوسواس القهري و، وقد لوحظ في المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، حتى الآن درسوا توجد دراسات منهجية النمط الظاهري السلوكية.
• الانتهاء من الآباء والأمهات من 21 طفلا مع BBS ينظر لإجراء تقييم سريري متعدد التخصصات تدابير موحدة للسلوك.
• الأطفال الذين يعانون من BBS أظهرت زيادة مستويات internalising المشاكل بما في ذلك الشعور سحب والقلق / الاكتئاب. لديهم أيضا ارتفاع مستويات الاجتماعي، والفكر، ومشاكل الانتباه. سجل أقلية كبيرة في مجموعة السريرية على مقياس من أعراض التوحد، رغم أن لا شيء تحقق معايير التشخيص السريري. وكان الأطفال أيضا ارتفعت درجات على مقياس السلوك المتكرر وذكرت الأغلبية أن يكون الهوس من قبل والديهم.
• وأشارت هذه النتائج الحاجة السريرية الكبيرة التي كانت تتم تلبيتها في كثير من الأسر. أسئلة للبحث في المستقبل تشمل ما إذا كانت التغييرات السلوك مع التقدم في السن أو يختلف وفقا لطفرة جينية.

هذه الورقة هي أول محاولة لوصف منهجية النمط الظاهري السلوكي لسلسلة من الأطفال الذين يعانون من BBS باستخدام التدابير السلوكية القياسية.
طرق

ضبط

كان ينظر إلى الأطفال في العيادة تقييم neurodisability في مستشفى جريت أورموند ستريت للأطفال NHS الثقة، لندن، المملكة المتحدة. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من لجنة مشتركة بحوث أخلاقيات مستشفى جريت أورموند ستريت للأطفال NHS الثقة ومعهد صحة الطفل.

تصميم والمشاركين

وقد تم تحديد اثنين وخمسين الأطفال مع تشخيص BBS من خلال مجموعة الدعم الأسري LMBBS وقسم علم الوراثة السريرية في مستشفى غاي في لندن، المملكة المتحدة. دعي أولياء أمور جميع الأطفال للانضمام إلى دراسة و26 وافقوا على المشاركة (50٪). شوهد واحد وعشرين طفلا (11 من الذكور و 10 من الإناث) ضمن الإطار الزمني للدراسة (40٪). لم تكن هناك بيانات متاحة لاختبار مدى تمثيل العينة ينظر مقارنة مع عينة دعوة للمشاركة. كان هناك خمسة أزواج السيب (10 طفلا) في مجموعة الدراسة. لم يكن أي من الأطفال في هذه الدراسة من زواج الأقارب. في تقييم كان الأطفال بين سن 3 سنوات 7 أشهر و 18 سنة 0 أشهر (يعني 9 سنوات 11 شهرا، SD 51 شهرا). في جميع المواد الدراسية وأكد تشخيص BBS من خلال تطبيق معايير التشخيص 3، 18 بعد أن أحيلت مع تشخيص مبدئي من قبل طبيب الأطفال المحليين.

الإجراءات

معدل الذكاء

أكملت تسعة عشر الأطفال مقياسا موحدا للاستخبارات (IQ)، ومقياس الذكاء وكسلر للأطفال (WISC-III-UK)، 30 أو كسلر مرحلة ما قبل المدرسة ومقياس أساسي للاستخبارات (WPPSI-R-UK)، 31 اعتمادا على عمر الطفل. كانت تدار نسخة شكل قصيرة من كل اختبار وكانت واسعة النطاق، اللفظي، ودرجات معدل الذكاء الأداء المؤيدة للتصنيف. سارت على الشكل شكل القصير الذي أوصت به كوفمان وآخرون 32 وشملت أوجه التشابه والحساب الاختبارات اللفظية والصورة إنجاز وكتلة تصميم اختبارات الأداء. وكان غير قادر على إكمال تقييم رسمي أصغر طفل. حاول ثلاثة أطفال آخرين فقط الاختبارات الفرعية اللفظية بسبب ضعف حدة البصر.

التدابير السلوكية

والدي كل طفل 21 الانتهاء من آخينباخ سلوك الطفل المرجعية (CBCL). 33 هذا التحقق جيدا التدابير على نطاق ومجموعة من خارجيا (على سبيل المثال، مشاكل الانتباه والعدوان) وinternalising (على سبيل المثال، والقلق، والاجتماعي، وجسدية) المشكلات السلوكية. يتم التعبير عن عشرات الموحد الى عشرات T (متوسط ​​عدد السكان 50، SD 10). يوفر مقياس العرضية قطع للحدود (> 67) ومستويات السريرية (> 70) من الاضطراب السلوكي.
الانتهاء من الآباء والأمهات أيضا الروتينات الطفولة الجرد (CRI). 34 هذه التدابير على نطاق والطقوس، التكرار، والقهري مثل السلوكيات. تتوفر فقط البيانات المعيارية على الأطفال النامية عادة حتى سن 72 شهرا. ومع ذلك، بيانات غير منشورة من عينة كبيرة من الأطفال الذين تتراوح أعمارهم بين 5-18 عاما يعانون من متلازمة برادر ويلي (ن = 75) والتوحد في مرحلة الطفولة (ن = 90) توفير البيانات المقارنة المناسبة على الأطفال من نفس العمر ومعدل الذكاء لعينة BBS.
الانتهاء اثني عشر أولياء الأمور أيضا الطفولة التوحد مقياس تصنيف (CARS). 35 هذه التدابير على نطاق والاجتماعية، والاتصالات، وضعف المتكررة المميزة من الأطفال الذين يعانون من التوحد. يوفر نطاق وقطع العرضية لغير المصابين بالتوحد (15-29)، خفيفة الى معتدلة (30-36)، وشديد (> 37) مستويات السلوك يعانون من التوحد.
باستخدام مقابلة منظم، وأيضا طلب من الآباء والأمهات بصورة منتظمة حول سلوك أنهم وجدوا إشكالية من حيث الإدارة في المنزل أو في المدرسة.

النتائج

معدل الذكاء

وكان متوسط ​​مقياس IQ كامل 65.7 (ن = 16، SD 16.2، ومجموعة 42-108)، يعني كان IQ اللفظي 66.3 (ن = 19، SD 13.5، ومجموعة 46-93)، ويعني كان IQ الأداء 65.7 (ن = 16 ، SD 21.6، تتراوح 46-127). سوى ثلاث أطفال (17.6٪) الذكاء واسعة النطاق في المدى المتوسط ​​(≥80). كان الأطفال أحد عشر الذكاء واسعة النطاق في نطاق التخلف العقلي (<70)، فإن الغالبية (ن = 10) في نطاق معتدل التخلف العقلي (50-69).

التدابير السلوكية

وتتلخص نمط درجات على CBCL في الجدول 1. من حيث السلوك خارجيا، المجموعة تعني نتيجة 53.2 (SD 10.8) وطفل واحد فقط سقطت فوق قطع لأهمية سريرية مع أي طفل إضافي تتساقط فوق قطع الشريط الحدودي إيقاف. من حيث internalising السلوك، وكانت النتيجة متوسط ​​62.8 (SD 11.2). انخفض خمسة أطفال فوق قطع لأهمية سريرية وقطع طفلين مزيد من فوق الشريط الحدودي قبالة. كان الفرق بين internalising وخارجيا السلوك كبيرا (إقران اختبار تي، تي (DF = 20) = 5.17، p <0.001). من حيث نمط درجات على سلم الدرجات الثانوي الفردية، وقد تم الحصول على درجات عالية نسبيا أيضا في المقاييس التي لا تندرج في أي من خارجيا أو عوامل internalising (مشاكل اجتماعية، ويعتقد المشاكل، مشاكل الانتباه). والجدير بالذكر، وسجل عدد قليل جدا من الأطفال في مجموعة السريري الإكلينيكي أو الشريط الحدودي على الفروع الجانبية العدوانية والانحراف.

عرض هذا الجدول:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

الجدول 1

ملخص درجات على CBCL

الانتهاء من الآباء 12 فقط CARS التدبير. وكانت النتيجة متوسط ​​28.3 (SD 8.2). وسجل اثنين من 12 طفلا (16.7٪) في نطاق التوحد خفيفة معتدلة وسجل طفلين المزيد من (16.7٪) في نطاق التوحد الشديد.
والدي كل طفل 21 الانتهاء من CRI. وكانت النتيجة متوسط ​​8.7 (SD 4.8). ويقارن هذا إلى النتيجة يعني (SD) من 7.0 (4.6) للعادة وضع 72 طفلا منذ شهر، 34 13.1 (5.1) للأطفال المصابين بمتلازمة برادر ويلي، و14،0 (4،1) للأطفال المصابين بالتوحد (شارمان وآخرون، غير منشورة البيانات).
وأظهرت المقابلات الوالدين تنظيما مزيد من الخصائص السلوكية للعينة. وذكر والدا 19 من 21 طفلا (90.5٪) أن طفلهم كان اجتماعيا وغير ناضج عاطفيا. تم الإبلاغ عن سبع عشرة أطفال (80.9٪) لديهم هواجس، 12 (57.1٪) يفضلون الروتين، 12 (57.1٪) لمثل لعب نفس اللعبة مرارا وتكرارا، وتسعة (42.9٪) لمثل جمع الأشياء، و 13 (61.9 ٪) لاجراء محادثات مع أنفسهم.

نقاش

من حيث ما إذا كان ينظر النمط الظاهري السلوكي المميز في BBS، برز عدد من النتائج المهمة المحتملة. كان المستوى العام للاضطراب السلوكي مقاسا CBCL عالية نسبيا، ما بين ربع ونصف من العينة تبين مستويات السريرية الإكلينيكية أو الشريط الحدودي اضطراب عبر الفروع الجانبية. والجدير بالذكر، ونادرا ما ذكرت مستويات السريرية للسلوك خارجيا بما في ذلك العدوان والجنوح. في المقابل، internalising المشاكل بما في ذلك سحب، جسدية، والقلق / المزاج المكتئب كانت متكررة، وكذلك مشاكل مع السلوك الاجتماعي والفكر اضطراب، والاهتمام. وهكذا، فإن الصعوبات السلوكية يتضح من الأطفال الذين يعانون من BBS تختلف عن تلك التي شوهدت في أكثر شيوعا الاضطرابات العصبية والنفسية ADHD وإجراء الفوضى. 33 على الرغم من أن العديد من فئات الأطفال معتدلا مع المعرض التخلف العقلي ارتفعت مستويات السلوك بالانزعاج على CBCL، لا internalising ولا ارتبط وخارجيا مع IQ في العينة الحالية (ص = -0.20 و r = -0.31، على التوالي، على حد سواء P> 0.10). المستويات المطلقة لاضطراب على CBCL هي مماثلة لتلك التي وجدت في عينات من الأطفال الذين يعانون من اضطرابات وراثية أخرى (على سبيل المثال، متلازمة برادر ويلي)، 36 على الرغم من أن في غيرها من المتلازمات الوراثية الاضطراب السلوكي على CBCL يبدو أن أقل شيوعا (على سبيل المثال ، VCFS). 37 والتعرف على تعريف معين نسبيا من الاضطراب السلوكي على CBCL (صورة تهيمن عليها internalising عالية والاجتماعية ويعتقد المشاكل، ولكن انخفاض مستويات خارجيا مشاكل) مهم للقضية السريرية للإدارة والمشورة للوالدين . في العينة الحالية الكثير من هذه الحاجة السريرية والتي لم تتم تلبيتها وكان عدد قليل من الأسر تلقت مساعدة الخبراء حول إدارة السلوكية.
وكانت بيانات عن السيارات المتوفرة على نصف العينة، ولكن أربعة من 12 الآباء والأمهات الذين الانتهاء من الإجراء المشار إليه قدرا كبيرا من أعراض مثل التوحد. سجل طفل واحد 45.5 على CARS، بالإضافة إلى "التوحد الشديد" مجموعة من المقياس. ومع ذلك، التقييم السريري لهذا الطفل، بما في ذلك استخدام أداة التشخيص منظم، وتشخيص التوحد المنقحة مقابلة (ADI-R) 38 أظهرت أنها لم تستوف المعايير السريرية لمرض التوحد. وسجل هذا الطفل فوق قطع على المعاملة بالمثل الاجتماعي والسلوكيات المتكررة والنمطية أبعاد أنماط ولكن ليس على البعد الاتصالات. ظهرت أي نمط ثابت من حيث CARS العناصر التي أيدها أكثر في كثير من الأحيان في العينة. وهذا هو، في حين سجل بعض الأطفال منخفضة جدا على البنود الاجتماعية وارتفاع على البنود السلوك المتكررة، وأظهر البعض الآخر النمط المعاكس.
على CRI، أظهرت العينة الحالية مستويات الروتين والطقوس زادت مقارنة بالأطفال النامية عادة (ومنهم قبل سن 72 شهرا CRI بدأت في الانخفاض)، وإن كان أقل مما كان عليه في عينات من الأطفال المصابين بمتلازمة برادر ويلي و التوحد (شارمان وآخرون، بيانات غير منشورة). صحه نشرت هذه التقارير من الهوس، والسلوك الطقسي القهري في بعض المرضى الذين يعانون من BBS. 18 وذكر الآباء أيضا مستويات عالية من تفضيل الروتين والأنشطة المماثلة وهذه لم تؤثر على الحياة الأسرية في بعض الحالات. على سبيل المثال، كان هاجس صبي واحد مع أي شيء له علاقة مع المصارعة. وقال انه تم جمعها بشكل إلزامي اللعب، والملصقات، والصور، أو أي شيء له علاقة بهذا الموضوع. وكان آخر جامدة حول توقيت وجبات الطعام، وكان أنيق بقلق شديد ومرتبة. وقال انه لا يمكن التعامل إذا كان أي شيء للخروج من المكان، وسوف تفعل سوى عدد قليل من انتقائي الألغاز مرارا وتكرارا. ومع ذلك، لم يرتبط العاهات الاجتماعية والسلوكيات المتكررة ذكرت من CARS وCRI مع IQ أو لغة القدرة داخل العينة.
ترتبط والسلوكيات النمطية بشكل عام مع IQ، وتوجد أكثر شيوعا في المتلازمات الوراثية، ولا سيما تلك التي التخلف العقلي هو شائع. 39، 40 ومع ذلك، هناك أدلة متزايدة على أن المتلازمات الوراثية يمكن أن تظهر الظواهر السلوكية المحددة، إلى جانب الطبية الأولية الخاصة والميزات التنموية. 26- 29، 37 وتشير النتائج الحالية أن مواصلة دراسة سلوك ينظر في المرضى الذين يعانون من BBS بشأنه. وتشمل الأسئلة معينة من الاهتمام كيف السلوكيات مثل تغيير مع التقدم في السن (وشملت العينة الحالية أطفال فقط) ومعدل الذكاء، وعما إذا كانت تختلف وفقا لطفرة جينية. 2 فهم النمط الظاهري السلوكي للBBS مهم أيضا لاتباع نهج شامل لإدارة وتوفير الخدمات لهؤلاء المرضى وأسرهم.
هذه الورقة هي الخطوة الأولى نحو استجلاء النمط الظاهري السلوكية في الأطفال الذين يعانون من BBS

 

[رافت ابراهيم]

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/18/7/1323.full

السمنة مشكلة صحية عامة رئيسية في معظم البلدان المتقدمة وعامل خطر رئيسي لمرض السكري وأمراض القلب والشرايين. شواهد يدل على ضعف الهدبية يمكن أن تساهم في البدانة الإنسان ولكن الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة غير معروفة. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي متلازمة السمنة الإنسان غير المتجانسة وراثيا المرتبطة اختلال وظيفي الهدبي. ويعتقد أن البروتينات BBS للعب دور في وظيفة الأهداب والخلايا الاتجار البروتين / الحويصلة. هنا، وتبين لنا أن البروتينات BBS هناك حاجة لمستقبلات هرمون الليبتين (LepR) في اشارة الى ما تحت المهاد. وجدنا أن Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران هي مقاومة لعمل هرمون الليبتين للحد من وزن الجسم وتناول الطعام بغض النظر عن مستويات اللبتين في الدم والسمنة. بالإضافة إلى ذلك، انخفض تفعيل STAT3 المهاد التي كتبها ليبتين بشكل كبير في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران. في المقابل، يشير الى المصب الميلانوكورتين مستقبلات تتأثر، مشيرا إلى أن LepR الإشارات تضعف تحديدا في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران. وارتبط ضعاف LepR يشير في BBS الفئران مع انخفاض POMC التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن البروتين BBS1 يتفاعل جسديا مع LepR وأن فقدان البروتينات BBS يشوش الاتجار LepR. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن البروتينات BBS توسط الاتجار LepR وأن يشير LepR ضعاف راء اختلال توازن الطاقة في BBS. وتمثل هذه النتائج آلية جديدة لمقاومة اللبتين والسمنة.

القسم السابق القسم التالي

مقدمة

تزايد انتشار السمنة وارتباطه مع مختلف الاضطرابات الإنسان، مثل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم قد جعل دراسة آليات التي تتحكم في توازن الطاقة أولوية عالية. العوامل البيئية والوراثية التي تسهم في البدانة "وباء" هي حاليا قيد التحقيق المكثف ولكن فهمنا للعمليات الجزيئية الخلوية والفسيولوجية التي تنظم توازن الطاقة والعيوب التي تؤدي إلى اختلال توازن الطاقة والسمنة لا تزال بعيدة عن الاكتمال. في الثدييات، يتم التحكم في وزن الجسم وتوازن الطاقة عن طريق التفاعل بين الإشارات الطرفية والدماغ، وخصوصا منطقة ما تحت المهاد (1). اللبتين هو هرمون المشتقة من خلية شحمية الذي يدور في نسبة إلى كمية الدهون في الجسم من أجل إبلاغ الدماغ عن تخزين الدهون الطرفية (2، 3). داخل النواة المقوسة من منطقة ما تحت المهاد، وهو موقع كبير للعمل هرمون الليبتين، ومن المعروف اللبتين للعمل على اثنين على الأقل من السكان العصبية: proopiomelanocortin (POMC) الخلايا العصبية، والتي يتم تفعيلها من خلال ليبتين ونيوروبيبتيدي Y (NPY) الخلايا العصبية [معربا عن المشترك آغوطي البروتين ذات الصلة ب (AgRP)]، وتحول دون اللبتين (1 - +4). في القوارض والبشر، والطفرات في الجينات التي تكود اللبتين ومستقبلات هرمون الليبتين الرصاص إلى السمنة والعقم والغدد الصماء اختلالات شديدة (2، 5).
وتشير الاكتشافات الحديثة أن الخلل الهدبية ويرتبط مع السمنة الإنسان. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب وراثي البشرية تنميط المرتبطة اختلال وظيفي الهدبي والسمنة (6، 7). حتى الآن، تم التعرف على أكثر من 12 جينات BBS وترتبط طفرات في الجينات BBS مع السمنة، polydactyly وتنكس الشبكية (6 - +8). المظاهر السريرية إضافية من BBS تشمل مرض السكري وارتفاع ضغط الدم وضعف الإدراك، وتشوهات الكلى ونقص الأعضاء التناسلية (6 - +8). على الرغم من أن تشارك البروتينات BBS في القائم أنيبيب الاتجار البروتين / الحويصلة (6، 9، 10)، لم تتميز وظيفة جزيئية دقيقة من كل من البروتين BBS. وبالمثل، فإن الآليات الفيزيولوجية المرضية التي تؤدي إلى كل عنصر من عناصر النمط الظاهري BBS غير معروفة.
في السابق، أثبتنا أن السمنة في BBS الفئران يرتبط hyperleptinemia ومقاومة اللبتين (11). ومع ذلك، منذ إنتاج هرمون الليبتين يتناسب مع كمية الدهون في الجسم، وكثيرا ما ترتبط hyperleptinemia ومقاومة اللبتين مع السمنة في النماذج الحيوانية والبشر (3، +12 - 14)، ومقاومة اللبتين في الفئران BBS يمكن أن تكون ثانوية إلى السمنة، مقارنة ليكون سببا في السمنة. هنا، تناولنا هذه المسألة، وكشف العيوب الجزيئية مما يؤدي إلى اختلال توازن الطاقة في BBS. باستخدام نموذج BBS الماوس خروج المغلوب (Bbs2 - / -) (15)، التي تلخص أهم مكونات النمط الظاهري البشري بما في ذلك السمنة، علينا أن نبرهن على البروتينات BBS مطلوبة للLepR الإشارات. أكدنا هذا مع BBS نماذج إضافية الماوس خروج المغلوب (Bbs4 - / - وBbs6 - / -) (16، 17). علينا أن نبرهن أيضا أن البروتينات BBS التفاعل بأنفسهم مع LepR والتوسط الاتجار LepR. النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن الإشارات LepR الموهنة بسبب الاتجار تغير من LepR هي السبب الرئيسي للسمنة في BBS.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

بارديه-بيدل الفئران متلازمة جود عيوب في المحور اللبتين الميلانوكورتين المهاد

لاختبار ما إذا كانت مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي الثانوية إلى السمنة، ودرسنا شهية-قمعها وآثار الخارجية ليبتين الماوس في BBS الفئران التي لديها مستويات تعميم ليبتين على تطبيع بواسطة تقييد السعرات الحرارية خفض الوزن Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - أعطيت الفئران 70-80٪ من الكريات طعام تستهلك عادة يوميا من قبل الفئران البرية من نوع الجنس والعمر المتطابقة. هذا البروتوكول تقييد السعرات الحرارية بشكل فعال منعت السمنة وانخفاض مستويات اللبتين في الدم في الفئران BBS (الشكل 1 A). في حين Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - أظهرت الفئران التي غذيت الإعلانية libitum 4-10 أضعاف أعلى مستويات اللبتين في الدم [الشكل 1 A و (11)]، ومستويات هرمون الليبتين من سعرات حرارية Bbs2 - / - Bbs4 - / - وBbs6 - / - كانت الفئران مقارنة مع البرية من نوع الحيوانات. تسببت Intracerebroventricular (ICV) إدارة يبتين انخفاضا كبيرا في تناول الطعام ووزن الجسم في البرية من نوع الفئران. في المقابل، فشلت ICV يبتين إلى الحد من الاستهلاك الغذائي ووزن الجسم في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران على الرغم من مستويات اللبتين في الدم العادية (الشكل 1 B و C). تناول الطعام تعديلها لوزن الجسم أسفرت عن نتائج مماثلة (لا تظهر البيانات). هذه النتائج تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران ليست الثانوية إلى السمنة. بدلا من ذلك، هذه النتائج تشير مقاومة اللبتين هو سبب السمنة في الفئران BBS.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الشكل 1.

بارديه-بيدل الفئران متلازمة مقاومة لهرمون الليبتين. (A) مستويات هرمون الليبتين في مصل الدم من النوع البري و(CR) Bbs2 المقيدة السعرات الحرارية - / - (2KO)، Bbs4 - / - (4KO) وBbs6 - / - (6KO) الفئران. وقد أظهرت مستوى اللبتين في الدم لتغذية الفئران عادة Bbs2 اغيا للمقارنة (ن = 4-16). (B، C) Bbs2، Bbs4 وBbs6 الفئران الخالية مع مستويات اللبتين تعميم العادية لا تزال تقاوم عمل عن زيادة الوزن والحد من الشهية اللبتين. تم قياس التغيرات في وزن الجسم وتناول الطعام 24 ساعة بعد تناوله ICV ليبتين (ن = 5-16). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران؛ † P <0.05 مقابل السيارة.

مستقبلات ميلانوكورتين، والتي هي المصب لLepR الإشارات، هي عقدة مهمة لتوازن الطاقة (1، 4). ولذلك، درسنا ما إذا كان ضعف قدرة المستقبلات ميلانوكورتين لتغيير الأيض أيضا في BBS الفئران. لهذا، نحن اختبار أثر إعطاء ICV من Melanotan الثاني (MTII)، ناهض مستقبلات ميلانوكورتين، على وزن الجسم وتناول الطعام (الشكل 2 ألف وباء). وعلى النقيض من اللبتين، وانخفاض ICV MTII تناول الطعام ووزن الجسم في كل من النوع البري وBbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، خفضت إدارة MTII الأنسجة الدهنية البنية والبيضاء في كل من السيطرة والحيوانات BBS (الشكل 2 C و D). وتشير هذه البيانات إلى أن قدرة المستقبلات ميلانوكورتين للتأثير على التمثيل الغذائي سليمة في الفئران BBS. الكمي العكسية الناسخ تفاعل البلمرة المتسلسل أظهرت (QRT-PCR) النتائج أيضا أن التعبير عن الميلانوكورتين-3 و -4 مستقبلات كان طبيعيا في BBS الفئران (المواد التكميلية، الشكل S1). جنبا إلى جنب، وهذه البيانات تشير إلى أن السمنة في الحيوانات BBS ونظرا لعيب (ق) المصب أو على مستوى LepR لكن المنبع من مستقبلات ميلانوكورتين في المحور اللبتين الميلانوكورتين المهاد.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 2.

بارديه-بيدل الفئران متلازمة هي استجابة لناهض مستقبلات ميلانوكورتين، MTII. (A-D) BBS الفئران لا يستجيب لعن زيادة الوزن، وتأثير الحد من كتلة appetite- والدهون من MTII. من النوع البري، Bbs2 - / - وBbs6 - / - تم حقن الفئران مع MTII أو مركبة، وتم قياس التغيرات في وزن الجسم وتناول الطعام بعد 24 ساعة. تم قياس البني الأنسجة الدهنية والدهون الإنجاب بعد وفاة في الفئران vehicle- أو MTII حقن (ن = 4-7). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران. † P <0.05 مقابل السيارة.

الموهنة ليبتين مستقبلات الإشارات في بارديه-بيدل الحيوانات متلازمة

لتحديد خلل محدد مما يؤدي إلى اللبتين المقاومة في الفئران BBS، درسنا التعبير ويشير قدرة الإسوي طويلة من مستقبلات هرمون الليبتين (LepRb)، وشكل الإسوي الذي يشير القدرات داخل منطقة ما تحت المهاد (18، 19). لم تتغير مستويات مرنا من LepRb في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران مقارنة مع من النوع البري الضوابط (الشكل 3 A). لدراسة ما إذا كانت قدرة الإشارات من LepRb أمر طبيعي في الفئران BBS، قارنا قدرة اللبتين لتفعيل المهاد محول الإشارات ومنشط النسخ-3 (STAT3) بين النوع البري والفئران BBS. على النحو الوارد أعلاه، تم تطبيع مستويات اللبتين في الفئران BBS بواسطة تقييد السعرات الحرارية لتجنب مقاومة اللبتين الثانوية إلى السمنة. في السيطرة على الفئران، تسببت اللبتين زيادة قوية في STAT3 الفسفرة (الشكل 3 B). ومع ذلك، تم تخفيض الناجم عن اللبتين STAT3 الفسفرة إلى حد كبير في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (إلى 17-39٪ من السيطرة) وإن كانت مستويات اللبتين في الدم طبيعية في تلك الفئران (الشكل 3 B و C). تدل هذه البيانات على أن اللبتين المقاومة في BBS الفئران سببه عدم قدرة LepR لتفعيل آلية داخل الخلايا اللاحقة المرتبطة هذا المستقبل. في الفئران السمينة التي يسببها النظام الغذائي، ويعتقد مقاومة اللبتين أن يكون بسبب زيادة في القامع للخلوى يشير 3 (Socs-3)، واحدة من الأهداف التي تحدثها STAT3 ومثبط ردود الفعل السلبية من LepR الإنذار (20، 21 ). وجدنا أن كلا مرنا (الشكل 3 D) والبروتين (الشكل 3 E) مستويات Socs-3 وانخفض في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الحيوانات، مشيرا إلى أن المقاومة اللبتين في BBS الفئران لم يكن بسبب زيادة التعبير عن Socs-3 على عكس ما لوحظ في النظام الغذائي الناجم عن نموذج السمنة. الدور المحتمل للآليات أخرى مثل البروتين التيروزين الفوسفاتيز 1B ودوري AMP استجابة البروتين 1 (Creb1) لا يزال -regulated النسخ coactivator-1 في مقاومة اللبتين المرتبطة BBS يتم تحديدها (ملزم العنصر 22، 23). كما وجدنا أن Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - زيارتها الفئران التعبير الطبيعي للSyntaxin 1 (الشكل 3 E)، الذي سبق ان عرضه إلى أن downregulated في الفئران من نقص في هرمون الليبتين (OB / OB) أو LepRb (ديسيبل / ديسيبل) (24). Synaptophysin هو علامة عموم العصبية ولم يتم تغيير مستوى له في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران، مشيرا إلى أنه لا يوجد أي خسارة جسيمة للخلايا العصبية في الفئران BBS (الشكل 3 E). باختصار، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي بسبب الإشارات LepR الموهنة في منطقة ما تحت المهاد.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 3.

ضعاف LepRb يشير في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) الفئران. مستويات (A) التعبير عن LepR مطولا (LepRb). تم قياس كميات النسبية LepRb من mRNAs التي كتبها الكمي عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (QRT-PCR) بعد التطبيع مع RPL19. تم تحديد مستويات التعبير في البرية من نوع تعسفا في 1 (ن = 6-9). تم تخفيض (B) STAT3 الفسفرة على ادارة اللبتين في الفئران BBS. وكانت الفئران BBS على النحو الوارد أعلاه لتطبيع مستويات اللبتين في الدم وحقن هرمون الليبتين المقيدة السعرات الحرارية. وقد تم تحليل مقتطفات البروتين طائي من قبل ستاندرد دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام والنشاف الغربي. (C) الكمي لSTAT3 مفسفر من البيانات المستخدمة في (B). وقد انخفض (D) Socs-3 مستوى مرنا في الفئران BBS. تم تحديد Socs-3 مستوى مرنا من قبل QRT-PCR على النحو الوارد أعلاه (ن = 4-8). (E) مستويات البروتين من Socs-3، Syntaxin1 وSynaptophysin. β-catenin كان يستخدم كعنصر تحكم التحميل. البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران.

الخلايا العصبية proopiomelanocortin المعيبة في بارديه-بيدل الحيوانات متلازمة

للحصول على مزيد من التبصر في الآليات الجزيئية والخلوية من السمنة في الحيوانات BBS، درسنا مستويات التعبير عن الجينات طائي الرئيسية المشاركة في العمل اللبتين. وتمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها السابقة (11)، ومستويات التعبير عن الجينات Agrp ونبي مشه كانت طبيعية، في حين كان مستوى التعبير عن الجينات POMC مقهم؛ مفقد الشهية أقل من ذلك بكثير في Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (الشكل مقارنة مع من النوع البري الضوابط 4 A). المقبل، ونحن اختبار ما إذا كانت الجينات مشه ومقهم؛ مفقد الشهية طائي ردت بشكل صحيح للتغيرات في توازن الطاقة المحيطية في BBS الفئران عن طريق مقارنة مستويات مرنا من هذه نيوروببتيد في الحيوانات التي تتغذى عادة و 48 ساعة صام. في البرية من نوع الفئران، زادت AgRP وNPY مرنا المستويات، وانخفضت مستويات POMC مرنا بعد الصيام (الشكل 4 B). في Bbs2 - / - وBbs4 - / -، وكانت التغيرات في مستويات AgRP وNPY مرنا في الاستجابة للصيام الفئران مماثلة لتلك التي من النوع البري الضوابط. في المقابل، كان الانخفاض الناجم عن الصيام في مستويات POMC مرنا أقل بكثير في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران بالمقارنة مع من النوع البري الضوابط (الشكل 4 B). وتشير هذه البيانات إلى أن الخلايا العصبية POMC من الفئران BBS لا تستجيب بشكل صحيح إلى تغييرات في توازن الطاقة المحيطية. وهكذا، يبدو أن الخلايا العصبية POMC أن تتأثر بشكل انتقائي في BBS الفئران المصب LepR الإشارات.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 4.

الخلايا العصبية POMC المعيبة في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) الفئران. مستويات (A) طائية من البروتين ذات الصلة آغوطي (AgRP)، نيوروبيبتيدي Y (NPY) وproopiomelanocortin (POMC) مرنا في تغذية عادة Bbs2، Bbs4 وBbs6 الفئران باطل بالمقارنة مع من النوع البري الضوابط (ن = 6-9). (B) تأثير الصيام 48 ساعة (نسبة إلى الدولة تتغذى عادة) على AgRP المهاد، NPY وPOMC مرنا المستويات في البرية من نوع، Bbs2 وBbs4 الفئران فارغة (ن = 4-5). (C) تلطيخ المناعى للخلايا العصبية POMC إيجابية. أقسام الاكليلية من النوع البري، Bbs2 - / - (2KO) وBbs6 - / - كانت ملطخة (6KO) أدمغة مع أضداد POMC وتظهر المقاطع التمثيلية. (D) متوسط ​​عدد الخلايا العصبية POMC إيجابية في النواة المقوسة. احصي الخلايا POMC إيجابية في خمسة أقسام داخل موقف مماثل من كل حيوان ويظهر متوسط ​​عدد الخلايا العصبية POMC في نصف الكرة الأرضية (ن = 3-4). البيانات يعني ± SEM. * P <0.05 مقارنة مع البرية من نوع الفئران.

لاختبار ما إذا كان الانخفاض في عدد الخلايا العصبية POMC قد يكون الخلل الرئيسي في الفئران BBS، قارنا عدد هذه الخلايا العصبية في النواة المقوسة طائي بين النوع البري والفئران BBS. وكشفت النتائج المناعية أن هناك انخفاض طفيف (حوالي 20٪) في الخلايا POMC إيجابية في Bbs2 - / - وBbs6 - / - الحيوانات (الشكل 4 C و D). ومع ذلك، هذا الانخفاض في الخلايا العصبية POMC لا يمكن أن يفسر تخفيض حوالي 40٪ في POMC التعبير الجيني أو الانخفاض أكثر من 60٪ في STAT3 الفسفرة. بالإضافة إلى ذلك، كان المناعية من POMC في الحيوانات BBS في كثير من الأحيان ضعيف (وهو ما يتسق مع مستويات أقل من POMC مرنا) مما يشير إلى أن عدد الخلايا العصبية POMC يمكن الاستهانة بها في الفئران BBS. جنبا إلى جنب مع الكيمياء الحيوية والتعبير الجيني بياناتنا، فإن هذه النتائج تشير إلى أن مقاومة اللبتين في BBS الفئران هي في معظمها بسبب الموهنة يشير LepR.

بارديه-بيدل البروتينات متلازمة تتفاعل مع LepRb وتوسط الاتجار LepRb

مؤخرا، تبين أن سبعة البروتينات BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9) تشكل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome (9). ويقترح هذا المجمع كوحدة وظيفية التي تتوسط الاتجار البروتين / الحويصلة إلى أهداب. نحن افترض أن بعض مفارز BBSome قد تتفاعل مع LepRb و / أو STAT3 للتوسط الاتجار بهم. لافت للنظر، وجدنا أن البروتين BBS1 تفاعل تحديدا مع LepRb في ترنسفكأيشن وشارك في مناعي المقايسات عابرة (الشكل 5 A). لم تظهر أي مفارز BBSome أخرى التفاعل مع LepRb. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التفاعل بين BBS1 وLepR محددة لشكل الإسوي إشارات من المستقبلات، LepRb، لأن الإسوي غير إشارة، LEPRA، لم تتفاعل مع BBS1 (الشكل 5 B). واتساقا مع ذلك، وجدنا أن المجال-C محطة حشوية من LepRb، والتي هي فريدة من نوعها لLepRb، كان كافيا للتفاعل مع BBS1 (الشكل 5 C). نحن لم يكشف عن أي تفاعل بين STAT3 وBBS البروتينات (لا تظهر البيانات). طفرة BBS1 M390R، وهو تحور الأكثر شيوعا وجدت في المرضى الذين يعانون BBS البشري وكافية للحث على الظواهر BBS بما في ذلك السمنة في نموذج الفأر المغلوب في (25)، تقلص إلى حد كبير على قدرة BBS1 للتفاعل مع LepRb (الشكل 5 د). متحولة BBS1 M390R كما أظهرت انخفض التفاعل مع LepRb مجال حشوية (الشكل 5 C). لاختبار ما إذا كان التفاعل بين BBS1 وLepRb يحدث في الخلايا الحية، ونحن transfected ARPE 19 الخلايا مع BBS1 إما وحدها أو مع LepRb. وجدنا أنه على الرغم من الكشف عن البروتينات BBS1 overexpressed في جميع أنحاء السيتوبلازم، وشارك في ترنسفكأيشن من LepRb مع المقيدة BBS1 BBS1 توطين لينقط صغيرة في ARPE 19 الخلايا (المواد التكميلية، الشكل S2)، ودعم التفاعل المادي للLepR مع BBS1. وإجمالا، فإن هذه النتائج تشير إلى أن LepRb يمكن أن تترافق مع الوحيدات BBS1 من BBSome.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 5.

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) البروتينات تتوسط الاتجار LepRb. (A) تفاعل BBS1 مع LepRb. البروتينات BBS HA الموسومة (BBS1-5 و7-9) وعابر. مع LepRb وتم فحص التفاعلات التي كتبها المقايسات المشترك مناعي الموسومة FLAG. وقد أظهرت مستويات التعبير من كل من البروتين BBS وLepRb في لست] في لوحات أسفل والمتوسطة، على التوالي. وقد أظهرت LepRb-immunoprecipitated شارك في اللوحة العلوية. IP، مناعي. IB، immunoblotting. (ب) يشير الإسوي من LepR، LepRb، ولكن ليس الإسوي قصيرة LEPRA، يتفاعل مع BBS1. مجال حشوية (C) C-محطة من LepRb (LepRb خلوي) غير كافية للتفاعل مع BBS1. وقد استخدم MYC-GFP بمثابة سيطرة سلبية. (D) BBS1 M390R طفرة يعطل التفاعل BBS1-LepRb. الآخرين هي نفسها كما في (A).

وأخيرا، نحن اختبار ما إذا تم تغيير الاتجار LepRb في غياب البروتينات BBSome. بما يتفق مع الدراسات السابقة للتوطين LepR (26، 27)، وقد وجد معظم LepRb مناعية في شبكة -Golgi العابرة (TGN) والحويصلات الصغيرة، وتم الكشف فقط على مستوى منخفض جدا من LepRb في غشاء البلازما ( الشكل 6 ألف والتكميلية المواد، الشكل S3). وكانت بعض حويصلات صغيرة تظهر مناعية لLepRb إيجابية لTGN46، علامة لالحويصلات بعد جولجي، وكذلك TGN (28)، مما يشير إلى أن هذه الحويصلات هي في الطريق أو إعادة التدوير الإندوسومات إفرازية. تم العثور على جزء من LepRb أيضا في الإندوسومات في وقت مبكر كما تميزت EEA1 (المواد التكميلية، الشكل S3) (29). عندما المنضب البروتين BBS1 التي تدخل RNA shRNA بوساطة (. المواد التكميلية، الشكل S4)، فقد وجد LepRb في حويصلات كبيرة بشكل غير طبيعي بالقرب من النواة (حوالي 7٪ من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل؛ الشكل 6). وجدنا mistrafficking مماثلة من LepRb عندما المنضب البروتين BBS2 (الشكل 6)، مشيرا إلى أن شرط البروتينات BBS للاتجار LepRb لا يقتصر على BBS1. وتشير هذه البيانات إلى أن البروتينات BBS مطلوبة من أجل الاتجار السليم للLepRb على الأرجح بين جولجي والهدبية و / أو غشاء البلازما.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 6.

متلازمة بارديه-بيدل مطلوبة (BBS) البروتينات للاتجار LepRb. (A) التعديلات للاتجار LepRb في BBS1- والخلايا المنضب BBS2. و transfected ARPE 19 الخلايا مع FLAG-LepRb جنبا إلى جنب مع تدافعت (السيطرة)، BBS1 أو BBS2 رني يبني. تم بحثها توطين LepRb (الخضراء) وTGN46 (الأحمر) بواسطة المجهر المناعي غير المباشر. وترد، الصور المدمجة مع تلوين دابي (نواة الأزرق). (أشرطة مقياس: 10 ميكرون). (B) النسبة المئوية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل (يحدده FLAG المناعي) مع حويصلات كبيرة. القيم هي متوسط ​​من ثلاث تجارب وأحصت ما لا يقل عن 120 الخلايا في كل تجربة. البيانات يعني ± SEM.

القسم السابق القسم التالي

نقاش

قد تورطت البروتينات BBS في الاتجار البروتين / حويصلة على طول أنيبيب (9، 10). ولكن، كيف يرتبط هذا الوظيفة العامة مع المكونات الفردية من النمط الظاهري BBS لم يكن معروفا. وتقدم هذه الدراسة الآلية الفيزيولوجية المرضية للسمنة في BBS على المستوى الجزيئي. دراستنا تقدم دليلا على أن مقاومة اللبتين الناجمة عن الشاذة الاتجار LepR والموهن LepR يشير في منطقة ما تحت المهاد هو سبب السمنة المرتبطة BBS. علينا أن نبرهن على القضاء على السمنة وhyperleptinemia لا يستعيد حساسية هرمون الليبتين في الفئران BBS، مشيرا إلى أن المقاومة اللبتين هو الجوهرية بدلا من الثانوية إلى hyperleptinemia والسمنة. علينا أن نبرهن أيضا أن البروتين BBS1 يتفاعل جسديا مع الإسوي إشارات من LepR، LepRb وأن البروتينات BBS مطلوبة للاتجار السليم للLepRb.
وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن البروتينات BBS توسط الاتجار LepRb بين جولجي ومناطق محددة من غشاء البلازما (مثل الدهون طوف، الغشاء الهدبي). في غياب البروتينات BBS، منزعجة الاتجار LepRb والموهن LepRb الإشارات. وهذا يتفق مع النتائج السابقة أن البروتينات BBS ضرورية لتوطين G مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs) لأهداب الخلايا العصبية (30). على الرغم من أننا اختبار العديد من الأجسام المضادة ضد LepR، لم نكن قادرين على كشف LepRb في شرائح مخ الفأر. قد يكون هذا بسبب انخفاض مستوى سطح التعبير ودوران سريع للLepRb (26، 27). ومع ذلك، فقد تم العثور على LepRb في هدب من الخلايا الظهارية حاسة الشم (31)، مما يوحي بأن LepRb قد حصر إلى هدب من الخلايا العصبية المهاد.
من مفارز BBSome أظهرت BBS1 فقط التفاعل الجسدي مع LepRb. أثبتنا سابقا أن BBS1 أيضا تفاعلت مع Rabin8، وهو عامل الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP لRab8 (9). هذه الملاحظات تثير احتمال أن BBS1 هو الوحيدات ملزم البضائع من BBSome. وبالتالي، فإنه من مصلحة لاختبار ما إذا كان GPCRs mislocalized في BBS الخلايا العصبية متحولة (على سبيل المثال Sstr3 وMchr1) تتفاعل أيضا مع BBS1 (30). خلايا ومع ذلك، عيوب الاتجار LepRb المماثلة الملحوظة في BBS2 المنضب وعدم وجود ارتباط الوراثي، النمط الظاهري واضح بين مختلف الطفرات BBS تشير إلى أن سلامة BBSome مهمة لوظيفتها في الاتجار وأن فقدان أي مفارز BBSome يمكن أن تؤدي إلى نفس النمط الظاهري (mistrafficking من البضائع).
ومن المثير للاهتمام، في BBS الحيوانات فقدان وظيفة LepRb يبدو أن تكون انتقائية. في الواقع، على الرغم من أن التعبير عن Agrp، نبي وPOMC تنظم وقبل كل شيء ليبتين (1)، تأثر فقط التعبير الجيني POMC في الفئران BBS. وهكذا، تظهر فقدان العمل ليبتين أن يقتصر على الخلايا العصبية POMC. الاجتثاث الجيني للLepRb تحديدا في الخلايا العصبية POMC يؤدي إلى فرط الأكل وزيادة كتلة الدهون في الفئران (32، 33). في الفئران BBS، الموهن LepRb يشير في الخلايا العصبية POMC يرجح السبب الرئيسي للسمنة. هذه النتائج متسقة مع النتائج الأخيرة التي دافنبورت وآخرون. (34) تبين أن تعطل بروتينات النقل intraflagellar، Tg737 أو Kif3a، وهي مطلوبة لتكون الأهداب، وتحديدا في الخلايا العصبية أسفرت POMC في فرط الأكل والبدانة لدى الفئران. وبالإضافة إلى ذلك، في حين أن الفئران BBS مقاومة لعمل هرمون الليبتين في خفض وزن الجسم وتناول الطعام، لديهم متعاطفة / استجابة القلب والأوعية الدموية الحفاظ على ليبتين (11)، ودعم الفقدان الانتقائي وظيفة LepRb في الفئران BBS. في الواقع، لم تلغ اللبتين إشارات تماما في BBS الفئران. جزء من الإشارات LepRb موجود كما هو مبين من خلال تفعيل STAT3 المتبقية بعد العلاج ليبتين. وهكذا، يبدو أن البروتينات BBS لازما ل"فعالة" يشير LepRb، وهو أمر ضروري للسيطرة على سلوك التغذية، في حين أن مستوى "منخفض" من LepRb الإشارات ما زالت transduced في غياب البروتينات BBS وهذا المستوى من الإشارات غير كافية لزيادة متعاطفة النشاط العصبي وضغط الدم. توطين LepRb إلى مجال محدد في غشاء البلازما قد تكون هناك حاجة لهذا يشير الى "فعالة"، في حين LepRb في أماكن أخرى من غشاء البلازما قد تكون كافية لتنبيغ مستوى "منخفض" للإشارة. بدلا من ذلك، شرط البروتينات BBS في إشارة LepRb قد تكون محددة لبعض أنواع الخلايا و / أو مؤثرات المصب. هذه هي الأسئلة المهمة التي تستدعي إجراء المزيد من الدراسات.
في البشر، وقد تم الإبلاغ عن المتغيرات من BBS2، BBS4 وBBS6 الجينات لتترافق مع السمنة في الأفراد BBS غير (35). في الواقع، كان مرتبطا البديل في الجين BBS2 إلى السمنة الكبار المشتركة، وارتبطت الأشكال في BBS4 وBBS6 الجينات مع البدانة في مرحلة الطفولة المبكرة الحدوث المشتركة والشائعة السمنة المرضية الكبار. إذا كانت المتغيرات محددة من الجينات المرتبطة بالسمنة BBS مشتركة تؤثر إشارات LepRb و / أو الاتجار يزال يتعين تحديد.
باختصار، حددنا عيب معين أن تمثل البدانة في نماذج الماوس من BBS. النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن mistrafficking ويشير الموهنة للLepRb هو السبب الرئيسي لاختلال توازن الطاقة مما يؤدي إلى السمنة في BBS. ويمثل هذا العيب آلية المرضية جديدة للمقاومة اللبتين مع الآثار المحتملة للسمنة الإنسانية المشتركة.

القسم السابق القسم التالي

المواد والأساليب

للحصول على وصف مفصل للمواد وطرق، الرجاء الاطلاع على المواد التكميلية، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الوراثة الجزيئية البشرية.
الحيوانات

جيل من Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - وصفت الفئران والتنميط الجيني سابقا (- / +15 - +17). وافقت جامعة أيوا جنة البحوث الحيوانية كافة البروتوكولات.

اللبتين التطبيع / دراسة مقاومة اللبتين

وتم إيواء الضوابط حسب نوع الجنس والعمر المتطابقة والفئران BBS في أقفاص الفردية في 6-8 أسابيع من العمر Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - أعطيت الحيوانات 70-80٪ من المواد الغذائية التي يستهلكها wild- نوع يتحكم كل يوم حتى اليوم قبل العلاج ليبتين. وتم تجهيز الحيوانات مع ICV حقنة عادية كما هو موضح سابقا (36). مركبة أو ليبتين الماوس المؤتلف (2 ميكروغرام في 1 ميكرولتر، أنظمة R & D، مينيابوليس، مينيسوتا) تم حقن ICV. تم التضحية الفئران 24 ساعة بعد تناوله ICV اللبتين، وتم قياس كمية الغذاء ووزن الجسم. لSTAT3 تحليل الفسفرة، تمت إزالة الطعام 18 ساعة قبل حقن ICV. تم حقن هرمون الليبتين أو مركبة ICV والحيوانات التضحية في وقت لاحق 2 ساعة قبل CO 2 الاختناق. الوطاء تم تشريح بسرعة والمتجانس في المخزن المؤقت تحلل. تم تحميل مقتطفات من البروتين على 4-12٪ NuPAGE مكرر تريس المواد الهلامية وتحليلها بواسطة immunoblotting.

دراسة MTII

حسب نوع الجنس والعمر المتطابقة الضوابط من النوع البري وBbs2 - / - وBbs6 - / - تم إيواء الحيوانات في أقفاص الفردية في 9-13 أسابيع من العمر مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. بعد أسبوعين، تم زرع الفئران مع ICV حقنة عادية كما هو موضح أعلاه. تم قياس وزن الجسم وتناول الطعام يوميا لمدة أربعة أيام متتالية قبل الحقن ICV وتستخدم القيم الأساسية. لكل الوراثي، والفئران التي عولجت مع مركبة أو MTII والمطابقة الوزن. تم التضحية الحيوانات 24 ساعة بعد MTII (1 ميكروغرام في 1 ميكرولتر؛ فينيكس الصيدلة شركة، بورلنجام، CA) أو الحقن المركبة CO 2 الخنق، ووزن الجسم، واستهلاك الغذاء وأوزان البني الأنسجة الدهنية والدهون الإنجاب كما تم قياس موضح سابقا (11، 25، 36).

استخراج الحمض النووي الريبي والكمي عكس الناسخ، البلمرة سلسلة من ردود الفعل

تم استخراج الحمض النووي الريبي من الماوس الوطاء باستخدام TRIzol الكاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). تم تصنيعه DNA مكملة من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع وتستخدم لQPCR مع معدل الذكاء SYBR الخضراء Supermix (بيو راد، هرقل، CA) وMx3000P نظام QPCR (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا). تم احتساب النسبي التعبير الجيني من خلال طريقة ΔΔCt التالية التطبيع مع RPL19 (37). وتأكدت المنتجات PCR من خلال تحليل تذوب منحنى والتسلسل. وتظهر تسلسل التمهيدي في التكميلية مادة النص.

المناعية

تم perfused الفئران مع بارافورمالدهيد 4٪ / 0.5٪ غلوتارالدهيد في الفوسفات مخزنة المالحة (2.5 مل / دقيقة، 50 مل). وقد اقتطعت الدماغ كله والمحتضنة في نفس ليلة وضحاها تثبيتي في 4 ° C ثم نقل إلى 30٪ محلول السكروز. تم العقول مقطوع vibratome مع 45 ميكرون سمك. تم permeabilized أقسام التعويم الحر في المياه المالحة الفوسفات مخزنة مع 0.25٪ تريتون X-100 (0.25٪ تريتون X-100)، سدت 3٪ مصل الماعز العادي ومزينة أرنب الأجسام المضادة لمكافحة POMC (1: 4000)، الماعز البيروكسيديز مفتش المضادة للأرنب (1: 200) وVectastain النخبة ABC مجموعة (المتجهات مختبرات، بورلنجام، CA).

ترنسفكأيشن وشارك في مناعي

و transfected الخلايا HEK293T في لوحات ستة جيدا مع 1 ميكروغرام من CS2FLAG-LepR و1 ميكروغرام من أشار HA الموسومة البروتينات BBS باستخدام FuGENE HD (روش العلوم التطبيقية، انديانابوليس، IN). تم immunoprecipitated لست] الخلية مع مكافحة Myc على (9E10، سانتا كروز، سانتا كروز، كاليفورنيا) أو مكافحة HA (F-7؛ سانتا كروز، سانتا كروز، كاليفورنيا) الأجسام المضادة مترافق إلى الاغاروز. وقد تم تحليل البروتينات التي عجلت القياسية دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام وimmunoblotting.

المناعي

وكانت المصنفة ARPE 19 الخلايا على الزجاج زلات غطاء في 24 لوحات جيدا ومع transfected جميع 1 ميكروغرام من الحمض النووي باستخدام FuGENE HD (روش، انديانابوليس، IN). تم إصلاح الخلايا مع الميثانول لمدة 6 دقائق في -20 درجة مئوية، ومنعت مع 5٪ BSA و 3٪ مصل الماعز العادي وزينت مع الأجسام المضادة الأولية المشار إليها. واستخدمت اليكسا الدقيق 488 الماعز المضادة للماوس مفتش (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا) واليكسا الدقيق 568 الماعز المضادة للأرنب مفتش (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا) للكشف عن الأجسام المضادة الأولية.

التحليل الاحصائي

وأعرب عن النتائج كما يعني ± SEM. تم إجراء مقارنات بين المجموعات عن طريق باتجاه واحد أو تحليل التباين الثنائي (ANOVA) مع طريقة فيشر LSD التحليل البعدي للمقارنات متعددة البشرى، حسب الاقتضاء. P <0.05 اعتبرت أن تكون ذات دلالة إحصائية.

 

[رافت ابراهيم]

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/23/20/5441.full

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) وراثي جسمي مرض الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) هما ciliopathies متميزة وراثيا ولكنها تشترك الظواهر الشائعة مثل الكيسات الكلوية. سبعة البروتينات BBS شكل مجمع يسمى BBSome التي يتم ترجمتها في الجسم الهدبي أو القاعدية الخيط المحوري وينظم دخول الهدبية أو الخروج سوطي من عدة جزيئات الإشارة. هنا، علينا أن نظهر أنه، على خلاف سبعة تمتد السوماتوستاتين مستقبلات 3 أو مستقبلات هرمون الليبتين الذي يتفاعل مع جميع مفارز من BBSome، البروتين ADPKD polycystin-1 (PC1) يتفاعل مع BBS1، BBS4، BBS5 وBBS8، وأربعة من السبعة مكونات BBSome. فقط نضوب أو تحور BBS1، ولكن ليس استنزاف BBS5 وBBS8، أو خروج المغلوب من BBS4، يضعف الاتجار الهدبية من PC1 في الخلايا الظهارية في الكلى. نضوب هذه BBS البروتينات يؤثر لا على طول الهدبية ولا غشاء البلازما استهداف PC1. التعبير عن BBS3 الممرضة / Arl6 متحولة (T31R) ان اقفال Arl6 في شكل الناتج المحلي الإجمالي يؤدي إلى أهداب التقزم وتثبيط PC1 على أهداب الابتدائي. نقترح أن 11 تمتد بروتين الغشاء PC1 هو شحنة BBSome وأن مكونات BBSome قد تمتلك وظائف فرعية محددة. وعلاوة على ذلك، والتفاعلات الفيزيائية بين BBS وADPKD البروتينات قد تبرز الظواهر الكلى المتداخلة في هذين المرضين.

القسم السابق القسم التالي

مقدمة

أهداب الابتدائية ضئيلة، يشبه الشعر العضيات الحسية إسقاط من السطح القمي معظم الخلايا. متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب المتنحية غير المتجانسة وراثيا من أهداب الابتدائي. يتميز BBS أساسا من السمنة، وتنكس الشبكية وضعف الإدراك، polydactyly، قصور الغدد التناسلية والعجز الكلوي بما في ذلك الكيسات الكلوية (1). على الرغم من أن تم تحديد 19 جينات BBS حتى الآن، ليست مفهومة تماما الوظائف الخلوية الدقيقة لهذه البروتينات BBS. وأفيد أن تشارك بعض البروتينات BBS في مجال النقل داخل الخلايا (2، 3) والنقل intraflagellar (4). اكتشفت الدراسات البيوكيميائية وBBSome، وهو بروتين معقد تجميعها من قبل سبعة من البروتينات BBS بما في ذلك BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9 (5). وBBSome يموضع وظائف في الجسم الهدبي أو القاعدية الخيط المحوري وتتفاعل مع عامل Rab8 GTPase-تبادل، Rabin8، وتسهيل دخول Rab8 في أهداب الابتدائي في BBS3 (Arl6) التي تعتمد على -GTP الطريقة. هذه العملية ينظم دخول الهدبية من جزيئات الإنذار (6، 7)، وأظهرت الحرجة لتكون الأهداب (8). بالإضافة إلى دخول البروتين الهدبية، BBSome يتحكم أيضا في خروج سوطي من البروتينات مما يشير إلى مثل فسفوليباز D نوع ج في كلاميدوموناس reinhardtii (9).
وراثي جسمي مرض تكيس الكلى (ADPKD) (10)، مما يؤثر على أكثر من 12 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، وتتميز التطوير التدريجي للالخراجات مبطنة الظهارية ومملوءة بسائل في الكلى مختلف شرائح أنبوبي (11). وينظر أيضا الكبد والبنكرياس الكيسي. الطفرات في اثنين من الجينات PKD1 (12، 13) وPKD2 (14)، ترميز على التوالي polycystin-1 (PC1) وpolycystin 2 (PC2)، تمثل ~85 و~15٪ من الحالات ADPKD. حتى الآن، وPC1 PC2 قد تورطت في تحوير عدد من الأحداث الخلوية مثل الكالسيوم 2+ الإشارات (15، 16)، JAK-STAT (17)، mTOR س (18)، AMP الحلقي (19)، الكنسي WNT (20 )، ID2 (21)، الخلية القطبية مستو (22)، cMET (23)، STAT3 (24)، PI3 / AKT (25)، اليشم-1 (26 مستقبلات)، إلى جانب البروتين G (GPCR) (27)، ابيديرمي epidermal عامل النمو مستقبلات (28، 29)، وكذلك توطين ونشاط الكيسي منظم تليف الغشاء تصرف (CFTR) (30، 31). كيف تعدل polycystins هذه المسارات لا يزال بعيد المنال. على الرغم من PC1 وPC2 تم الإبلاغ عن حصر للمواقع التحت خلوية متعددة (15، +32 - 34)، وقد تورط في هدب الأساسي باعتباره عضية الرئيسية لوظيفة polycystin والتسبب في ADPKD (15، 35). PC1 PC2 وتشكيل مجمع مستقبلات القنوات في هدب الابتدائي ودورها في transducing وخارج الخلية السوائل إجهاد القص تدفق الكالسيوم إلى 2+ إشارة في هذا الموقع قد يكون العيب الأساسي في ADPKD (10). كما تم اقتراح دور حسي كيميائي لPC1 وPC2 (36). توضيح من شبكة التفاعل polycystin هي طريقة واحدة لتحديد الأحداث القريبة في شبكات البيوكيميائية المعقدة للpolycystins وتسهيل التصميم الرشيد وتقييم العلاجات لADPKD.
من خلال الشاشة مشاركات باستخدام PC1 ذيل-C محطة كطعم، حددنا BBS8، وهو مكون من BBSome للتفاعل جسديا مع ADPKD. من خلال إنشاء نظام التعبير عن كامل طول PC1 وضربة قاضية lentiviral الفردية الجينات BBS، ونحن أيضا أنه PC1 يتفاعل مع أربعة من عناصر سبعة من BBSome وأن توطين الهدبية من PC1 يمكن تنظيمها من قبل عناصر محددة من BBSome. وجدنا أن BBS1، جين رئيسي BBS، مهم لإيصال الفعال للPC1 لأهداب ولكن ليس لغشاء البلازما. إعادة التعبير عن النوع البري لكنها ليست الإنقاذ BBS1 متحولة الاتجار الإمراض PC1 الهدبية. تعبير عن شكل متحولة المهيمنة السلبية المسببة للأمراض من BBS3 يؤثر أيضا PC1 الهدبية الترجمة. لأن كلا ADPKD وBBS المرضى من الكيسات الكلوية، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن التفاعلات الفيزيائية بين PC1 والبروتينات BBS قد تبرز الظواهر الكلى متداخلة في BBS وADPKD.

القسم السابق القسم التالي

النتائج

BBS8 وثلاث مفارز أخرى من BBSome تتفاعل مع PC1

لتحديد شبكة التفاعل من PC1، نحن فحص مكتبة الكلى الجنين البشري باستخدام الخميرة نظام هجين اثنين مع الذيل 198 الأحماض الأمينية حشوية (4106-4303) من PC1 الإنسان كطعم. BBS8، أول بروتين BBS التي تم تحديدها لربط ضعف الجسم القاعدية لقضية BBS (37) وأصبح لدينا شريك فوري ملزم مرشح العلوي من PC1 البشري. BBS8 يشفر بروتين مع تكرار tetratricopeptide متعددة (TPRs) وهي من بين البروتينات BBS السبع التي تشكل مجمع BBSome في الجسم القاعدية (8، 37). جزء من BBS8 معزولة عن مكتبة بترميز الببتيد من الأحماض الأمينية 281 إلى نهاية البروتين، الأحماض الأمينية 593.
لتأكيد هذا التفاعل في خلايا الثدييات، أجرينا شارك في مناعي في الخلايا HEK293 مع transfected الموسومة MYC على حد سواء BBS8 وHA الموسومة PC1-C محطة ذيل حشوية (PC1-CTT). وقد شارك immunoprecipitated-BBS8 مع PC1-CTT في هذه الخلايا (الشكل 1 A). في المقابل، في HEK293 المحللة الخلية مع transfected BBS8 وحده، وعجلت لا BBS8 من الأجسام المضادة لمكافحة HA، مما يدل على خصوصية التفاعل BBS8-PC1-CTT.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الشكل 1.

يتفاعل مع PC1 BBS8 وعدة مفارز BBSome أخرى. (A) التحقق من BBS8 كشريك التفاعل من PC1 في الخلايا HEK293. و transfected الخلايا مع BBS8-MYC وحدها أو BBS8-MYC بالإضافة إلى PC1-CTT-HA. تم immunoprecipitated لست] الخلية مع الأجسام المضادة ضد HA. تم الكشف عن BBS8-MYC (~63 كيلو دالتون، السهم) مع الأجسام المضادة ضد MYC. وimmunoprecipitated BBS8-MYC فقط في وجود PC1-CTT-HA. واستخدمت واحدة العشرين من الخلية لست] كإدخال. (B) PC1-CTT يتفاعل بشكل خاص مع BBS1، 4، 5 و 8. GST وPC1 C-ذيل تنصهر مع ضريبة السلع والخدمات (GST-PC1-CTT) استخدمت حبات لهدم كل من مفارز سبعة من BBSome بالإضافة إلى BBS3 أعربت في HEK293 الخلايا. استخدمت واحدة العشرين من الخلية لست] كمدخل لكل فحص المنسدلة. وقد نشف البروتينات BBS مع الأجسام المضادة ضد HA. جرى التحقيق (C) البقع أيضا مع الأجسام المضادة ضد GST. وتم قياس كمية كمية البروتينات BBS التي استولت عليها GST-PC1-CTT والمدخلات التي كتبها صورة J البرمجيات ونسبة البروتين القبض على مقابل وإدخال مؤامرة مع BBS1 لتعيين 100٪.

لتحديد ما إذا كانت مفارز أخرى من مجمع BBSome قادرة على ربط PC1، أجريت الجلوتاثيون S -transferase (GST) التجارب المنسدلة باستخدام GST-PC1-CTT البروتين الانصهار وخلية 293T لست] مع transfected كل من السبع التي تتألف منها البروتينات BBS BBSome (BBS1، 2، 4، 5 و 7 و 9)، وكذلك BBS3 / Arl6، وGTPase صغير بالغ الأهمية من أجل وظيفة BBSome. ومن المثير للاهتمام، بالإضافة إلى BBS8، تتفاعل على PC1-CTT أيضا مع BBS1 و 4 و 5 (الشكل 1 B).

إنشاء نموذج خلية لدراسة الاتجار الهدبية من PC1

الجمعية الفيزيائية بين PC1 ومفارز من BBSome دفعتنا لاستكشاف نتيجة الوظيفية لهذا التفاعل. تورط BBSome مجمع في استيراد عدة GPCRs سبعة تمتد (6، 38) ويبتين مستقبلات فترة واحدة في هدب من خلايا الثدييات وتصدير البروتينات مما يشير محددة من سياط من كلاميدوموناس reinhardtii (9). ولذلك، فإننا نهدف إلى دراسة دور مكونات BBSome في توطين الهدبية من PC1 والذي يعرف لدينا 11 المجالات عبر الغشاء. قدمنا ​​مجموعة من N-عضال و / أو بالطول بنيات الماوس PC1 C-عضال الموسومة (المواد التكميلية، الشكل S1 A). أدخلنا تعزيز الأصفر البروتين الفلوري (YFP) بعد مخلفات 34 الأولى المصب من الببتيد إشارة توقع و / أو علامة HA الثلاثي، وهو AviTag أو تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) إلى C-محطة من كامل طول PC1 . التعبير عن YFP-PC1 يبني هو تصور بسهولة باستخدام المجهر مضان في الخلايا HEK293 (المواد التكميلية، الشكل S1 B) وإن لم يكن في النخاع الداخلي جمع القناة 3 (IMCD3) خلايا الظهارية (المواد التكميلية، الشكل S1 C) نظرا ل انخفاض مستوى التعبير (التكميلي المواد، الشكل S1 D)، على غرار PC1-EGFP (لا تظهر البيانات). التعبير عن YFP-PC1-AviTag (YPC1A) يعزز tubulogenesis الخلايا IMCD3 (المواد التكميلية، الشكل S1 E)، بما يتفق مع دور ذكرت سابقا من PC1 في هذه العملية (39). باستخدام GFP أو HA العلامة الأجسام المضادة التي تعترف إما YFP / GFP أو علامة HA، والتعبير عن المؤتلف كامل طول PC1 هو كشفها بسهولة على أهداب الأساسي للخلايا IMCD3 (المواد التكميلية، الشكل S2 A). منذ يتعرض N-محطة من PC1 إلى الفضاء خارج الخلية، والتعبير سطح الخلية من YFP-PC1 يمكن تصور بوصف مباشر من الخلايا الحية مع الأجسام المضادة ضد GFP دون إجراءات تثبيت أو permeabilization. وينظر الهدبية التعبير عن YFP-PC1 في كل الخلايا المهدبة IMCD3 أن التعبير عن ثابت كامل طول PC1 (المواد التكميلية، الشكل S2 B).

يتأثر توطين الهدبية من PC1 بسبب نقص BBS1، ولكن ليس BBS5، BBS8 أو BBS4

نحن بعد ذلك حاول أن تستنفد BBS1، 4 و 5 و 8، ومفارز BBSome التي تم سحبها بنسبة PC1-CTT في الخلايا IMCD3 بواسطة lentiviral shRNA. باستثناء BBS4، كنا قادرين على تحقيق> 70٪ ضربة قاضية كفاءة تقييمها من قبل الكمي عكس سلسلة الناسخ-تفاعل البلمرة (RT-PCR) (التكميلية المواد، الشكل S3 A). وأكد ضربة قاضية من BBS8 أيضا في مستوى البروتين عن طريق التحليل الغربي (التكميلي المواد، الشكل S3 B و C)، كما كنا قادرين على الحصول على الضد العمل. استنزاف BBS1 أو 5 أو 8 لا تؤثر على عدد الهدبية ولا طول في IMCD3 الخلايا (المواد التكميلية، الشكل S3 D)، مما أدى إلى متوسط ​​طول هدب عند 4.2 ميكرون (التكميلي المواد، الشكل S3 E) ومعدل ciliation من 60٪ (المواد التكميلية، الشكل S3 F). لأن أيا من المواقع المستهدفة خمسة لBBS4 تحقيق الكفاءة ضربة قاضية كافية، وكنا سبق نشرها BBS4 الأساسي الماوس خروج المغلوب الكلى الخلايا الظهارية أنبوبي (2).
وجدنا أن في الخلايا السيطرة المخفوق، والخلايا المهدبة ~83٪ لديهم YFP-PC1 على أهداب (الشكل 2 ألف وباء). في الخلايا BBS1 ضربة قاضية، ومع ذلك، فإن الاتجار YFP-PC1 لأهداب وتضاءلت بشدة مع٪ فقط 40-50 الخلايا وجود YFP-PC1 على أهداب الخاصة بهم. على العكس من ذلك، كان نضوب BBS5 أو ثمانية في الخلايا IMCD3 أي تأثير على الاتجار الهدبية من YFP-PC1. النسبة المئوية للخلايا مهدبة YFP-PC1 إيجابية (~90٪) هي مماثلة لتلك الخلايا السيطرة المخفوق. والمثير للدهشة، لم تتأثر الهدبية توطين YFP-PC1 في الخلايا الأنبوبية الأساسي BBS4 الماوس خروج المغلوب الكلى.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 2.

BBS1، لا BBS4، BBS5 أو BBS8 أمر مهم للاتجار الهدبية من PC1. (A) YFP-PC1 غائب على أهداب الخلايا في BBS1 ضربة قاضية، على الرغم من تعبيرها عن جسم الخلية ما زال قائما. الاتجار YFP-PC1 لأهداب في BBS5 أو خلايا BBS8 ضربة قاضية وBBS4 خروج المغلوب الخلايا الظهارية الكلوية طبيعية. SCRB، سارعت السيطرة. كانت ملطخة YFP-PC1 من قبل الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء). وقد استخدم الأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر) للاحتفال أهداب. يمثل مقياس شريط 20 ميكرون. ومحاصر المنطقة المحيطة هدب وتوسيع. (B) النسبة المئوية لل-PC1 إيجابي أهداب هو مبين في (A). لا يقل عن 50 YFP-PC1 transfected واحصي الخلايا المهدبة لكل حالة. أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر. (C) وتوطين الهدبية من PC1 الذاتية غائب في الخلايا الليفية الجلد من مريض الإنسان مع طفرة BBS1 M390R. كانت ملطخة PC1 التي كتبها 96521 الأجسام المضادة (الخضراء). وقد استخدم الأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر) للاحتفال أهداب.

كما درسنا الاتجار الهدبية من PC1 في الخلايا الليفية الجلد من مريض مع طفرة BBS1 متماثل (M390R). وقد تبين BBS1 (M390R) أن يكون لها وظيفة ضعاف في نموذج الفأر (40). في الخلايا الليفية السيطرة، لاحظنا PC1 على أهداب الابتدائي في ~10٪ من الخلايا (الشكل 2 C). في المقابل، في الخلايا الليفية المستمدة من المريض BBS1، واقتصرت PC1 إلى منطقة الجسم القاعدية.

التعبير عن الشكل السائد سلبية من BBS3 / Arl6 يضعف PC1 التعريب على أهداب

لتقييم ما إذا BBS3 / Arl6، وGTPase صغير بالغ الأهمية من أجل وظيفة BBSome، يلعب دورا في توطين الهدبية من PC1، عبرنا عن مجموعة من HA الموسومة BBS3 الماوس / Arl6 يبني (من نوع البرية، وT31R متحولة المهيمنة سلبية المسببة للأمراض أو جوهري نشاطا Q73L متحولة) جنبا إلى جنب مع YFP-PC1. وجدنا أن YFP-PC1 بالاتجار إلى أهداب الابتدائي جنبا إلى جنب مع من النوع البري ونشط بشكل جوهري BBS3 / Arl6 (Q73L) (الشكل 3 والتكميلية المواد، الشكل. S4). أدى overexpression من متحولة المهيمن سلبية من BBS3 / Arl6 (T31R) في الخلايا IMCD3 لأهداب يعانون من التقزم، مشيرا إلى وجود خلل تكون الأهداب. ومع ذلك، كانت إشارة PC1 غائبة في الخلايا مع أهداب أقصر على الرغم من التعبير PC1 في خلايا الجسم واضحة للعيان.

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 3.

BBS3 / Arl6 تسيطر على الاتجار الهدبية من PC1. (A) YFP-PC1 وشارك transfected مع إما HA الموسومة البرية من نوع (WT)، T31R أو Q73L BBS3 / Arl6 إلى خلايا IMCD3. كانت ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة ضد GFP لYFP-PC1 (الأخضر)، HA لBBS3 / Arl6 (الحمراء)، والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض والأزرق ولكن هو مبين في أبيض وأسود) للاحتفال أهداب. يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. (B) الكمي لنسبة الاتجار YFP-PC1 إلى أهداب الأساسي هو مبين في (A). لا يقل عن 30 YFP-PC1 transfected واحصي الخلايا المهدبة لكل حالة. أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر.

تفاعل PC1 وBBS1 مهم لPC1 لحركة المرور إلى أهداب الابتدائي

التجربة المنسدلة GST إلى أن BBS1 يتفاعل مع PC1 من خلال الذيل PC1 ل-C المحطة. لذلك، سعينا إلى تحقيق دور PC1-CTT في الاتجار الهدبية من PC1. لهذا الغرض، قدمنا ​​بناء YFP-PC1 دون آخر حمض أميني 198 من PC1 (YFP-PC1ΔCTT) (الشكل 4 أ) واختبار قدرتها على التفاعل مع BBS1 قبل فحص شارك في مناعي. بينما YFP-PC1 المشارك immunoprecipitated HA الموسومة BBS1، فشل YFP-PC1ΔCTT للقيام بذلك (الشكل 4 B). بالإضافة إلى ذلك، كما فشلت YFP-PC1 للمشاركة في immunoprecipitate متحولة الإمراض المشتركة من BBS1 في المرضى الذين يعانون BBS البشري، BBS1 (R146X) (41).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 4.

تفاعل PC1 وBBS1 مهم لPC1 لحركة المرور إلى أهداب الابتدائي. (A) رسم تخطيطي لكامل طول YFP-PC1 كما هو موضح في المواد التكميلية، الشكل S1 وYFP-PC1ΔCTT حذف متحولة. تم حذف حمض أميني 198 CTT من YFP-PC1، وتوليد YFP-PC1ΔCTT. يتفاعل (B) BBS1 مع YFP-PC1، ولكن ليس مع YFP-PC1ΔCTT. خلايا HEK293 وقد شارك transfected مع HA الموسومة BBS1 وYFP-PC1 أو YFP-PC1ΔCTT. تم immunoprecipitated لست] الخلية مع الضد GFP ونشف لPC1 (7e12) وBBS1 (HA). كامل طول BBS1 (BBS1-HA) وشارك immunoprecipitated من قبل YFP-PC1 لكن ليس YFP-PC1ΔCTT. YFP-PC1 لا يمكن أن يشارك في immunoprecipitate متحولة الإمراض من BBS1 (R146XHA). استخدمت عشر من الخلية لست] كإدخال. (C) آثار الحذف C-المحطة على الاتجار الهدبية من PC1. تم transfected YFP-PC1 أو YFP-PC1ΔCTT إلى IMCD3 كما هو موضح أعلاه، وجرى تقييم الهدبية التعبير عن هذه التركيبات التي تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء) والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض، أحمر). وأظهرت صور الممثل من كل ترنسفكأيشن. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (D) الكمي لنسبة الاتجار الهدبية للبنيات هو مبين في (C). أشرطة الخطأ تمثل SD بين الحقول المجهر. (E) التعبير عن WT ولكنها ليست متحولة الإمراض BBS1 (R146X) recues الاتجار الهدبية من PC1. كانت ملطخة الخلايا مع الأجسام المضادة ضد GFP لYFP-PC1 (الأخضر)، HA لBBS1 (الحمراء)، والأسيتيل α تويولين (AC-α الحوض والأزرق ولكن هو مبين في أبيض وأسود) للاحتفال أهداب. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون.

ومن المثير للاهتمام، فشل YFP-PC1ΔCTT للوصول إلى أهداب الأساسي عند transfected إلى IMCD3 الخلايا (الشكل 4 C و D). وعلاوة على ذلك، والعيب في الاتجار PC1 إلى أهداب الأساسي في الخلايا BBS1 ضربة قاضية يمكن انقاذ من قبل reexpressing وBBS1 الإنسان العادي (الشكل 4 E)، ولكن ليس متحولة اقتطاع BBS1 (R146X). ونظرا لعدم قدرة YFP-PC1ΔCTT للتفاعل مع BBS1 وYFP-PC1 للتفاعل مع BBS1 (R146X)، وهذه النتائج تشير إلى أن التفاعل الوظيفي بين BBS1 وPC1 من خلال PC1-CTT مهم للاتجار الهدبية من PC1.

لا يتأثر الاتجار PC1 إلى غشاء البلازما أو الجسم القاعدية من قبل نضوب BBS1

لا PC1 يتراكم في بعض المقصورات غشاء عندما يفشل في حركة المرور إلى أهداب الابتدائي؟ منذ البروتينات قد حركة المرور إلى أهداب إما عن طريق الاستقطاب استهداف الجسم القاعدية أو انتشار الأفقي من غشاء البلازما (42)، درسنا ما إذا كان نضوب BBS1 يؤدي إلى تراكم PC1 في هذه المواقع. على عكس CD8a-SSTR 3i3 التي تتراكم على الغشاء البلازمي للخلايا المنضب من Arl6 أو BBS4 (8)، لم يكن هناك تراكم واضح من PC1 سواء على الجسم القاعدية أو الغشاء البلازمي في الخلايا المنضب BBS1 (الشكل 5 ألف وباء ).

عرض نسخة أكبر:

• في هذا الإطار
• في نافذة جديدة

• تحميل ك شريحة PowerPoint

الرقم 5.

آثار استنفاد BBS1 عن الاتجار PC1 إلى الهيئات القاعدية أو غشاء البلازما ونموذجا للتنظيم BBSome الاتجار PC1 إلى هدب الأساسي. (A) الاتجار YFP-PC1 إلى الهيئات القاعدية في الخلايا IMCD3 المنضب BBS1. تم الكشف عن YFP-PC1 مع الأجسام المضادة ضد GFP (الخضراء في الصور المدمجة)، وγ تويولين (الرمز بواسطة السهام، والحمراء في الصور المدمجة) كان يستخدم كعلامة الجسم القاعدية. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. لا يتأثر (B) الاتجار سطح قمي من YFP-PC1 في الخلايا المنضب BBS1. كان تلطيخ الخلايا الحية باستخدام الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة لمكافحة GFP (الأخضر، مع وضع علامة *) أول إجراء للكشف عن خلية PC1 السطح. بعد تثبيت وpermeabilization، تم استخدام الأجسام المضادة الثاني الماوس وحيدة النسيلة ضد GFP (الحمراء) للكشف عن PC1 المؤتلف بما في ذلك بركة سباحة داخل الخلايا. يمثل شريط مقياس مكون من 5 ميكرون. (C) السطح biotinylation الفحص. تم إجراء biotinylation السطح كما هو موضح في المواد وطرق. تم الكشف عن سطح YFP-PC1 مع الأجسام المضادة ضد GFP، وكان يستخدم β1-إنتغرين كمجموعة تحكم. (D) الكمي لPC1 السطح هو مبين في (C). PC1 سطح تطبيع في الخلايا سارعت تم تعيين إلى 100٪ لإنتغرين بيتا. (E) ويسر الاتجار الهدبية من PC1 من خلال BBSome الاعتراف PC1-CTT في BBS3 / الطريقة التي تعتمد على ARL6. PC1 (باللون الأحمر) التي تحتوي حويصلات تستهدف إلى غشاء البلازما (المسمى من قبل ①) أو قاعدة periciliary (المسمى من قبل ②) وتدخل أهداب إما من غشاء البلازما عبر انتشار الأفقي أو من قاعدة periciliary عبر استهداف الاستقطاب. (F) تعطيل وظيفة البروتين PC1-BBSome معقدة مثل نضوب BBS1، خلل في BBS3 / ARL6 أو حذف / تحور PC1 C-الذيل (ΔCTT) يضعف الاتجار الهدبية من PC1.

وأكد تأثير استنزاف BBS1 على غشاء البلازما استهداف PC1 أيضا كيميائيا من قبل biotinylation فحص سطح الخلية. biotinylation سطح الخلية إما سارعت كشفت السيطرة أو خلايا IMCD3 المنضب BBS1 مع transfected YFP-PC1 أنه لا يوجد انخفاض كبير في PC1 سطح الخلية في الخلايا المنضب BBS1 (الشكل 5 C و D)، مما يوحي بأن الاتجار التي تحتوي على PC1 الحويصلات الموجهة للغشاء البلازما لا تعتمد على وجود BBS1.

القسم السابق القسم التالي

نقاش

آلية دقيقة التي PC1 تصل إلى أهداب الابتدائي لا تزال بعيدة المنال. هنا، وتبين لنا، للمرة الاولى، من خلال شاشة مشاركات باستخدام PC1 ذيل C-محطة كطعم، أن PC1 البروتين ADPKD يتفاعل مع البروتينات المشفرة بواسطة الجينات BBS. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن الاتجار الهدبية من PC1 ينظمه البروتينات BBS متميزة (الشكل 5 E). وبالنظر إلى الأهمية البالغة لتوطين السليم وظيفة polycystins في علم وظائف الأعضاء الجهاز العادي، وتوفر النتائج التي توصلنا إليها الأساس لمزيد من فهم النمط الظاهري عديد المظاهر والمسببات من BBS.
نص كبير نسبيا من PKD1 (~14 كيلوبايت) أعاق دراسات PC1. هنا، قمنا بتأسيس نظام تعبيرا عن n و C-محطة الموسومة كل من كامل طول PC1، وهو أمر مفيد لدراسة الاتجار، الحيوي وظيفة كامل طول PC1 في الخلايا الظهارية الكلوية. وجدنا كل من N- وC-تيرميني من PC1 على أهداب الابتدائي. واقترح PC1 للخضوع حدث انشقاق الشق الشبيهة التي يتم تحريرها ذيل صغير-C محطة (43، 44). جنبا إلى جنب مع الدور الحاسم للPC1-CTT في الاتجار الهدبية لها، وتشير البيانات المتوفرة لدينا إما أن جزء كبير من PC1 لا المشقوق أو الانقسام من PC1 في دورته C-محطة يحدث بعد وصوله الى أهداب الابتدائي.
وتشير البيانات المقدمة هنا دور BBSome في استيراد PC1 إلى أهداب الأولية بدلا من تصدير PC1 من أهداب الابتدائي منذ PC1 يتم تقليل، وليس المتراكمة في أهداب الأساسي للخلايا IMCD3 عند فقدان BBSome وظيفة. ومن المثير للاهتمام، مع ذلك، أن الاتجار PC1 ضعاف إلى أهداب الابتدائي وينظر فقط في ضربة قاضية BBS1، ولكن ليس في BBS5 وBBS8 ضربة قاضية أو BBS4 خروج المغلوب الخلايا الظهارية. هناك ما مجموعه 19 (45) الجينات التي تسبب BBS الطفرات. BBS1 هي واحدة من الجينات BBS الرئيسية الثلاثة تحور في 20-30٪ من الحالات BBS بعد الولادة (46). أحد الاحتمالات هو أن BBS1 قد يكون لها دور متميز من مفارز BBSome الأخرى حتى أن التفاعل بين PC1 وBBS1 هو العامل الأكثر أهمية المساهمة في توطين الهدبية من PC1. وقد اقترحت ظائف فريدة من نوعها من الجينات BBS مختلفة يرجع ذلك إلى حقيقة أن الاختلافات المظهرية أو تقلب كثيرا ما لوحظ بين مختلف BBS فئرانا معدلة وراثيا أو المرضى (47). بياناتنا تتفق أيضا مع نموذج التجمع BBSome التي استنزاف BBS1 و 2 و 7 و 9 كان لها أثر بارز في جمعية المجمع BBSome في حين أن استنزاف BBS4 و 5 و 8 قاصر أو أي تأثير في شبكية العين الصباغ الظهارية الخلايا (48). ويشير تقرير صدر مؤخرا أن BBS2 و 7 و 9 شكل المكونات الأساسية للBBSome بينما BBS1، تضاف 4 و 5 و 8 كما مفارز محيط (49). يتفاعل PC1 فقط مع مفارز الطرفية كما هو مبين في هذه الدراسة. BBS4 وBBS8 وتتكون أساسا من عدة زخارف تفاعل البروتين البروتين، وهي TPRs، والتي تشكل الهيكل اللولبي (8). منذ صيد BBS8 الخروج من الخميرة شاشة يومين الهجين باستخدام PC1-CTT كطعم، وPC1-BBS8 أو التفاعل PC1 BBS4 من المرجح المباشر، وربما بوساطة الزخارف TPR. BBS1 وBBS5 تختلف هيكليا من BBS4 وBBS8. لدينا في المقايسات المنسدلة، يظهر PC1 C-ذيل للتفاعل مع BBS1 بقوة كما مع BBS8 (الشكل 1 B). وأكد تفاعل PC1 مع BBS1 أيضا شارك في immunoprecipitations (الشكل 4 B). ونظرا لطبيعة زائدة عن الحاجة المحتملة للتفاعل PC1 مع مفارز BBSome مختلفة، ونحن نعتقد أنه في غياب بعض مفارز BBSome مثل BBS4 أو 5 أو 8، مجمع BBSome المتبقية حفظه النشاط الكافي لاستهداف PC1 للأهداب. وأظهر تقرير صدر مؤخرا أنه في غياب BBS7، وهو BBSome subcomplex لا يزال أشكال والاتجار الهدبية من polycystins تبدو طبيعية بشكل فاضح ويحتمل أن تكون وظيفية (47) كما يدعم فرضيتنا.
BBS1 يتوسط تفاعل BBSome مع Rabin8 (5)، واقترحت أن تكون الوحيدات الاعتراف البضائع من BBSome لدخول الهدبية للفترة واحدة مستقبل الليبتين (7). تعطى فقط استنزاف BBS1 يؤثر على الاتجار الهدبية من PC1، فمن الممكن أيضا أن BBS1 يلعب دورا حاسما في الاعتراف PC1 كما شحنة BBSome وبالتالي فإن تسليم لاحق من PC1 للأهداب. الاعتراف البضائع عن طريق BBS1 قد تكون بوساطه الذيل-C محطة حشوية من PC1 منذ حذف هذا الجزء النتائج أيضا في فشل الاتجار PC1 إلى أهداب (الشكل 5 F). وبالمثل، فإن حلقة الخلايا الثالثة من سبع تمتد السوماتوستاتين مستقبلات 3 (SSTR3) تمتلك سلسلة استهداف أهداب الذين اعتراف BBSome أمر حاسم لتوطين SSTR3 لأهداب (8).
تجارب مع BBS3 / Arl6 توفر دعما إضافيا لتنظيم توطين الهدبية من PC1 بواسطة بروتين آخر BBSome (الشكل 5 F). دراسة أنيقة جين وآخرون. (8 أظهرت) أن شكل محدد GTP من BBS3 / Arl6 هو أمر حاسم لتجنيد BBSome بلمرة إلى الحويصلات الدهنية بمثابة معطف واستهداف BBSome لأهداب، ولكن ليس للجمعية BBSome. في هذه الدراسة، وأظهرت أن الإفراط في الإنتاج من الكفاءة من النوع البري BBS3 ملزم GTP أو النموذج النشط جوهري من BBS3 (Q73L) كان قادرا على المرافق الاتجار PC1 لأهداب بكفاءة. ومع ذلك، overexpression من BBS3 T31R، وهو غير الساحلية الناتج المحلي الإجمالي، متحولة الإمراض المهيمنة سلبية وجدت في المريض BBS البشري، يؤدي إلى أهداب حيلة في الخلايا IMCD3 وفشل PC1 لحركة المرور إلى أهداب. والجدير بالذكر أن BBS3 / Arl6 يتفاعل أكثر كفاءة مع الوحيدات BBS1 من BBSome من خلال الربط إلى N-محطة من BBS1 (8).
النمط الظاهري السريرية للمرضى BBS متغير بدرجة كبيرة، حتى بين الأشقاء مع نفس الطفرات (50). وعلاوة على ذلك، فإن الطيف من BBS النمط الظاهري قد تتداخل مع غيرها من ciliopathies سريريا ومتميزة وراثيا (50). وقد تبين التفاعلات أليلية متعددة بين BBS المكاني أو BBS المكاني مع الجينات ciliopathy أخرى للمساهمة في التباين في التعبير السريري من الطفرات BBS (41، 51). على الرغم من هنا وجدنا أن نقص فقط من BBS1 وBBS3 ضعاف الاتجار PC1 الهدبية، فإنه لن يكون من المستغرب إذا الجينات BBS متعدد الألائل أو بالاشتراك مع الأليلات ciliopathic أخرى تؤثر على الاتجار الهدبية و / أو وظيفة polycystins وبالتالي تؤدي إلى الظواهر ذات الصلة polycystin مثل الكيسات الكلوية.
قد تتراكم البروتينات في موقع معين عندما فشلوا في حركة المرور إلى وجهتها (7، 8). في تجاربنا، إلا أننا لا يمكن أن نلاحظ زيادة ملحوظ من إشارة YFP-PC1 في الجسم القاعدية، غشاء البلازما أو مواقع أخرى فحصها (لا تظهر البيانات) في خلايا BBS1 ضربة قاضية. لأن الغشاء الهدبي لا يمثل سوى جزء صغير من غشاء البلازما الهائل للخلايا IMCD3، وغياب PC1 من أهداب قد لا يؤدي إلى زيادة بارزة في كثافة إشارة PC1 في البلازما أو الأغشية عضية أخرى. العادي توزيع غشاء البلازما من PC1 في الخلايا المنضب BBS1 يوحي بأن الحويصلات المحتوية على PC1 قادرة على برعم من شبكة عابرة للجولجي (TGN)، قفص الاتهام، والصمامات إلى غشاء البلازما في ظل هذه الظروف. وقد تم مؤخرا تبين أن مملس تتحرك من خلال مسار النقل الجانبي رواية من غشاء البلازما إلى الغشاء الهدبي (52). مع البيانات الحالية لدينا، فإننا لا نستطيع التمييز بين الاحتمالات أن المجمع BBSome نقل الشحنات التي تحتوي على PC1 المقيمين في الغشاء البلازمي للأهداب الابتدائي أو مباشرة إلى من TGN إلى غشاء periciliary في الخلايا الظهارية الكلوية.
وباختصار، علينا أن نظهر أن PC1 البروتين ADPKD، وهذه العملية من غير نمطية 11 تمتد، يستهدف إلى أهداب الابتدائي بطريقة BBSome التي تعتمد على. تفاعل PC1 مع BBS1 هو خطوة حاسمة لنقل الحويصلات المحتوية على PC1 كفاءة لأهداب الابتدائي. وهذا يشكل التفاعل مثيرة للاهتمام بين اللاعبين حاسما وراء اثنين من أمراض وراثية متميزة genotypically لكن جزئيا متداخلة ظاهريا. PC1 موجود أيضا على أهداب الأساسي من الخلايا البطانية حيث انها تتوسط mechanosensation والنيتريك الافراج أكسيد (53). ومن المرجح أن مجموعة فرعية من الظواهر التي لوحظت في مرضى BBS مثل الخراجات الكلى وارتفاع ضغط الدم تنتج عن PC1 mistargeted. كما توفر البيانات فهمنا رواية من مسارات الإشارات التي تسيطر عليها BBSome.

القسم السابق القسم التالي

المواد والأساليب

زراعة الخلايا وshRNA ضربة قاضية

تم شراء الماوس النخاع جمع خلايا القناة الداخلية (mIMCD3) من ATCC (CRL-2123) والمثقف في DMEM / F12 50/50 تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS). كانت خلايا HEK293 و293EBNA مثقف في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco ولل(DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS. كانت البشرية تحكم الخلايا الليفية الجلد والخلايا M390R (التي قدمها الدكتور Beales) مثقف في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. تم شراؤها البلازميدات تحتوي على خمسة المواقع المستهدفة ضد كل جين من سيجما. تم تجميع الجزيئات Lentiviral في 293EBNA الخلايا التالية تعليمات في المصنع. والخلايا المصابة بفيروسات IMCD3 تليها ليلة وضحاها عن طريق الانتقاء مع بوروميسين بتركيز 2 ميكروغرام / مل. تم اختبار كفاءة ضربة قاضية في الخلايا مستقرة الكمي RT-PCR أو النشاف الغربي. العثور على تسلسل الهدف ShRNA من سيغما أن تكون فعالة في هذه الدراسة هي: BBS1 (TRCN0000252354 وTRCN0000252355)، BBS5 (TRCN0000248514 وTRCN0000248517) وBBS8 (TRCN0000113210 وTRCN0000113212).
لتحليل تكون الأهداب، وكانت المصنفة الخلايا في 70٪ التقاء وجوعا لمدة 48 ساعة في DMEM وسائل الإعلام / F12 تحتوي على 0.5٪ FBS بعد الوصول إلى نقطة التقاء. لتحليل الاتجار الهدبية من PC1، كانت المصنفة الخلايا في 60٪ التقاء وعابر. مع مختلف بنيات بين عشية وضحاها. كانت خلايا ثم المصل جوعا في DMEM وسائل الإعلام / F12 تحتوي على 0.5٪ FBS لمدة 48 ساعة.

البلازميدات والأجسام المضادة

وPCR تضخيم PC1 ذيل-C محطة البشري (PC1-CTT) ترميز جزء 198 الأحماض الأمينية من cDNAs الكلى الإنسان وإدراجها في pACT2 لخلق pACT2-hCTT الطعم البلازميد. تم إدراج هذا الجزء أيضا إلى pGEX-4T-1 لإنشاء pGEX-hCTT بناء لإنتاج GST-PC1-CTT البروتين الانصهار في البكتيريا. كان BBS8 الموسومة MYC هدية المقدمة من الدكتور نيكولاس Katsanis في جامعة ديوك. وHA الموسومة BBS1، 2، 3، 4، 5 و 8 و 9 كانوا الهدايا السخية من الدكتور فال شيفيلد في جامعة ولاية ايوا. تم إنشاء BBS1 اقتطاع HA الموسومة (R146X) من HA-BBS1 بواسطة PCR الطفرات. تم تضخيم BBS3 الماوس من [كدنا الكلى والفأرة المستنسخة في pcDNA3.1-HA ناقل لخلق HA الموسومة BBS3 (pcDNA3.1-BBS3-HA). وقدم T31R ونقطة Q73L طفرة لpcDNA3.1-BBS3-HA بواسطة PCR الطفرات. لتوليد YFP-PC1، تم إدراج إطار القراءة المفتوح من YFP في الماوس PKD1 كدنا] بناء على الفور بعد أول 34 الأحماض الأمينية التي المؤتلف PCR في البلازميد التتراسيكلين محرض التعبير (pcDNA4.1، إينفيتروجن). تم إنشاء YFP-PC1ΔCTT من YFP-PC1 بحذف مشاركة 198 الأحماض الأمينية من PC1 C-المحطة. وقد أكد متواليات من جميع التركيبات ولدت في هذه الدراسة من خلال تحليل تسلسل الحمض النووي.
كانت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة: مكافحة GFP الأرنب بولكلونل (Abcam) 01:20 000؛ مكافحة GFP وحيدة النسيلة الماوس (كوفانس) 1: 1000 تخفيف، ومكافحة HA حيدة النسيلة الفئران 3F10 (روش) 1: 1000 تخفيف؛ مكافحة HA الماوس وحيدة النسيلة 12CA5 (روش) 1: 100 التخفيف؛ مكافحة MYC الماوس وحيدة النسيلة 9e10 (إينفيتروجن) 1: 1000 تخفيف؛ مكافحة γ تويولين (سيغما) الماوس وحيدة النسيلة 1: 2000 تخفيف؛ لمكافحة الأسيتيل-α تويولين الماوس وحيدة النسيلة (سيغما) 01:50 000 التخفيف؛ مكافحة PC1 الأرنب بولكلونل 96521 (15) 1: 500 ومكافحة PC1 الماوس وحيدة النسيلة 7e12 (سانتا كروز) 1: 2000، ومكافحة BBS8 بولكلونل الأرنب (سانتا كروز) 1: 500 التخفيف.

المناعية والمناعي المجهري

للتحاليل مجهرية، تم إصلاح الخلايا المستزرعة مع 4٪ لامتصاص العرق، permeabilized مع 0.5٪ تريتون X وسدت مع 5٪ ألبومين المصل البقري. خلايا Permeabilized ثم تم ملطخة الأجسام المضادة الأولية المطلوبة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بعد الغسل الكامل، وأضيفت الأجسام المضادة الثانوية مع وضع العلامات المناسبة لآخر ساعة من الحضانة. وقد شنت الشرائح مع إطالة ® الذهب Antifade الكاشف مع أو بدون 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي). لتلطيخ الخلايا الحية، وتشطف الخلايا أولا مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وحضنت مع GFP الأضداد على الجليد. بعد 1 ساعة، وكانت تغسل الخلايا، ثابتة مع 4٪ لامتصاص العرق، واستمر مع بروتوكول تلطيخ العادية المذكورة أعلاه.
تم الحصول على الصور الفلورسنت مع epifluorescence المجهر نيكون 1000 (نيكون، طوكيو، اليابان). وقد اتخذت جميع الصور في نفس المجموعة من التجربة مع ظروف مماثلة وتعرض لسطوع أو تعديل التباين على قدم المساواة في فوتوشوب.

الخميرة فحص اثنين من الهجين

تم تنفيذ الخميرة اثنين الهجين باستخدام Clontech الخاطبة III نظام الخميرة اثنين الهجين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحولت البلازميد الطعم pACT2-hCTT إلى سلالة الخميرة AH109 أولا، وتحولت مكتبة [كدنا الكلى الجنين البشري من إينفيتروجن إلى AH109 / pACT2-hCTT. وقد تم اختيار المستعمرات شكلت على لوحات عالية التشدد-SD / -Ade / العاهل / -Leu / -Trp / XA-غال. تم انتشال البلازميدات من الحيوانات المستنسخة الإيجابية وإرسالها للتسلسل الحمض النووي.

شارك في مناعي

والمتجانس خلايا HEK293 مع transfected مختلف بنيات مع M-PER (بيرس) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (روش) و 1 م م DTT. للمشاركة في مناعي، وحضنت 2-4 ملغ من الخلية لست] إما 2-4 ميكروغرام الأجسام المضادة أو مبلغ مساو من مفتش عادي مع هزاز لطيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أضيفت البروتين الخرز A سيفاروز (إينفيتروجن) وحضنت لمدة 2 ساعة في آخر 4 ° C. تم solubilized حبات غسلها في حجم مساو من 2 × الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) عينة العازلة، وكان مزال البروتينات التي المغلي لمدة 5 دقائق وتحليلها بواسطة النشاف الغربي. استخدمت عشر واحد إلى 1/20 من لست] كمدخلات، ما لم ينص على خلاف ذلك.

GST المنسدلة الفحص

تم إنشاء GST وGST البروتينات الانصهار كما هو موضح سابقا (54). لGST تحليل المنسدلة، وحضنت 500 ميكروغرام من 293 لست] T-خلية التعبير عن مختلف البروتينات BBS HA الموسومة مع GST تنقية البروتينات الانصهار ثبتوا على الجلوتاثيون سيفاروز الخرز (أمرشام فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية) في 4 درجات مئوية خلال الليل. تم طرد الخرز وتم غسلها ثلاث مرات مع الثلج الباردة PBS غسل العازلة التي تحتوي على 1٪ NP-40. تم solubilized حبات غسلها في حجم مساو من 2 × SDS عينة العازلة، والبروتينات مزال من قبل الغليان لمدة 5 دقائق وتحليلها بواسطة النشاف الغربي. استخدمت واحدة العشرين لللست] كمدخلات، ما لم ينص على خلاف ذلك.

سطح biotinylation فحص

تم إجراء biotinylation سطح الفحص كما هو موضح سابقا مع بعض التعديلات (55). و transfected الخلايا بين عشية وضحاها والمصل جوعا لمدة 24 ساعة بعد الوصول إلى نقطة التقاء. وبعد ذلك وصفت بروتينات سطح الخلية في تعليق خلية في درجة حرارة الغرفة مع 0.5 ملغ / مل من NHS-PEG4-البيوتين (الحرارية العلمية) لمدة 30 دقيقة. وهي lysed الخلايا في المخزن الترسيب المناعي الشعاعي، وكانت انسحبت البروتينات المعقدة البيروكسيديز بنسبة حبات streptavidin. ومزال الخرز مع 2 م م حرة د -biotin (بيرس)، وتم حل عينات مزال على 7.5٪ دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام لاحقا التحليل.