#1  
قديم 11-22-2015, 09:14 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي دراسة سريرية والجينية والبيوكيميائية من الطفرات spg7 في الشلل النصفي التشنجي وراثي

 

http://brain.oxfordjournals.org/content/127/5/973.full


الملخص

الطفرات في الجين SPG7، ترميز البروتين paraplegin الميتوكوندريا، وكان أول من ذكر اسمه في راثي متنحي الشلل النصفي التشنجي وراثي (ARHSP). وقد وصفت أربع طفرات SPG7 مختلفة حتى الآن بالتعاون مع كل نقية ومعقدة الظواهر HSP. وقد أظهرت الخزعات العضلية من المرضى الأكثر تضررا دليل النسيجي للعيب الفسفرة المؤكسدة. حددنا ست قبائل ARHSP، ومنهم من الربط SPG7 لا يمكن استبعاد، و 29 متقطع مرضى الشلل النصفي التشنجي. تم فحص والإكسونات 17 والمناطق المحيطة من الجين SPG7 للطفرات باستخدام مزيج من واحد الذين تقطعت بهم السبل تعدد الأشكال التشكل (SSCP) تحليل والتسلسل. تم العثور على ثلاثة مرضى لتنفيذ مجمع الطفرات SPG7 متخالف، تتألف من خمسة رواية واحدة الطفرة التي سبق وصفها. لم الخزعات العضلية من مريضين طفرة SPG7 لا تظهر أي دليل النسيجي للعيب الفسفرة المؤكسدة. ومع ذلك، كشفت التحاليل البيوكيميائية انخفاض في سترات لتصحيح سينسيز المجمع الأول ومجمع II الأنشطة / III في العضلات والنشاط I معقدة في الكسور التخصيب الميتوكوندريا من myoblasts مثقف، مما يدل على أن إما الابتدائي أو عيب الثانوي من سلسلة وظيفة الجهاز التنفسي قد تلعب دورا هاما في التسبب في المرض.
  • الشلل النصفي التشنجي راثي؛ paraplegin. SPG7
  • ARHSP = راثي متنحي الشلل النصفي التشنجي راثي؛ HSP = الشلل النصفي التشنجي راثي؛ SSCP = واحد الذين تقطعت بهم السبل تعدد الأشكال التشكل
مقدمة

الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP) يشمل مجموعة من الاضطرابات غير المتجانسة سريريا وراثيا التي الميزة الغالبة هي التشنج التدريجي وضعف في الأطراف السفلية. قد يكون وراثة وراثي جسمي، جسمي مقهور (ARHSP) أو X-ربط. يتم تصنيف النمط الظاهري كما النقي HSP عندما تقتصر أعراض وعلامات لتلك التي من خزل سفلي تشنجي التدريجي مع احتمال العمود الخلفي أو تورط المثانة (بولو وآخرون، 1993). وقد وصفت الظواهر HSP المعقدة بالتعاون مع مجموعة واسعة من المظاهر السريرية العصبية أو غيرها إضافية (ماكديرموت وشو، 2002).
في معظم الحالات HSP (~80٪) إثبات أدلة على ميراث السائد (بولو وآخرون، 1991). حتى الآن، تم تعيين 10 جسمية مواضع HSP المهيمنة، والتي من الطفرات في خمسة جينات، SPG3A (atlastin)، SPG4 (spastin)، SPG6 (NIPA1)، SPG10 (KIF5A) وSPG13 (Hsp60)، وقد تم تحديد (حزان وآخرون آخرون، 1999.؛ تشاو وآخرون، 2001.؛ هانسن وآخرون، 2002.؛. ريد وآخرون، 2002؛. رينييه وآخرون، 2003). يبدو الميراث مقهورة مناطق خارج شائعة نسبيا حيث توجد معدلات عالية من زواج الأقارب (Sridharan وآخرون، 1985)، على الرغم من أنها قد يشكلون نسبة كبيرة من الحالات فيما يبدو متفرقة. حتى الآن، وقد تم تحديد ستة مواضع ARHSP والطفرات المسببة العثور عليها في اثنين من الجينات، SPG7، الترميز paraplegin، وSPG20، ترميز spartin البروتين (. Casari وآخرون، 1998؛. باتل وآخرون، 2002).
كان SPG7 أول جسمية HSP الجينات تتسم. تقع على الصبغي 16، ويضم 17 الإكسونات تمتد ~52 كيلوبايت. المنتج البروتين، paraplegin، ويتكون من 795 الأحماض الأمينية ويموضع إلى الميتوكوندريا. وتشترك في أقرب الأحماض الأمينية تسلسل تناظر مع الخميرة metalloproteases الميتوكوندريا Afg3، Rca1 وYme1 (Casari وآخرون، 1998.؛ Settasatian وآخرون، 1999.). هذه البروتينات هي أعضاء الفصيلة البروتين AAA (أتباز المرتبطة بالأنشطة الخلوية المتنوعة) التي توجد على نطاق واسع في كل من خلايا أولية النواة وحقيقية النواة وتلعب دورا هاما في مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية بما في ذلك انقسام الخلايا، والنسخ، وعضية نشوء حيوي والنقل حويصلة و التجمع انزيم (باتل وLatterich، 1998). الخميرة ATPases الميتوكوندريا تمتلك كل من بروتين والأنشطة مثل كوصي على الغشاء الداخلي الميتوكوندريا حيث كانوا يشاركون في التجمع وتدهور البروتينات في سلسلة معقدة التنفسي (بيرس، 1999). طفرة من هذه الجينات في الخميرة يستحث سلسلة عيب في الجهاز التنفسي بسبب كتلة في البرلمان من مفارز في الانزيمات وظيفية (بول وTzagoloff، 1995). وفي وقت لاحق، عددا من الجينات البشرية إضافية ترميز البروتينات عالية مثلي لparaplegin مثل تم اكتشافها AFG3L1، AFG3L2 وYME1L1 (بانفي وآخرون، 1999.؛. كوبولا وآخرون، 2000؛. Kremmidiotis وآخرون، 2001). وتظل الوظيفة الدقيقة للparaplegin والبروتينات ذات الصلة في البشر غير مؤكدة.
حتى الآن، وقد وصفت أربعة SPG7 الطفرات الناتجة في أي نقية أو معقدة الظواهر HSP. بعد الربط 16q24.3 في أسرة إيطالية الأقارب كبيرة مع النمط الظاهري معقد متغير (دي ميشيل وآخرون، 1998)، Casari وآخرون. (1998) اكتشف الحذف 9.5 كيلوبايت المقابلة لالإكسونات الخمس الماضية من الجين SPG7. وكشف تحليل خزعة العضلات من شخصين تضررا التغييرات المميزة من الميتوكوندريا العيوب الفسفرة المؤكسدة بما في ذلك ألياف خشنة الحمراء، السيتوكروم ج-أوكسيديز سلبي وسوسينات ألياف نازعة إيجابي. أكد المجهر الإلكتروني تراكم الميتوكوندريا غير طبيعية تحتوي على شوائب paracrystalline في 'موقف للسيارات' النمط. ومع ذلك، في اثنين من الأفراد المتضررين أقل بشدة، وشوهدت قليلة فقط، أوكسيديز السلبية المنتشرة السيتوكروم ج الألياف. اثنين من طفرات انزياح الإطار إضافية، حذف 2 سنة مضت في اكسون 6 في عائلة ايطالية صغيرة مع خالص HSP والإدراج قاعدة واحدة في اكسون 17 في HSP الفرنسي المشابهة مع النمط الظاهري تعقيدا بما في ذلك البصرية، وضمور القشرية والمخيخ، كما تم تحديد. وكانت كل من الأسر والأقارب متماثلة اللواقح بالنسبة للطفرة (Casari وآخرون، 1998). في الآونة الأخيرة، وقد تم الإبلاغ عن متخالف 9 الحذف غليان في اكسون 11 من SPG7 في أب وابنه تتأثر خزل سفلي تشنجي، مما يشير إلى احتمال النمط السائد وراثي جسمي من الميراث في هذه العائلة (ماكديرموت وآخرون، 2001).
وكان الهدف من هذه الدراسة هو فحص لفيف كبير من الحالات مقهورة HSP المتنحية ومتفرقة من المملكة المتحدة إلى تقدير مدى انتشار الطفرات SPG7 في هذه الفئة من السكان وزيادة تحديد طبيعة الخلل الميتوكوندريا في الأفراد المتضررين.

طرق

المواضيع

وتم تحديد عشرين قبيلة HSP أدلة على راثي الميراث المتنحية ومزيد من 29 مريضا بشكل متقطع وليس لهم تاريخ العائلة، ومنهم من الأسباب البديلة لشلل سفلي تشنجي استبعدت، إما من خلال قاعدة البيانات التي أنشئت من المرضى HSP البريطانية (التي يوجد مقرها في المراكز الثلاثة المشاركة الذين أجروا البحث في HSP لعدة سنوات) أو عن طريق وحدة البريطاني العصبية المراقبة، التي تنقل بانتظام مع جميع أطباء الأعصاب مستشار المملكة المتحدة يطلب فيها معلومات عن فئات محددة المريض. جميع الأفراد أعطى موافقة مستنيرة للمشاركة في الدراسة، التي حصلت على موافقة متعددة الإقليمية جنة أخلاقية.
التنميط الجيني والربط تحليل

تم استخراج DNA من الدم الجينوم بأكمله باستخدام البروتوكولات القياسية. تم التحقيق الربط موضع SPG7 في 20 عائلة ARHSP باستخدام متعددة الأشكال من الواسمات الوراثية D16S413، D16S3023 وD16S303. وكانت تضخيم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) حجم المنتجات مجزأة من قبل الكهربائي باستخدام 8٪ المواد الهلامية بولي أكريلاميد وتصور من قبل تلطيخ الفضة. حسبت عشرات زوجيا اللد باستخدام MLINK في ظل افتراض الترددات أليل المتساوية والمساواة الذكور والإناث معدلات إعادة التركيب. كان يفترض أن تكون وراثة المرض باعتباره مقهورة مع انتفاذ كامل وتردد أليل من 10 -4.
الكشف عن الطفرات

وقد صممت ثمانية عشر زوجا من الاشعال، بناء على الصبغي 16 مشروع تسلسل البيانات، لتضخيم المنطقة الترميز والمرافقة تقاطعات لصق جميع الإكسونات 17 من الجينات SPG7. أجريت تقارير إتمام المشروعات (50 ميكرولتر) في ظل ظروف الأمثل (الجدول 1). واحد الذين تقطعت بهم السبل التشكل تعدد الأشكال تم تنفيذ (SSCP) التحليل باستخدام 0.6٪ والمواد الهلامية والكشف عن الطفرات تعزيز تشغيل في 4-10 درجة مئوية لمدة 10-16 ساعة لتحقيق الانفصال الأمثل للفروع. وتميزت التحولات التنقل عن طريق التسلسل المباشر لمنتجات PCR تنقيته باستخدام BIGDYE (النظم البيولوجية التطبيقية) وتحليلها على تحليل الوراثي ABI 3100.

الجدول 2
تردد من الأشكال SPG7 في المريض والسيطرة الكروموسومات
موقع تغيير النوكليوتيدات توقع تغيير البروتين الكروموسومات المرضى (ن = 70) الكروموسومات التحكم (ن = 100) اكسون 1 120G → A G40G 1 1 إنترون 4 IVS4 + 12C → T - 36 56 إنترون 7 IVS7 + 5G → A - 2 3 إنترون 7 IVS7 + 17G → C - 2 2 إنترون 7 IVS7 + 38G → A - 3 5 إنترون 10 IVS10 + 19G → A - 2 5 اكسون 11 1507A → G T503A 2 6 اكسون 11 1529C → T A510V 1 4 إنترون 12 IVS12 + 13C → T - 1 4 إنترون 13 IVS13 + 45G → C - 14 31 اكسون 14 1816C → T G605G 0 1 اكسون 15 2063G → A R688Q 5 24 اكسون 17 2283G → A Q761Q 2 2 اكسون 17 2292C → T I764I 2 4
A = ألانين. G = الجلايسين. I = آيسولوسين؛ Q = الجلوتامين. R = أرجينين. T = ثريونين. V = حمض أميني أساسي.


الجدول 3
الطفرات SPG7 الكشف
صبور موقع تغيير النوكليوتيدات توقع تغيير البروتين 1 اكسون 1 28G → A A10S
اكسون 13 1729G → A G577S 2 اكسون 8 1057-1085del29 انزياح الإطار 353-384X385
اكسون 13 1715C → T A572V 3 اكسون 11 1450-1458del9 E، R، R484-486del
اكسون 15 2026T → C F676L
A = ألانين. E = حمض الجلوتاميك. F = الفينيل ألانين. G = الجلايسين. L = يسين. R = أرجينين. S = سيرين. V = حمض أميني أساسي.


الجدول 4
الخصائص السريرية للمرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7
صبور 1 2 3 عمر (سنة) 21 51 42 جنس م F م العمر عند بداية (سنة) 11 14 19 التلفظ - + + الرأرأة تذبذب المقلتين السريع اللإرادي - + + ضعف المثانة - - + الطرف العلوي


الشلل التشنجي + + + ضعف - - - ترنح - + + فرط المنعكسات + + + حسي - - - الطرف السفلي


قدم جوفاء + + - الشلل التشنجي + + + ضعف - + + ترنح - + + فرط المنعكسات + + + حسي - + - ردود الفعل أخمصي ↑↑ ↑↑ ↑↑ مشية تشنجي تشنجي-رنحي تشنجي-رنحي الحالة الوظيفية مستقل يتطلب عصا مستقل EMG / NCS لم تفعل طبيعي طبيعي التصوير بالرنين المغناطيسي الدماغ طبيعي تلين hyperintensity T2. ضمور المخيخ ضمور المخيخ الحبل الشوكي التصوير بالرنين المغناطيسي طبيعي طبيعي طبيعي
M = ذكور؛ F = أنثى؛ + = الحاضر. - = غائبة. ↑↑ = ثنائيا الباسطة. دراسات NCS = التوصيل العصبي.


الجدول 5
الميتوكوندريا أنشطة مجمع السلسلة التنفسية تصحيح لسينسيز سيترات في المرضى الذين يعانون طفرة SPG7، غير مرضى SPG7 ARHSP والضوابط

مجمع I II معقدة / III مجمع IV عضلة


المريض 2 0،182 0.132 0.018 المريض 3 0،115 0.14 0.017 ضوابط 0.227 ± 0.037 0.217 ± 0.032 0.0196 ± 0.0043 عدم SPG7 ARHSP 0.185 ± 0.085 0.211 ± 0.116 0.171 ± 0.012 بالخلايا العضلية الجذعية


المريض 2 0.09 0.27 0.025 المريض 3 0،044 0.28 0.018 ضوابط 0.158 ± 0.046 0.288 ± 0.046 0.027 ± 0.011
± فاصل الثقة 95٪.


الجدول 1
الاشعال وشروط إتمام المشروعات SPG7
اكسون التمهيدي إلى الأمام التمهيدي العكسي الصلب temperatue (° C) ملي MgCl 2 PCR حجم المنتج (بي بي) 1 5 'ATCACGCAGGCGCGGCTTTCAG 3' 5 'CTGGGCCTTACAGAGCAGA 3' 60 15 270 2 5 'AGTCTGCATTGCTTTGGTACT 3' 5 'TAGCTGAGGCGATAAGTGTG 3' 57 15 228 3 5 'GGAGTACACTGTTGTCCTGT 3' 5 'ACAGAAATGTAAAGACATCCAG 3' 55 15 226 4 ا 5 'AAGCTCTGGATGTCGCCCGT 3' 5 'AGGAAATGCTGCCTCCGCTG 3' 57 15 193 4B 5 'GCGGTTGTCATGAGCCTCCT 3' 5 'CTCACTCTCACAGGCTGCCA 3' 57 2.0 241 5 5 'GACTGTAGGGTTGCTCGTCT 3' 5 'CAGATTACAAAGCCAAGTTAGG 3' 55 15 260 6 5 'TTGGAAGCCTGCGTCTGTCA 3' 5 'GTATTCAGCAAACACAAACCAG 3' 57 15 225 7 5 'CTGGCATCGTGCTGCTGATT 3' 5 'CCCTTCTGGGAGAGGAGGA 3' 57 15 257 8 5 'AGTGTTGCATTGTCTGCTGC 3' 5 'ATGTGTGAAAGGAGCCAGGT 3' 57 2.0 252 9A 5 'CCTTGGTGTAGAACTTTGTCT 3' 5 'TGTTGGAGAAGCCGGACATG 3' 55 15 221 9B 5 'GCATCGTCTACATCGATGAG 3' 5 'CCTGTTCTGAAAGACATCGG 3' 55 15 187 10 5 'TCCCTCCTGTGTCCTGAAGG3 " 5 'CCAGACCACTCAGAGCGAGT 3' 57 15 283 11 5 'ACCTGTGGCAGTAACTAGGT 3' 5 'GCCTTGATGCTGTTTGCGCA 3' 57 15 211 12 5 'CTCTTAAGCCCTGATAGCAG 3' 5 'TCACCTCTCAATACCTGCCT 3' 55 2.0 252 13 5 'GTCTCGAACTCCTGTCCTCA 3' 5 'AGTCAGCTACAGACACAGGC 3' 60 15 300 14 5 'ACGGAGACCTCTTAGTCCCA 3' 5 'CATGGCATGCACTGGAACAG 3' 55 2.0 321 15 5 'ACTGCTCTGCGCCTGCAGT 3' 5 'CCTTGTGTGGTAGACCCA 3' 57 15 294 16 5 'TCTGTGCTTTGGTGCTGGAG 3' 5 'ACCGTGGGTGCTGTGTGGA 3' 57 15 206 17 5 'ACATGCATATGCCTGTTCTTT 3' 5 'CTCAGCTGAAAAGCAACTCAG 3' 55 15 312
تحليل خزعة العضلات

أجريت الخزعات العضلية مفتوحة تحت مخدر موضعي من الوحشية المتسعة في اثنين من المرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7. تم تحليل العضلات لردود الفعل النسيجية القياسية بما في ذلك متتابعة السيتوكروم أوكسيديز وردود الفعل نازعة سكسينات. عينات العضلات من كل من المرضى، وأعدت أيضا أربعة مرضى إضافية مع ARHSP ومنهم من الربط SPG7 قد استبعدت و19 العمر كعينة ضابطة ويعاير لالميتوكوندريا I معقدة، II / III، IV وسينسيز سترات كما هو موضح سابقا (شابيرا وآخرون .، 1990). تم تصحيح أنشطة سينسيز سترات والبروتين (Biorad)، وذلك باستخدام ألبومين المصل البقري كمعيار قياسي. وقد تم قياس السلسلة التنفسية النشاط المعقد أيضا في شظايا الميتوكوندريا المعزولة من myoblasts مثقف بواسطة الطرد المركزي التفاضلي من كل من المرضى وتسعة في العمر كعينة ضابطة.

النتائج

التنميط الجيني والربط تحليل

تم استبعاد الربط موضع SPG7 في 14 من 20 ARHSP قبيلة (لا تظهر البيانات). لم يستبعد ست عائلات المتبقية نظرا لحجم نسب صغيرة أو علامات uninformative. لذا تم فحص واحد الفرد المصاب من كل من هذه العائلات إلى جانب متفرقة الحالات الشلل النصفي التشنجي 29 للطفرات SPG7.
الكشف عن الطفرات

بعد تحليل SSCP الأولي وتسلسل كل التحولات التنقل، تم تحديد ما مجموعه 12 التغييرات تسلسل متخالف في المناطق ترميز الجين SPG7. أربعة تم الإبلاغ سابقا الأشكال. ثلاثة تغييرات تسلسل الأخرى المحفوظة، 120G → A (G40G)، وقد تم تحديد 1816C → T (G605G) و2283G → A (Q761Q)، وأيضا في عينات مراقبة، وتحديد لهم كما الأشكال الجديدة. لم تحديد خمسة تغييرات تسلسل الترميز المتبقية في 200 الكروموسومات السيطرة، ودعم هذه الطفرات المسببة للأمراض كما. وقد تم تحديد وسبعة الأشكال intronic إضافية أيضا في عينات المريض والسيطرة عليها. ويرد موجز من الأشكال SPG7 والترددات النسبية في المريض والسيطرة الكروموسومات في الجدول 2.
في المجموع، تم تحديد ستة SPG7 الطفرات، خمسة منها رواية (الجدول 3). وكان اثنان من المرضى (1 و 2) الزيجوت المركبة، كل من لديه اثنين من الطفرات المختلفة. المريض 1 زيارتها لديهم تاريخ عائلي موحية من الميراث مقهورة، ولكن كان المريض 2 متفرقة. مريض مزيد متفرقة (3) ظهرت في البداية على تحمل سوى طفرة متخالف واحدة، وحذف 9 غليان في اكسون 11 (1450-1458del9) التي سبق ارتبط الممكن راثي الميراث المهيمن. التسلسل المباشر لجميع الإكسونات المتبقية في هذا المريض كشف التغيير الثاني في تسلسل اكسون 15، 2026C → T (F676L)، التي لم تنتج تحولا التنقل مرئية على SSCP تحت أي ظرف من الظروف اختبارها. وبالتالي زوج جديد من الاشعال تحتوي على تغيير تسلسل في قاعدة الأولى من التمهيدي العكسي تصميم، وPCR في ظل الظروف الأمثل تضخيم بنجاح DNA المريض ولكن أيا من 100 عينة السيطرة، ودعم هذا النحو الطفرة الثانية في هذا المريض.
الخصائص السريرية للمرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7

ارتبطت طفرات SPG7 مع الظواهر HSP معقدة بنسب مختلفة في جميع المرضى الثلاثة (الجدول 4). عمر البدء يتراوح 11-19 عاما، مع التدهور التدريجي ببطء. كل ذلك أظهر زيادة لهجة في جميع أطرافه الأربعة، أكثر وضوحا في الساقين، مع قوة الحفاظ نسبيا. وكان المرضى 2 و 3 على حد سواء مثلت علامات المخيخ، مع أطرافهم وترنح، والتلفظ ورأرأة. ولم يكن لدى أي من المرضى ضمور العصب البصري.
وأظهرت مسح الدماغ بالرنين المغناطيسي في المرضى الذين يعانون 2 و 3، الذي كان وترنح، وضمور المخيخ (الشكل 1). ولوحظت مجالين صغيرة من الآفات عالية إشارة T2 حول البطينات الدماغية من أهمية مؤكدة أيضا في المرضى 2. المظاهر MRI من الحبل الشوكي والطبيعي في جميع المرضى الثلاثة. EMG، كانت طبيعية أيضا دراسات التوصيل العصبي والاستجابات البصرية أثار في المرضى الذين يعانون 2 و 3.

تين. 1 محوري T2 التصوير بالرنين المغناطيسي في المرضى 3 تظهر ضمور المخيخ.

كان كلا الوالدين من المريض 3 على الفحص العصبي الطبيعي كجزء من هذه الدراسة. وكان المريض 1 نتاج زواج ابن عم الأول، وكان أربعة أشقاء وشقيقة واحدة. التاريخ، كما قد تأثرت أخ واحد. ومع ذلك، كانت لا أفراد العائلة الأخرى المتاحة للفحص، على الرغم من أن الآباء قد سبق فحص وشعروا أن تكون طبيعية. كان والدي المريض 2 كما لا تتوفر (توفيت والدته، ورفض الأب أن تشارك)، ولكن لم يكن لأيهما تشوهات عصبية أو المشية قبل التاريخ.
تحليل خزعة العضلات

خزعات العضلات من المرضى 2 و 3 أظهر كلا من التغيرات من إزالة التعصيب مع عودة التعصيب محدودة. في كل حالة، أظهرت الألياف الكتابة فائض ملحوظ من النوع 1 الألياف مع العديد صغير، ضامر، والألياف مزوى، في الغالب من النوع الثاني. واعتبرت أي ألياف خشنة الحمراء، ورغم وجود عدد قليل من متناثرة السيتوكروم ج-أوكسيديز سلبي الألياف في جميع أنحاء الخزعات والبقع أكسدة، بما في ذلك سكسينات نازعة، واعتبرت ضمن الحدود الطبيعية بالنسبة لعمر في المرضى.
ويظهر تحليل الميتوكوندريا وظيفة السلسلة التنفسية في العضلات من المرضى 2 و 3 في الشكل 2. مقارنة مع الضوابط، وأنشطة لتصحيح سينسيز سيترات لأني معقدة ومعقدة II / III انخفض تحت نطاق السيطرة يعني في كل من المرضى، في حين أن النشاط الرابع معقد يبدو الحفاظ نسبيا (الشكل 2 A). وكانت صورة مماثلة واضحة عندما تمت مقارنة اثنين SPG7 المرضى طفرة مع المرضى ARHSP الآخرين ومنهم من الربط SPG7 قد استبعدت، مع أنني معقدة ومعقدة II / III الأنشطة التي تقع تحت يعني الضوابط. ولكن نظرا لصغر حجم العينة في هذه المجموعة، وكانت فترات الثقة لأنشطة مكافحة يعني كبيرة والاختلافات غير الجوهرية (الجدول 5). كما أظهر الجهاز التنفسي المقايسات وظيفة سلسلة حول الكسور الميتوكوندريا المعزولة من myoblasts مثقف في كل من المرضى طفرة SPG7 انخفاض في سترات لتصحيح سينسيز الأنشطة المعقدة أنا خارج الخطأ القياسي لأسعار السيطرة متوسط، على الرغم من / الأنشطة المعقدة II III ومجمع IV كانت في وضعها الطبيعي مجموعة (الشكل 2 B).

تين. 2 التنفسي سلسلة النشاط المعقد تصحيح لسينسيز سترات. يتم التعبير عن بيانات التحكم كما يعني فاصل الثقة ± 95٪. أعرب النشاط الرابع معقدة × 10. (A) في العضلات المتجانسة. (B) بالخلايا العضلية الجذعية الكسور الميتوكوندريا.

نقاش

منذ اكتشاف SPG7 كما الجين الأول المسؤول عن ARHSP، تم الإبلاغ عن الطفرات أربعة فقط. ثلاثة وقعت في الأنساب الأقارب تمتلك طفرات متماثل، في حين تم العثور على معظم ذكرت مؤخرا متخالف 9 الحذف غليان في اكسون 11 (1450-1458del9) في الأب وابنه من عائلة والذي اقترح الممكن راثي الميراث المهيمن. حددنا ستة SPG7 الطفرات، في حالة واحدة من عائلة مع الممكن راثي الميراث المتنحية، وحالتين HSP يبدو متفرقة. كانوا جميعا الزيجوت المركبة لمدة طفرات منفصلة. هذا أمر غير مألوف بالنسبة للمريض 1 الذي كان نتاج الآباء الأقارب. ولوحظ وجود النمط الظاهري مماثلا مع رنح مخيخي بارز في الحالتين متفرقة. وقد تم تحديد الطفرات في أي من ستة راثي المرضى HSP المتنحية من الأسر ومنهم من الربط إلى مكان SPG7 لا يمكن استبعاده.
الشكل 3 يبين توزيع الطفرات في SPG7. الطفرات مغلطة اثنين في المريض 1 تحدث في مجالات وظيفية الحفظ للغاية. طفرة A10S في اكسون 1 نتيجة في الاستعاضة عن مسعور مع بقايا الأحماض الأمينية ماء في الببتيد زعيم paraplegin. وتحتاج هذه قصيرة تسلسل الأحماض الأمينية في N-محطة للبروتينات الميتوكوندريا المشفرة النووية لتشكيل الأساسي، الحلزون متقابلة الزمر من أجل السماح استهداف البروتين على الميتوكوندريا (يثغو، 2000). لذا من المتوقع إدخال ماء بقايا الأحماض الأمينية في الببتيد زعيم لعرقلة توطين الميتوكوندريا من paraplegin. الطفرة الثانية، G577S، ويقع ضمن الحفاظ ملزم الزنك عزر (HESGH)، وتوفير مزيد من الأدلة لأهمية وظيفية لهذا المجال في paraplegin.

تين. 3 التمثيل التخطيطي للجين SPG7 تبين المجالات والمواقع من الطفرات وظيفية.

في المريض 2، وطفرة مغلطة في اكسون 13 (A572V) النتائج في استبدال حمض أميني اثنين من مخلفات قبل المجال ملزم الزنك. على الرغم من أن كلاهما غير القطبية، والأحماض الأمينية مسعور صغيرة، ووضع نماذج من البروتين متحولة مع برنامج التنبؤ GOR4 (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl أظهرت) التشكل المتغيرة في المنطقة المجال ملزم الزنك من نمط لفائف α-الحلزون α حلزون عشوائي إلى حبلا الموسعة. هذا تغيير في هيكل الثانوي من المرجح أن يعطل النشاط الوظيفي لهذا المجال. الطفرة الثانية في المريض 2، حذف 29 نقطة أساس في اكسون 8 (1057-1085del29)، هي ضمن كاسيت AAA التي تنطوي على جزء من عزر ATP ملزم الحفظ جدا. فإنه يؤدي إلى انزياح الإطار مع كودون وقف سابق لأوانه في بقايا 385، وتوقع أن تسفر عن بروتين اقتطاع.
في المريض 3، وكانت طفرة واحدة حذف 9 غليان في اكسون 11 (1450-1458del9) ذكرت سابقا طفرة المهيمنة الممكن راثي (ماكديرموت وآخرون، 2001). هذا هو داخل الكاسيت AAA، مما أدى إلى فقدان ثلاثة أحماض أمينية (E، R، R484-486del). فشل تحليل SSCP أيضا لتحديد طفرة ثانية في مريضنا، وكان فقط عن طريق التسلسل المباشر لالإكسونات المتبقية التي تغير تسلسل آخر، 2026C → T (F676L)، تم الكشف. الفحص العصبي للوالدين، سواء في 70S، وأعراض، كان طبيعيا تماما. وأكد تسلسل الإكسونات اثنين في كل من الآباء والأمهات أن الأم قامت بحذف 9 غليان في اكسون 11 والد طفرة مغلطة في اكسون 15. وفي هذه الحالة، 1450-1458del9 يعمل بشكل واضح بطريقة مقهورة مع مزيج من اثنين الطفرات متخالف المطلوبة لإنتاج النمط الظاهري المرض. لم استبدال F676L لا تحدث في مجال وظيفي واضح داخل paraplegin. أنه يؤدي إلى إحلال يسين للفينيل ألانين، ولم يتم الكشف عن هذا التغيير في 200 الكروموسومات السيطرة، ودعم دورها بوصفها الطفرة المسببة للأمراض.
فشل التحليل النسيجي للعضلات من اثنين من المرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7 لإظهار التغيرات المورفولوجية عنها سابقا مرتبطة بضعف الفسفرة التأكسدية، على الرغم من كل ما زالوا متنقل وأقل تضررا من الحالات السابقة. غياب هذه الميزات على خزعة العضلات وبالتالي لا يمكن أن تستبعد SPG7 كسبب للمرض. وتمثلت النتيجة متسقة الوحيد من التغييرات إزالة التعصيب مع وجود فائض من نوع الألياف I مما يعكس على الأرجح منذ فترة طويلة التشنج.
الميتوكوندريا الأنشطة السلسلة التنفسية في العضلات من المرضى 2 و 3، ومع ذلك، أظهرت انخفاضا في مجمع الأول ومجمع النشاط II / III مقارنة مع الضوابط، وعندما تصحيح لسينسيز سترات. وتم الحصول على نتائج مماثلة عند مقارنة مع المرضى الآخرين مع ARHSP ومنهم من قد استبعدت الطفرات SPG7، مما يشير إلى أن هذا التأثير قد لا تعكس ببساطة تأثير على العضلات من التشنج منذ فترة طويلة وقلة الحركة. ولكن نظرا لقلة عدد المرضى غير SPG7 ARHSP، والاختلافات بين المجموعتين لم تصل دلالة إحصائية.
وشملت دراسة سابقة من سلسلة وظيفة الجهاز التنفسي في العضلات من المرضى HSP اثنين من المرضى الذين يعانون من ARHSP، ومنهم من تم استبعاد طفرات SPG7 (بيمونتي وآخرون، 2001). كان واحدا من هذه التغيرات النسيجية مميزة مرتبطة بضعف الفسفرة التأكسدية، وسواء كانت معزولة أوجه القصور I المعقدة. أظهرت دراسة حديثة من وظيفة الميتوكوندريا في المرضى الذين يعانون HSP ومنهم على حد سواء SPG4 وSPG7 الطفرات قد استبعدت أيضا انخفاضا في كل من الأنشطة IV I ومعقدة تعقيدا (ماكديرموت وآخرون، 2003)، مما يوحي بأن العيوب السلسلة التنفسية قد يكون أمرا شائعا أكثر من شكل واحد من ARHSP.
نمط معقد نقص I-III في العضلات والهيكل العظمي مماثلة لتلك التي وجدت في أنسجة القلب من المرضى الذين يعانون من ترنح فريدريك (برادلي وآخرون، 2000). في رنح فريدريك، ويعتقد أن نقص frataxin أن يؤدي إلى تشكيل كتلة الحديد الكبريت غير طبيعي في سلسلة بروتينات الجهاز التنفسي، مما يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي والتلف. ويعتبر هذا النمط من نقص معقدة I-III أيضا في الماوس SOD2 خروج المغلوب (Melov وآخرون، 1999). ولذلك فمن الممكن أن نمط التنفس سلسلة خلل في العضلات من المرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7 قد تمثل ضرر الجذور الحرة بوساطة الزائد. حقيقة أنه ليس هناك سوى خلل في النشاط I معقدة وقد لوحظ في myoblasts قد تمثل مجرد تراكم الضرر التأكسدي في ثابت بدلا من تقسيم الأنسجة.
تظهر الطفرات SPG7 أن يكون سبب نادر نسبيا من HSP، التي تم تحديدها في ثلاث فقط من أصل 49 (6٪) من المرضى دراستها. هذا الرقم، ومع ذلك، ينبغي اعتبار الحد الأدنى للتقدير كما SSCP قد فشلت في الكشف عن الطفرات. بالإضافة إلى ذلك، يوضح هذه الدراسة أيضا أن مركز SPG7 هو متعدد الأشكال للغاية. SSCP ليس أداة فعالة لفحص للطفرات، والتسلسل المباشر هو الأفضل.
وباختصار، فقد حددت هذه الدراسة ستة الطفرات في ثلاث حالات جديدة من SPG7 HSP. تم العثور على التغيرات البيوكيميائية، ولكن ليس النسيجية في عينات العضلات، مشيرا إلى أن معيار خزعة العضلات تلطيخ ليس اختبار تشخيصي مفيدة. وجود ترنح مع HSP، حتى في حالة متفرقة، يجب تنبيه الطبيب إلى إمكانية حدوث طفرات SPG7 كسبب.
المرضية الكامنة التي تنطوي على ضعف الميتوكوندريا قد تجعل هذه الحالات أكثر قابلية للتدخلات العلاجية من الأشكال الأخرى للمرض. هناك حاجة لدراسات إضافية لتحديد وظيفة محددة من paraplegin في الميتوكوندريا الإنسان في الصحة والمرض من أجل تسهيل تطوير علاجات محتملة المعدلة للمرض لهذا النوع من HSP.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #2  
قديم 11-22-2015, 09:54 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي طيف spg4 الطفرات في مجموعة كبيرة من الأسر أمريكا الشمالية وراثي مشلول الشلل النصفي

 

http://archneur.jamanetwork.com/arti...ticleid=781440

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #3  
قديم 11-22-2015, 10:17 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي النقي وراثي جسمي قاهر الشلل النصفي التشنجي: والسريرية، اسريرية، ودراسة وراثية

 

http://jnnp.bmj.com/content/64/1/61.full



وقد وصفت الأهداف لا يقل عن ثلاثة أنواع تمييزه سريريا لكن مختلفة وراثيا من مرض وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي النقي (ADPSP). في هذه الدراسة تمت دراسة الخصائص السريرية، وراثية، العصبية، والتصوير بالرنين المغناطيسي من ADPSP.
طرق ستين ثلاثة على أعضاء خطر من خمس أسر قيمت سريريا. وقد تم إنشاء مؤشر التشخيص للدراسة. تم تحديد المورثات الصغرية للصبغيات 2P، 14Q، وأجريت 15q علامات وتحليلات متعددة الربط. دراسات الساعة التوصيل المحرك المركزي (CMCT)، أثار الحسية الجسدية المحتملة (SSEP) القياس، وأجريت أشعة الرنين المغناطيسي للدماغ والحبل الشوكي الكلي في 16 مريضا من أربع أسر.
النتائج وأعرب عن الملامح الأساسية السريرية لADPSP متجانس في جميع المرضى ولكن تم العثور على بعض الميزات فقط في بعض العائلات وليس في جميع المرضى داخل الأسرة. في عائلتين غير تقدمية "خلقي" كان ينظر ADPSP في بعض أعضاء المتضررين في حين كان الكبار ADPSP تقدمية بداية موجودة في غيرها من أفراد الأسرة المصابين. كعرض الراحل كان المبلغ عنها وغير الموصوفة سابقا الظهر انخفاض بنسبة 47٪. العمر عند بداية تختلف على نطاق واسع، وكان هناك ميل إلى الانخفاض في الأجيال المتعاقبة في الأسر، مما يشير إلى الترقب. تحليل الربط الجيني تقتصر موضع ADPSP إلى الكروموسوم 2p21-P24 في الأسر الخمس. وكانت عشرات اللد التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل متعددة الربط إيجابية مع أقصى درجة اللد مجتمعة Z = 8.60. وأظهرت الدراسات العصبية فقط إطالة طفيفة وضئيلة من الوقت التوصيل المحرك المركزي وكذلك أن التوصيل الطرفية وسلامة الأعمدة الظهرية كانت في معظمها طبيعية. لم الدماغ والحبل الشوكي مجموع MRI عدم الكشف عن أي تشوهات كبيرة مقارنة مع الضوابط.
الاستنتاجات ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24 هو اضطراب غير متجانسة المظهري تتميز كلا interfamilial والاختلاف داخل الأسرة. في بعض العائلات قد يكون المرض "نقية" ولكن اقترح وجود "نقية بالإضافة إلى" الأسر في مناطق أخرى. وقال إن التحقيقات العصبية والتصوير العصبي لا تظهر أي تشوهات كبيرة.
تضم paraplegias تشنجي وراثي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات العصبية النادرة. تقليديا تم تقسيمها إلى مجموعتين، وهذا يتوقف على ما إذا كان اضطراب هو الشلل النصفي التشنجي النقي أو متلازمة أكثر تعقيدا مع الميزات الأخرى المرتبطة بها. 1 وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي النقي (ADPSP) يتميز سريريا من قبل التشنج ببطء تدريجي وضعف في الساقين، فرط المنعكسات، وعلامة بابنسكي، بمشاركة ضئيلة أو معدومة من الأطراف العلوية؛ التعبير phenotypical من ADPSP يجري متغير بدرجة كبيرة، ولا سيما فيما يتعلق العمر عند بداية. من خلال الربط يحلل تم تعيينها ADPSP إلى الكروموسومات 14Q (موضع SPG3)، 2P (SPG4)، و15q (SPG6). 2-4 كما ADPSP في بعض الأسر لا تعين أي من هذه المكاني، الجينات لا تزال مجهولة الهوية إضافية قد الوجود. 5
تقتصر النتائج عصبية مرضية بشكل حصري تقريبا على الحبل الشوكي وتشمل انحطاط مساحات القشري الجانبي تناقص من انخفاض أسفل الظهر إلى مستوى عنق الرحم العلوي. في كثير من الأحيان، وكما وصفت مشاركة مساحات هرمي امتصالب وزيادة انحطاط الناحلة الحزمة من الفقرات القطنية إلى مستوى عنق الرحم العلوي. 6 وجزئيا انعكست هذه النتائج في النتائج اسريرية باستخدام التحفيز المغناطيسي أو الكهربائي عبر الجمجمة من القشرة الحركية، الحسية الجسدية أثار إمكانيات (SSEPs)، ودراسات التوصيل العصبي. 7-9 على الرغم من أن التصوير بالرنين المغناطيسي توفر صورا فائقة من جذع الدماغ، المخيخ، والنخاع الشوكي، إلا سلسلة صغيرة من المرضى الذين يعانون من ADPSP تم دراستها. 10 11 والغرض من هذه الورقة هو تقديم السريرية، اسريرية، والسمات الوراثية في كل من خمس عائلات مع ADPSP، ومناقشة interfamilial والاختلاف داخل الأسرة.
المرضى والطرق

المرضى

تم تفتيش Probands لفي السجلات من العيادة الخارجية العصبية في مستشفى هافيدوفر وفي معهد علم الوراثة الطبية في كوبنهاغن. بعد الموافقة المسبقة، وشوهد أفراد الأسرة في المنزل أو في المستشفى. تم التشخيص على أساس وجود تاريخ عائلي موثقة جيدا ومعايير التشخيص من هاردينغ 1 وبروين وScheltens. 12 وكانت معايير الحد الأدنى للتشخيص التشنج في الأطراف السفلية، عادة ما تكون أكثر وضوحا من الضعف، وردود الفعل وتر مفرط، وعلامة بابنسكي . وقد تم إنشاء مؤشر لتشخيص الدراسة (الجدول 1).

الجدول 1
مؤشر لتشخيص ADPSP

تم فحص ثلاث وستين شخصا من خمس أسر (المعين AE) شخصيا، باستثناء ثلاثة أشخاص من عائلة و(IV-10، V-7، V-8، التين 1)، الذين يعيشون في السويد. كل ثلاثة، ومع ذلك، تم الإبلاغ عن عدد من أفراد الأسرة أن تتأثر وأكد تاريخهم اتصال هاتفي. وقد تم تعيين الأشخاص الذين قد لقوا حتفهم كما تتأثر إذا قيل لهم كان "المرض الأسرة" بأكثر من واحد من أفراد الأسرة أو من خلال سجلات المستشفى. تم الحصول على عينات من الدم لعزل الحمض النووي.

الشكل 1
الأنساب من العائلات الخمس (AE) مع ADPSP. الأرقام المذكورة أعلاه رموز تشير العمر عند بداية.

A ثلاث نقاط على نطاق والدرجات الوظيفية، من تعديل بيهان ومايا اعتمد للدراسة. 13 درجة 1 يناظر المريض غير متناظرة مع وجود علامات الهرمية في الأطراف السفلية مع مشية عادية أو تشنجي فقط قليلا. الصف 2 يشير إلى المريض مع مشية تشنجية، وقادرة على المشي بشكل مستقل مع أو بدون دعم. الصف 3 يشير إلى chairbound أو مريض طريح الفراش.
وخضع خمسة مرضى من عائلة A، أربعة مرضى من العائلة B، أربعة مرضى من عائلة C، وثلاثة مرضى من عائلة D، بدءا من الصف 1-3 التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة والدراسات SSEP، والرنين المغناطيسي للدماغ والحبل الشوكي. لأسباب جغرافية كان المرضى من E الأسرة غير متوفر للدراسات اسريرية.
دراسات الربط الجينية

تم استخراج DNA الجينومية من الكريات البيض باستخدام إجراءات القياسية. تم تحديد المورثات الصغرية لSPG3، SPG4، وSPG6 مواضع. واحد من كل زوج التمهيدي ونهاية المسمى، وذلك باستخدام (γ- 32 P) ATP وكيناز عديد النوكليوتيد T4 (فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية).
وأجري تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في نظام بيركن إلمر GeneAmp PCR 2400 باستخدام الشروط التي قدمها برجر وآخرون 14 مع تعديلات طفيفة: كانت التليين درجات الحرارة 59 درجة مئوية لمدة D2S400. 57 ° C لD14S266، D14S269، وD15S156. 55 ° C لD15S128 وD15S986.
تم احتساب الدرجات اللد عن طريق تحليل متعددة باستخدام برنامج LINKMAP من حزمة FASTLINK 15 مع علامات وضعه وفقا لخريطة Généthon. 16 وكانت علامات والمسافات (سم) المستخدمة لتحليل متعددة كروموسوم 2: D2S400- (0.0) - D2S352- (0.01) -D2S2351 - (0.01) - D2S2374 - (0.0) - D2S367. كروموسوم 14: D14S266- (6.0) -D14S269. كروموسوم 15: D15S128- (8.0) -D15S156.
تقنيات الكهربية

أجريت المركزي الساعة التوصيل السيارات (CMCT) القياسات على اليمين واليسار الخاطف القصيرة لإبهام اليد، العضلة ذات الرأسين العضدية، المتسعة الإنسية، عظام الساق الأمامية، باسطة القصيرة، والمبعدة لإبهام العضلات. وضعت القطب المشاركين في midpart من العضلات، وإشارة على القاصي وتر للتسجيل الكهربائي. تم تحديد عتبة السيارات كما أدنى كثافة التحفيز التي أعطت أثار لاستنساخه المغناطيسي المحتملة (MEP) مع اتساع تتجاوز 50 μV في خمسة المحفزات متتالية. طبقت التحفيز للمنطقة القشرية المقابل تمثل العضلات، على النحو المحدد في المنطقة مع عتبة أدنى المحرك. طبقت كل التحفيز مع استرخاء (غير سهل) العضلات. كانت كثافة التحفيز 1،5 × عتبة الحركية. طبقت تحفيز عنق الرحم وأسفل الظهر. تم قياس الكلية والرقبية القطنية الإختفاء وحسبت CMCTs.
وقد تم الحصول على SSEPs من تحفيز الأعصاب متوسط ​​اليسار واليمين في المعصم والأعصاب عظام الساق في الكعب الإنسي. وقد تم الحصول على SSEPs من الأعصاب متوسط ​​من وجهة Erbs، C7، من وإلى المنطقة التالية للتلم المركزي المقابل. سجلت SSEPs من الأعصاب عظام الساق من المنطقة الألوية، Th12، ومن المنطقة postvertex. كانت كثافة التحفيز نحو 50٪ أعلى من الحد الأدنى لانكماش مرئية للالقصيرة المبعدة لإبهام والمبعدة لإبهام العضلات. وقدمت تقريرا مفصلا للطريقة والبيانات المعيارية التي كتبها بيدرسن وTrojaborg. 17 وتمت مقارنة النتائج من جميع القياسات مع النتائج من الاصحاء مع التقدم في السن وارتفاع توزيعات مماثلة.
التصوير بالرنين المغناطيسي

أجريت الدماغ والحبل الشوكي MRI في 1.0 تسلا نظام فائق التوصيل (سيمنز الأثر). تم تصوير الدماغ باستخدام المحورية والاكليلية تدور مزدوج تسلسل صدى (مللي 2200/20/80 (الوقت التكرار (TR) / صدى الزمن (TE) / صدى الزمن (TE)))، والسهمي T1 المرجحة تدور الصور صدى (570 / 15 (TR / TE)). في النخاع الشوكي تم الحصول السهمي تدور مزدوجة الصور صدى (مللي 2200/20/80 (TR / TE / TE)) وT1 الصور المرجحة (500/15 (TR / TE)). تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي مماثلة في ضوابط صحية مطابقة للعمر والجنس. اثنين من أطباء الأشعة خبرة تقييم الصور من المرضى والضوابط وذكرت بتوافق الآراء لعلامات أمراض. تم تقييم المخ، المخيخ، جذع الدماغ، والنخاع المستطيل وجود ضمور على نطاق والدرجات ثلاث نقاط (0: لا ضمور؛ 1: ضمور خفيف؛ 2: ضمور شديد). احصي الآفات Hyperintense على T2 الصور المرجحة وولوحظ أي علامة أخرى من الأمراض. تم تقييم النخاع الشوكي لوجود ضمور في T1 الصور المرجحة وفحص للآفات hyperintense على T2 الصور مرجح.
إحصائيات

وتمت مقارنة العمر في توزيعات الحدوث قبل اختبار كروسكال واليس والمتوسطات التي كتبها t الاختبار. تم فحص العلاقة بين CMCT والارتفاع عن طريق الانحدار الخطي. وتمت مقارنة الترددات χ 2 الاختبار. واتخذت مستوى الدلالة 0.05.

النتائج

كان ميراث السائد واضح من الأنساب (الشكل 1). لم يكن لوحظ انتفاذ غير مكتملة. في الفحص السريري من 63 شخصا، 30 استوفى معايير مؤشر ADPSP 3 (الجدول 2). وسجل اثني عشر شخصا من عائلات A، B، C، D و0-1، 1 أو 2، تسعة منهم ليس لديه أعراض، ولكن كشف علامات في الامتحان. وكان ثمانية عشر شخصا من دون أي أعراض أو علامات ADPSP (مؤشر ADPSP 0). في جميع المرضى كان بداية غدرا وتقتصر على الساقين.

الجدول 2
مؤشر التشخيص والعمر عند بداية ومدة المرض، ودرجة الإعاقة (متوسط، المدى) في خمس عائلات مع ADPSP

الجدول 2 يبين الأعمار في بداية في الأسر الخمس. سن بداية المتنوعة داخل وبين العائلات على حد سواء، إلا أن خمسة توزيع الأعمار في بداية لا تختلف كثيرا ووجدنا هناك فرق الجنس. لم نكن قادرين على تحديد وقت مبكر أو متأخر الأسر الظهور الموافق المعايير المقترحة من قبل هاردينغ، 18 فيما عدا أسرة B. التي قد تكون عائلة بداية مبكرة. تم العثور على ميزة وليس وصفها من قبل في الأسر A و E، التي كان خمسة أعضاء بداية الطفولة غير تقدمية في حين كان غيرهم من أفراد الأسرة المصابين المراهق التدريجي أو بداية البالغين. 32 أزواج الآباء والأبناء ومنهم من تضرر كل من الأم والطفل (مؤشر ADPSP 3)، وقعت بداية من ADPSP في العقد السابق من الحياة في الطفل مما كانت عليه في الأصل في 24 زوجا ("المجموعة تحسبا") وفي العقد نفسه أو في عقد لاحق في ثمانية أزواج (P <0.01). للقضاء على التحيز التثبت المباشر، تم استبعاد اثنين من أزواج الآباء والأبناء التي تضم مرضى مؤشر. من 30 زوجا المتبقية 22 كانوا في مجموعة الترقب وكان هذا لا يزال فائض كبير (P <0.02)، مما يشير إلى الترقب. وكان متوسط ​​العمر عند بداية للنسل في نقل الأب 20.6 عاما، وعلى نقل الأمهات 27.2 عاما ولكن الفرق لم يكن كبيرا. في كل خمس أسر كان المتوسط ​​لدرجة العجز 2 وهو ما يتفق مع المسار إلى حد ما "حميدة" من ADPSP. رجلين من الأسر C (II-3) وE (II-1)، مع تقدم العمر عند بدء في 40 و 41 عاما هم المرضى chairbound الوحيد. في كلتا الحالتين كان المرض التدريجي بسرعة مع مدة تسعة فقط و 12 عاما حتى تم يجمد فيها.
الجدول 3 يلخص توزيع المظاهر السريرية المحدد في 30 مريضا مع مؤشر ADPSP 3. جميع المرضى، باستثناء ثلاثة مع ظهور الأعراض من مرحلة الطفولة، وكان معالم السيارات العادية. وكانت الأعراض الأولية الأكثر شيوعا تصلب في الساقين (93٪)، تليها الأحذية السريعة البالية، وخاصة في الخارج في الجبهة (87٪)، وعدم الثبات بالمشي (87٪). كعرض أواخر أفيد انخفاض آلام الظهر بنسبة 47٪ من المرضى.

الجدول 3
الأعراض والعلامات في 30 من الأشخاص المتضررين (مؤشر ADPSP 3) في الأسر الخمس

لاختبار وجود ارتباط بين مدة المرض وحدوث ستة الخصائص السريرية تم تقسيم المرضى الذين يعانون من مؤشر ADPSP 3 إلى مجموعتين وفقا لما إذا كانت مدة المرض كان أكثر أو أقل من 10 عاما. حدث انخفاض آلام الظهر لأقل نسبيا المرضى إذا كانت مدة المرض كان أقل من 10 عاما مما لو كانت مدة أكثر من 10 سنة (2 من 7 = 29٪ ضد 12 من 23 = 52٪). أيضا لفرط المنعكسات العلوي أطرافه، وضعف في الساقين، وانخفاض الشعور الاهتزاز، والأعراض البولية، ورأرأة النسب كانت أقل لمجموعة من المرضى الذين يعانون من قصر مدة. ومع ذلك، ربما يرجع ذلك إلى أي مجموعات صغيرة من الاختلافات كانت كبيرة.
وقد تم الحصول على عشرات اللد إيجابية للعلامات SPG4 على الصبغي 2P مع أقصى درجة متعددة اللد للالجمع بين خمس عائلات من Z = 8.60 (لا تظهر البيانات).
يحلل الربط في مواضع ADPSP على الكروموسومات أظهرت 14Q و15q recombinations في كل واحد منهم في كل خمس أسر. لذلك النمط الظاهري من غير المرجح أن يكون سبب حدوث تحور في جين ينتمون إلى واحدة من تلك مواضع اثنين. وهكذا تحليل الربط تقتصر موضع ADPSP إلى الكروموسوم 2p21-P24 (SPG4) في كل من أسر خمسة.
في الفحص الكهربية كانت SSEPs وضعها الطبيعي في تحفيز الأعصاب الوسيطة في 15 من 16 مريضا. قدم أحد المريض إطالة طفيف في الوقت التوصيل المركزي. في تحفيز الأعصاب الظنبوب تم العثور على 11 من 16 وضعها الطبيعي. كانت تشوهات في خمسة مرضى بسيطة وتافهة، تقتصر في معظمها على الأطراف السفلية. الرسم البياني مبعثر في الشكل 2 يوضح CMCT في مللي تآمر ضد الارتفاع. لأصابع الباسطة القصير للقيم CMCT تميل إلى أن تكون أعلى للمرضى من لضوابط. لضوابط القيم CMCT زادت في المتوسط ​​مع ارتفاع. وقد لوحظ اتجاه مماثل للمرضى، ولكن الانحدار ليس كبيرا، وربما يعود ذلك إلى عدد قليل. بالنسبة للمرضى ويبدو أيضا أن النقاط المنتشرة إلى حد أكبر حول خط الانحدار مقارنة مع الضوابط. لم نعثر على أي خلافات بين العائلات الأربع وعدم وجود ارتباط بين السن عند بداية ومدة المرض، أي علامة واحدة، والنتائج العصبية.

الرقم 2
المركزي الساعة التوصيل السيارات (CMCT) ضد ارتفاع في 16 مريضا مع ADPSP والضوابط. مجلس التنمية الاقتصادية = باسطة القصيرة. APB = المبعدة لإبهام القصيرة. الدوائر شغل = المرضى. الدوائر المفتوحة = الضوابط. خطوط الانحدار (1) و (4) للمرضى، (2) و (3) لترد على الضوابط: (1) CMCT = -19.46 + 0.23 × الارتفاع. (2) CMCT = 2.20 + 0.08 × الارتفاع، (ن = 28)؛ (3) CMCT = 6.07 + 0.01 × الارتفاع، (ن = 50)؛ (4) CMCT = 1.64 + 0.04 × الارتفاع. كان معامل الانحدار 0.08 أكبر بكثير من 0 (P = 0.01).

التصوير بالرنين المغناطيسي كشف ضمور النخاع الشوكي معتدل في شقيقان من عائلة C؛ في المريض II-1 على مستوى ث 4-6 وII-7 على مستوى ث 3-7. ومع ذلك، أفيد هذه النتيجة عن طريق الأشعة واحد فقط. تم العثور على ضمور القشرية المعتدلة في مريض واحد من الأسرة D (II-10)، وكذلك في عنصر تحكم واحد، سواء كبار السن من 50 عاما. وشوهدت آفات النظر hyperintensity البيضاء في نصفي الكرة المخية في ستة مرضى من عائلات مختلفة أربعة، مقارنة مع شخصين في 15 الضوابط (6 من 16 = 38٪ ضد 2 من 15 = 13٪، والفرق ليس كبيرا). لم اجه المخيخ أو ضمور الدماغ.

نقاش

الربط تحليلات تقتصر موضع ADPSP في كل خمس أسر في الكروموسوم 2p21-P24. وبالتالي فإن الأسر تمثل واحدة ونفس النوع من ADPSP.
كان Interfamilial والاختلاف داخل الأسرة في سن بداية اضح. تذبذب داخل الأسر قد يعكس حقيقة أن العمر عند بداية قد يكون من الصعب للغاية حتى الآن على وجه التحديد، وخاصة في ADPSP، وهو اضطراب ببطء تدريجي، والتي الأعراض يمكن أن تمر مرور الكرام لسنوات كما يتضح من تسعة مرضى من بين 12 مع مؤشر ADPSP 0-1 و 1 و 2.
لم نجد قفزات جيل. وذكر انتفاذ غير مكتملة من قبل بولو وآخرون 19 ولكن كما ذكرت نسبة عالية من المرضى الذين يعانون أعراض في ADPSP يجعلها محفوفة بالمخاطر للنظر تتأثر كما سلف الذين لم يتم فحصها.
هذه الظاهرة من الترقب قد يكون نتيجة لتحيز تجنيد لصالح الأسر التي يتم اكتشاف المرض في وقت سابق من الأطفال مما كانت عليه في الآباء والأمهات على النحو الذي اقترحه Dürr ألف آخرون 11 أو ظاهرة بيولوجية كما هو مبين على الأقل في حالات "خلقي" ADPSP ينظر في الأسر ألف وهاء وغيرها جسمية الاعصاب اضطرابات يورث مثل مرض هنتنغتون، 20 ضمور dentatorubropallidoluysian، 21 وماتشادو يوسف المرض 22 حالة الترقب راسخة والناجم عن استطالة futher للتوسع CAG تكرار في الجينات المعنية.
مثل الدر وآخرون 11 لم نعثر على أي تحيز الوالدين ولكن كان هناك اتجاه نحو انخفاض سن بدء في النسل عندما أحيل جين المرض أبويا مقارنة مع انتقال الأمهات، الذي يوصف أيضا في علاج الاضطرابات العصبية الثلاث المذكورة أعلاه.
كان التباين المظهري واضح، على الرغم من أن المعالم الأساسية لADPSP وأعرب عن متجانس في جميع المرضى. ومع ذلك، وآلام الظهر منخفضة، لا ترتبط سابقا مع ADPSP، كان ينظر في كل خمس أسر، وربما هذا العرض قد يكون نتيجة للشاقة، مشية قعسي من هؤلاء المرضى. خلل تناوبية الحركات، قد تكون ذات صلة رأرأة، والتلفظ إلى الدماغ أو مشاركة المخيخ. ومع ذلك، وقعت تلك الميزات في أقلية من أعضاء المتضررين فقط، وليس في الآخرين من نفس العائلة وأبدا في probands. ولذلك، لا تزال مدرجة تلك الأسر في فئة ADPSP نقية وإصابات أجهزة متعددة، وفقا لتقييم البصرية، والدماغ، أثار الحسية الجسدية الإمكانات، وقد اقترحت الدراسات حركات العين رمشي من قبل الآخرين أيضا. 11 17 23 24
وربما يرجع ذلك إلى اختلافات في المعايير السريرية، في شدة ومدة المرض، والتباين الوراثي، واختلاف تشريحي، وتقنيات التسجيل أن الدراسات العصبية من ADPSP يتعارض نوعا ما، ومتضاربة. لدينا في SSEPs المواد من الأطراف العلوية كانت طبيعية في 15 من 16 مريضا وفقا للتوزيع أعراض وعلامات ADPSP ونتائج بروين وآخرون 25 من 11 من 16 مريضا كانوا SSEPs من الأطراف السفلية ضمن طبيعي مجموعة في حين أن التشوهات في خمسة مرضى كانت طفيفة وضئيلة فقط، وهو على النقيض من ذلك مع نتائج بروين وآخرون، الذين كتبوا عن الشاذ SSEPs عظام الساق العصبية في 20 من 32 مريضا مع ADPSP من تسعة الصلات الأسرية الميراث غير المبلغ عنه في مقابل واحد من 17 ضوابط.
في دراسة CMCT لدينا، التي يؤديها التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة، وكانت من أعضاء البرلمان الأوروبي الأطراف العلوية والسفلية فقط ضمن المعدل الطبيعي، وجدت لا يوجد فرق كبير، مقارنة مع الضوابط، وبين أو داخل الأسر. ومع ذلك، كان هناك ميل لتأخر البرلمان الأوروبي في الأطراف السفلية. في دراسة قام بها نويل وآخرون 7 تم فحص أربعة مرضى ADPSP مع تسجيلات من كل أطرافه العلوية والسفلية. كان لديهم القيم الطبيعية للتسجيلات الطرف العلوي في ثلاثة مرضى ولكن القيم غير طبيعي لأطرافه السفلى في جميع المرضى الأربعة. وثمة مشكلة رئيسية في معظم الدراسات السابقة، ومع ذلك، هو ما إذا كان يتم تطبيق التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة مع كثافة كافية لاستحضار MEP. تأخر أو أن ينظر أعضاء البرلمان الأوروبي غائبة في المرضى الذين يعانون من زيادة عتبة الحركية. في دراستنا لذلك طبقنا التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة مع كثافة المتعلقة عتبة الحركية ونتائجنا تشير إلى أن التوصيل في مسارات السيارات المركزية في معظم الحالات أمر طبيعي وأن إزالة الميالين في أول الخلايا العصبية الحركية ليست ظاهرة المرضية الرئيسية. ولذلك، فإننا نقترح أن آلية الشوكي المحلية قد تكون أيضا تشارك في التسبب في والتشنج.
في دراسة التصوير بالرنين المغناطيسي وصفت ضمور النخاع الشوكي الصدري في شقيقان ولكن فقط عن طريق الأشعة واحد. وهكذا يبدو أن ضمور النخاع الشوكي قد يكون من الصعب تقييم ويفترض أن إيجاد متأخر جدا كما تقييمها نوعيا من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي. أيضا دراسة التصوير بالرنين المغناطيسي للمرضى من عائلة مع X مرتبطة النقي خزل سفلي تشنجي وراثي كشف الحبل الشوكي الطبيعي في المريض الوحيد الذي كان له الحبل الشوكي MRI تنفيذها. 26 MRI للمخ، المخيخ، وكان الدماغ العادي معظمها في مرضانا. Ormerod وآخرون 10 تقريرا عن سبعة مرضى الذين يعانون من مرض وراثي جسمي خزل سفلي تشنجي وراثي إما في شكل نقي (خمس حالات) أو مع ميزات إضافية الذي كان الرنين المغناطيسي للدماغ يقوم به. كان مريض واحد مع شكل نقي الآفات المسألة hyperintensity البيضاء في حين كان التصوير بالرنين المغناطيسي الطبيعي في أربعة مرضى آخرين مع ADPSP. وجدنا الآفات المسألة hyperintensity البيضاء في أقدم ستة مرضى ADPSP مقارنة مع اثنين من الضوابط وفقا للتقصي من زيادة خطية تقريبا في عدد من المتطوعين المصابين بآفات مسألة hyperintensity بيضاء مع الشيخوخة للرجال والنساء في دراسة التصوير بالرنين المغناطيسي من 142 صحي الناس كريستيانسن وآخرون 27
في الختام، الميزات الأساسية السريرية لADPSP مرتبطة أبديت متجانس في جميع المرضى الكروموسوم 2p21-P24 لكن تم العثور على بعض الأعراض والعلامات إلا في بعض الأسر وفقط في عدد قليل من المرضى من تلك الأسر، وهي ميزة في جزء قد تكون مسؤولة عن تعريف متفاوتة من ADPSP من دراسة إلى أخرى. وهكذا يبدو أن ADPSP قد يكون أكثر أو أقل "نقية"، وأنه "نقية زائد" قد توجد عائلات دون أن "معقدة"، ويفترض اعتمادا على حد سواء على طفرة معينة في الأسرة وعلى عوامل وراثية وبيئية غير معروفة تحوير كذلك. توقع، عمر متفاوتة في البداية، وعدم التجانس المظهري قد توحي بوجود تكرار ثلاثي النوكليوتيد غير مستقر كما الطفرة الجزيئية الكامنة، 28 ولكن المزيد من التحقيقات، بما في ذلك الدراسات الجينية الجزيئية، وسوف تكون هناك حاجة لتحديد الجينات المسؤولة ADPSP لتوضيح العمليات الفيزيولوجية المرضية والعمل على تسوية مسألة التصنيف.

شكر وتقدير

تم الحصول على دعم مالي من صندوق أبحاث الجمعية الطبية الدانماركية؛ مؤسسة مستشفى الدانماركية للبحوث الطبية، مقاطعة كوبنهاجن، جزر فارو، وغرينلاند. وسيغني وصندوق غريغرسن بطرس. صندوق لوند Benthine ليلى؛ واعترف الدكتور Eilif ترير هانسن وزوجته انو ترير هانسن صندوق الامتنان. أن هذه الدراسة لم يكن ممكنا من دون مشاركة من المرضى الذين يعانون من ADPSP وأسرهم.

المراجع

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #4  
قديم 11-22-2015, 10:38 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تكوين الوحدة الفرعية متغير والأنسجة محددة من الميتوكوندريا م -aaa البروتياز مجمعات ترتبط راثي مشلول الشلل النصفي

 

http://mcb.asm.org/content/27/2/758.full

البروتيني م -AAA، مجمع بروتين ATP التي تعتمد في الغشاء الداخلي الميتوكوندريا، يتحكم جودة البروتين وينظم التجمع الريبوسوم، وبالتالي ممارسة مهام التدبير المنزلي الأساسية داخل الميتوكوندريا. الطفرات في م -AAA البروتيني فرعية paraplegin تسبب انحطاط محور عصبي وراثي في الشلل النصفي التشنجي (HSP)، ولكن ليست مفهومة أساس لخصوصية الأنسجة غير متوقعة. Paraplegin يجمع مع مفارز Afg3l2 مثلي في المجمعات مغاير بلازميدة قليلة القسيمات التي يمكن أن تكون بديلا عن البروتياز الخميرة م -AAA، مما يدل على الحفظ وظيفية. وظيفة من paralogue الثالث، أعرب Afg3l1 في الماوس، غير معروف. هنا، نحن نحلل تجميع paraplegin إلى متر المجمعات -AAA ورصد الآثار المترتبة على نقص paraplegin في الخلايا الليفية HSP ونموذج الفأر لHSP. تكشف النتائج التي توصلنا إليها التغير في التجمع البروتياز م -AAA في الميتوكوندريا في الأنسجة المختلفة. يمكن تشكيلها Afg3l1 وAfg3l2 مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات والمجالس-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات كل من البروتينات مع paraplegin. وتبين الدراسات تكامل الخميرة النشاط بروتين من هذه التجمعات. نقص Paraplegin في HSP لا يؤدي إلى فقدان م -AAA نشاط الأنزيم البروتيني في الميتوكوندريا الدماغ. بدلا من ذلك، المجمعات Afg3l2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات تتراكم، ويمكن لهذه المجمعات بديلا عن مهام تدبير الشؤون المنزلية م المجمعات -AAA التي تحتوي على paraplegin. لذا فإننا نقترح تشكيل م البروتياز -AAA مع خصوصيات الركيزة تغييرها يؤدي إلى انحطاط محور عصبي في HSP.

الميتوكوندريا هي عضيات الأساسية وتنوعا. وتؤوي تلك المجمعات الجهاز التنفسي المنتجة للطاقة وتمثل المكان الرئيسي لإنتاج الأكسجين التفاعلي المحمول، ولكنها تحمل أيضا ردود فعل الابتنائية حاسمة وظائف مهمة خلال العمليات أفكارك والإشارات الخلوية. كشفت المسوحات البروتين الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة الثدييات المختلفة براعة كبيرة في تكوين البروتين من العضيات، والذي قد يعكس مختلف الاحتياجات الأيضية والمنشطة في خلايا مختلفة (14، 25). ونظرا لأهمية هذه العضيات لالفيزيولوجيا الخلوية، فإنه ليس من المستغرب أن الخلل الميتوكوندريا وقد تم ربط لمختلف الأمراض البشرية السائدة، بما في ذلك اضطرابات الاعصاب (9، 21، 34، 35). وقد تم تحديد الطفرات المسببة للأمراض في كل من البروتينات الميتوكوندريا الميتوكوندريا المشفرة والمشفرة النووية. ميزات مشتركة من اضطرابات الميتوكوندريا هي مجموعة متنوعة هائلة في شدة المرض وخصوصيات الأنسجة ملفتة للنظر. في حين أن هذا يمكن أن تكون على الأقل يفسر جزئيا heteroplasmy في حالة الطفرات الميتوكوندريا، وحاليا غير مفهومة عواقب الأنسجة محددة من الجينات المشفرة النووية المعيبة مع وظائف التدبير المنزلي.
ويتمثل ذلك من خلال استمارة مقهورة من الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP)، والذي كان سببه طفرات في paraplegin، وحدة فرعية من الحفظ ATP التي تعتمد م -AAA البروتيني في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا (29). فقدان النتائج paraplegin في انحطاط محور عصبي من الخلايا العصبية الحركية القشرية، مما أدى إلى جمود وضعف في الأطراف السفلية (8). دراسات مع خميرة الخباز الخميرة المخصصة النشاط المزدوج إلى البروتيني م -AAA لتدهور البروتين وتفعيل (27): أنه تجري مراقبة نوعية البروتين في الغشاء الداخلي ويحط بروتينات الغشاء nonassembled لالببتيدات (4، 22)؛ من ناحية أخرى، فإنه يتوسط معالجة البروتين وبالتالي ينشط بروتينات معينة الميتوكوندريا. وتشمل ركائز التي المشقوق بدلا من التي تدهورت بفعل البروتيني م -AAA السيتوكروم ج الغلوثانيون (12) والوحيدات الريباسي MrpL32 (26). انشقاق MrpL32 من قبل البروتيني م -AAA يضمن تجميع الريباسي وتخليق البروتين داخل الميتوكوندريا وضروري للتنفس (وبالتالي 26).
مثل كل مفارز المعروف البروتياز AAA، paraplegin ينتمي إلى الفصيلة AAA من ATPases ويتميز بوجود وحدة AAA أتباز الحفظ (15). على الرغم من تورطه في أنشطة الخلوية المتنوعة، وهي سمة مشتركة من البروتينات AAA هو أنها تنشط على التجمع هومو أو مغاير بلازميدة قليلة القسيمات فقط. ويفسر هذا من خلال تفعيل النشاط أتباز عن طريق التواصل بين المجالات بين المجالات المجاورة AAA (18، 28). وفقا لذلك، والبروتيني الخميرة م -AAA يشكل مجمع مغاير بلازميدة قليلة القسيمات مبنية من مثلي Yta10 (Afg3) وYta12 (Rca1) مفارز؛ هو المعطل المجمع في غياب فرعية واحدة (4). البروتينات مثلي لYta10 وYta12 موجودة بتواجد مطلق في الخلايا حقيقية النواة متعددة الخلايا (17)، ولكن من المفهوم وظيفة الثدييات البروتياز م -AAA سيئة فقط. وكشفت الدراسات تكامل حفظ الوظيفي للم البروتياز -AAA في الخميرة والثدييات وحددت مجموعة معقدة من paraplegin الثدييات وAfg3l2 (لAFG3 تشبه الجين 2) كما orthologue ظيفية من الخميرة م -AAA البروتيني (5، 26). نموذج الفأر لHSP تفتقر paraplegin يعيد الميزات الهامة من الأمراض التي تصيب البشر ويكشف التدريجي وخلية محددة تنكس محواري في الهابطة طويلة والصعود مساحات في العمود الفقري، في الأعصاب البصرية، والأعصاب الوركي (13). ميزات عصبية مرضية والأدلة التجريبية تشير إلى أن تنكس محور عصبي يرجع في النهاية إلى نقل محور عصبي ضعف. ومع ذلك، واحدة من العلامات الأولى للأمراض هو مظهر من الميتوكوندريا العملاقة وغير طبيعي من الناحية الهيكلية في المناطق البعيدة من المحاور، مما يدل على أن ضعف الميتوكوندريا محددة العصبية يطلق شلال المرضية (13). استنساخ النمط الظاهري الإنسان في نموذج الفأر لافت للنظر باعتبار أن ونديد إضافية من paraplegin، Afg3l1 (لAFG3 تشبه جينات 1)، موجود في الفأرة ولكن المشفرة من قبل جين كاذب في البشر (20).
عواقب الأنسجة محددة من فقدان paraplegin محيرة، وظائف التدبير المنزلي الحاسمة من البروتيني م -AAA، مثل تجهيز الوحيدات الريباسي MrpL32، يتم حفظها من الخميرة للثدييات (27). ومن المتوقع أن يؤدي إلى عيوب في الفسفرة التأكسدية نضوج ضعاف من MrpL32 في الميتوكوندريا الثدييات. ومع ذلك، في حين أن أوجه القصور في التجمع من مجمع لقد تم الإبلاغ عن HSP الليفية المريض (5)، لوحظت فقط العيوب تنفسية خفيفة في الأنسجة الماوس paraplegin ناقصة (13). في الآونة الأخيرة، وقد تم ربط paraplegin لتجهيز بروتين من OPA1 (16)، وهي تشبه dynamin GTPase المحفوظة في الغشاء الداخلي الذي ينظم ديناميات الميتوكوندريا (10). الطفرات في OPA1 سبب وراثي جسمي ضمور العصب البصري المهيمن تتميز خسارة في خلايا الشبكية (1، 11). كما الموسع والميتوكوندريا غير طبيعية تتراكم في المراحل المبكرة في المحاور في Spg7 - / - الفئران (13) ويلاحظ ضمور العصب البصري وأحيانا في أشكال معقدة من HSP وفي نموذج paraplegin الماوس (8، 13)، قد يتم تجهيز OPA1 ضعف من أهمية المسببة للأمراض.
للحصول على مزيد من الإيضاحات بشأن العواقب المترتبة على فقدان paraplegin، في هذه الدراسة، قمنا بتحليل تجميع المفترضة م مفارز -AAA البروتيني في الفئران والإنسان الميتوكوندريا. ونحن لشرح الاختلافات الأنسجة محددة في الوفرة النسبية للم مفارز -AAA البروتيني في الماوس وتقلب غير متوقع في جمعيتهم. وتشكل كل من Afg3l1 وAfg3l2 مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات وكذلك المجالس-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات التي تحتوي على paraplegin. وتشير دراساتنا أن الجمعية تغير من مفارز مثلي بدلا من فقدان كامل للم -AAA نشاط الأنزيم البروتيني ذو أهمية المسببة للأمراض في HSP.
المواد والأساليب

استنساخ الإجراءات على سبيل التعبير في الخميرة، وتنصهر في شكل ناضج من الفئران Afg3l1 (الأحماض الأمينية 25-789) إلى الميتوكوندريا استهداف تسلسل Yta10 (الأحماض الأمينية 1-61). تم استنساخ A جزء HindIII / BamHI DNA التي تحتوي على مروج YTA10 (480 بي بي) وبي بي 1-183 من YTA10 وجزء BamHI / KpnI DNA التي تحتوي على بي بي 73-2367 من Afg3l1 إلى البلازميد YEplac195 multicopy. وعلقت A حاتمة ج. Myc على لمحطة C من Afg3l1 للسماح للمناعي من البروتين الهجين Yta10 (1-61) -Afg3l1 (25-789) -Myc. البلازميدات الخميرة السماح تعبير مغايرة من AFG3L2 البشرية (hAFG3L2) -Myc (في YEplac112 ADH1)، الفئران Afg3l2-هيماغلوتينين (في YEplac112 YTA10)، وparaplegin (في YEplac181 YTA10) والبلازميدات pGEM4-Atp7 وpGEM4-Yme2ΔC لSP6-البلمرة وقد وصفت التعبير -driven في المختبر سابقا (5، 19، 26).
تم المعطل م -AAA مفارز البروتيني من استبدال بقايا الغلوتامات ناشطة تحفيزيا داخل مراكز بروتين مع بقايا الجلوتامين باستخدام QuikChange موقع الموجه عدة الطفرات (Stratagene). وقد تبدل الكودونات منها على النحو التالي: أكاديمية الخليج للطيران إلى الجهاز المركزي للمحاسبات عن hAFG3L2 (الأحماض الأمينية 575) والفئران Afg3l2 (الأحماض الأمينية 574) وGAG لCAG لparaplegin الفئران (الأحماض الأمينية 575) وAfg3l1 (الأحماض الأمينية 567). استخدمت [أليغنوكليوتيد التالية: 5'-GGT CGC CTT CCA TCA GTC TGG CCA TGC C-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-GGC ATG دول مجلس التعاون الخليجي AGA CTG ATG غا GGC GAC C-3" (التمهيدي العكسي) لparaplegin الفئران ؛ 5'-CTG TAG CCT ACC ACC AGG CTG GGC ATG CAG-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-CTG CAT دول مجلس التعاون الخليجي CAG CCT GGT GGT AGG CTA CAG-3" (التمهيدي العكسي) لالفئران Afg3l1. و5'-CGG TGG CTT ACC ACC AAG CAG دول مجلس التعاون الخليجي ATG CGG-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-CCG CAT GGC CTG CTT GGT GGT AAG CCA CCG-3" (التمهيدي العكسي) لالفئران Afg3l2. تم التحقق من الطفرات من تسلسل الحمض النووي.

سلالات الخميرة وظروف النمو. سلالات خميرة الخباز المستخدمة في هذه الدراسة هي مشتقات من W303. تم الحصول على yta10 Δ yta12 Δ (YKO200) سلالة من حذف YTA12 في Δ yta10 (YGS101 [3]) سلالة بواسطة PCR تستهدف إعادة التركيب مثلي باستخدام الحذف كاسيت kanMX6 (23). yta10 Δ yta12 Δ سلالات التعبير عن الإنسان أو تم إنشاء البروتياز الفئران م -AAA (انظر الجدول S1 في المواد التكميلية) من خلال التحول من YKO200 الخلايا مع البلازميدات YEplac112 ADH1 -Yta10 (1-61) -hAFG3L2 (36-798) -Myc، YEplac181 YTA10 -Yta10 (1 -61) -paraplegin (44-781)، YEplac195 YTA10 -Yta10 (1-61) -Afg3l1 (25-789) -Myc، وYEplac112 YTA10 -Yta10 (1-61) -Afg3l2 (36-802) -HA أو البلازميدات ترميز المتغيرات موقع بروتين منها (5، 26).
كانت تزرع خلايا الخميرة وفقا للاجراءات المتبعة عند 30 درجة مئوية في أي من الخميرة، ببتون المتوسط ​​أو الحد الأدنى من المتوسط ​​تستكمل مع auxotrophs المطلوبة. اثنين في المئة (وزن / المجلد) الجلوكوز، أو لعزل الميتوكوندريا، 2٪ (وزن / المجلد) اللبن و 0.5٪ (وزن / المجلد) اللاكتات، أو لفحص نمو الجهاز التنفسي، أضيفت 3٪ (وزن / المجلد) الجلسرين كما مصادر الكربون.

تم تنفيذ BN-PAGE. الأزرق الأصلي الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (BN-PAGE) أساسا كما هو موضح سابقا (30). تم solubilized بروتينات الميتوكوندريا (150 ميكروغرام) المعزولة من الخميرة أو الخلايا الليفية الأولية الإنسان بتركيز 5 ملغ / مل في 1٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 5 ملي ε-جذر الأمينو ن حمض -caproic، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم ATP. بعد زيادة ونقصان توضيح لمدة 30 دقيقة في 125،000 × ز، تم تحميل مقتطفات الصعود إلى 3-13٪ (وزن / المجلد) هلام بولي أكريلاميد. تم الكشف عن مفارز الفردية المجمعات البروتيني م -AAA التي كتبها immunoblotting.

تم solubilized تحليل الترشيح هلام مقتطفات الميتوكوندريا. الميتوكوندريا الخميرة المعزولة التي تحتوي على hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (البروتين 1 ملغ الميتوكوندريا) بتركيز 5 ملغ / مل في 1٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 150 ملي K-خلات، ودرجة الحموضة 7.4، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، 1 ملي ATP. وهي lysed الفئران (1 ملغ الميتوكوندريا البروتين) بتركيز 5 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 50 ملي كلوريد الصوديوم، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 4 مم - الميتوكوندريا الكبد من Spg7 - / MG-خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF. تمت إزالة المواد Nonsolubilized بواسطة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 125،000 × ز، وتعرض طاف لاستبعاد حجم اللوني باستخدام عمود Superose 6. تم جمع البروتينات مزال في الكسور 500 ميكرولتر، حمض ثلاثي كلور أسيتيك (TCA) عجل، وتحليلها بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS) -PAGE وimmunoblotting. وتم قياس كمية البروتينات الموجودة في الكسور شطافة التي كتبها كثافة الليزر.

تقرير من الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني. لمقارنة كميات النسبية paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا، وقد تم تحليل المستخلصات الميتوكوندريا التي كتبها SDS-PAGE وimmunoblotting. كانت مجزأة مقتطفات تحتوي على كميات مماثلة من Afg3l1 بواسطة SDS-PAGE وتحليلها بواسطة immunoblotting باستخدام Afg3l1-، paraplegin-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة و، من أجل السيطرة، الأجسام المضادة الموجهة ضد الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha). وتم قياس كمية البروتين كميات باستخدام نظام التصوير القائم على مضان (أوديسي؛ LI-COR العلوم البيولوجية). تم تطبيع إشارات لAfg3l2 وparaplegin باستخدام Afg3l1 كعنصر تحكم التحميل. تم احتساب الكمية النسبية للparaplegin وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا كنسبة من إشاراتها في كل التحضيرات الميتوكوندريا.

Coimmunoprecipitation وimmunodepletion على سبيل التجارب مناعي، وهي lysed الميتوكوندريا الفئران (400 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) بتركيز 1 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم PMSF تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز (روش). بعد زيادة ونقصان توضيح لمدة 15 دقيقة في 125،000 × ز، تم تحميلها مقتطفات على البروتين الخرز-A سيفاروز (2 ملغ) إلى جانب الأجسام المضادة تنقية تقارب أو مصل preimmune والمحتضنة لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية تحت الهز لطيف. وكانت تغسل حبات في وقت لاحق مع 0.5٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 1 ملم PMSF، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4. ومزال المجمعات الضد مستضد من الخرز ومجزأة على أساس للا مائية وذلك باستخدام 1٪ (وزن / المجلد) تريتون-X114 و 1٪ (المجلد / المجلد) حمض الخليك. تم انتشال البروتينات مزال من الكسر المنظفات التي كتبها TCA هطول الأمطار وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting.
وأجريت التجارب Immunodepletion باستخدام كميات تشبع من Afg3l2 أو الأجسام المضادة Afg3l1C بالإضافة إلى البروتين الخرز-A سيفاروز (10 ملغ). وهي lysed الميتوكوندريا (150 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) بتركيز 0.5 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0 ، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم PMSF تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز (روش) وتطبيقها على البروتين الخرز جانب الضد-A سيفاروز. أجريت الأمطار خارج كما هو موضح أعلاه. تعرض خمسين في المئة من الكسر طاف من هطول الأمطار (الموافق 75 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) لهطول الأمطار TCA، SDS-PAGE، وimmunoblotting.

وأثيرت الأجسام المضادة. الأجسام المضادة الموجهة ضد متر -AAA مفارز البروتيني في الأرانب (BioGenes، ألمانيا) باستخدام الببتيدات الموافق الأحماض الأمينية 121-139 من paraplegin الفئران (C-PEDDEEEKRRKEREDQMYR)، إلى الأحماض الأمينية 90-103 من Afg3l2 (C-KEAVGEKKEPQPSG ) والأحماض الأمينية 104-118 (C-NAGPGGDGGNRGGKG) أو الأحماض الأمينية 771-785 (C-WNKGREEGGTERGLQ) من Afg3l1 (Afg3l1 وAfg3l1C، على التوالي) المناعي النوعي غس الدولية المختصة بالسلع وتنقيته من الأمصال التي كتبها immunoabsorption على الببتيد، مترافق SulfoLink مصفوفة (بيرس) واختباره من قبل immunoblotting ومناعي من الميتوكوندريا yta10 Δ Δ yta12 الخميرة التي تحتوي إما paraplegin، Afg3l1 أو Afg3l2. تم التحقق من خصوصية Afg3l1 وAfg3l2 أمصال مضادة أيضا باستخدام شظايا البروتين الذي يحتوي على مناطق المستضدات المقابلة أعرب في القولونية.
تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة تجاريا للمناعي من الوحيدات 39 كيلو دالتون من مجمع I (Ndufa9؛ المسابر الجزيئية)، الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha؛ المسابر الجزيئية)، ج. Myc على (9B11؛ خلية اشارة التكنولوجيا )، والحواتم هيماغلوتينين (3F10؛ روش).

. متنوعة تم تنفيذ الإجراءات التالية أساسا كما هو موضح سابقا: عزل الميتوكوندريا من الخميرة، والخلايا الليفية الإنسان، والأنسجة الفئران (6، 24، 33)؛ توليف preproteins الميتوكوندريا رديولبلد. posttranslational استيراد البروتين في الميتوكوندريا المعزولة. والتحلل البروتيني من البروتينات المستوردة حديثا (33).

النتائج

مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا الإنسان. Paraplegin وhAFG3L2 مفارز تجميع في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا البشري إلى نشطة وظيفيا البروتيني م -AAA التي كون تشكيلها هو ضعف في خلايا المريض HSP تفتقر paraplegin (5). والمثير للدهشة، تم الكشف عن مجمع عالية الجزيئية الكتلة تحتوي على hAFG3L2 عندما تم solubilized الميتوكوندريا المعزولة من-paraplegin نقص الخلايا الليفية HSP في ديجيتونين وتحليلها بواسطة BN-PAGE. وكانت الكتلة الجزيئية لهذا المجمع ~900 كيلو دالتون ومماثلة لتلك التي للمغاير بلازميدة قليلة القسيمات م -AAA البروتيني تحتوي على hAFG3L2 وparaplegin موجودة في البرية من نوع البشري الميتوكوندريا (الشكل 1A).

تين. 1.
hAFG3L2 يشكل م -AAA مجمع البروتيني-وطي بلازميدة قليلة القسيمات مع نشاط بروتين. (A) مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا الليفية HSP. تم solubilized الميتوكوندريا في ديجيتونين وتحليلها بواسطة SDS-PAGE (50 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين، اللوحة العليا) أو BN-PAGE (150 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين، اللوحة السفلى)، تليها immunoblotting باستخدام paraplegin محددة (اللوحة العليا) وhAFG3L2 محددة ( العلوي والسفلي لوحة) أمصال مضادة. من أجل السيطرة، كانت مجزأة الخميرة yta10 Δ Δ yta12 تحتوي على hAFG3L2 الميتوكوندريا التي كتبها BN-PAGE بشكل متواز. واستخدمت ثايروجلوبولين (669 كيلو دالتون) وصميم الفريتين (443 كيلو دالتون) للمعايرة. (B) صيانة نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ Δ yta12 خلايا الخميرة التي كتبها hAFG3L2. البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا، وyta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا عن hAFG3L2 أو البديل غير نشط proteolytically hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ)، وقد نمت على تخمر (خلاصة الخميرة، ببتون-سكر العنب [YPD]) و nonfermentable (وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلسرين [YPG]) مصادر الكربون في 30 ° C. (C) المجمعات hAFG3L2-هومو بلازميدة قليلة القسيمات في yta10 Δ الميتوكوندريا yta12 Δ. وأعرب عن hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ) في الخلايا Δ Δ yta10 yta12، وتم عزل الميتوكوندريا. بعد الإذابة في المخزن التي تحتوي على ديجيتونين، كانت مجزأة مقتطفات الميتوكوندريا (1 ملغ الميتوكوندريا البروتين) من خلال Superose 6 التحجيم اللوني. وكسور شطافة TCA عجل وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام الأجسام المضادة hAFG3L2 محددة. وكان كميا hAFG3L2 (المربعات شغل) أو hAFG3L2 E575Q (الدوائر شغل) موجودة في الكسور شطافة التي كتبها كثافة الليزر، ويتم إعطاء النتائج كنسبة مئوية من البروتين منها في شطافة الإجمالية. مجمع أصغر hAFG3L2 التي تحتوي على، وضع علامة مع علامة النجمة، أكثر النتائج المحتملة من التفكك الجزئي للمجمع كبير. تم استخدام البروتينات علامة التالية للمعايرة: 1، Hsp60 (840 كيلو دالتون)؛ 2، صميم الفريتين (443 كيلو دالتون)؛ 3، نازعة الكحول (150 كيلو دالتون)؛ 4 البقري albumine المصل (66 كيلو دالتون). (D و E) تجهيز MrpL32 الخميرة وCCP1 التي كتبها hAFG3L2. تم تحليل معالجة البروتين في البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ Δ yta12 الخلايا، وyta10 Δ Δ yta12 الخلايا معربا إما hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ) بواسطة SDS-PAGE. تم رصد (D) نضوج MrpL32 (L32) في الميتوكوندريا المعزولة (30 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من خلال immunoblotting باستخدام أمصال مضادة بولكلونل موجهة ضد ناضجة وأشكال السلائف من MrpL32 و، ​​كما تحكم التحميل، ضد المترجمة مصفوفة Mge1. تم فحص معالجة (E) CCP1 في مقتطفات الخلية باستخدام أمصال مضادة موجهة ضد CCP1 و، من أجل السيطرة، وبروتين الغشاء الخارجي Tom40. ص، السلائف. م، شكل ناضج. (F) تدهور للبروتينات غشاء nonassembled التي كتبها hAFG3L2 أعرب في الخميرة. تم استيرادها رديولبلد Yme2ΔC (اللوحة العليا) أو Atp7 (اللوحة السفلى) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية في الميتوكوندريا المعزولة من سلالات الخميرة المستخدمة لوحات D و E. استقرار البروتينات المستوردة حديثا في 37 ° C تم تحديدها من قبل SDS- PAGE وتصوير الإشعاع الذاتي. يظهر بمعدل ثلاث تجارب مستقلة (± الخطأ المعياري للمتوسط). الساحات شغلها، النوع البري. مثلثات شغلها، yta10 Δ Δ yta12. مثلثات مفتوحة، yta10 Δ Δ yta12 + hAFG3L2. الساحات المفتوحة، yta10 Δ Δ yta12 + hAFG3L2 E575Q.

لدراسة ما إذا كانت hAFG3L2 يجمع مع AAA البروتيني فرعية أخرى أو يشكل مجمع وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الغشاء الداخلي، عبرنا عن البروتين في خلايا الخميرة yta10 Δ Δ yta12 تفتقر إلى أي الوحيدات م -AAA البروتيني. تم عزل الميتوكوندريا من هذه الخلايا وsolubilized في ديجيتونين، وتم تحديد الكتلة الجزيئية الأم من hAFG3L2 بواسطة BN-PAGE (الشكل 1A). تم الكشف عن hAFG3L2 كجزء من مجمع ~900 كيلو دالتون، وبالتالي يشكل مجمع مماثلة في الحجم لأنه في الميتوكوندريا-paraplegin ناقصة الإنسان. وتشير هذه النتائج إلى أن hAFG3L2 يمكن بناء مجمع وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا.
التعبير عن hAFG3L2 استعادة حدها اختصاص الجهاز التنفسي من yta10 Δ خلايا yta12 Δ (الشكل 1B). هذه الملاحظة هي على النقيض من النتائج التي توصلنا إليها السابقة باستخدام م -AAA البروتيني نقص الخميرة سلالة أخرى وعلى الأرجح تعكس الاختلافات سلالة محددة (5). لتقييم اعتماد النمو التنفسي على التحلل البروتيني من قبل hAFG3L2، استبدلنا بقايا الغلوتامات ناشطة تحفيزيا 575 قبل الجلوتامين، وأعرب عن البروتين الطافر في yta10 Δ خلايا yta12 Δ. لم تحور أن تؤثر على تجميع hAFG3L2 إلى مجمع عالية الجزيئية الكتلة كما يتبين من هلام تحليل ترشيح-ديجيتونين solubilized الميتوكوندريا (الشكل 1C). ومع ذلك، كان نمو الخلايا التي تحتوي على الجلسرين المتوسطة يلغى كليا، مما يدل على الاعتماد من التنفس على نشاط بروتين من hAFG3L2 (الشكل 1B).

التحلل البروتيني من قبل المجمعات hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات. لمراقبة مباشرة التحلل البروتيني من قبل hAFG3L2، درسنا تجهيز اثنين preproteins الميتوكوندريا المشفرة النووية، وهي intermembrane البروتين الفضاء السيتوكروم ج الغلوثانيون (CCP1) والوحيدات الريباسي MrpL32، وكلاهما معروف ل أن المشقوق من الخميرة م -AAA البروتيني (12، 26). مطلوب نضوج MrpL32 لتجميع الريبوسوم، وبالتالي تخليق البروتين داخل الميتوكوندريا، وهو شرط أساسي لتجميع المجمعات الجهاز التنفسي في الغشاء الداخلي (26). بالاتفاق مع الظواهر وحظ نمو، والتعبير عن hAfg3l2 ولكن ليس hAfg3l2 E575Q في yta10 Δ Δ استعادة خلايا yta12 إلى حد كبير تجهيز MrpL32، كما يتضح من التحليل الغربي لطخة من الميتوكوندريا المعزولة من هذه الخلايا (الشكل 1D). وبالمثل، ناضجة CCP1 المتراكمة في خلايا yta10 Δ Δ yta12 إيواء hAfg3l2 ولكن ليس في وجود hAfg3l2 E575Q (الشكل 1E).
بالإضافة إلى دورها لمعالجة البروتين، والخميرة م جودة البروتين ضوابط -AAA البروتيني في الغشاء الداخلي وتتوسط تدهور كامل للبروتينات الغشاء غير الأصليين (4، 22). لدراسة ما إذا كان مجمع hAFG3L2 يمكن أيضا بديلا لهذا النشاط، تم توليفها اثنين من البروتينات الركيزة معروف من الخميرة م -AAA البروتيني في نظام خالية من الخلايا في وجود [35 S] ميثيونين واستيرادها إلى عزل yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا إيواء hAFG3L2 أو hAfg3l2 E575Q. واحدة من هذه الركائز، Yme2ΔC، المترجمة في الغشاء الداخلي ويحتوي على نطاق تتعرض لمصفوفة (22). حذف مجال الفضاء intermembrane-كربوكسي المحطة، موجودة في البرية من نوع Yme2، والنتائج في زعزعة استقرار Yme2ΔC وتدهور لاحق من م -AAA البروتيني (الشكل 1F) (19). حين تتراكم في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا، وقد تدهورت المستوردة حديثا Yme2ΔC بحضور hAFG3L2 (الشكل 1F). في المقابل، بقي Yme2ΔC مستقرة في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا إيواء hAfg3l2 E575Q. وقد لوحظت آثار مماثلة من خلال تحليل استقرار المستوردة حديثا Atp7، وهو الطرفية بروتين الغشاء الداخلي التي تدهورت بفعل م -AAA البروتيني وآخر، كما ولكن في ذات مجهولة الهوية البروتيني الميتوكوندريا (الشكل 1F) (19). في حين hAFG3L2 يسرع تدهور Atp7 في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا، طفرة نقطة في المركز بروتين من hAFG3L2 (hAfg3l2 E575Q) ألغيت تماما هذا النشاط (الشكل 1F).
لذا نستنتج أن مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات يمارس النشاط بروتين في الميتوكوندريا ويمكن أن تكون بديلا عن وظيفة الخميرة م -AAA البروتيني في تصنيع البروتين وتدهور للبروتينات غشاء nonassembled. وهكذا، hAFG3L2 تنشط proteolytically على حد سواء على التجمع مع paraplegin في مجمع مغاير بلازميدة قليلة القسيمات وعلى وطي oligomerization.

البروتياز م -AAA-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا الفئران. وكشفت هذه التجارب التباين في جمعية الإنسان م -AAA البروتيني فرعية hAFG3L2. آخر المفترضة م -AAA البروتيني الوحيدات، Afg3l1، يتم ترميز من قبل جين كاذب في الإنسان ولكنه أعرب عن الماوس في إشارة إلى تقلب حتى أعلى في الأخير (20). الفئران Afg3l1 وAfg3l2 تبادل الهوية تسلسل 68٪، مما يشير إلى أنشطة مماثلة من كل من البروتينات. ومع ذلك، لم يتم تحليل وظيفة أو تجميع Afg3l1.
من أجل دراسة تركيبة معقدة من الإنزيمات البروتينية م -AAA في الميتوكوندريا الفئران، أجريت التجارب coimmunoprecipitation بها. رفعنا الأجسام المضادة الببتيد محددة موجهة ضد المفترضة مفارز م -AAA البروتيني Afg3l1، Afg3l2، وparaplegin. تم عزل الميتوكوندريا من الكبد الفئران، والنظر في النمط الظاهري الخلايا العصبية محددة من HSP، وأيضا من الدماغ. بعد الإذابة الميتوكوندريا في ديجيتونين، وحضنت مقتطفات مع أمصال مضادة-تنقية تقارب موجهة ضد متر -AAA مفارز البروتيني ثلاثة المفترضة. وقد تم تحليل الرواسب في وقت لاحق من قبل immunoblotting (الشكل 2). تم الكشف عن Paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في immunoprecipitates بغض النظر عن الأجسام المضادة المستخدمة لهطول الأمطار (الشكل 2A). في المقابل، كان عجلت أيا من هذه البروتينات مع المصل preimmune، مما يدل على خصوصية التفاعل الملاحظة. وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام الكبد أو الدماغ الميتوكوندريا (الشكل 2B). لذا نستنتج أن Afg3l1 يتفاعل مباشرة مع paraplegin وAfg3l2 في كل من الكبد والدماغ الميتوكوندريا. في اتفاق مع هذه النتائج، تم الكشف عن البروتينات في مجمع عالية الجزيئية الكتلة وcoeluted من العمود على تجزئة مقتطفات الميتوكوندريا التي كتبها التحجيم اللوني (لا تظهر البيانات).

تين. 2.
جمعية paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في الميتوكوندريا الفئران. الميتوكوندريا (400 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) تم عزل من (A) الكبد و (B) الدماغ وsolubilized مع ديجيتونين. تمت إزالة عشرة (الكبد) أو 20٪ (المخ) من العينة من أجل السيطرة (المدخلات). أجريت Coimmunoprecipitations من استخدام منقى تقارب paraplegin-، Afg3l1-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. تم استخدام مصل Preimmune كوسيلة لمراقبة سلبية. وقد تم تحليل Immunoprecipitates (IP) من خلال SDS-PAGE وimmunoblotting.

م التجمع -AAA البروتيني في نموذج الفأر paraplegin ناقصة لHSP لرصد النتائج المترتبة على فقدان paraplegin على تشكيل الفئران المجمعات م -AAA الأنزيم البروتيني، درسنا تجميع Afg3l1 وAfg3l2 في الميتوكوندريا من Spg7 - / - الفئران. تم عزل الميتوكوندريا من الكبد والدماغ، solubilized في ديجيتونين، وتعرض لcoimmunoprecipitation باستخدام Afg3l2 محددة الأجسام المضادة تنقية تقارب والمصل preimmune (الشكل 3). وقد عجلت Afg3l1 مع Afg3l2 ولكن ليس مع المصل preimmune عندما مقتطفات من المنظفات Spg7 - / - تم تحليل الكبد أو الدماغ الميتوكوندريا (الشكل 3A وباء). باستمرار، اكتشفت جل التجارب الترشيح Afg3l1 وAfg3l2 كجزء من مجمع عالية الجزيئية الكتلة في الغشاء الداخلي للSpg7 - / - الميتوكوندريا الكبد (الشكل 3C). وهكذا، فإن فقدان paraplegin لا يمنع الجمعية من Afg3l1 وAfg3l2 في الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. وتشير هذه النتائج إلى التقلبات في التجمع من الفئران م البروتياز -AAA التي يبدو أن تعتمد إلى حد كبير على توافر مفارز الفردية.

تين. 3.
مجمع Afg3l1 / Afg3l2-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا من Spg7 - / - الفئران. مقتطفات ديجيتونين الميتوكوندريا (400 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من (A) الكبد و (B) في الدماغ من النوع البري (WT) وparaplegin ناقصة Spg7 - / - تعرض الفئران لcoimmunoprecipitations باستخدام الأجسام المضادة Afg3l2 محددة، تنقية تقارب كما وصفها في وسيلة إيضاح الشكل 2. تم استخدام المصل Preimmune كوسيلة لمراقبة سلبية. وقد تم تحليل الرواسب التي كتبها SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام paraplegin-، Afg3l1-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. مبالغ Afg3l1 في الرواسب المستمدة من النوع البري وSpg7 - / - الميتوكوندريا تختلف قليلا في تجارب مختلفة. (C) مجمع عالية الجزيئية الكتلة تحتوي على Afg3l1 وAfg3l2 في Spg7 - / - الميتوكوندريا. مقتطفات (1 ملغم بروتين الميتوكوندريا) الميتوكوندريا الكبد معزولة عن Spg7 - / - كانت مجزأة الفئران عن طريق Superose 6 التحجيم اللوني. وكسور شطافة TCA عجل وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام Afg3l1- والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. وتم قياس كمية Afg3l1 (مثلثات شغل) وAfg3l2 (الدوائر شغل) في شطافة التي كتبها كثافة الليزر وتعطى كنسبة مئوية من البروتين منها في شطافة الإجمالية. علامات نجمية مجمع عالية الجزيئية كتلة من Afg3l1 وAfg3l2 التي coelutes مع prohibitins Phb1 وprohibitins Phb1 وPhb2، مما يدل على تفاعل م -AAA مجمع البروتيني مع prohibitins، كما لوحظ في الميتوكوندريا الخميرة (31). تم استخدام البروتينات علامة التالية للمعايرة: 1، مثنوي ATP سينسيز (1.5 MDA)؛ 2، أحادى ATP سينسيز (750 كيلو دالتون)؛ 3، صميم الفريتين (443 كيلو دالتون)؛ 4، نازعة الكحول (150 كيلو دالتون).

الاختلافات الأنسجة محددة في الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني. وفي سياق هذه التجارب، لاحظنا أن مستويات ثابتة للدولة من م -AAA مفارز البروتيني يبدو أن تختلف في الكبد والدماغ الميتوكوندريا. استبعاد التأثيرات غير المباشرة بسبب الاختلافات في نقاء الاستعدادات organellar من الأنسجة المختلفة، قارنا الوفرة النسبية للAfg3l1، Afg3l2، وparaplegin في الميتوكوندريا المعزولة من الكبد والدماغ.تم تحديد مستويات ثابتة للدولة النسبية Afg3l2 وparaplegin من قبل immunoblotting مقتطفات الميتوكوندريا التي تحتوي على كميات متساوية من Afg3l1 (الشكل 4A). لافت للنظر، Afg3l2 المتراكمة في ~10-أضعاف أعلى المستويات في الدماغ مما كانت عليه في الكبد (الشكل 4A). كان Paraplegin أيضا أكثر وفرة في الدماغ مما كانت عليه في الميتوكوندريا الكبد وكان حاضرا عند مستويات ~4-أضعاف العالي في العضيات المعزولة من الدماغ الفئران (الشكل 4A). في المقابل، كان Afg3l1 الحاضر في انخفاض طفيف فقط المبالغ في الميتوكوندريا الدماغ قريبة الوحيدات 70 كيلو دالتون من سكسينات نازعة (الشكل 4A).

تين. 4.
الوفرة النسبية للparaplegin، Afg3l1 وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا. تم عزل الميتوكوندريا من (A) من النوع البري أو (B) Spg7 - / - كبد الفئران والدماغ. وقد تم تحليل المستخلصات التي تحتوي على كميات متساوية من Afg3l1 بواسطة الأجسام المضادة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام paraplegin-، Afg3l1-، وAfg3l2 محددة فضلا عن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة ضد الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha). وتم قياس كمية Paraplegin وAfg3l2 موجودة في الكبد والدماغ الميتوكوندريا بواسطة التصوير القائم على مضان باستخدام Afg3l1 كعنصر تحكم التحميل. تم احتساب نسبة إشارات الكشف عن Afg3l2 وparaplegin في الدماغ مقابل الميتوكوندريا الكبد لمراقبة الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني في كل الأنسجة. متوسط ​​ن وأظهرت تجارب مستقلة (± الخطأ المعياري للمتوسط) باستخدام الأنسجة المعزولة من مختلف الحيوانات اختيارها عشوائيا.

فمن المتصور أن الوفرة النسبية للAfg3l1 وAfg3l2 يتم تبديل في غياب paraplegin، مما يؤدي إلى تعويض جزئي عن فقدان paraplegin. وبالتالي فإننا مقارنة الوفرة النسبية للAfg3l1 وAfg3l2 في الميتوكوندريا المعزولة من الكبد والدماغ من Spg7 - / - الفئران التي تفتقر paraplegin (الشكل 4B). عندما تطبيع Afg3l1، Afg3l2 لا يزال المتراكمة في-أعلى ~10 أضعاف المستويات في الميتوكوندريا الدماغ من Spg7 - / - الفئران، مما يدل على أن الوفرة النسبية لكل من البروتينات لم تتغير في غياب paraplegin.
هذه التجارب تكشف عن اختلافات لم تكن متوقعة في الوفرة النسبية للم مفارز البروتيني -AAA في الأنسجة المختلفة. وبالنظر إلى التباين الملاحظ في جمعيتهم، يبدو من المرجح أن تكوين فرعية من المجمعات بروتين يختلف بطريقة الأنسجة محددة.

هومو ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م البروتياز -AAA في الميتوكوندريا الدماغ. لتقييم تجميع م -AAA مفارز البروتيني بطريقة أكثر الكمية، أجرينا تجارب immunodepletion. تم solubilized الميتوكوندريا الدماغ في ديجيتونين، وكانت تستخدم الأجسام المضادة Afg3l2 محددة، تنقية تقارب في استنزاف تماما مستخلص Afg3l2 (الشكل 5A). كان Afg3l2 مناعيا لا يمكن كشفها في جزء طاف بعد immunodepletion. كانت تصاحب Afg3l2، Afg3l1 وparaplegin الحالي عند مستويات فقط تضاءلت بشكل كبير (الشكل 5A). حضانة مقتطفات الميتوكوندريا مع المصل preimmune أثرت على مستوى الدولة المستقرة من لا Afg3l2 ولا Afg3l1 أو paraplegin (الشكل 5A). لذا نستنتج أن Afg3l1، Afg3l2، وparaplegin تجميع الكمية مع بعضها البعض في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا الدماغ.

تين. 5.
تعايش م البروتياز -AAA المبنية من مفارز مختلفة في الميتوكوندريا الدماغ. الميتوكوندريا (150 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من (A) من النوع البري (WT) و (B) Spg7 - / - وهي lysed الدماغ في ديجيتونين وحضنت مع تشبع كميات من المصل preimmune أو تنقية تقارب-Afg3l2- أو الأجسام المضادة Afg3l1C محددة. بعد إزالة راسب، وقد تم تحليل الكسور طاف (SN) بواسطة SDS-PAGE وفحصها لوجود paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 التي كتبها immunoblotting. تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة ضد الوحيدات 39 كيلو دالتون من مجمع I (Ndufa9) للسيطرة على قدم المساواة هلام التحميل. في حين Afg3l1 وAfg3l2 يمكن أن تنفد تماما من الكسر طاف باستخدام الأجسام المضادة Afg3l1- أو Afg3l2 محددة، تنقية تقارب، على التوالي، لا يمكن أن تستنفد مقتطفات من paraplegin باستخدام الأجسام المضادة paraplegin محددة المتاحة (لا تظهر البيانات).

والجدير بالذكر، عندما أجريت تجارب مماثلة مع الأجسام المضادة Afg3l1 محددة، Afg3l2 وparaplegin تم استنفاد إلا قليلا من مقتطفات الميتوكوندريا. هذا الأرجح أن ذلك يعكس وفرة انخفضت من Afg3l1 مقارنة بما كان عليه من Afg3l2 وparaplegin. وهكذا، على الأقل مختلفة م المجمعات البروتيني -AAA تتعايش في الميتوكوندريا الدماغ: Afg3l2 / paraplegin والمجمعات Afg3l1 أقل وفرة التي تحتوي أيضا Afg3l2، paraplegin، أو كليهما.
التي متر -AAA البروتيني المجمعات موجودة في الميتوكوندريا الدماغ paraplegin ناقصة؟ لمعالجة هذه المسألة، ونحن عزل الميتوكوندريا الدماغ من Spg7 - / - الفئران وتحليلها وتكوين معقد من م المجمعات -AAA البروتيني من قبل immunodepletion باستخدام Afg3l1- والأجسام المضادة Afg3l2 محددة (الشكل 5B). على غرار البرية من نوع الميتوكوندريا، وAfg3l1 المنضب بالكامل تقريبا من مقتطفات من Spg7 - / - الميتوكوندريا الدماغ مع الأجسام المضادة Afg3l2 يدل التجمع الكمي (الشكل 5B). في المقابل، كان مستوى ثابت للدولة من Afg3l2 لا يكاد يتأثر المستنفدة Afg3l1 (الشكل 5B). نستنتج أن Afg3l2 هي موجودة في الزائدة بالنسبة لAfg3l1 في الميتوكوندريا الدماغ من النوع البري وSpg7 - / - الفئران. بينما Afg3l1 تجميعها كميا مع Afg3l2، فإن غالبية Afg3l2 ليست جزءا من هذا الهيكل وعلى الأرجح تشكل مجمعا وطي بلازميدة قليلة القسيمات.

النشاط بروتين من هومو ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م البروتياز -AAA. هذه التجارب تثبت وجود م -AAA المجمعات البروتيني مع تكوين الوحيدات متغير في الميتوكوندريا الفئران. لدراسة النشاط بروتين للجمعيات مختلفة، أجرينا دراسات تكامل مع م -AAA البروتيني-ناقص yta10 Δ yta12 خلايا Δ الخميرة.
في التجارب الأولية، paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 وأعرب بشكل مستقل في yta10 Δ yta12 Δ الخلايا وتم فحص نمو الخلايا في الجهاز التنفسي (الشكل 6A). لافت للنظر، والتعبير عن إما Afg3l1 أو Afg3l2 ولكن ليس paraplegin استعادة نمو yta10 Δ yta12 خلايا Δ على المحتوية على الجلسرين المتوسطة (الشكل 6A). هذا يذكرنا hAFG3L2، والتي شكلت-وطي بلازميدة قليلة القسيمات، proteolytically مجمعات نشاطا عندما أعرب في الخميرة (الشكل 1). تحليل الترشيح هلام مقتطفات الميتوكوندريا كشف الحقيقة وطي oligomerization من Afg3l1 وAfg3l2 في الخميرة، في حين paraplegin لا تشكل مجمع عالية الجزيئية الكتلة في غياب الأخرى مفارز AAA البروتيني (لا تظهر البيانات). التعبير عن المتغيرات موقع بروتين من Afg3l1 (Afg3l1 E567Q) أو Afg3l2 (Afg3l2 E574Q لم) لا تعزز نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ، مشيرا إلى أن المجمعات وطي بلازميدة قليلة القسيمات تمارس النشاط بروتين (الشكل 6A). باستمرار، لاحظنا نضوج MrpL32 في yta10 Δ yta12 خلايا Δ إيواء Afg3l1 أو Afg3l2، في حين تم إلغاء هذا النشاط عن طريق الطفرات في مركز بروتين من كل من البروتين (الشكل 6B). وعلاوة على ذلك، تم استعادة تجهيز CCP1 على التعبير عن Afg3l1 أو Afg3l2 لكن إعاقة إلى حد كبير في وجود متغيرات الخاملة proteolytically من كل من البروتين (الشكل 6C). وتجدر الإشارة إلى أن نقص التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ لم ترد على التعبير عن paraplegin، كما لم تنضج MrpL32 أو CCP1 الحاضر في هذه الخلايا (الشكل 6). وهكذا، تظهر القدرة على تكوين مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات أن يقتصر على Afg3l1 وAfg3l2.

تين. 6.
النشاط بروتين من هومو-بلازميدة قليلة القسيمات ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م المجمعات -AAA البروتيني في الخميرة. (A) نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ معربا عن الفئران م مفارز -AAA البروتيني. البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا، وyta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا إما paraplegin، Afg3l1 (Afg3lX)، Afg3l2 (Afg3lX)، أو متحولة من المتغيرات Afg3l1 E567Q أو Afg3l2 E574Q (Afg3lX EQ كانت تزرع) في 30 ° C على (YPG) وسائل الاعلام (YPD) أو التي تحتوي على الجلسرين التي تحتوي على الجلوكوز لفحص كفاءة الجهاز التنفسي من الخلايا. لتقييم نشاط المجمعات مغاير بلازميدة قليلة القسيمات، متحولة المتغيرات Afg3l1 E567Q أو Afg3l2 E574Q تم coexpressed مع paraplegin (الفقرة / Afg3lX EQ) أو مع paraplegin E575Q (الفقرة EQ / Afg3lX EQ) في yta10 Δ yta12 تم تحليل Δ الخلايا والخلايا النمو على النحو الوارد أعلاه. (B و C) تجهيز MrpL32 الخميرة وCCP1 من قبل الفئران م البروتياز -AAA. تم تحليل معالجة البروتين في yta10 Δ yta12 خلايا Δ إيواء الفئران م -AAA مفارز البروتيني بواسطة SDS-PAGE كما هو موضح لوحة ألف وimmunoblotting كما هو موضح في أسطورة عن الشكل 1 باستخدام MrpL32 (L32) أمصال مضادة -specific (B) أو أمصال مضادة CCP1 محددة (C). ص، أشكال السلائف. م، أشكال ناضجة. استخدمت Mge1 وTom40 للسيطرة على قدم المساواة هلام التحميل.

في مزيد من التجارب، ونشاط بروتين من الفئران-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات م تم تقييم البروتياز -AAA تتألف من Afg3l1 وparaplegin أو من Afg3l2 وparaplegin في الخميرة. بعد coexpression إما زوج من مفارز، تم التحقق من التفاعل من خلال التجارب coimmunoprecipitation (لا تظهر البيانات). على غرار الخلايا التي تحتوي فقط Afg3l1 أو Afg3l2، ونمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ تم ترميمه إذا كان coexpressed paraplegin مع أي البروتين (لا تظهر البيانات). لدراسة ما إذا كان هذا النمط الظاهري هو بسبب مغاير oligomerization مع paraplegin بدلا من هومو-oligomerization من Afg3l1 أو Afg3l2، على التوالي، عبرنا عن proteolytically المتغيرات غير نشطة من هذه البروتينات. الدراسات السابقة على الخميرة م وقد أثبتت -AAA البروتيني أن البروتيني هو المعطل فقط عندما تحمل جميع مفارز الطفرات نقطة في المركز بروتين بها (3). في المقابل، مجمع AAA البروتيني-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات تتألف من وحدات فرعية النشطة وغير النشطة proteolytically يتوسط معالجة البروتين ويحافظ على نمو الجهاز التنفسي (3). في حين لا التعبير عن paraplegin ولا أن من Afg3l1 E567Q يسمح yta10 Δ yta12 Δ الخلايا لتنمو على المحتوية على الجلسرين المتوسطة، تم استعادة نمو الخلايا في الجهاز التنفسي على coexpression كل من البروتينات (الشكل 6A). في المقابل، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا عن خاملة proteolytically Afg3l1 E567Q وparaplegin E575Q كانت بالقصور التنفسي. وبالتالي، يمكن الحفاظ على نمو الجهاز التنفسي عن طريق مجمع / paraplegin نشط proteolytically Afg3l1.
لتقييم مباشرة النشاط بروتين من Afg3l1 مجمع / paraplegin-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات، تم رصد نضوج CCP1 وMrpL32 في هذه الخلايا (الشكل 6B وC). تم الكشف عن أشكال ناضجة من كلا CCP1 وMrpL32 في الخلايا إيواء paraplegin وAfg3l1 E567Q ولكن ليس في وجود paraplegin E575Q وAfg3l1 E567Q. لذا نستنتج أن مجمع AAA البروتيني تتألف من Afg3l1 وparaplegin مفارز نشط proteolytically.
والجدير بالذكر، تم الحصول على نتائج مشابهة جدا عندما yta10 Δ yta12 Δ تم تحليل الخلايا معربا عن Afg3l2 وparaplegin (الشكل 6). إدخال طفرة نقطة في المركز بروتين من Afg3l2 (Afg3l2 E574Q) لم يلغ نمو الجهاز التنفسي إذا تم coexpressed paraplegin. وعلاوة على ذلك، تم تجهيز CCP1 وMrpL32 جزئيا في هذه الخلايا. على coexpression من Afg3l2 E574Q وparaplegin E575Q، ومع ذلك، لم ترد اختصاص الجهاز التنفسي من الخلايا، وكلا CCP1 وMrpL32 المتراكمة في شكل السلائف (الشكل 6). وهكذا، فإن مجمع / paraplegin Afg3l2 يمارس النشاط في بروتين الخميرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #5  
قديم 11-22-2015, 10:44 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي راثي شلل سفلي تشنجي المتنحية (SPG30) مع ترنح معتدل والاعتلال العصبي الحسي الخرائط لكروموسوم 2q37.3

 

http://brain.oxfordjournals.org/content/129/6/1456.full



الملخص

وparaplegias تشنجي وراثي (شركائنا HSPs) هي مجموعة سريريا وغير متجانسة وراثيا من الأمراض العصبية التي تتميز التشنج التدريجي في الأطراف السفلية. تم تعيين تسعة وعشرين مواضع مختلفة (SPG) حتى الآن، وتم تحديد 11 جينات مسؤولة. سريريا، واحد يميز بين أشكال HSP نقية والمعقدة التي ترتبط بنسب مختلفة مع مجموعات عديدة من علامات العصبية وخارج عصبية. لا يعرف الكثير عن أشكال مقهورة (ARHSP) منذ تم تحديد مواضع تعيينها في كثير من الأحيان في الأسر وحيدة وحساب نسبة صغيرة فقط من المرضى. نفيدكم موضعا ARHSP الجديد (SPG30) على الصبغي 2q37.3 في عائلة الأقارب مع سبعة تتأثر وأربعة أعضاء المتضررين من أصل المعيشة الجزائرية في شرق فرنسا بنتيجة كبيرة من 3.8 متعددة اللد. عشر عائلات أخرى من فرنسا (ن = 4)، تونس (ن = 2)، الجزائر (ن = 3) وجمهورية التشيك (ن = 1) لم تكن مرتبطة بموضع التي تم تشخيصها حديثا مما يدل على مزيد من التجانس الوراثي. النمط الظاهري للأسرة مرتبطة يتكون من خزل سفلي تشنجي واعتلال الأعصاب المحيطية المرتبطة مع وجود علامات للدماغ طفيفة أكده ضمور المخيخ على واحد الاشعة المقطعية.
  • SPG30
  • كروموسوم 2q37.3
  • راثي شلل سفلي تشنجي المتنحية
  • صلة
مقدمة

وparaplegias تشنجي وراثي (شركائنا HSPs) هي مجموعة سريريا وغير متجانسة وراثيا من الأمراض العصبية التي تتميز التشنج التدريجي في الأطراف السفلية. طريقة الميراث قد يكون وراثي جسمي، راثي مقهور (ARHSP) أو X-ربط. تم تعيين تسعة وعشرين مواضع مختلفة (SPG) حتى الآن، وحددت 11 الجينات المسؤولة. وغالبا ما تشارك البروتينات المناظرة في الاتجار محور عصبي أو استقلاب الميتوكوندريا (ريد، 2003).
سريريا، واحد يميز بين الأشكال نقية ومعقدة من HSP (الدر وبرايس، 2000؛ Tallaksen وآخرون، 2001.). في أشكال نقية، تتكون المظاهر السريرية من علامات هرمي معزولة، مثل ردود الفعل سريعة، بابينسكي علامة، التشنج والعجز الحركي، والتي يمكن أن تترافق مع اضطرابات العضلة العاصرة وفقدان الحواس عميقة. في أشكال معقدة من HSP، ويرتبط هذا المرض بنسب مختلفة مع مجموعات عديدة من علامات العصبية وخارج العصبية مثل رنح مخيخي، التلفظ، والتخلف العقلي، والاعتلال العصبي المحيطي، ضمور العصب البصري، التهاب الشبكية الصباغي، وفقدان السمع أو رقيقة الجسم الثفني.
وأوضح ما يقرب من 40٪ من الحالات الغالبة من مواضع معروفة. لا يعرف الكثير عن ARHSP منذ تم تحديد مواضع تعيينها في عدد قليل، واحدة في كثير من الأحيان، والأسر، وتمثل سوى نسبة صغيرة من المرضى. عادة ما يرتبط ARHSP مع الظواهر المعقدة سريريا ولكنها تعتبر SPG5، SPG24 وSPG28 أن تكون أشكال نقية من المرض (Bouslam وآخرون، 2005.؛. هودجكينسون وآخرون، 2002؛ ماير وآخرون، 2004... ويلكنسون وآخرون، 2003).
في هذه الدراسة فإننا الإبلاغ عن مكان ARHSP جديد على الصبغي 2q37.3 في عائلة الأقارب من أصل جزائري.

المرضى والطرق

المرضى

تم اختيار أحد عشر أسر مع ARHSP (ثمانية مع شكل نقي وثلاثة مع شكل معقد من ARHSP). وكان من بينهم 64 أشخاص، 27 منهم المتضررة. بعد موافقة مكتوبة، تم فحص جميع الأفراد من قبل طبيب أعصاب. استخدمت الخرائط موحدة لتقييم السريرية لجميع المشاركين. عائلة جزائرية (FSP-546؛ الشكل 1)، مع سبعة تتأثر وأربعة أعضاء المتضررين، أدرج في المسح على نطاق الجينوم. عشر عائلات أخرى نشأت من فرنسا (ن = 4)، تونس (ن = 2)، الجزائر (ن = 3) وجمهورية التشيك (ن = 1).

تين. 1
نسب الأسرة FSP-546. وأظهرت إعادة الإعمار النمط الفرداني لمدة تسع الواسمات الوراثية تمتد ~13 سم على كروموسوم 2. وبالنظر إلى الأرقام شفرة جميع أفراد العينة تحت حرف. الدوائر المغلقة (النساء) والساحات (الرجال) إلى أعضاء المتضررين. ويحيط النمط الفرداني متماثل يفترض أن تحمل أليل المرض عن طريق صناديق مغلقة. ميغابايت = megabase. سم = سنتي مورغان.

تم استخراج DNA من عينات الدم باستخدام بروتوكول قياسي. الطفرات في الجين SPG7 (paraplegin) (Casari وآخرون، 1998 تم استبعاد) في المرضى مؤشر من جميع الأسر التي كتبها dHPLC الفرز (Elleuch وآخرون، 2006).
التنميط الجيني

وتضخمت الواسمات الوراثية مع الاشعال الفلورسنت وشظايا حلها على ABI-3730 المنظم (النظم البيولوجية التطبيقية، فوستر سيتي، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحديد الأنماط الجينية مع البرنامج GeneMapper 3.5 (النظم البيولوجية التطبيقية).
تم إجراء مسح الجينوم على نطاق الأسرة في FSP-546 باستخدام 400 الصغرية متباعدة ~10 سم (centimorgans) على حدة على جميع الكروموسومات. أجريت البشرى وتحليلات متعددة الربط باستخدام فاست لينك 3.0 (كوتينغام وآخرون، 1993) واليجرو البرامج 1.2c (Gudbjartsson وآخرون، 2000). واعتبر هذا المرض أن يكون توغل تماما جسمية مقهورة، مع تردد أليل مرض 0.00005 وتكافؤ الكسور إعادة التركيب للذكور والإناث. كانت المسافات الوراثية تلك من مركز مرشفيلد لعلم الوراثة الطبية وتم التحقق منها مواقف الخريطة على مشروع تسلسل الجينوم البشري (مراكز NCBI وEnsembl).
تحليل مرشح الجينات

وقد تم التسلسل المباشر لجميع الإكسونات الترميز، ومواقع لصق مجانحة وعلى الأقل 50 سنة مضت من تسلسل intronic على كل جانب من الجين STK25 باستخدام فاصل الكيمياء BigDye على المنظم ABI-3730 (النظم البيولوجية التطبيقية). وقد تم تحليل الشخصية اللوني باستخدام Seqscape 2.5 برنامج (النظم البيولوجية التطبيقية). متوفرة عند الطلب الاشعال PCR والشروط الصلب.

النتائج

رسم خرائط SPG30

بعد استبعاد الربط إلى عدة مواضع معروفة لARHSP (SPG5، SPG11، SPG21، SPG24، SPG27، SPG28) والتصلب الوحشي الضموري (ALS2 وALS5) وفي حالة عدم وجود طفرات في الجين SPG7، شاشة الجينوم على نطاق في الأسرة قدمت FSP-546 دليل على الربط على اثنين من علامات متتالية على الصبغي 2 بنتيجة متعددة اللد 3.8. تم الكشف عن ستة مواقع أخرى محتملة مع عشرات متعددة اللد> 1 على الكروموسومات 2، 7، 10، 11، 12 و 20، ولكن استبعدت عندما استخدمت 25 علامات إضافية (لا تظهر البيانات).
تحليل تسع الواسمات الوراثية الإضافية على الصبغي 2 إنشاء عشرات اللد البشرى كبيرة> 3 (الجدول 1) في علامات D2S2285 (ض = 3.1) وD2S125 (ض = 3.2). تم الحصول على القصوى ومتعددة كبيرة نتيجة اللد 3.8 في الفترة D2S2338-D2S2585 (الشكل 2)، وذلك بالاتفاق مع إعادة الإعمار النمط الفرداني يظهر أن جميع علامات في هذا سم الفاصل 5.1 كانت متماثل في المرضى المصابين (الشكل 1). وقد سمي هذا الموضع الجديد SPG30 وفقا لتسمية HUGO. هذا الفاصل الزمني يمتد المنطقة 4 ميجا بايت ويحتوي على 62 الجينات، واحدة منها، STK25، الذي يشفر بروتين كيناز تشارك في الاستجابة للإجهاد البيئي ونقل البروتين، لم يكن لديهم طفرات / الأشكال في الإكسونات الترميز، في المرضى.

تين. 2
تحليل الربط متعددة. يتم رسم عشرات اللد وفقا للخريطة الوراثية للكروموسوم 2Q. بالخط العريض يشار إلى علامات تستخدم للمسح الجينوم. سم = سنتي مورغان.


الجدول 1
عشرات اللد البشرى المحسوبة في الأسرة FSP-546 بين موضع المرض و9 الواسمات الوراثية على الصبغي 2
علامة اللد النتيجة عند θ


0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 D2S338 ∞ -2.77 -0.88 -0.23 0.15 0.16 0.05 D2S345 -2.35 -0.84 -0.22 -0.01 0.09 0.07 0.01 D2S2338 -2.45 -0.96 -0.36 -0.17 -0.06 -0.01 0.01 D2S2285 3.11 3.05 2.79 2.47 1.80 1.12 0.44 D2S125 3.23 3.17 2.91 2.58 1.90 1.20 0.50 D2S395 1.35 1.33 1.22 1.08 0.79 0.49 0.20 D2S1378 2.80 2.74 2.50 2.20 1.57 0.94 0.33 D2S140 1.42 1.40 1.29 1.14 0.84 0.53 0.22 D2S2585 ∞ 0.85 1.32 1.33 1.05 0.64 0.23
  • اللد: وغاريتم الصعاب.

تم استبعاد الفترة الفاصلة بين علامات D2S2338 وD2S2585 في الأسر 10 ARHSP الأخرى عن طريق إعادة الإعمار النمط الفرداني و / أو تحليل الربط مع عدة نقاط عشرات اللد تحت عتبة -2 (لا تظهر البيانات).
المظاهر السريرية في الأسرة FSP-546

في الأسرة النووية FSP-546 (الشكل 1)، كان هناك تسعة أشقاء (ستة رجال وثلاث نساء) ولدت من الآباء والأمهات الذين كانوا الأقارب من الدرجة الأولى. تم فحص كل 11 أفراد وأخذ عينات لاستخراج الحمض النووي. أربعة من الأشقاء (ثلاثة رجال وامرأة واحدة) تأثرت سريريا وكان الفحص العصبي الطبيعي في ما تبقى من الأطفال والآباء على حد سواء. وكان متوسط ​​العمر عند بداية 17.5 ± 4 سنوات (12-21 سنة).
كانت الصورة العامة مشية تشنجية مع متغير المرتبطة القاصي الهزال، والاعتلال العصبي الحسي ورنح مخيخي (الجدول 2).

الجدول 2
الخصائص السريرية من 4 مرضى في الأسرة FSP-546
المظاهر السريرية المرضى


004 009 010 011 العمر عند بداية (سنة) 20 17 21 12 العمر عند الفحص (سنوات) 35 27 26 24 مدة المرض (سنوات) 15 10 5 12 اضطراب وظيفي لا استطيع الجري معتدل لا استطيع الجري لا استطيع الجري الشلل التشنجي في مشية معتدل معتدل معتدل شديدة في الاستراحه معتدل معتدل معتدل معتدل زيادة ردود الفعل في LL نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا الباسطة منعكس أخمصي لا نعم فعلا نعم فعلا نعم فعلا ضعف دبوس وخز، والاهتزاز لا نعم فعلا نعم فعلا لا اختبار الأنف الإصبع لا أقل ما يقال المخيخ الجانب الأيسر للدماغ أقل ما يقال المخيخ اضطرابات العضلة العاصرة لا معتدل لا معتدل السعي العين رمشي لا نعم فعلا لا نعم فعلا الدماغ الاشعة المقطعية الثاني ضمور المخيخ منتشر خفيف الثاني الثاني
  • LL = الطرف السفلي. الثاني = لم تفعل.

وكان المريض مؤشر (FSP-546-004) رجل يبلغ من العمر 35 عاما الذي لاحظ لأول مرة الساقين شديدة في سن 20. وفي سن ال 25، وقال انه كان غير قادر على تشغيل واجهوا صعوبة نزول الدرج. أظهرت دراسة زيادة ردود الفعل في الأطراف السفلية (LL) والاستجابات المثنية أخمصي. وكانت ردود الفعل العادية في الأطراف العلوية. كان التشنج معتدل على المشي وعلى بقية مع ضعف معتدل في LL الداني. وكانت العضلات الهزال في ساقيه واضحة. كان شعور الاهتزاز والإحساس بوخز العادي، وكانت هناك اضطرابات العضلة العاصرة أو علامات للدماغ.
شقيقه (FSP-546-009) شكا في سن 17 من إحساس الوخز في الأطراف العلوية. عندما تم فحصه في سن 27 وقال انه لا يمكن أن يقف مع قدميه في المركز جنبا إلى جنب. كان هناك التشنج معتدل في أطرافه السفلى في المشي والراحة. وقال انه زيادة ردود الفعل في ركبتيه ولكن ليس في كاحليه وكانت ردود الفعل أخمصي الباسطة. كان هناك هدر القاصي خفيف في الأطراف السفلية وبعض الضعف البعيدة. أظهر اختبار أصابع الأنف الحماقات المخيخ. كما وصف المريض اضطرابات العضلة العاصرة خفيفة. / وقد انخفض مسة القاصي حساسية الوخز بالابر في الساقين، ولكن لوحظ شعور الاهتزاز في الكاحلين. ونظرة العين العادي باستثناء السعي رمشي. تم تسجيل انخفاض سعة المحرك الحسية ولكن الفسيولوجية خلال دراسات التوصيل العصبي (الجدول 3). أظهر الإبرة EMG نمط التوظيف انخفاض مع بعض الإمكانيات اطلاق بمعدل متزايد، وهو علامة على إزالة التعصيب. أظهر الدماغي الاشعة المقطعية أجريت في سن 29 ضمور المخيخ منتشر معتدل.

الجدول 3
دراسة التوصيل العصبي في FSP المريض 546-009

الصحيح اليسار



سعة السرعة (م / ث) سعة السرعة (م / ث) حسي العصب الكعبري (الحسية) 27 μV 59 5 μV 49 العصب الربلي 4 μV 53 2 μV 50 محرك العصب الشظوي المشترك 2.8 بالسيارات 52 3 بالسيارات 53 العصب الشظوي العميق 8 بالسيارات 47 7 بالسيارات 54

أختهم (FSP-546-010) وهي امرأة تبلغ من العمر 26 عاما، ولاحظت أولا عدم الثبات والساقين شديدة في سن ال 21. وكانت تعاني من الركبة مؤلمة وكان التشنج معتدل في الأطراف السفلية لها في الغالب في ساقها اليسرى، على المشي و في الاستراحه. وكشف الفحص السريري زيادة ردود الفعل في جميع أطرافه ومنعكس الباسطة أخمصي على كلا الجانبين. كان اختبار الإصبع الأنف المخيخ قليلا على الجانب الأيسر. وقد وصفت شعور الاهتزاز بشكل طبيعي في الكاحلين. وقد انخفضت تستهلكه ضجة كبيرة في كلا القدمين.
الأخ الأصغر سقط (FSP-546-11) عن طريق الخطأ في سن 11، وبعد ذلك مشية غير مستقرة والساقين أعراض شديدة تطويرها. في سن ال 19، وكان ضعف معتدل ولكن غير قادر على تشغيل. كان التشنج الشديد في المشي وزيادة توترية العضلات في بقية. وقال انه زيادة ردود الفعل في جميع أطرافه مع الكاحلين رمع والباسطة الثنائية ردود الفعل أخمص القدم. كان هناك هدر خفيف في الأطراف العلوية. وذكر أنه جرى الإلحاح البولي معتدل والساقين مؤلمة. كان السعي العين رمشي.

نقاش

رسمناها موضعا رواية ARHSP (SPG30) على الصبغي 2q37.3 في الأسرة الجزائرية الأقارب الذين يعيشون في شرق فرنسا. بعد استبعاد المرشح SPG وALS المكاني والمناطق الأخرى بنتيجة اللد> 1 في مسح الجينوم على نطاق، وظلت منطقة مرشح واحد على الصبغي 2. غرامة رسم الخرائط باستخدام تسع علامات إضافية وإعادة الإعمار النمط الفرداني ضاقت المنطقة مرشحة ل 4 ميغابايت الفترة. تم استبعاد الربط SPG30 أيضا في 10 عائلات ARHSP الأخرى الذين لا يحملون طفرات في الجين SPG7.
وهذا هو أول ARHSP مكان وجدت على كروموسوم 2 حيث شكلين من ADHSP، SPG4-الأكثر شيوعا وSPG13، كما تم يقع (الدر وآخرون، 1996.؛. هانسن وآخرون، 2002). ALS2 (Alsin) (يانغ وآخرون، 2001)، وشكل وراثي من الشلل الدماغي التشنجي (مكهيل وآخرون، 1999 خريطة) أيضا لكروموسوم 2، على الرغم من أن مناطق مختلفة وتختلف سريريا من SPG30 قبل حدوث الصلبية و علامات الكاذب (ALS2)، والتخلف العقلي والصرع والشلل الرباعي (الشلل الدماغي التشنجي). تحتوي المنطقة المكرر 62 الجينات، والعديد منها ترميز البروتينات يحتمل أن تشارك في HSP، بحسب وظائفها الفيزيولوجية (البروتينات متورطة في تهريب الجزيئية والأيض الميتوكوندريا). الطفرات نقطة في الجين STK25، الذي يشفر سيرين / ثريونين كيناز 25، استبعدت بواسطة التسلسل المباشر. فحص الجينات المرشحة أخرى جارية.
وعلى النقيض من جسمي HSP المهيمن حيث اثنين من الجينات، وترميز SPG3 atlastin-1 وSPG4 ترميز spastin، تشكل نسبة كبيرة من المرضى، ويبدو ARHSP أن يكون ناجما عن عدد وافر من الجينات، كما اقترح عدد من جديد ARHSP مواضع نشرت مؤخرا (هودجكينسون وآخرون، 2002.؛ ماير وآخرون، 2004.؛ Bouslam وآخرون، 2005... ويلكنسون وآخرون، 2005). SPG7، الشكل الأكثر شيوعا للARHSP ذكرت حتى الآن، الذي يشفر paraplegin، ويوضح جزء فقط من الحالات ARHSP (Elleuch وآخرون، 2006).
النمط الظاهري للأسرة SPG30 يتكون من بداية مبكرة وخزل سفلي تشنجي ببطء تدريجي يرتبط مع وجود علامات للدماغ طفيفة، مثل السعي رمشي العين، اصبع الأنف الحماقات، صعوبة في الوقوف جنبا إلى جنب وضمور المخيخ على مسح CT، عندما يقوم. بالإضافة إلى ذلك، أظهر الفحص الكهربية في مريض واحد وجود اعتلال الأعصاب المحيطية التي عثر عليها سريريا في مريض آخر. أخيرا، يبدو أن تطور المرض بطيئا كما كانت جميع المرضى قادرا على المشي بعد فترات المرض تصل إلى 15 عاما.
ويلاحظ التباين Phenotypical في العديد ARHSP والنمط الظاهري من SPG30 قد تكون أكبر مما لوحظ في هذه العائلة الجزائرية. أظهرت معظم الأسر اختبارها في هذه الدراسة النمط الظاهري ARHSP النقي، في حين وصفت معظم أشكال ARHSP المعروفة، بما في ذلك SPG30، كما معقدة مع عصبية إضافية أو المظاهر السريرية الأخرى (جدول 4). ولعل هذا يفسر لماذا لم نجد عائلات أخرى مرتبطة بموضع SPG30. على حد سواء، ومع ذلك، قد تكون مرتبطة أشكال نقية ومعقدة لنفس الموضع، كما هو مبين لSPG4 (Heinzlef وآخرون، 1998)، SPG7 (دي ميشيل وآخرون، 1998) وSPG27 (الرباعي وآخرون، 2006) .

الجدول 4
أشكال المتنحية معروفة من الشلل النصفي التشنجي، الكروموسومات التوطين، والمنتج الجينات والنمط الظاهري
رمز الجين موقع الكروموسومات منتج الجين النمط الظاهري العمر عند بداية (سنة) علامات المخيخ و / أو ضمور PNP علامات اضافية SPG5 (منير الهنتاتي وآخرون، 1994؛. يلكنسون وآخرون، 2003) 8Q-11q13 - نقي 1-40 لا - - SPG7 (Casari وآخرون، 1998؛. DeMichele وآخرون، 1998؛. يلكنسون وآخرون، 2004) 16q24.3 Paraplegin النقي، مجمع 11-42 نعم فعلا نعم فعلا قدم جوفاء، ضمور العصب البصري SPG11 (مارتينيز موريللو وآخرون، 1999) 15q13-Q15 - النقي، مجمع 1-50 لا - التخلف العقلي، وقدم جوفاء، CC رقيقة SPG14 (Vazza وآخرون، 2000) 3q27-Q28 - مجمع ~30 لا نعم فعلا قدم جوفاء، والتخلف العقلي، وعمه البصرية، ونقص الذاكرة SPG15 (هيوز وآخرون، 2001) 14q22-Q24
مجمع 13-23 نعم فعلا - تدهور الفكري، البقعة المصطبغة، CC وضمور الدماغ SPG20 (باتل وآخرون، 2002) 13q12.3 Spartin مجمع الطفولة المبكرة نعم فعلا - التخلف العقلي، وضيق في مكانة SPG21 (سيمبسون وآخرون، 2003) 15q21-Q22 Maspardin مجمع 20-40 نعم فعلا نعم فعلا متلازمة خارج هرمية، والخرف، CC رقيقة، الأبيض حول البطينات الدماغية مسألة hyperintensities، إعتام عدسة العين، خلل التوتر، رقص، ضمور العضلات اليد SPG23 (BLUMEN وآخرون، 2003) 1q24-Q32 - مجمع الطفولة المبكرة لا - تشوهات للجلد والشعر وتصبغ، خلل البنية؛ شوهة الوجه والهيكل العظمي، ورعاش الوضعي، الادراكي SPG24 (هودجكينسون وآخرون، 2002) 13q14 - نقي 1 لا - - SPG25 (Zortea وآخرون، 2002) 6q23-q24.1 - مجمع 30-46 لا نعم فعلا العديد من فتق القرص، وإعتام عدسة العين الثنائي، الزرق الخلقي SPG26 (ويلكنسون وآخرون، 2005) 12p11.1-12q14 - مجمع 22-42 لا نعم فعلا العاطفي، واللسان ورعاش، والقصور الفكري المعتدل SPG27 (ماير وآخرون، 2004؛. الرباعي وآخرون، 2006) 10-q22.1-q24.1 - النقي، مجمع 2-45 نعم فعلا نعم فعلا التخلف العقلي، وصغر الرأس، شذوذ البنية في الوجه، وتضيق الأجفان، خلل البنية؛ شوهة الهيكل العظمي SPG28 (Bouslam وآخرون، 2005) 14q21.3-q22.3 - نقي 15/06 لا - قدم جوفاء والجنف في 1 المريض SPG30 2q37.3 - مجمع 12-21 نعم فعلا نعم فعلا - الشلل الدماغي التشنجي (مكهيل وآخرون، 1999) 2p24-25 - مجمع الطفولة المبكرة - - التخلف العقلي، الصرع، صغر الرأس
  • CC = الجسم الثفني. PNP = اعتلال الأعصاب المحيطية.

على الرغم من أن خزل سفلي تشنجي ومن الواضح أن دلالة كبيرة في SPG30، يمكن فحص سطحي يغيب عن علامات العصبية المرتبطة بها (مثل علامات المخيخ) مما يؤدي إلى التشخيص الأولي من الذهب الخالص ويست معقدة HSP. هذه النتيجة مهمة في الممارسة السريرية منذ العديد من أشكال ARHSP الحاضر مع وجود علامات إضافية للدماغ (14/06 ARHSP مواضع، الجدول 4) والتي يمكن التغاضي عند فحص المرضى الذين يعانون من التشنج بارز. مشاركة المخيخ المعتدل الذي عثر عليه في هذا الشكل الجديد من ARHSP مماثلة لتلك التي لوحظت في المرضى الذين يعانون من SPG7 (paraplegin) الطفرات، التي كانت أيضا كان يعتقد في البداية أن يكون ARHSP نقية (دي ميشيل وآخرون، 1998). وقد أظهرت الدراسات التي أجريت مؤخرا، مع ذلك، أن إشارات للدماغ خفيفة و / أو ضمور المخيخ على تصوير الدماغ ثابتة تقريبا في SPG7 (Elleuch وآخرون، 2006). ترتبط العديد من الأشكال الأخرى من ARHSP أيضا مع الاعتلال العصبي (جدول 4) وارتباطه رنح مخيخي ليس محددة لSPG30 ولكن يمكن أيضا أن تكون موجودة في SPG7، SPG21 وSPG27.
وفي الختام فإننا قمنا تعيين موضعا رواية (SPG30) لكروموسوم 2q37.3 هي المسؤولة عن شكل جديد راثي متنحي من التعقيد HSP. هذه هي الخطوة الأولى نحو تحديد جين جديد حاسم لفهم الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء HSP.

مصادر إلكترونية

مركز Mashfield لعلم الوراثة الطبية: http://www.marshfieldclinic.org/genetics
المركز الوطني للتحقيقات البيولوجية (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov
متصفح الجينوم Ensembl: http://www.ensembl.org
منظمة الجينوم البشري (HUGO): http://www.gene.ucl.ac.uk/hugo/

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #6  
قديم 11-22-2015, 10:57 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تفاعل اثنين وراثية المنتجات الشلل النصفي التشنجي الجينات، spastin وatlastin، يشير إلى وجود مسار مشترك لصيانة محور عصبي

 

http://www.pnas.org/content/103/28/10666.full

ملخص

الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP) هو اضطراب الاعصاب التي تتميز تنكس محور عصبي الوراء الذي يؤثر على الخلايا العصبية في المقام الأول في العمود الفقري طويلة. هذا المرض هو غير متجانس سريريا، وهناك> 20 المواضع الجينية التي تم تحديدها. هنا، وتبين لنا التفاعل الجسدي بين spastin وatlastin، وهما جسمية مهيمنة منتجات الجين HSP. Spastin يشفر أنيبيب (MT) -severing AAA أتباز (أتباز المرتبطة بالأنشطة المختلفة)، وatlastin يشفر بروتين الغشاء لا يتجزأ GTPase المترجمة جولجي. Atlastin لا تنظم النشاط الأنزيمي من spastin. حددنا أيضا طفرة السريرية في atlastin خارج المجال GTPase الذي يمنع التفاعل مع spastin في الخلايا. ولذلك، فإننا نفترض أن عدم التفاعل المناسب بين هذين HSP منتجات الجينات قد تكون ذات صلة pathogenetically. وتشير هذه البيانات إلى أن ما لا يقل عن مجموعة فرعية من الجينات HSP قد تحدد مسار بيولوجي الخلوية التي أمر مهم في صيانة محور عصبي.
وراثي الشلل النصفي التشنجي (HSP) هو اضطراب وراثيا وغير متجانسة سريريا أن يتميز سريريا من قبل مشية تشنجية، حسي اهتزازي معتدل، والإلحاح البولي ومرضي من قبل axonopathy رجعية أن ينطوي في المقام الأول على الخلايا العصبية طويلة من الجهاز القشري والحزمة الناحلة (1 ). هناك> 20 جينات مرتبطة HSP. وقد وصفت لم التفاعل الجزيئي بين أي من البروتينات المشفرة بواسطة هذه الجينات.
بصفة عامة، وقد أدت وظائف ثبت أو الاستدلال من الجينات HSP إلى عدة فرضيات واسعة حول المرضية الجزيئي للHSP. وقد اقترح HSP أن يكون اضطراب الميتوكوندريا، استنادا إلى حقيقة أن اثنين من الجينات HSP، paraplegin (2) وmtHSP 60 (3)، هي بروتينات الميتوكوندريا مع الأدوار في مراقبة الجودة من البروتين وقابلة للطي. الطفرات في KIF5a، وهو كينيسين التقليدية التي يتم التعبير بشكل كبير في الخلايا العصبية، يسبب HSP (4)، مما يدل على أن نقل محور عصبي ضعف قد تكمن وراء بعض أشكال المرض. الطفرات في spastin (SPG-4)، وهو AAA أتباز (أتباز المرتبطة بالأنشطة المختلفة)، يسبب 40٪ من حالات جسمية مهيمنة من HSP (5). نحن وغيرنا قد أظهرت أن spastin هو أنيبيب (MT) انزيم -severing وأن الطفرات المرض يضعف هذا النشاط (6، 7).
وترتبط العديد من الجينات HSP مع مختلف العضيات غشائي ولقد استنتج الأدوار في الاتجار حويصلي. Spastin وspartin (SPG-20) (8)، جين آخر HSP، سواء تحتوي على معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (أنيبيب التفاعل والنقل) المجال (9)، والتي كثيرا ما وجدت في البروتينات المرتبطة الاندوسوم، بما في ذلك Vps4، وهو AAA أتباز أن يفكك ESCRT (endosomal الفرز المعقدة اللازمة لنقل) مجمعات البروتين كجزء من مسار الجسم عديد الحويصلات (10). MIT Spastin ويربط CHMP1B (11)، واحد من عائلة من البروتينات المتورطين في مسار الجسم عديد الحويصلات. الطفرات في atlastin (12)، والغشاء لا يتجزأ من البروتين GTPase الذي المترجمة في المقام الأول إلى جهاز جولجي (13)، كما يسبب HSP. الطفرات في alsin، التي لديها راب 5 وراك جوانين مجالات تبادل النوكليوتيدات، تشير إلى أن وجود خلل في الاتجار داخل الخلايا قد يسبب HSP (14، 15).
سريريا، يمكن HSP يكون المتغير فيما يتعلق عمر البدء، انتفاذ، التعبيرية من النمط الظاهري، ومجموعة من التشوهات العصبية الموجودة في المرضى. ونظرا لعدم التجانس وفرضيات لا تعد ولا تحصى من الأساس الجزيئي لفقدان محور عصبي في HSP، ينشأ السؤال المركزي حول ما درجة غير HSP مرض واحد. وبعبارة أخرى، القيام بأي أو بعض هذه الجينات مرض تعمل معا في المسار الخلوي واحد وظيفتها مهم في صيانة محور عصبي؟ التفاعل وصفنا بين spastin وatlastin تشير إلى أن مجموعة فرعية من منتجات الجين HSP قد تعمل بهذه الطريقة.
النتائج

لتحديد البروتينات التفاعل spastin، أجرينا الخميرة شاشة يومين الهجينة التي تستخدم بالطول spastin كطعم. فحص حقق 12 استنساخ المستقلة، واحدة منها المشفرة جزء من atlastin-1 (الشكل 1 A). مثل spastin، atlastin هو الصفة السائدة HSP الجين (12). Atlastin هو لا يتجزأ GTPase بروتين الغشاء جولجي المترجمة (13). كان استنساخ استردادها في إطار ويفتقر المجال GTPase لكن ترميز اثنين من شرائح الغشاء والذيل حشوية (C-الذيل) من atlastin. حذف المجال-C الذيل من هذا استنساخ (496 إيقاف) في atlastin-1 البشري إلغاء التفاعل في الخميرة فحص اثنين من الهجين (الشكل 1 A).

تين. 1.
Spastin-atlastin التفاعل. (A) A الخميرة الشاشة هجين اثنين حددت atlastin باعتباره interactor لspastin. وقد استخدم كامل طول spastin الإنسان كطعم وتفاعلوا مع ترميز استنساخ الأحماض الأمينية 408-558 من atlastin-1 البشري. وقد استخدمت هذه استنساخ ومتحولة الحذف تفتقر إلى C-ذيل atlastin (ΔCtail) لretransform الخميرة في فحص اثنين من الهجين. استنساخ الأصلي، ولكن ليس استنساخ ΔCtail، تفاعلت مع spastin في هذا الاختبار. (B) Coimmunoprecipitation من spastin وatlastin. خلايا هيلا وعابر. لمدة 24 ساعة مع 2HA-spastin وإما atlastin-صاحب-6X (المحللة 1) أو صاحب-6X الموسومة β-غال (المحللة 2) كوسيلة لمراقبة سلبية. تعرض لست] الخلية إلى مناعي مع الأجسام المضادة له-6X تليها مكافحة HA (يسار) أو مكافحة صاحب-6X (يمين) النشاف الغربي. وأعرب كلا لست] المبالغ المعادلة من HA-spastin (SM) وspastin coimmunoprecipitated مع atlastin ولكن ليس بيتا غال. في 50- وشرائح 20 كيلو دالتون هي سلاسل الثقيلة والخفيفة IG. (C) Coomassie هلام الزرقاء الملطخة تبين أن spastin بربط atlastin C-الذيل. تم المشقوق ضريبة السلع والخدمات من GST-spastin بدقة البروتيني (PP)، وخليط التفاعل الخام (حارة 3) تحتوي على 10 ميكروغرام من spastin تم تطبيقها على حبات الجلوتاثيون سيفاروز تحتوي على 10 ميكروغرام من GST-atlastin C-الذيل أو ضريبة السلع والخدمات وحدها ( الممرات 4-6) في إجمالي حجم 200 ميكرولتر. الممرات 1 و 2 عرض عينات من الخرز التي تحتوي على GST atlastin الوحيد C-الذيل أو ضريبة السلع والخدمات. جميع spastin أضاف لكن أيا من GST المشقوق أو PP منضمة إلى atlastin C-الذيل، وATP لم يكن مطلوبا للربط (قارن الممرات 4 و 5). وعلى النقيض من GST-spastin، لا يحتوي على البروتين GST atlastin-C الذيل موقع انشقاق PP.

المقبل، ونحن cotransfected خلايا هيلا مع البلازميدات ترميز spastin 2HA الموسومة وإما atlastin-6xHis أو β-غال-6xHis (الشكل 1 B). تعرض لست] توضيح لمناعي مع الأجسام المضادة لمكافحة 6xHis. جرى التحقيق Immunoprecipitates لspastin من قبل مكافحة هيماغلوتينين (HA) النشاف الغربي. Spastin coprecipitated مع atlastin ولكن ليس مع β-غال، على الرغم من أن أعرب عن البروتين السيطرة على مستوى أعلى من atlastin (الشكل 1 B). وأكد الغربية النشاف مع الأجسام المضادة لمكافحة HA أن كلا لست] أعربت المبالغ المعادلة من spastin. الأضداد HA الكشف عن شريطين المتعلقة spastin. على الرغم من أننا لا نعرف لماذا، ونحن نتصور أن الشريط العلوي قد تمثل صيغة معدلة posttranslationally من spastin. على الرغم من أنه يبدو كما لو سوى أقل الفرقة الزميلة مع atlastin، لا يمكننا استبعاد احتمال أن الشريط العلوي تربط لكن هذا لم نتمكن من الكشف عن ذلك بسبب وفرة أقل من هذا النموذج.
لأن الخميرة تحليل هجين اثنين أشارت إلى أن C-ذيل atlastin ملزم spastin، أنتجنا وتنقيته المؤتلف GST-atlastin C-الذيل. تم المشقوق شاردة GST الخروج من spastin المؤتلف مع البروتيني للموقع المحدد. تمت إضافة خليط التفاعل spastin / GST / البروتيني إلى يجمد حبة GST atlastin C-الذيل أو ضريبة السلع والخدمات. لا يحتوي على C-ذيل البروتين الانصهار GST atlastin موقع الدقة البروتيني، وبالتالي لم المشقوق من قبل البروتيني. Spastin متجهة إلى GST atlastin C-ذيل، ولكن ليس إلى GST، بطريقة ATP مستقلة، مما يدل على التفاعل المباشر (الشكل 1 C). أجرينا أيضا هذه التجربة مع كامل طول GST-spastin ثبتوا على حبات واستحوذ على كامل طول المالتوز المؤتلف البروتين atlastin ملزمة (في المخازن التي تحتوي على المنظفات) (انظر الشكل رقم 6، التي تصدر عن دعم المعلومات على شبكة الإنترنت PNAS موقع).
إضافة فائض المولي 10 أضعاف من GST-atlastin C-الذيل ولكن ليس GST تسبب زيادة طفيفة جدا في النشاط أتباز spastin في المختبر (الشكل 7، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). بعد ذلك، طلبنا ما إذا كان هذا زيادة طفيفة في أتباز نتائج النشاط في تعزيز قطيعة MT. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن المحتضنة ضريبة السلع والخدمات spastin مع، النظام التجاري المتعدد الأطراف استقرت التاكسول المسمى رودامين في غياب أو وجود فائض المولي 10 أضعاف من GST-atlastin C-الذيل. في نقاط زمنية مختلفة، وإزالة aliquots من كل رد فعل، ولم تتوقف انقطاع بإضافة غلوتارالدهيد. وقد تم قياس طول MT من الميكروسكوب، وحسبت متوسط ​​أطوال. الشكل. 2 A يدل على أن متوسط ​​طول النظام التجاري المتعدد الأطراف بمرور الوقت. نحن لم يكشف عن أي تغييرات التي يسببها atlastin في حد أو المعدل الظاهر من MT تقصير في هذا الاختبار. على الرغم من أننا لم يكشف أي تأثير atlastin، وفحص المرجح لديها هامش كبير من الخطأ، ونحن لا نستطيع استبعاد دور للatlastin في تحوير النشاط spastin. بالاتفاق مع المختبر في البيانات، لم cooverexpression من atlastin-FLAG جنبا إلى جنب مع الأصفر بروتين فلوري (YFP) -spastin في كوس-7 الخلايا لا يمنع بوساطة spastin انقطاع (الشكل 2 B).

تين. 2.
Atlastin C-الذيل لا تمنع بوساطة spastin MT انقطاع. استخدمت (A) استقرت تاكسول، النظام التجاري المتعدد الأطراف المسمى رودامين وspastin، قطع فحوصات بدون أو مع المؤتلف atlastin C-الذيل كما هو موضح في المواد وطرق. في النقاط الزمنية المشار إليها، توقفت ردود الفعل من قبل التثبيت في غلوتارالدهيد. تم تصويرها النظام التجاري المتعدد الأطراف، وحسبت متوسط ​​أطوال كما هو موضح في المواد وطرق. ويبين الرسم البياني شريط أطوال متوسط ​​± الخطأ المعياري. تظهر photomicrographs تمثيلية مدى MT انقطاع. لم يكن هناك فرق ملحوظ بين ردود الفعل المحتضنة مع أو بدون C-الذيل. يظهر Coomassie هلام الزرقاء الملطخة المبالغ النسبية لكل بروتين (تويولين، 0.1 ملغ / مل؛ spastin، 0.02 ملغ / مل). تم استخدام C-الذيل في 10 أضعاف الرحى الزائدة مقارنة مع spastin. تم cotransfected (B) كوس-7 الخلايا مع YFP-spastin وatlastin-FLAG. بعد 24 ساعة، تم إصلاح الخلايا وملطخة مكافحة FLAG و أضداد تويولين. Spastin (الخضراء) وatlastin (الأحمر) colocalize. الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تظهر انخفض MT (الأزرق) محتوى مقارنة مع الخلايا المجاورة. (مقياس شريط 15 ميكرون).

ومع ذلك، فإننا لم تلاحظ أن في الخلايا cotransfected، ونمط atlastin-FLAG تلطيخ يبدو غيرت (الشكل 2 B) مقارنة مع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل فقط مع atlastin-FLAG (الشكل 8، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS ). في حين تم العثور على معظم atlastin الذاتية في جولجي (13)، وoverexpressed atlastin-FLAG colocalizes معظمها مع علامة جولجي (الشكل 8) في الخلايا cotransfected، وcodistributed atlastin-FLAG في نقاط ومع spastin. كما هو الحال مع اضطراب MT الناجمة عن العديد من العلاجات، نتائج فقدان MT-الناجم عن spastin في تشتت جولجي (لا تظهر البيانات). على الرغم من spastin overexpressed وatlastin وcolocalized في هذه التجربة (الشكل 2 B)، ويظهر لا البروتين نمط تلطيخ هذا هو الحال في أي الذاتية البروتين (انظر الشكل 4 A).
ومع ذلك، اقترحت هذه التجربة أن التجارب cotransfection قد يكون وسيلة مريحة لتحديد مجالات spastin وatlastin اللازمة لcoassociation في الخلايا. للالتفاف على حقيقة أن WT spastin يدمر النظام التجاري المتعدد الأطراف، وهذا بدوره قد تغير توطين التحت خلوية من البروتينات، وكنا E442Q spastin متحولة، الذي يربط النظام التجاري المتعدد الأطراف ولكن لا يمكن أن يطلق أو قطع (6)، وبالتالي يزين النظام التجاري المتعدد الأطراف في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. والمثير للدهشة، أدى cotransfection مع spastin E442Q وatlastin-FLAG في atlastin توزع جنبا إلى جنب مع spastin على النظام التجاري المتعدد الأطراف (الشكل 3). في نفس الخلايا، مورفولوجيا جولجي وفقا لتقييم GM130 تلطيخ يبدو طبيعي نسبيا (الشكل 9، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). لأن atlastin هو بروتين الغشاء لا يتجزأ، ونحن نتصور أن الحويصلات تحمل تصنيعه حديثا atlastin-FLAG من الشبكة الإندوبلازمية إلى جولجي أو بعد جولجي-الحويصلات تحمل atlastin يجب أن يكون قد جند لspastin متجهة الى MT. من هذا الاختبار، فإننا نستنتج فقط أن اثنين من البروتينات في الخلايا تتفاعل بطريقة بحيث واحد يؤثر على توطين البعض. في المرضى المصابين حيث لا هى overexpressed spastin متحولة، وقد لوحظ عدم وجود علاقة مستقرة من spastin متحولة مع النظام التجاري المتعدد الأطراف (16).

تين. 3.
التفاعل Spastin atlastin في الخلايا. في كوس-7 خلايا cotransfected مع YFP-E442Q spastin وatlastin-FLAG، atlastin هو "تجنيد" إلى النظام التجاري المتعدد الأطراف جنبا إلى جنب مع متحولة spastin، مشيرا إلى أن اثنين من البروتينات تتفاعل في الخلايا (A - C). حذف المنطقة N-الطرفية (بقايا 1-132) من spastin (G - I)، ولكن ليس MIT (بقايا 116-194) (J - L) أو اكسون 4 (بقايا 195-227) (M - O) المجالات، منع تجنيد atlastin. حذف C-الذيل من atlastin منع تجنيد (D - F).

وعدم تجنيد Atlastin تفتقر إلى C-الذيل إلى spastin E442Q (الشكل 3)، بما يتفق مع ربط البيانات في المختبر أظهرت أن spastin بربط atlastin C-الذيل. لتحديد مجال spastin هي المسؤولة عن التفاعل atlastin، قدمنا ​​سلسلة من عمليات الحذف مجال واحد في spastin. بشكل عام، spastin هو جزيء ثنائي مع C-محطة مجال AAA أتباز (الأحماض الأمينية 344-616). المنطقة-N من محطة spastin (الأحماض الأمينية 1-343) يحتوي على أربعة نطاقات فرعية متميزة. 115 الأحماض الأمينية الأولى من spastin تحتوي على منطقة البرولين الغنية ومجال مسعور. وتشمل الأحماض الأمينية 116-194 المجال MIT (9). اكسون 4 (الأحماض الأمينية 195-227) وتقسم بدلا من ذلك، والقليل هو المعروف عن هذا المجال (17). المجال-N محطة، ولكن لا مجال MIT ولا اكسون 4، مطلوب للتجنيد atlastin (الشكل 3). معا، وهذه النتائج تشير إلى أن المجال N محطة من spastin بربط C-ذيل atlastin. اثنين من الأشكال (S44L وP45Q)، والتي قد تكون بمثابة المعدلات الوراثية (18)، وطفرة الأمراض المرتبطة (dupA102، S103) (19 تقع) في هذه المنطقة-N من محطة spastin. أيا من هذه التغييرات في spastin منع تجنيد atlastin في مقايسة cotransfection (الجدول رقم 1، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). باستخدام فحوصات ترنسفكأيشن والعمل مع النظام التجاري المتعدد الأطراف النقاء في videomicroscopic قطع فحص (6)، وجدنا أن Δ1-227 spastin (تفتقر المنطقة N-المحطة، المجال MIT، واكسون 4) يمكن ما زالت تفصل النظام التجاري المتعدد الأطراف ولها نشاط مماثل أتباز لذلك من البروتين كامل طول (لا تظهر البيانات وبيانات غير منشورة).
درسنا عدة طفرات في كل spastin وatlastin باستخدام هذا الاختبار (انظر الجدولين 1 و 2، والتي يتم نشرها عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). قمنا بتحليل اثنين من الطفرات السريرية في atlastin C-الذيل وجدت أن R495W (20)، ولكن ليس ins1688A، تفاعلت مع spastin (الشكل 10، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS).
رفعنا الأجسام المضادة لكلا spastin وatlastin وفحص ما إذا كان spastin الذاتية وatlastin colocalize في خلايا كوس. وتظهر البقع غرب لست] الخلية باستخدام الأجسام المضادة تنقية تقارب (الشكل 11، التي تصدر عن دعم المعلومات على الموقع الشبكي PNAS). أظهر الأجسام المضادة atlastin نمط تلطيخ محيط بالنواة (الشكل 4) مماثلة لتلك التي نشرتها تشو وآخرون. (13). كثافة تلطيخ تنوعت بين الخلايا. وكانت كثافة تلطيخ spastin الذاتية يتناسب مع كمية من atlastin أعرب (الشكل 4 A). أيضا، كان هناك colocalization الجزئي لاثنين من البروتينات الذاتية.

تين. 4.
Colocalization من spastin الذاتية وatlastin. (A) كوس الخلايا وملطخة الأجسام المضادة لatlastin وspastin. تم الكشف عن إشارات باستخدام قبرصي-5-مترافق أو اليكسا فلور 488 الضد الثانوية. تم الكشف عن إشارة Spastin باستخدام فلور اليكسا 488. لاحظ colocalization الجزئي لاثنين من البروتينات. وكانت Atlastin كثافة تلطيخ المتغيرة، وإشارة spastin أعلى في الخلايا معربا عن المزيد من atlastin. (B) Spastin رني لا يغير بشكل ملحوظ atlastin تلطيخ. تم قمع التعبير Spastin (يسار) جزئيا ترنسفكأيشن من سيرنا spastin محددة ولكنها ليست سيرنا المخفوق. أظهر ترنسفكأيشن مع سيرنا المسمى رودامين أن> 90٪ من الخلايا و transfected (لا تظهر البيانات). كانت ملطخة coverslips مكررة أعدت من نفس transfections لatlastin الذاتية (يمين)، والتي ظهرت دون تغيير. (C) آثار atlastin رني على spastin. الخلايا كانت ثابتة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وتكرار coverslips كانت ملطخة إما spastin أو atlastin. في هذه التجربة، لوحظ تلوين الخلفية من نوى في بعض الأحيان. الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، التي حددها GFP التعبير (إدراجات) بالرمز النصال. كانت ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). مقارنة مع الخلايا nontransfected، يتم منعها atlastin تلطيخ جزئيا في atlastin رني ولكن ليس في خلايا رني السيطرة. مقارنة مع الخلايا السيطرة transfected، أظهرت نسبة مئوية صغيرة من الخلايا تعرض لatlastin رني تركيز محيط بالنواة من spastin (29٪ مقابل 45٪، ن = 135 الخلايا من كل ترنسفكأيشن). التحليل الكمي لطخة غربية من عدد متساو من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل الحصول عليها عن طريق التدفق الخلوي يوضح أن atlastin قمع كان 60٪ وخفضت أن مستويات spastin أيضا درجة مماثلة. وتم تطبيع إشارات إلى كثافة أكتين. (أشرطة النطاق، 15 ميكرومتر).

سألنا عما إذا تدخل الحمض النووي الريبي (رني) إسكات بوساطة أي من spastin أو atlastin تتأثر البروتين الأخرى. قمع Spastin، باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل باختصار (سيرنا) التي تحققت، أدى إلى انخفاض ولكن لم تلغ تلطيخ spastin (الشكل 4 B) ولكن لم يغير بشكل ملحوظ إما نمط atlastin تلطيخ أو شدة. في تحليل لطخة غربية، لم قمع spastin بنسبة 50٪ بحلول رني لا يؤدي إلى مستويات atlastin تغيير (لا تظهر البيانات). لقمع atlastin، ونحن transfected الخلايا مع البلازميد التي تحتوي على الحمض النووي الريبي دبوس الشعر القصير (shRNA) معين لatlastin. الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل coexpress GFP جنبا إلى جنب مع shRNA. النشاف الغربي من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل الحصول عليها عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 4 أظهر C) 60٪ قمع atlastin. ومن المثير للاهتمام، كما أدى atlastin رني في انخفاض مماثل في مستويات spastin. أدى Atlastin رني في انخفاض بنسب مختلفة atlastin تلطيخ مقارنة مع الخلايا السيطرة (الشكل 4 C). وفيما يتعلق تلطيخ spastin، أظهرت 45٪ من الخلايا السيطرة transfected منطقة محيط بالنواة مع المركز تلطيخ spastin (انظر الشكل 4 C). في المقابل، أظهرت 29٪ فقط من الخلايا atlastin رني transfected هذه الميزة. انخفاض في spastin تلطيخ محيط بالنواة يمكن أن تنجم عن أي انخفاض مستويات spastin أو عدم القدرة على التركيز spastin إلى المناطق التي تحتوي على atlastin.
كنا نتساءل عما إذا atlastin overexpression من شأنه أن يؤدي في التعيين وربما زيادة مستوى ثابت للدولة من spastin الذاتية. أيضا، لاختبار ما إذا كان atlastin C-الذيل هو ضروري وكاف لهذه الظواهر، أنشأنا اثنين من بنيات إضافية. بين أفادت والطفرات المسببة للأمراض في atlastin واحد هو أن يحذف أكثر من C-الذيل (21). هذه الطفرة، والإدراج من الأدنين في موقف 1688، تغير القراءة إطار 10 أأ إلى C-الذيل، ويضيف تسلسل غير الأصليين، ويدخل وقف كودون سابقة لأوانها. مثل بناء ΔC الذيل المستخدمة في الشكل. 3، منعت هذه الطفرة التفاعل spastin في مقايسة cotransfection (الشكل 10). نحن أيضا خلق بناء (atlastin C-الذيل جولجي) مع atlastin C-الذيل FLAG شاردة تنصهر شاردة جولجي في توطين (بقايا galactosyl ترانسفيراز الأحماض الأمينية الترميز التي هي المسؤولة عن جولجي التعريب).
نحن transfected الخلايا مع البلازميدات ترميز WT-atlastin-FLAG، ins1688A-atlastin-FLAG، أو atlastin C-الذيل جولجي. تم إصلاح الخلايا وملطخة المزدوج لFLAG وspastin الذاتية (الشكل 5). في الخلايا overexpressing atlastin تفتقر إلى C-الذيل (atlastin-ins1688A)، لم colocalized spastin الذاتية مع atlastin overexpressed. في هذه الخلايا، وتلطيخ spastin أيضا أقل كثافة (الصورة المعروضة في الشكل 5 تم الحصول E باستخدام قتا أطول التعرض لجعل تلطيخ spastin مرئية). أيضا، وتلطيخ spastin في كل من الخلية transfected والخلايا nontransfected تظهر مشابهة في كثافة والتوزيع. في المقابل، في خلايا overexpressing WT atlastin-FLAG أو atlastin C-الذيل جولجي، وcolocalized spastin الذاتية مع atlastin overexpressed. وبمقارنة خلايا ثلاثة صورت في الشكل. 5 G و H، وكمية من تلطيخ spastin الذاتية يتناسب مع كمية atlastin-C الذيل جولجي التعبير عنها. وتشير هذه النتائج إلى أن C-ذيل atlastin ضروري وكاف لتجنيد spastin. جنبا إلى جنب مع البيانات في الشكل. 4 A، فإنها تشير أيضا إلى أن مستويات atlastin وspastin ترتبط. قمنا بقياس مضان atlastin-FLAG ومضان من spastin الذاتية في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وnontransfected تم اختيارها عشوائيا. مؤامرة من شدة atlastin-FLAG مقابل كثافة spastin تبين أن هناك علاقة جيدة بين مستويات atlastin وspastin على أساس خلية تلو خلية (الشكل 5).

تين. 5.
وatlastin C-الذيل اللازم والكافي لتجنيد spastin الذاتية للجولجي. كوس و transfected الخلايا مع WT atlastin-FLAG (A - C)، ins1688A-atlastin-FLAG (D - F)، أو atlastin-C الذيل جولجي (G - I) لمدة 48 ساعة. كانت ملطخة الخلايا باستخدام الأجسام المضادة FLAG (قبرصي-5 الضد الثانوية في A، D، G و، كما هو موضح باللون الأحمر) والملون لspastin الذاتية (فلور اليكسا 488 كشف في B، E، H و، كما هو موضح باللون الأخضر). لاحظ colocalization الجزئي للspastin مع-C الذيل جولجي بالوزن وatlastin ولكن ليس مع ins1688A-atlastin. وتزداد كثافة Spastin في الخلايا معربا عن المزيد من atlastin-C الذيل جولجي (قارن الخلايا في G و H). تم الحصول على صورة في E مع زيادة مدة التعرض لتصور أفضل لتلطيخ spastin. لاحظ أن مستويات spastin هي نفسها في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وnontransfected ولا المترجمة التي spastin مع atlastin. تظهر لطخة غربية أن الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع البلازميدات ترميز atlastin-YFP أو atlastin C-الذيل جولجي، ولكن ليس YFP، وتظهر زيادة مستويات spastin الذاتية (كما هو موضح باللون الأخضر). الأرقام أعلاه كل حارة تظهر الزيادة النسبية في مستويات spastin [مقارنة مع الخلايا YFP transfected وتطبيع للالأكتين التعبير (أحمر)]. ويبين الرسم البياني spastin كثافة مضان بوصفها وظيفة من كثافة مضان atlastin-FLAG في الخلايا المحددة بشكل عشوائي. لديها خلايا لا overexpressing atlastin-FLAG بمتوسط ​​كثافة spastin من 95 وحدة تعسفية.

المقبل، ونحن transfected الخلايا مع YFP، atlastin-YFP، أو atlastin-C الذيل جولجي. بعد 24 ساعة، تم فحص مستويات spastin عن طريق ويسترن الكمية النشاف (الشكل 5). فحص الخلايا YFP وYFP معربا عن تحلل قبل كشف الكفاءات ترنسفكأيشن متساوية من ≈70٪. overexpression من atlastin-YFP، ولكن ليس YFP وحده، أدت إلى زيادة ≈3 أضعاف في إشارة spastin، في حين أدى overexpression من atlastin C-الذيل جولجي في زيادة 7.8 أضعاف في spastin.

نقاش

أظهرنا أن المجال N-محطة من spastin يربط مباشرة إلى المجال-C محطة حشوية من atlastin. هذا التفاعل بين اثنين من المنتجات HSP جين المرض تشير إلى أن بعض> 20 الجينات HSP قد تحدد مسار بيولوجي الخلوية التي أمر مهم في صيانة محور عصبي. أظهرنا أيضا متحولة HSP المرتبطة ins1688A-atlastin لا تتفاعل مع spastin، مما يوحي بأن HSP يمكن أن تنجم عن عدم وجود تفاعل طبيعي بين spastin وatlastin.
لا حذف ولا الطفرات مغلطة في-N محطة GTPase مجال atlastin لمنع تجنيد (الجدولين 1 و 2). وبالتالي، فإن دور النشاط GTPase، إن وجدت، في تنظيم تفاعل atlastin spastin غير واضح.
في حين أن هذه الورقة تحت المراجعة، ساندرسون وآخرون. (22) أن spastin وatlastin التفاعل في الخميرة اثنين الهجين الفحص. وعلى النقيض من النتائج التي توصلنا إليها، فإنها ذكرت أن الجزء N-محطة من atlastin يربط spastin. واستند هذا الاستنتاج على تجربة حيث حضنت لست] من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع spastin مع GST-1-447 atlastin أو مع GST وحدها. لأن atlastin الذاتية كان حاضرا أيضا في هذه الخلايا، ولأن atlastin قادر على homooligomerization (13)، فمن الممكن أن التفاعل وحظ وغير المباشر. باستخدام الخميرة فحص اثنين من الهجين (الشكل 1)، وفحص التوظيف حيث الذيل C ولكن ليس مطلوبا أول 447 الأحماض الأمينية atlastin للتجنيد (التين. 3 و5 والجدولين 1 و 2)، والمؤتلف المنقى البروتينات (الشكل 2)، ودراسة spastin الذاتية (الشكل 5)، وتبين لنا أن atlastin C-ذيل يربط مباشرة إلى spastin وغير ضروري وكاف للتفاعل spastin.
لأن atlastin بربط منطقة spastin هذا هو الاستغناء عن MT انقطاع (لا تظهر البيانات)، ولأن وجدنا أن atlastin المؤتلف C-ذيل لم يغير بوساطة spastin MT انقطاع في المختبر (الشكل 2)، ونحن نعتقد أنه يجوز atlastin العمل في توطين spastin. الأدلة الحالية تشير إلى أن atlastin وجدت في جولجي ويترافق مع حويصلات في المحاور ومخاريط النمو في الخلايا العصبية (23)، أثار احتمال أن تكون بعض atlastin من جولجي يحصل تعبئتها في حويصلات جولجي مشتقة. Atlastin يمكن توظيف spastin إلى جولجي أو ربما إلى الحويصلات بعد جولجي في ظل الظروف لم يحدد بعد. وتمشيا مع هذه الفكرة، معربا عن الخلايا كميات أكبر من أي atlastin الذاتية (الشكل 4 أ) أو overexpressed عرض atlastin ارتفعت مستويات ثابتة للدولة من spastin وعززت colocalization مع spastin. أدى القمع الجزئي للatlastin أيضا في انخفاض مستويات ثابتة للدولة من spastin وتوزيع الخلوية تغير أقل ما يقال في بعض الخلايا.

المواد والأساليب

ثقافة هيلا وكوس-7 خلايا وTransfections.

وكانت مزارع الخلايا وtransfections كما هو موضح في المرجع. 6. حذف بنيات YFP-spastin الأصلية (6 تم انجازه) مع نظام الطفرات QuikChange (Stratagene)، وتأكدت الطفرات من تسلسل الحمض النووي. حذف بناء ΔN الأحماض الأمينية 1-132، حذف بناء ΔMIT الأحماض الأمينية 116-194، وحذف بناء Δexon 4 الأحماض الأمينية 195-227. تم الحصول على صورة استنساخ atlastin وFLAG- أو صاحب-6X الموسومة في محطة C. لبناء atlastin C-الذيل جولجي بناء، تم إضافة البادئ الأرصاد رامزة إلى DNA ترميز atlastin C-الذيل FLAG. وتنصهر تسلسل مسؤولة عن توطين galactosyl ترانسفيراز إلى جولجي (81 بقايا N-المحطة) 3 'إلى تسلسل FLAG.

الخميرة ثنائي هجين الفرز.

تم إجراء فحص الخميرة اثنين الهجين مع النظام Clontech صانع عيدان الثقاب. تم استنساخ spastin الإنسان إلى البلازميد pGBK-T7 باستخدام تقييد مواقع NdeI وBamHI، وكان يستخدم البلازميد لتحويل سلالة AH109. وتزاوج هذه الخمائر مع سلالة Y187 التي تم pretransformed مع كدنا] مكتبة هيلا (Clontech) المستنسخة في pGAD T7 تفصيل. كانت مطلية Diploids على الثلاثي المتوسطة التسرب (منخفض اختيار صرامة)، وكانت replated ايجابيات على لوحات التسرب رباعية (الصرامة العالية) التي تحتوي على X-α-غال. تم إعداد البلازميدات من الحيوانات المستنسخة الإيجابية واستخدامها لتحويل KC8 القولونية. والتسلسل البلازميدات تعافى وretransformed إلى سلالة AH109، وكررت الفحص هجين اثنين لتأكيد أننا قد عزل البلازميدات الصحيحة.

البروتينات المؤتلف.

كان التعبير Spastin وتنقية كما هو موضح في المرجع. 6. وكان جزء ترميز C-ذيل atlastin (الأحماض الأمينية 495-558) PCR تضخيم مع الاشعال مضيفا BamHI وEcoRI تقييد مواقع للاستنساخ في pGEX2T. وأعرب عن ضريبة السلع والخدمات atlastin C-الذيل في الخلايا BL21 RILP (Stratagene) من خلال تحريض الثقافات المرحلة لوغاريتمي مع 0.4 ملي الآيزوبروبيل β- د -thiogalactoside عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. تم تعطيل عمل خلايا غسلها، وكان تنقية البروتين GST الانصهار نفس لGST-spastin (6). تم المشقوق GST من spastin المؤتلف باستخدام البروتيني الدقة (GE للرعاية الصحية).

في المختبر MT قطع حبل.

، النظام التجاري المتعدد الأطراف استقرت التاكسول المسمى رودامين أعد كما هو موضح في المرجع 6 استخدمت (0.1 ملغ / مل تركيز النهائي) في قطع فحوصات أجريت في 25 ° C مع spastin (0.02 ملغ / مل)، وATP (1 ملم) في غياب أو وجود 10 أضعاف الزيادة المولي من atlastin C-الذيل. في بعض الأحيان هو مبين في الشكل. 2 A، أزيلت قسامات وثابتة في غلوتارالدهيد. وكانت مخففة العينات ورصدت على coverslips، وصورت MTS من 10 على الأقل المجالات المجهرية تم اختيارها عشوائيا ويتم قياسها باستخدام metamorph. تم تصوير حوالي 125-250 النظام التجاري المتعدد الأطراف وقياس لكل نقطة زمنية.

Coimmunoprecipitations.

و transfected خلايا هيلا في لوحات ستة جيدا لمدة 24 ساعة و lysed في RIPA العازلة (50 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4 / 100 ملي كلوريد الصوديوم / 2 مم MgCl 2/10٪ الجلسرين / 1٪ تريتون X-100 / 0.5٪ deoxycholate / 0.1 وقد تم توضيح روش العلوم التطبيقية، انديانابوليس)، ولست] بواسطة الطرد المركزي (20،000 × ز مركبات لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية)؛٪ SDS / البروتيني خليط المانع. تم precleared Supernatants مع بروتين G سيفاروز، وأضيفت 2.5 ميكروغرام من صاحب-6X الأجسام المضادة والبروتين G لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تم غسلها حبات ثلاث مرات في المخزن RIPA ومزال في SDS عينة العازلة. جرى التحقيق لست] لspastin وatlastin التي كتبها α-HA وα صاحب الغربي النشاف، على التوالي. جرى التحقيق Immunoprecipitates عن محتوى spastin التي كتبها HA النشاف.
الأجسام المضادة والمناعي.

تم تحصين الدجاج مع GST-spastin، وكانت الأجسام المضادة تقارب-تنقيته من المستمدة من صفار IGY جزء باستخدام مصفوفة تقارب حيث ثبتوا بروتين النخاعين الأساسي (MBP) -spastin مع Affigel. تم انتشال الأجسام المضادة النقاء بتركيز 0.2 ملغ / مل وتخزينها في 50 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0). لجعل الأجسام المضادة atlastin، تم تحصين الأرانب مع GST atlastin C-الذيل. والأجسام المضادة تنقية تقارب على مصفوفة MBP-atlastin.
الكشف عن spastin الذاتية المناعي المجهري الحجب المطلوب من خلايا الميثانول الثابتة في BlockHen II (إيفس مختبرات، تيغارد، OR) للحد من تلوين الخلفية. أيضا، تم استخدام الأجسام المضادة في 1: 5،000-1: 20،000 التخفيفات، وتضخيم إشارة مع Tyramide تضخيم إشارة كيت اليكسا فلور 488 أو فلور اليكسا 594 (المسابر الجزيئية).تم استخدام الأجسام المضادة Atlastin في 1: 500 التخفيف أو في 1: 5،000-1: 10،000 عند استخدامها مع tyramide تضخيم الإشارات. تم استخدام الأجسام المضادة في التخفيفات التالية: Yl1 / 2 (Chemicon) لتويولين في 1: 500، أرنب مكافحة FLAG (الانجذاب BioReagents، محطة Neshanic، NJ) في 1: 250، ومكافحة صاحب-6X (Clontech) في 1: 250، والماوس مكافحة GM130 (BD العلوم البيولوجية) في 1: 250، والفئران-HA المضادة (روش العلوم التطبيقية) في 1: 250. تم تنفيذ النشاف الغربي الكمي باستخدام الأجسام المضادة صبغ مترافق الأشعة تحت الحمراء الثانوية بالتزامن مع نظام الأشعة تحت الحمراء التصوير / المسح Licor الأوديسة.
رني.

وقد تحقق Spastin رني باستخدام الوجهين سيرنا (العقاقير، 5'-rArUrArCrCrArUrUrCrCrArCrArGrCrUrUrGrCrUrCrCrUrUrC rUrG-3 '؛ المعنى، 5phos-rGrArArGrGrArGrCrArArGrCrUrGrUrGrGrArArUrGrGrUAT). و transfected الخلايا مع الوجهين سيرنا في 20 نانومتر المزدوجة باستخدام Silentfect (بيو راد) لمدة 48 ساعة. تم استخدام سيرنا سارعت في نفس التركيز كعنصر تحكم (المعنى، 5phos-rCrUrUrCrCrUrCrUrCrUrUrUrCrUrCrUrCrCrCrUrUrGrUGA؛ العقاقير، rUrCrArCrArArGrGrGrArGrArGrArArArGrArGrArGrGrArArG rGrA). وقد تحقق Atlastin رني باستخدام RNA دبوس الشعر القصير (shRNA) الذي سبق ان عرضه لقمع atlastin (23). تم استنساخ عنصر تحكم shRNA إلى alphafetoprotein (GGATCTGTGCCAAGCTCAGTTCAAGAGACTGAGCTTGGCACAGATCCTT TTTT) في pLentilox (24). وكانت البلازميدات استخدام ل transfect كوس-7 الخلايا، وتم فحص خلايا 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #7  
قديم 11-22-2015, 11:12 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي CAG كرر التوسع في مرض وراثي جسمي النقي مشلول الشلل النصفي مرتبط الكروموسوم 2p21-P24

 


CAG كرر التوسع في مرض وراثي جسمي النقي مشلول الشلل النصفي مرتبط الكروموسوم


2p21-P24



وقد تم تحديد CAG تكرار التوسعات كما الطفرات المسببة للأمراض ديناميكية في المناطق ترميز الجينات في العديد من الاضطرابات العصبية يورث، بما في ذلك نخاعي بصلي ضمور العضلات، مرض هنتنغتون،-pallidoluysian مسنني حمراوي ضمور، النخاعي المخيخي نوع ترنح 1 و 2 و 6 و Machado- جوزيف المرض. يتم تحويل CAG تكرار التوسعات لمساحات polyglutamine ممدود وزيادة حجم الجهاز polyglutamine يرتبط بترقب، ميزة أساسية، وينظر في كل هذه الأمراض. وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي النقي (ADPSP) هو اضطراب تنكسي للجهاز الحركي المركزي يتميز سريريا من قبل التشنج ببطء تدريجي ومتواصل في الساقين، فرط المنعكسات وعلامة بابنسكي. مثل تكرار الأمراض CAG أنشأت يتميز ADPSP من قبل كل من الاختلاف بين وداخل الأسرة والترقب. باستخدام كرر التوسع كشف (RED) طريقة، قمنا بتحليل 21 الأفراد المتضررين من ست عائلات الدنماركية مع المرض مرتبط الكروموسوم 2p21-P24. وجدنا أن 20 من 21 أفراد المتضررين أظهر CAG تكرار التوسعات مقابل اثنين من 21 أزواج الأصحاء، مما يدل على وجود ارتباط بقوة ذات دلالة إحصائية بين حدوث توسع تكرار والمرض (اختبار فيشر، P <10 -5) مما يدل على أن تكرار CAG وتشارك التوسع يفترض بمثابة طفرة ديناميكية في ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24. ويقدر حجم التوسع لتكون ≥60 CAG تكرار نسخة في الأفراد المتضررين. توسيع CAG تكرار ومن المرجح جدا ترجمتها وأعرب كما يتضح من الكشف عن البروتين التي تحتوي على polyglutamine في المريض ADPSP.
مقدمة

الشلل النصفي التشنجي وراثي هو اضطراب تنكسي للجهاز الحركي المركزي يتميز سريريا من قبل التشنج ببطء تدريجي ومتواصل في الساقين، فرط المنعكسات وعلامة بابنسكي. اعتمادا على وجود علامات سريرية أخرى المسيطرة على التعاون اضطراب تقليديا ينقسم إلى مجمع وشكل نقي (1).
وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي النقي (ADPSP) يتميز سريريا في أواخر بداية، والتباين المشترك بين وداخل الأسرة والترقب (2). تم تعيين ثلاثة مواضع مختلفة لADPSP إلى الكروموسومات 14q11.2-q24.3 (موضع SPG3) (3)، 2p21-P24 (موضع SPG4) (4) و15q11.1 (موضع SPG6) (5) ؛ ومع ذلك، فإن المظاهر السريرية تكاد تكون متطابقة في الأسر مع موقع مختلف للجين المرض.
ترتبط CAG تكرار التوسعات مع التقدمية، في وقت متأخر من الأمراض التنكسية بداية الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك نخاعي بصلي ضمور العضلات (SBMA) (6)، مرض هنتنغتون (HD) (7)، النخاعي المخيخي نوع ترنح 1 (SCA1) (8)، وترنح النخاعي المخيخي نوع 2 (SCA2) (9)، النخاعي المخيخي نوع ترنح 6 (SCA6) (10)، ماتشادو يوسف المرض (MJD) (11)، ومسنني حمراوي-pallidoluysian ضمور (DRPLA) (12). تقع يكرر CAG في المنطقة الترميز من الجينات المعنية والتوسعات هي من 36 إلى> 100 تكرار النسخ في الأفراد المتضررين؛ الأليلات عادية تحتوي على ما يصل إلى 40 تكرار النسخ، وترك مجموعة غير محدد من 36-40 حيث قد يحدث انخفاض انتفاذ (13). في SCA6، ومع ذلك، فإن مجموعة من (CAG) n هو 21-27 بينما الأليلات العادية تحتوي على 4-16 وحدة تكرار (10). هناك علاقة عكسية بين طول التوسع CAG والعمر عند بداية وجميع هذه الأمراض تظهر تباين ملحوظ في الأعراض وغالبا الحاضر في وقت متأخر. كما يتميز ADPSP من الاختلاف نفسه، كنا تحرض على دراسة ADPSP فيما يتعلق بحضور CAG تكرار التوسعات. استخدمنا RED (كرر التوسع الكشف) طريقة (14)، الذي يحدد تكرار التوسعات المحتملة المرضية في الجينوم، لتحليل لحدوث CAG تكرار التوسعات في الأفراد المتضررين من ست عائلات الدنماركية مع ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24.

النتائج

تحليل الربط الجيني تقتصر موضع ADPSP إلى الكروموسوم 2p21-P24 (SPG4) في كل من الأسر الدنماركية ستة (2). تم إجراء تحليل الأحمر على عينات من 21 أفراد المتضررين من ست عائلات مختلفة. والضوابط العادية قمنا بتحليل 21 الزوجين صحي وشمل عينة من مريض يعاني من ضمور الأحداث تأتر العضل كما تحكم إيجابية.
كانت الضوابط العادية كل فرقة من 72 سنة مضت ولكن ثلاثة منهم تحسنت RED المنتجات> 72 نقطة أساس في الحجم. كان اثنان من أفراد منتجات الحمراء من 180 سنة مضت واحد فرد منتج الأحمر من 108 سنة مضت.
أن تكون فوق عتبة المرضية من وحدات تكرار 36 CAG تنطبق على معظم الأمراض العصبية المذكورة (+6 - 9، 11، 12)، ولكن لا يزال في الطرف الأدنى من هذه التوسعات، حددنا المنتجات RED ≥144 بي بي ~48 تكرار نسخ كما توسعت الأليلات. أظهر عشرين مريضا التوسعات كرر مقابل اثنين من 21 الضوابط العادية (10٪)، مما يدل على وجود ارتباط بقوة ذات دلالة إحصائية بين حدوث توسع تكرار والمرض (اختبار فيشر، P <10 -5) الذي يشير إلى أن تكرار توسيع CAG ويشارك في ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24. المقايسات من فرد واحد المتضررين مع النمط الفرداني المرض فشلت مرارا وتكرارا لإعطاء المنتج الحمراء للكشف وبالتالي فقد تم استبعاده من التحليل الإحصائي. كان جميع الأفراد المتضررين السريري داخل الأسرة نفس النمط الفرداني المرتبطة بهذا المرض (الشكل 1).
لتقدير حجم تكرار المرضية في ADPSP أدرجنا عينات من المريض MJD مع وحدات تكرار 72 CAG في أليل المرض على النحو الذي يحدده تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التحليل باستخدام الاشعال MJD 25 و 52 MJD (11). وكان المنتج الحمراء للمريض MJD 216 سنة مضت ~72 CAG تكرار نسخ المقابلة لتقصي عن طريق تحليل PCR (الشكل 2، 2 لين). على افتراض أن وجود ارتباط مماثل موجود في ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24 وقد قدر التوسع تكرار في ADPSP أن يكون لا يقل عن 180 سنة مضت ~60 CAG تكرار النسخ كما كانت هذه الفرقة موجودة في جميع الأفراد المتضررين.
كما هو مبين في الشكل 2، وكان هناك اختلاف في حجم أعلى المنتجات الوزن الجزيئي الكشف داخل كل أسرة. ومع ذلك، لم يكن هناك ارتباط واضح بين حجم المنتج والعمر عند بداية. في الممرات 4 و 5 فرق إضافية> 252 و> 216 نقطة أساس، على التوالي، وكشف ولكن مع شدة انخفاض مقارنة مع أقل العصابات.
التحقيق في ما إذا ترجمت تكرار CAG إلى polyglutamine تحتوي على البروتينات اختبرنا lymphoblastoid خط الخلية (LCL) مقتطفات من البروتين واحد ADPSP المريض، واحد HD المريض واثنين من الضوابط العادية على لطخة غربية. عندما بحث مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 1C2، الذي يعترف مساحات polyglutamine كبيرة، وهو بروتين ذات وزن جزيئي> تم الكشف عن 350 كيلو دالتون في استخراج ADPSP LCL ولكن ليس في LCL مقتطفات من الضوابط العادية (الشكل 3). شوهد البروتين كيلو دالتون ~240 في جميع العينات الثلاث. استخدمت كيلو دالتون huntingtin 350 مع توسيع 52 glutamines من استخراج البروتين الليفية كعنصر تحكم إيجابية. كان المريض ADPSP الأليلات HD في المعدل الطبيعي (14/16) (لا تظهر البيانات)، وبالتالي دون عتبة الكشف عن mAb1C2.

نقاش

مثل الاضطرابات العصبية الأخرى يورث، كل الناجمة عن التوسع CAG تكرار الديناميكي في الجينات المسببة، ADPSP هو مرض غير متجانس phenotypical تتميز كلا من بداية الراحل، والتباين المشترك بين وداخل الأسرة والترقب (2). ولذلك، درسنا ADPSP فيما يتعلق بحضور CAG تكرار التوسعات. لهذا الغرض طبقنا طريقة الأحمر إلى ست عائلات مع ADPSP مرتبطة بإحكام على كروموسوم 2p21-P24. طريقة الأحمر، الذي يحدد تكرار التوسعات المحتملة المرضية دون معرفة مسبقة من موقع الكروموسومات، وقد تم تطبيقها على الأمراض العصبية الموروثة من مجهول المكان وراثية واظهار الترقب. في الآونة الأخيرة، يندبلاد آخرون تطبيق طريقة الأحمر لثماني عائلات مع النخاعي المخيخي نوع ترنح 7، والعثور على تكرار التوسع CAG من 64 في المتوسط ​​أن يكون السبب الأكثر احتمالا لهذا المرض (15). الجمعيات بين CAG تكرار التوسعات واضطراب عاطفي ثنائي القطب (16) وكذلك مرض انفصام الشخصية (17 تم العثور أيضا) من خلال طريقة الأحمر. ومع ذلك، لم يكن هناك دليل على وجود توسع CAG تكرار المعنية كما طفرة مسببة للمرض لا في مرض عائلي باركنسون (18) ولا في الأسر التي لديها راثي التهاب الشبكية الصباغي السائد (19).
مقارنة مع المنتج الأحمر من مريض MJD مع CAG طول تكرار أحجام المنتج RED-PCR تحديد المترابطة بشكل جيد مع عدد تكرار نسخة الفعلي على النحو الذي يحدده PCR، وجود علاقة وأفيد أيضا يندبلاد وآخرون. (20). تطبيق ارتباط مماثل لأسر ADPSP هنا وأظهر تحليل المنتجات ربط ≥180 بي بي ~60 CAG تكرار النسخ في جميع الأفراد المتضررين. في تكرار غيرها من الأمراض CAG هناك علاقة عكسية بين تكرار CAG التوسع وعمر في البداية. لصالح فرضية أن هذا قد يحدث في ADPSP كذلك يبدو من F الأسرة حيث تم العثور على منتج الأحمر في أعلى الوزن الجزيئي في امرأة تبلغ من العمر 56 سنة مع التقدم في السن في بداية 10 سنة. على العكس من ذلك، تبين عكس ذلك على مدى ثلاثة أجيال من عائلة H حيث سن في بداية ينخفض ​​موازية للانخفاض في عدد من المنتجات الحمراء (الشكل 2). ولذلك، فإنه من غير الممكن من نتائجنا لجعل أي بيان واضح ما إذا كان التوسع CAG تكرار له أهمية لعمر في بداية في ADPSP.
الفرق في شدة الفرقة ينظر في الممرات واحدة مع عصابات من أعلى الوزن الجزيئي التي تظهر أضعف قد يكون راجعا إلى إنشاء عدد محدود من المنتجات من حجم أكبر من القالب المستخدم، على الأرجح بسبب الصلب الثاني من ligated بالفعل جزيئات (14). بدلا من ذلك، والفرق في شدة قد تمثل استعلاء من المنتجات من اثنين من مختلف CAG تكرار تسلسل من أطوال مختلفة (20)، وهي أطول سلسلة يجري لا علاقة للمرض، مثل تلك العصابات من انخفاض كثافة موجودة في بعض الأفراد المتضررين فقط.
وأظهرت ثلاث من 21 الضوابط العادية منتجات الحمراء> 72 نقطة أساس في الحجم. كان اثنان من أفراد التوسعات من 180 سنة مضت واحد فرد منتج الأحمر من 108 سنة مضت. Schalling وآخرون. (14) ويندبلاد وآخرون (16، 20) وصفه التوسعات في ~30٪ من السكان الطبيعي. الفرق في وتيرة التوسع في الضوابط العادية في الدراسات وربما يرجع ذلك إلى عدد صغير نسبيا من الضوابط وبالتأكيد لا تعتمد على الاختلاف البيولوجي الحقيقي في مجموعات.
في HD، DRPLA، SBMA، SCA1، SCA2، SCA6 وMJD، يتم تحويل CAG تكرار التوسعات في مساحات polyglutamine (9، 10، 21)، والتي يعتقد أنها تؤدي إلى تحقيق مكاسب من وظيفة من البروتينات المتحورة. تروتييه وآخرون. (22) ميزت mAb1C2 الأجسام المضادة التي تعترف التوسعات polyglutamine في البروتينات المرضية المتورطين في HD، SCA1، MJD، SCA2 وSCA7 (22، 23). باستخدام هذه الأجسام المضادة وجدنا البروتين ذات وزن جزيئي فوق 350 كيلو دالتون في مقتطفات LCL من مريض واحد ADPSP. تروتييه وآخرون. (22) لم تجد دليلا للتوسعات polyglutamine في المرضى الذين يعانون ADPSP لا في الأسر مع المرض مرتبط كروموسوم 2 ولا في الأسر التي ليست مرتبطة المرض إلى كروموسوم 2. ومع ذلك، فإن mAb1C2 فقط بالكشف عن التوسعات polyglutamine فوق عتبة معينة وحد الكشف يختلف وفقا للبروتين، ويتضح من عتبة تحور HD بروتين يجري 39 glutamines مقارنة مع الحد من الكشف عن البروتين SCA1 من 55 glutamines (22). توسعات Polyglutamine دون عتبة "محددة" في المرضى ADPSP التحقيق قد يكون تفسيرا لماذا تروتييه وآخرون لم تجد دليلا للتوسعات polyglutamine؛ ولكن هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحليل للمادة أكبر لتحديد ما إذا كان هناك ارتباط بين> 350 كيلو دالتون البروتين والنمط الظاهري ADPSP.

الشكل 1
الأنساب تظهر أجزاء من الأسر F وH مع ADPSP. أسفل كل النسخ المتنوعة الفردية شيدت من علامات الصبغي 2p21-P24 D2S400، D2S352، D2S2351، D2S2374، وD2S367 ترد. يظهر النمط الفرداني المرتبطة بهذا المرض مع أشرطة سوداء. كان جميع الأفراد المتضررين أحمر المنتج> 144 سنة مضت (باستثناء III-3 من أسرة H، الذي فشل مرارا وتكرارا لإعطاء المنتج الحمراء للكشف وبالتالي تم استبعادها من التحليل الإحصائي). IV-1، IV-2 وIV-3 من العائلة F هم جميع الأطفال دون سن 10 عاما. لم يتم تنفيذ تحليل الأحمر في أولئك الأفراد كما كانت كمية DNA صغيرة جدا للتحاليل.


الرقم 2
صورة الإشعاع الذاتي من المنتجات الأحمر من أجزاء من الأسر ADPSP H وF باستخدام (CTG) 12 النوكليوتيد. تشير الأرقام العمر عند بداية. أدنى الفرقة في كل حارة تمثل ربط منتج واحد = 72 قواعد ~24 CAG تكرار النسخ. كل فرقة إضافية تمثل 36 قواعد إضافية الموافق المشارك ربط واحد إضافي (CTG) 12. حارة 1: تأتر العضل الأحداث ضمور المريض. حارة 2: المريض MJD. (PCR تحديد CAG تكرار حجم = 72.) لين 3: الزوج تتأثر. الممرات 4-6: ثلاثة مرضى ADPSP من H. الأسرة الممرات 7-10: أربعة مرضى ADPSP من عائلة F.


الشكل (3)
اثنين من البقع الغربية من مستخلصات البروتين من أحد ADPSP LCL، وهما LCLs التحكم العادي واستخراج البروتين الليفية من مريض يعانون من مرض هنتنغتون (HD). حارة 1 + 6: استخراج LCL من الضابطة (N1). لين 2 + 5: استخراج LCL من المريض ADPSP. حارة 3: استخراج LCL من الضابطة (N2)، لين 4: الخلايا الليفية استخراج من HD المريض. شوهد البروتين كيلو دالتون ~240 في جميع مقتطفات LCL، ولكن البروتين كيلو دالتون> 350 تم الكشف فقط في LCL مقتطفات من المريض ADPSP. وقد استخدم شكل مرضي من 350 كيلو دالتون HD البروتين مع توسيع 52 glutamines عن السيطرة الإيجابية.

في الختام، أنشأنا علاقة بين التوسع CAG تكرار وADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24. ومن المفترض أن تشارك التوسع في آلية المرض كما طفرة ديناميكية تقع في المنطقة ترميز الجين. كما يدل على ذلك mAb1C2 تحليل تكرار التوسع CAG من المرجح جدا ترجمتها وكنسبة المسالك polyglutamine في البروتين المرضية.

المواد والأساليب

الأسر

تم التشخيص على أساس وجود تاريخ عائلي موثقة جيدا ومعايير التشخيص من هاردينغ (1). وكانت معايير الحد الأدنى للتشخيص التشنج في الأطراف السفلية، عادة أكثر وضوحا من الضعف، وردود الفعل وتر مفرط وعلامة بابنسكي. يتم إعطاء البيانات السريرية وتفاصيل العائلة في مكان آخر (2). تم فحص واحد وعشرين الأفراد المتضررين من ست عائلات الدنماركية مع ADPSP و 21 الزوجين تتأثر.

تحليل الأحمر

تم استخراج DNA الجينومية باستخدام الإجراء التمليح من ميلر وآخرون. (24). وقد أجريت جميع ردود الفعل على نظام بيركن إلمر GeneAmp PCR 2400، وذلك باستخدام الشروط التالية مع بعض التعديلات من Schalling وآخرون. (14) ويندبلاد وآخرون. (20).
قبل رد الفعل ربط ل(CTG) 12 النوكليوتيد (فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية) وفسفرته باستخدام dATP وكيناز عديد النوكليوتيد (فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية). ردود الفعل ربط (20 ميكرولتر) يحتوي على 4 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني، 50 نانوغرام من 5'ذا الصلة، phosphory (CTG) وحضنت 12 النوكليوتيد و5 U PFU DNA يغاز (Stratagene) مع يغاز العازلة توفيره في البداية في 94 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. وبعد ذلك تعرضوا ل495 دورات من 80 درجة Cfor 30 ثانية و 94 درجة مئوية لمدة 10 ثانية. تم التشويه والتحريف المنتجات ربط في 50٪ الفورماميد لمدة 5 دقائق قبل الكهربائي على هلام 6٪ بولي أكريلاميد تغيير طبيعة / 6 M اليوريا. وelectrotransferred الحمض النووي في وقت لاحق (شركة CBS العلمي، نظام النشاف شبه الجافة، EBU-6000) على Hybond N + غشاء باستخدام 175 مللي أمبير لمدة 20 ساعة في 1 × TBE. بعد UV-IMMOBIL-سعودة، تم تهجين الأغشية لمدة 20 ساعة عند 65 ° C إلى (CAG) 10 [32 P] -labeled النوكليوتيد التحقيق باستخدام 3 DNA "نهاية نظام الترقيم (PROMEGA). وجرفت المياه الأغشية في 2 × SSC، 0.1٪ SDS لمدة 45 دقيقة في 40 ° C 1 × SSC، 0.1٪ SDS لمدة 45 دقيقة في 63 ° C 0.1 × SSC، 0.1٪ SDS لمدة 45 دقيقة في 63 ° C وautoradiographed ل1 -3 أيام باستخدام شاشة تكثيف. وقد أجريت فحوصات الحمراء مرتين على الأقل لكل عينة DNA.
كانت الظروف النشاف الأساسية لاستنساخ أعلى العصابات الوزن الجزيئي.

تحليل صلة

تم احتساب النتيجة متعددة اللد مع علامات وضعه وفقا لخريطة Généthon بالقرب من مكان 2p21-P24 (SPG4) (25). كانت علامات والمسافات (سم) المستخدمة لتحليل متعددة: D2S400- (0.0) -D2S352- (0.01) -D2S2351- (0.01) -D2S2374- (0.0) -D2S367. تم إجراء التحليل الربط متعددة الأطراف باستخدام برنامج LINKMAP من حزمة FASTLINK (26).

استخراج البروتين وصمة عار الغربية

تم استخراج البروتينات من الابيضاض اللمفاوي والخلايا الليفية صوتنة في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.8، 10٪ (ت / ت) الجلسرين، 1 ملم EDTA، 5 ملي بوكل، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلوريد، 10 ميكروغرام / leupeptin مل و 10 ميكروغرام / مل aprotenin. بعد الطرد المركزي في 000 15 جرام لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وجمعت طاف وتركيز البروتين يحدده الفحص BCA (بيرس). تم فصل عينات البروتين (50 ميكروغرام / حارة) من قبل 5٪ SDS-PAGE (27) والرطب نشف لImmobilon P غشاء (ميليبور) (28). وأغلقت الأغشية في الفوسفات مخزنة المالحة مع 5٪ الحليب المجفف منزوع الدسم وimmunoprobed مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 1C2 (20). وقد وضعت البقع باستخدام الفجل البيروكسيداز مترافق أمصال مضادة لمكافحة فأر (داكو) وتعزيز لمعان كيميائي (ECL طقم، أمرشام).

التحليل الاحصائي

واستخدمت عصابة من 72 سنة مضت والتي تتطابق مع اثنين ligated (CTG) 12 [أليغنوكليوتيد كعنصر تحكم للمقايسة الأحمر. كما ذكرت من قبل Schalling وآخرون. (14) هذا المنتج على الأرجح يمثل عملية ربط لعدة تكرار قصيرة مواضع في الجينوم، وبالتالي يجب أن تكون موجودة في كل فرد. وقد تم تحديد المنتجات الحمراء من 144 سنة مضت ~48 CAG تكرار نسخ أو multimers العليا من ركائز ربط باعتبارها أليل الموسعة. تم استخدام اختبار فيشر في جدول 2 × 2 لاختبار فرضية وجود علاقة بين تكرار التوسع والمرض.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
إضافة رد

« الموضوع السابق | الموضوع التالي »

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك
BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة
الانتقال السريع

 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع |  المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية


الساعة الآن 06:23 AM.

الاتصال بنا - موقع أطفال الخليج ذوي الاحتياجات الخاصة - الأرشيف - الأعلى

Powered by vBulletin® Version 3.8.2
Copyright ©2000 - 2025, Jelsoft Enterprises Ltd

a.d - i.s.s.w