#1  
قديم 11-22-2015, 08:30 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي يتفاعل وراثي تشنجي البروتين الشلل النصفي spastin مع ESCRT-III-يرتبط بروتين معقد endosomal CHMP1B

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/14/1/19.full

ملخص

يتميز النقي الشلل النصفي التشنجي وراثي عن طريق تعتمد على طول انحطاط الغايات البعيدة من المحاور طويلة. الطفرات في spastin هي السبب الأكثر شيوعا لهذه الحالة. شرعنا في تحقيق وظيفة spastin باستخدام نهج يومين الهجين الخميرة لتحديد البروتينات التفاعل. باستخدام كامل طول spastin كطعم، حددنا CHMP1B، وهو بروتين يرتبط مع ESCRT (endosomal الفرز المعقدة اللازمة لنقل) -III مجمع، كشريك ملزمة. وأكدت عدة طرق مختلفة أهمية الفسيولوجية للتفاعل في خلايا الثدييات. CHMP1B وأظهرت spastin اضح حشوية شارك في التعريب في كوس-7 وPC12 الخلايا الموسومة حاتمة. CHMP1B وspastin تفاعلت بشكل خاص في المختبر والمجراة في β-اكتاماز فحوصات البروتين جزء تكامل، وimmunoprecipitated المشارك spastin مع CHMP1B. تم بوساطة التفاعل من قبل منطقة spastin الواقعة بين بقايا 80 و 196 و تحتوي على أنيبيب التفاعل ومجال الاتجار. التعبير عن CHMP1B الموسومة حاتمة في خلايا الثدييات منع تطور النمط الظاهري أنيبيب غير طبيعي يرتبط التعبير عن أتباز معيب spastin. وتشير هذه البيانات إلى دور للspastin في أحداث المرور غشاء الخلايا وتوفير مزيد من الأدلة لدعم الاعتراف الناشئة التي عيوب في حركة غشاء الخلايا هي سبب كبير من الخلايا العصبية الحركية علم الأمراض.

مقدمة

ويمكن تقسيم الرئيسي مسار السيارات الطوعي إلى مرحلتين. أولا، الخلايا العصبية الحركية العليا (UMNs) في القشرة الحركية في الدماغ الاتصال عبر مساحات القشري للخلايا في المادة الرمادية للنخاع الشوكي. ثانيا، وانخفاض الخلايا العصبية الحركية (LMNs) في القرن الأمامي للنخاع الشوكي تتصل عضلات الهيكل العظمي في الوصل العصبي العضلي (1). المحاور من UMNs وLMNs طويلة للغاية، مع وحدات التخزين حشوية أكبر بكثير من خلايا الجسم. وبالتالي فإنها توفر بيئة متطرفة للعديد من العمليات الخلوية، مثل الاتجار داخل الخلايا والنقل والتمثيل الغذائي للطاقة.
بالإضافة إلى أن يكون متصلا تشريحيا، ترتبط UMNs وLMNs التي كتبها علم الأمراض. المرض الأكثر شهرة على نطاق واسع من الخلايا العصبية الحركية هو مرض التصلب الضموري الجانبي (مرض العصبون الحركي)، وهي حالة عادة متقطعة التي تتأثر بها كل من UMNs وLMNs. وبالإضافة إلى ذلك، ترتبط عدة مجموعات من الشروط المحددة وراثيا مع ضعف الخلايا العصبية الحركية. وإن كان نادرا بشكل فردي، هذه الشروط توفر فرصة لتشريح العمليات الخلوية العاملة في صيانة وانحطاط الخلايا العصبية الحركية. وparaplegias تشنجي وراثي (شركائنا HSPs) هي واحدة من هذه المجموعة وتحديد الخصائص التي السريرية هي الشلل التشنجي التدريجي التي تؤثر على الساقين، وعادة ما يحدث ذلك من قبل تعتمد على طول، انحطاط الأعلى من المحاور السبيل القشري (2 - 4).
سريريا، يتم تقسيم شركائنا HSPs إلى أشكال نقية ومعقدة، مع شركائنا HSPs نقية، حيث يحدث التشنج في عزلة نسبية، وتشكيل واحدة أكبر مجموعة فرعية. تم تعيين أكثر من 20 مواضع HSP وتم تحديد 10 من الجينات المرتبطة (إعادة النظر في 2). الجين SPG4، spastin، هو HSP الجينات الأكثر شيوعا، مع الطفرات وجدت في ~40٪ من الأسر نقية المهيمنة مقهورة HSP (5، 6). يتم التعبير عن spastin نسخة كاملة الطول على نطاق واسع داخل الجهاز العصبي والأنسجة في غير العصبية، بما في ذلك مجموعة من الخلايا المتصلة الكريات البيض. يتم التعبير عن ذلك بشدة في الفئات الفرعية من الخلايا العصبية (5، 7، 8). محاضر Spastin تفتقر إما الإكسونات تم العثور على 4 أو 8 أو 15، على الرغم من أن يتم التعبير عن المتغير فقط اكسون 4 حذف في مستويات كبيرة (7، 9).
وكانت البيانات على توطين التحت خلوية من spastin الذاتية المتعارضة. على الرغم من أن الدراسات المناعي في وقت مبكر باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة spastin على الأنسجة الماوس والبيني خلايا هيلا اقترح أن spastin الذاتية المترجمة حصريا في النواة (7)، وقد وجدت الدراسات اللاحقة باستخدام الأجسام المضادة أخرى النووية المختلطة والتوزيعات حشوية في خلايا هيلا (10، 11) وخطوط الخلايا العصبية الحركية الخلية (11) وأنسجة الجهاز العصبي الإنسان (8). في الأنسجة العصبية البشرية، يقع spastin في السيتوبلازم ومتشابك محطات عدة أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية الحركية، على الرغم من أنواع الخلايا العصبية الأخرى التي كانت موجودة في النواة (8).
وتعريب التحت خلوية مختلفة تم تحديدها لspastin تدل على أن البروتين قد يكون له عدة أدوار وظيفية مختلفة، ومجموعة كاملة من التي ليست واضحة حتى الآن. تحليل تسلسل المبكر وضع spastin في AAA (ATPases المرتبطة بالأنشطة الخلوية المتنوعة) أسرة، أسرة متعددة مجموعة كبيرة من البروتينات التي تحتوي على أتباز كاسيت مميزة والمشاركة في العديد من العمليات الخلوية المختلفة (5، 12). Spastin هو عضو في مجموعة فرعية AAA-7 الذي يحتوي على katanin P60، وهو بروتين قطع أنيبيب، وخلية ثقافة والحية وتشير البيانات إلى أن وظيفة واحدة على الأقل من spastin تتضمن تنظيم الأنابيب الدقيقة. في المراحل المبكرة من التعبير في كوس-7 مثقف الخلايا، spastin الموسومة حاتمة المحلية في السيتوبلازم، على مقربة من مركز زهور النجمة أنيبيب. مع التعبير في وقت لاحق، فإنه المترجمة إلى منقط منفصلة الهياكل حشوية لا تقابل العضيات المعروفة (13). وارتبط التعبير البرية من نوع spastin مع حزم أنيبيب مكسورة وعندما أعرب عن أتباز معيب الموسومة حاتمة spastin، اشتركت المترجمة مع حزم محيط بالنواة سميكة بشكل غير طبيعي وطويلة من الأنابيب الدقيقة (13). وقدمت نتائج مماثلة في العصبونات القشرية الفئران مثقف (14). وقد تم مؤخرا تمديد هذه النتائج من خلال دراسة immunolocalization الذي حدد مستويات عالية من spastin الذاتية في المناطق التحت خلوية حيث يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة حيوي. في تقسيم بنشاط خلايا كوس-7 وهيلا، تم العثور spastin على الأنابيب الدقيقة الجسيم المركزي والمغزل خلال الطورية، وعلى المغزل المركزي وأوسط الجذع أثناء الانقسام السيتوبلازمي. في خط الخلية العصبية الحركية، وأعرب عن غاية spastin في نهايات القاصي ملحقات محوار وعند نقاط الفرع. حددت هذه الدراسة أيضا NA14 البروتين centrosomal كشريك ملزم للspastin (11).
بيانات من نماذج ذبابة الفاكهة أيضا دعم دور للspastin في تنظيم أنيبيب (15). ذبابة الفاكهة spastin غير المخصب (D-spastin) ولا سيما في حبات متشابك، وشارك أنك تؤسس-مع متشابك synaptotagmin الحويصلة علامة في المناطق العصبية حيث ميكروتثبول مستقرة عادة ما تكون غائبة. استهداف RNA تدخل ضربة قاضية لل-D spastin في الجهاز العصبي تسبب شجيرات متشابك والحد من مجموع مساحة متشابك، مع تعزيز المقابلة من قبل المشبكي قوة العصبي الذي تم تصحيحه دواء من قبل نوكودازول، وكيل زعزعة استقرار أنيبيب. كانت الحيوانات زيادة في تويولين مستقر من الناحية الهيكلية في الوصل العصبي العضلي محطة قبل المشبكي، مع زحف الأنابيب الدقيقة في حبات قبل المشبكي. على العكس من ذلك، أدى overexpression من D-spastin إلى انخفاض في كمية تويولين مستقر من الناحية الهيكلية في الوصل العصبي العضلي محطة قبل المشبكي وانخفاض في قوة العصبي الذي تم تصحيحه من قبل أنيبيب استقرار وكيل التاكسول. هذه البيانات متسقة مع فرضية أن D-spastin يمكن أن ينظم مباشرة أو غير مباشرة الاستقرار أنيبيب ويمكن أن تقيد مكانيا الأنابيب الدقيقة استقرت في حبات قبل المشبكي (15).
على الرغم من كل البيانات لافتا نحو وظيفة أنيبيب تنظيم لspastin، كون انها وجدت في منقط أو أنبوبي الهياكل حشوية عندما أعرب في خلايا الثدييات، وأنه يختلف مكانيا من الأنابيب الدقيقة مستقرة في المحاور ذبابة الفاكهة يشير إلى أنه قد يكون أدوار أخرى . ومن بين الاقتراحات التي spastin قد يكون متورطا في أحداث المرور غشاء الخلايا. Spastin ديه N-محطة المتفاعل أنيبيب والاتجار (MIT) المجال. ويشترك في هذا المجال مع العديد من البروتينات التي حددت الأدوار في حركة الغشاء، بما في ذلك VPS4، وهو AAA (ATPases المرتبطة بالأنشطة الخلوية المتنوعة) بروتين من نفس فرعية كما spastin والفرز نيكسين 15 و calpain-7 / PalB (16، 17) . ومن المثير للاهتمام، وجدت المجال MIT أيضا في spartin، وهو بروتين تحور في متلازمة تروير، جسمية متنحية HSP تعقيدا بسبب التلفظ، ضمور عضلي القاصي وتأخر في النمو المعتدل (16).
وتنقسم الخلايا مسارات حركة الغشاء إلى مكونات الإفرازية والتقامي (18). في مسار التقامي، يتم تسليم مستقبلات المنضوية والبروتينات عبر الغشاء من غشاء البلازما لالإندوسومات في وقت مبكر، من حيث أنها قد تكون إعادة تدويرها إلى غشاء البلازما، تستهدف جولجي، وسلمت إلى الإندوسومات المتأخرة والجسيمات الحالة لتدهور أو، في خلايا الاستقطاب، transcytosed (18). كما الإندوسومات تربط إفرازية، واستيعاب والعمليات الهادمة، أنها تعمل كمواقع الفرز الهامة. وقد تم تحديد المكونات الجزيئية الرئيسية للمسار التقامي من خلال تحليل الخميرة المسوخ VPS، مقسمة إلى فئات A-F اعتمادا على الموقع من تأثير (19). المسوخ VPS فئة E هي ذات أهمية خاصة لهذه الدراسة. ومن المعروف المسوخ لا يقل عن 17 فئة الخميرة E VPS ولكل منها نديد بشري واحد على الأقل. وهي ضرورية لتشكيل الجسم عديد الحويصلات، هيكل endosomal أواخر شكلتها انغلاف والناشئين من الغشاء المحدد في تجويف الحويصلة (19). جسم عديد الحويصلات الصمامات مع يحلول، مع ما يترتب على التعرض للأغشية المنضوية إلى المقصورة الهادمة lumenal (19). وقد حددت الدراسات الأخيرة ثلاثة مجمعات البروتين غشاء المرتبطة ذات الصلة، ووصف ESCRT (endosomal الفرز المجمعات المطلوبة للنقل) من أنا، و-III-II، والتي تتكون من بروتينات الطبقة E VPS (20 - +22). هذه المجمعات يجوز توظيف بالتسلسل من السلائف حشوية والتوسط فرز الشحنات إلى الجسم عديد الحويصلات. ويعتقد مجمع ESCRT-III ليكون مسؤولا عن الفرز النهائي والتركيز البضائع إلى مجموعة فرعية من أغشية الجسم عديد الحويصلات (22). يتكون هذا المجمع من أربعة على الأقل من الدرجة E VPS البروتينات التي تعتبر جميع أفراد الأسرة البروتين نفسه، Chm2p، Chm3p، Chm4p وChm6p (وتسمى أيضا Vps2p، Vps24p، Vps32p / Snf7 وVps20p على التوالي في الخميرة، الموافق CHMP2A و2B، CHMP3، CHMP4A، 4B و 4C وCHMP6 في البشر) (+22 - +24). وقد تم تحديد اثنين آخرين من أعضاء الأسرة آلية تبادل المعلومات، Chm1p / Did2p (الموافق CHMP1A وCHMP1B في البشر) وChm5p / Vps60p (الموافق CHMP5 في البشر) (+22 - 24)، على الرغم من أنه ليس من الواضح ما إذا كانت تشكل جزءا من مجمع ESCRT-III أم أنها تنظيم وظيفة ESCRT-III (22). يتم تنظيم جمعية غشاء من البروتينات آلية تبادل المعلومات من قبل الطبقة E المبادئ الطوعية البروتين Vps4p (التي نوقشت في وقت سابق)، والذي قد يحفز تفكيك مجمع ESCRT-III (19، +22 - +25). VPS4 موجود في شكلين في البشر، VPS4A وVPS4B (23، 24، 26). بالإضافة إلى دورها في حركة الغشاء، المترجمة إلى الإسوي من CHMP1A الإنسان إلى النواة (27).
في هذه الدراسة، شرعنا في اكتساب رؤى جديدة في وظيفة spastin، باستخدام نهج يومين الهجين الخميرة لتحديد الشركاء ملزم للبروتين. باستخدام كامل طول spastin كطعم حددنا اثنين من البروتينات المشاركة في حركة الغشاء، CHMP1B وgp25L2، كشركاء محددة ملزمة. نظرا للتشابه بين spastin وVPS4 ومع الأخذ في الاعتبار القوة النسبية للتفاعلات الخميرة اثنين الهجين التي تم الحصول عليها مع اثنين من الشركاء ملزم المفترضة، اخترنا لتحديد أولويات التفاعل مع CHMP1B للدراسة. لقد أكدنا على أهمية الفسيولوجية للتفاعل في خلايا الثدييات من الدراسات التحت خلوية شارك في التعريب، وتقسيم β-اكتاماز البروتين جزء المقايسات تكامل والدراسات المشارك مناعي. ونظرا للدور CHMP1B في الاتجار غشاء endosomal، وتشير هذه البيانات إلى أن spastin، مثل الجينات HSP أخرى، قد تلعب دورا في أحداث المرور الغشاء.

النتائج

خميرة التجارب يومين الهجينة تحديد CHMP1B وgp25L2 كشركاء ملزم المحتمل لspastin

استخدمنا كامل طول spastin البروتين ك "الطعم" لفحص الخميرة الإنسان يومين الهجين مكتبة erythroleukaemia كدنا] عالية التعقيد، كما هو موضح سابقا (28). هذه الشاشة ولدت 16 استنساخ مضاعفا الإيجابية التي نمت على انتقائية وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الأدينين وكانت ايجابية للنشاط β غالاكتوزيداز. عندما تم اختبار هذه التفاعلات الأساسية في الخميرة الطازجة تم العثور على اثنين فقط على حد سواء استنساخه والطعم محددة. الى رموز اثنين إيجابية "فريسة" استنساخ البروتين gp25L2 (NM_017510)، التي أظهرت ضعف ملحوظ بعد النشاط β غالاكتوزيداز والنمو يقتصر على وسائل الإعلام انتقائية تفتقر التربتوفان، ليسين والأدينين (-W / L / A)، وCHMP1B (NM_020412 ، المعروف أيضا باسم CHMP1.5)، التي عرضت قوي النشاط β غالاكتوزيداز والنمو القوي على انتقائية (-W / L / A) وسائل الاعلام (الشكل 1 A و B). كما ظهرت spastin للتفاعل بقوة أكبر مع استنساخ CHMP1B فريسة، اخترنا لتحليل خصوصية وأهمية الفسيولوجية لهذا التفاعل في خلايا الثدييات.

يتفاعل الشكل 1. Spastin مع gp25L وCHMP1B في الخميرة نظام هجين اثنين. (A) الإيجابية مستعمرات الخميرة مضاعفا معزولة من الخميرة شاشة يومين الهجين التي بالطول spastin كان يستخدم تم نقل البروتين الطعم لالفلاتر واختبار لتفعيل β غالاكتوزيداز مراسل الجينات. الخلايا مضاعفا تحتوي على spastin واحد من اثنين من البروتينات المختلفة فريسة غير محددة (NSP1 وNSP2) لا تظهر أي تلون أزرق بعد فحص β غالاكتوزيداز، في حين أن الخلايا مضاعفا تحتوي على spastin وgp25L2 أو spastin وCHMP1B تظهر ضعيفة أو قوية النشاط β غالاكتوزيداز، على التوالي. (B) إعادة تأكيد التفاعل الملحوظ بين spastin وgp25L2 أو CHMP1B في الخميرة الطازجة. العمود 1 يبين نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر اليوراسيل ويسين (-U / L) لتحديد وجود كل من الطعم وفريسة ناقلات، في حين يبين العمود 2 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر اليوراسيل، ليسين والحامض الاميني، الأمر الذي يتطلب تفعيل صاحب مراسل الجينات. في كل spastin حال تم استخدامها باسم "الطعم"، في حين استخدمت gp25L2 أو CHMP1B كما بروتينات "فريسة".

توزيع الخلايا من spastin الموسومة حاتمة وCHMP1B

البيانات الموجودة على توطين التحت خلوية من spastin متضاربة ولم يتم الإبلاغ عن توطين التحت خلوية من CHMP1B سابقا، لذلك علينا أولا إجراء الدراسات المناعي لدراسة التوزيع التحت خلوية من الموسومة حاتمة spastin البشرية والبروتينات CHMP1B. لتجنب سوء الفهم وتقييم المحتملة للتغيرات الناجمة عن العلامة في توزيع البروتين، وقارنا توطين التحت خلوية النسبي من ثلاث نسخ الموسومة المختلفة لكل من البروتين. تم الموسومة البروتينات في إما N أو C-محطة مع GFP (GFP-Spastin، Spastin-GFP، GFP-CHMP1B وCHMP1B-GFP) أو في N-محطة مع ج myc حاتمة (MYC-Spastin وmyc- CHMP1B). للمساعدة في تقييم ما إذا كان السبب في اختلاف في توطين التحت خلوية من spastin في خلية ثقافة تجارب ترنسفكأيشن مقابل الدراسات باستخدام أجسام مضادة ضد بروتين الأصلي عن طريق توطين التفاضلية من اكسون 4 حذف وكامل طول إيسفورمس من spastin، قدمنا ​​C-محطة بناء الموسومة GFP تحتوي على النموذج اكسون 4 حذفها من spastin (SpastinΔex4-GFP، الشكل 2). وأعرب عن بنيات عابر في كوس-7 وPC12 الخلايا، وجرى تقييم توزيع فرعية الخلوية النسبي لكل بروتين بواسطة المجهر مضان.

الشكل 2. رسم تخطيطي من كامل طول spastin وأربعة أشكال أخرى من تحور spastin المستخدمة في هذه الدراسة. معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، والتفاعل أنيبيب ومجال الاتجار؛ AAA، أتباز المرتبطة متنوعة الأنشطة الخلوية المجال.

Spastin.

أعطى التعبير عن GFP-Spastin، Spastin-GFP أو MYC-Spastin نتائج مماثلة. وأعرب عن الثلاثة داخل سيتوبلازم خلايا كوس-7 (لا تظهر البيانات) وغير متمايز (الشكل 3 أ) أو الخلايا PC12 متباينة (الشكل 3 B و C)، بما يتفق مع الملاحظات السابقة (13، 14). تم المترجمة Spastin في الغالب إلى هياكل إما منقط أو أنبوبي التي لوحظت في البداية في منطقة محيط بالنواة. في نقطة زمنية لاحقة (48 ساعة أو أكثر)، لوحظت منقط والهياكل الأنبوبية أكثر اتساعا أيضا في المناطق الأكثر هامشية للخلية. في الخلايا PC12 متمايزة لديها ملحقات محوار، كان ينظر التعبير spastin منقط في سوما وأيضا داخل neurites التي. ضمن neurites التي كانت في كثير من الأحيان التعبير الأبرز في نهايات البعيدة (الشكل 3 B و C). التعبير عن SpastinΔex4-GFP بناء في كوس-7 أعطت خلايا نتائج متطابقة إلى التعبير عن كامل طول spastin، مع عدم وجود توطين النووية (لا تظهر البيانات).

الشكل 3. توزيع التحت خلوية من spastin وCHMP1B البروتينات الموسومة حاتمة في كوس-7 وPC12 الخلايا. (A-C و G-I) خلايا PC12، (D-F) كوس-7 الخلايا. (A-C) تبين توزيع spastin تنصهر إلى GFP في دورته N-محطة (A)، C-محطة (B)، أو لحاتمة ج myc في دورته N-محطة (C). (D-I) تبين توزيع CHMP1B تنصهر إلى GFP في دورته N-محطة (D و G) أو C-محطة (E و H)، أو لحاتمة ج myc في دورته N-محطة (F و I) . في كوس-7 الخلايا، وكانت الهياكل النووية منقط أكثر بروزا وتلطيخ محيط بالنواة أقل وضوحا مع البروتين GFP-CHMP1B الانصهار (D) بالمقارنة مع غيرها من اثنين من البروتينات CHMP1B الانصهار. وشوهدت المصفوفات الخطية من حين لآخر نقاط والمسمى (أقحم في F). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وPC12 الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

CHMP1B.

وكان توزيع التحت خلوية من MYC-CHMP1B والبروتينات الانصهار CHMP1B-GFP في عابر. كوس-7 مماثل على نطاق واسع. وقد لوحظت في كل من النواة والسيتوبلازم (الشكل 3 E و F). داخل النواة CHMP1B عرضت في الغالب توزيع منتشر / الحبيبية، على الرغم من أن الخلايا عرضية أظهرت منقط إضافي وضع العلامات النووي. داخل السيتوبلازم البروتينات الانصهار كانت محلية في الغالب إلى العديد جدا، والهياكل منقط الصغيرة التي كانت موجودة في جميع أنحاء السيتوبلازم. بالإضافة إلى ذلك، كتل من هياكل دائرية أكبر، تذكرنا جدا من حويصلات بغشاء، كانوا حاضرين، ومعظمها في قبعة محيط بالنواة البؤري. في نسبة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع CHMP1B-GFP، ولكن ليس MYC-CHMP1B، غطاء محيط بالنواة حويصلات يرد، والهياكل حويصلي المسمى تضخم غير طبيعي. عموما، هذا التوزيع الخلوي مماثلة لتلك التي سبق وصفها للبروتين CHMP1A ترتبط ارتباطا وثيقا (24). على الرغم من أن العديد من الهياكل منقط وصفت أيضا في جميع أنحاء السيتوبلازم في بعض الخلايا معربا عن GFP-CHMP1B، كانت هناك اختلافات مقابل البروتينات الانصهار الأخرى. وكان العديد من الخلايا تنتشر العلامات حشوية، وحيث لم يكن منتشر وضع العلامات، ونادرا ما يلاحظ الغطاء محيط بالنواة هياكل حويصلي ينظر مع البروتينات الانصهار الأخرى. بدلا من ذلك، تميل منقط وصفت والهياكل الأنبوبية أن يكون حاضرا في السيتوبلازم في جميع أنحاء النواة، ولا سيما في الخلايا معربا عن أعلى. بالإضافة إلى ذلك، كان تلطيخ النووي منقط أكثر شيوعا بكثير من مع بنيات أخرى (الشكل 3 D).
في الخلايا PC12، وكان كل من يبني CHMP1B ثلاثة الموسومة حاتمة توزيع التحت خلوية مماثل (الشكل 3 G-I). وكان معظم الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل العديد من حويصلي المسمى الهياكل حشوية دائرية / على خلفية من تلطيخ حشوية منتشر. في الخلايا تبين وجود نمط تمايز الخلايا العصبية أكثر، كان ينظر CHMP1B في عمليات محوار وفي بعض خلايا نهايات البعيدة من neurites التي كانت ملطخة بشدة بشكل خاص. بالإضافة إلى تلطيخ حشوية، أظهرت العديد من الخلايا منتشر تلطيخ النووي، مع عدد قليل من الخلايا وجود منقط تلطيخ النووي.

الموسومة حاتمة CHMP1B المشارك يموضع مع علامات endosomal

وكان جميع أفراد الأسرة CHMP من البروتينات درس حتى الآن على توطين التحت خلوية endosomal. درسنا ما إذا كان هذا صحيحا من CHMP1B من قبل المشترك، معربا عن عابر MYC-CHMP1B مع علامة endosomal، BD الألوان المعيشة ™ الموسومة GFP RhoB. شاهدنا ضرب شارك في توطين هذه العلامة وCHMP1B في الخلايا PC12 (الشكل 4 A-C) وكوس-7 الخلايا (لا تظهر البيانات). أكدنا على موقع endosomal من CHMP1B باستخدام علامات الأجسام المضادة لالإندوسومات في وقت مبكر (EEA1)، الإندوسومات في وقت متأخر (المانوز 6 فوسفات مستقبلات، M6PR) والجسيمات الحالة (مصباح 1)، في كوس-7 الخلايا. عابر. CHMP1B-GFP جزئيا شارك المترجمة مع M6PR (الشكل 4 D-F) وEEA1 (الشكل 4 G-I)، ولكن لم تظهر أي اضح المشارك التعريب مع Lamp1 (لا تظهر البيانات)، مشيرا إلى أن CHMP1B موجود على الإندوسومات المبكرة والمتأخرة، ولكن ليس الجسيمات الحالة.

الرقم 4. حاتمة الموسومة CHMP1B المشارك يموضع مع علامات endosomal. (A-C) تظهر شارك في التعريب في متباينة جزئيا خلية PC12 transfected المشترك مع علامة endosomal RhoB-GFP (A) وMYC-CHMP1B (B). ملاحظة قوي شارك في التعريب في نهايات القاصي ملحقات محوار وفي منطقة محيط بالنواة (C). (D-L) تظهر خلايا كوس-7. (D-F) تظهر شارك في التعريب بين CHMP1B-GFP (D) ومستقبلات المانوز 6 فوسفات (M6PR) (E)، وهو علامة من الإندوسومات في وقت متأخر. للتوطين المشترك هو الجزئي (F). (G-I) تظهر شارك في التعريب بين CHMP1B-GFP (G) والاندوسوم أوائل مستضد 1 (EEA1) (H)، وهو علامة من الإندوسومات مبكرة. مرة أخرى، وشارك في توطين جزئية (I). (J-L) تظهر خلية كوس-7 مع transfected CHMP1B-GFP (J) وملطخة علامة فيليبين الكولسترول مجانا (K). وينظر تلطيخ فيليبين داخل الحويصلات CHMP1B-GFP المغلفة (L). الساحات ملونة يظهر في الزاوية اليمنى السفلي من كل صورة على نطاق والرمادي تشير إلى لون من تلك الصورة في الصورة اندمجت المقابلة (C، F، I و L). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وPC12 الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

يتم نقل الكوليسترول أسترته تناولها عن طريق مستقبلات LDL إلى المقصورة التقامي في وقت متأخر، حيث يتحلل إلى إطلاق سراح الكوليسترول مجانا. overexpression من بعض أفراد الأسرة CHMP في خلايا الثدييات يمكن أن تؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالكولسترول مجانا في مقصورات endosomal (29). درسنا ما إذا كان هذا هو الحال عندما أعرب عن CHMP1B-GFP في كوس-7 الخلايا، وذلك باستخدام الكوليسترول محددة علامة فيليبين. كان هناك تلطيخ فيليبين من مجموعة فرعية من الحويصلات CHMP1B-GFP المسمى، على الرغم من أن قوة العلامات فيليبين في هذه الحويصلات لم تظهر زيادة بالمقارنة مع حويصلات إيجابية فيليبين في الخلايا untransfected (الشكل 4 J-L).

spastin الموسومة حاتمة المشارك يموضع مع البروتين endosomal RhoB

التفاعل المحتمل بين spastin وCHMP1B قادنا التحقيق في ما إذا spastin يمكن أن تكون أيضا موجودة على الإندوسومات. درسنا خلايا المشترك معربا عن RhoB الموسومة GFP-BD الألوان المعيشة مع MYC-Spastin ورأى مرة أخرى ضرب شارك في التعريب في كوس-7 (الشكل 5 A-C) والخلايا PC12 (الشكل 5 D-F). في الخلايا PC12، كان ينظر قوي شارك في التعريب في نهايات القاصي ملحقات محوار فضلا عن جسم الخلية (الشكل 5 D-F). في كل أنواع الخلايا، وأوضح الفحص أعداد كبيرة من الخلايا التي الرئيسين توطين كان مستقلة عن مرحلة دورة الخلية. أظهر تلوين الأجسام المضادة لا شارك في التعريب بين transfected منفردة، spastin الموسومة حاتمة وEEA1، M6PR أو مصباح 1 في كوس-7 الخلايا (لا تظهر البيانات).

الرقم 5. حاتمة الموسومة المشارك يموضع spastin مع RhoB-GFP في كوس-7 وPC12 الخلايا. في (A-C)، واشترك في مع transfected RhoB-GFP (A) وMYC-Spastin (B) كوس-7 الخلايا. وينظر قوي شارك في التعريب بين RhoB وMYC-Spastin (C). (D-F) تظهر متباينة الخلايا PC12 transfected بالاشتراك مع RhoB-GFP (D) وMYC-Spastin (E). مرة أخرى، قوي شارك في التعريب واضح، سواء في خلايا الجسم وفي بؤر على طول امتدادات محوار (F، السهام). وكانت نهايات البعيدة من neurites التي كثيرا ما شارك الملطخة بشدة (السهم طويلة). الساحات ملونة يظهر في الزاوية اليمنى السفلي من كل صورة على نطاق والرمادي تشير إلى لون من تلك الصورة في المقابلة الصورة المدمجة (C و F). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وPC12 الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

، حاتمة الموسومة spastin المشارك يموضع مع CHMP1B الموسومة حاتمة في كوس-7 والخلايا PC12

قمنا بتحليل المقبل إلى أي مدى مترجمة شارك spastin وCHMP1B داخل خلايا الثدييات. درسنا، مع التجارب المناعي في عابر. كوس-7 وPC12 الخلايا، ما إذا كان هناك أي توطين المشترك بين spastin الموسومة حاتمة وحاتمة الموسومة CHMP1B. قارنا MYC-Spastin مع GFP-CHMP1B وCHMP1B-GFP، وMYC-CHMP1B مع GFP-Spastin وSpastin-GFP. في كل حالة spastin وCHMP1B البروتينات وبوضوح شارك المترجمة إلى منقط صغير أو هياكل حشوية أنبوبي (الشكل 6). على الرغم من ضرب، وكان لوحظ المشارك توطين بوضوح لم يكتمل، كما لوحظ spastin لربط مع مجموعة فرعية فقط من الهياكل إيجابية CHMP1B. ومن المثير للاهتمام، وتم ترتيب هياكل منقط اظهار spastin-CHMP1B شارك في توطين بعض الأحيان في المصفوفات الخطية، تذكرنا حويصلات النقل يصطفون على عناصر هيكل الخلية (المواد التكميلية، الشكل S1). وكانت هناك بعض الاختلافات في نمط شارك في توطين شهدت مع مجموعات مختلفة من البروتينات الانصهار، ولا سيما في كوس-7 الخلايا. في دراسات شارك في التعريب التي كانت MYC-CHMP1B مقابل البروتينات الانصهار spastin، كان معظم المشاركين في التعريب في الهياكل منقط والأنبوبية التي وزعت في السيتوبلازم محيط بالنواة وأكثر الطرفية (الشكل 6 A-F). وكان الحد الأقصى للمحيط بالنواة هياكل حويصلي ينظر عادة مع MYC-CHMP1B التعبير وحدها عادة غائبة. في دراسات شارك في توطين باستخدام CHMP1B-GFP، على الرغم من أن عثر منقط الطرفية شارك في الترجمة، وكان أقوى شارك في توطين عادة موجودة داخل الغطاء محيط بالنواة هياكل حويصلي (الشكل 6 G-I). في دراسات شارك في التعريب التي كانت GFP-CHMP1B، كان معظم المشاركين في توطين مرة أخرى في هياكل منقط والأنبوبية التي وزعت في السيتوبلازم محيط بالنواة وأكثر الطرفية (الشكل 6 J-L).

الرقم 6. Spastin وCHMP1B البروتينات شارك توطين في خلايا الثدييات. و transfected خلايا كوس-7 عابر مع Spastin-GFP وMYC-CHMP1B (A-C)، GFP-Spastin وMYC-CHMP1B (D-F)، CHMP1B-GFP وMYC-Spastin (G-I) أو GFP-CHMP1B وMYC-Spastin (J-L). و transfected الخلايا PC12 عابر مع GFP-CHMP1B وMYC-Spastin (M-O). يشير السهم إلى المنطقة من شارك في التعريب في تمديد محوار. في كل transfections هناك شارك في توطين البروتينات اثنين. الساحات ملونة يظهر في الزاوية اليمنى السفلي من كل صورة على نطاق والرمادي تشير إلى لون من تلك الصورة في الصورة اندمجت المقابلة (C، F، I، L و O). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن وPC12 الخلايا 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

في الخلايا PC12، كانت spastin الموسومة حاتمة وCHMP1B شارك المترجمة في الهياكل منقط في إطار عمليات محوار، فضلا عن كونه في الهياكل منقط وأنبوبي في السيتوبلازم خلايا الجسم المترجمة المشترك (الشكل 6 M-O).

في المختبر والمجراة β-اكتاماز فحوصات البروتين جزء تكامل تدعم التفاعل الجسدي بين spastin وCHMP1B في خلايا الثدييات

درسنا كذلك أهمية الفسيولوجية للتفاعل الملحوظ بين spastin وCHMP1B باستخدام سلسلة من فحوصات البروتين β-اكتاماز جزء تكامل (PCAs). ويوفر هذا النهج طريقة محددة وحساسة مستقل لتقييم صلاحية الخميرة الأولية التفاعلات يومين الهجينة في نظام خلايا الثدييات (30 - 32). لأداء PCAs، وتفتيت البروتين β-اكتاماز في مجالين متكاملين وصف BLF1 (الأحماض الأمينية 24-197) وBLF2 (الأحماض الأمينية 198-288)، كما هو موضح سابقا (30، 31). عندما أعرب في عزلة هذه المجالات اثنين لا إعادة النشاط بيتا لاكتاماز بكفاءة. ومع ذلك، عندما يتم التعبير عن شظايا مكملة منفصلة اندماج في الإطار مع اثنين من البروتينات التفاعل يتم جلب اثنين من الأجزاء المكونة للانزيم β-اكتاماز الى مقربة، وتعزيز للطي المجال الصحيح وإعادة نشاط انزيم. وخلافا للنهج الخميرة اثنين الهجين، من المرجح أن تتفاعل في مكان التحت خلوية المعتاد شظايا البروتين.
وتنصهر البروتين CHMP1B المنبع من جزء BLF1 (CHMP1B-BLF1)، في حين أن تنصهر spastin المنبع من جزء BLF2 التكميلي (Spastin-BLF2). كما تحكم إيجابية ولدت لنا اثنين من بنيات أخرى في اثنين من مفارز (ATP6E وATP6G) للمضخة فجوي أتباز H + وتنصهر (V-أتباز) بروتين معقد المنبع من BLF1 وBLF2 شظايا، على التوالي (الشكل 7 A). وقد تم اختيار هذه البروتينات لأن هناك أدلة على أن تتفاعل جسديا في الجسم الحي (33)، وأنها تظهر ملامح التفاعل محددة للغاية في الخميرة المقايسات يومين الهجينة (28).

الرقم 7. البروتين المقايسات تكامل. (A) تمثيل تخطيطي لستة بنيات استخدامها لتنفيذ بيتا لاكتاماز فحوصات البروتين جزء تكامل. BLF1 هو جزء N-محطة للانزيم β-اكتاماز ترميز الأحماض الأمينية 24-197، في حين BFL2 يتوافق مع المجال C النهائي للβ-اكتاماز الأحماض الأمينية الترميز 198-288. (B) بيانات من فحص PCA مقارنة النسبي أعيد النشاط β-اكتاماز مراعاتها عند و transfected الخلايا HEK293T عابر مع أي BLF1 + BLF2، CHMP1B-BLF1 + ATP6G-BLF2، ATP6E-BLF1 + ATP6G-BLF2 أو CHMP1B-BLF1 + Spastin البروتينات الانصهار -BLF2. تظهر أشرطة البيانات متوسط ​​ثلاثة قياسات مستقلة من كل من تجربتين شارك في ترنسفكأيشن منفصلة. (C) البيانات من فحص PCA مقارنة النسبي أعيد النشاط β-اكتاماز مراعاتها عند و transfected الخلايا HEK293T عابر مع أي ATP6E-BLF1 + ATP6G-BLF2، ATP6E-BLF1 + Spastin-BLF2، أو CHMP1B-BFL1 + Spastin-BLF2 الانصهار البروتينات. في كل حالة تم تحديد النشاط β-اكتاماز 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.تظهر أشرطة البيانات متوسط ​​ثلاثة قياسات مستقلة من كل من تجربتين شارك في ترنسفكأيشن منفصلة. (D-H) تظهر النتائج وجود في الجسم الحي β-اكتاماز البروتين جزء تكامل الفحص. خلايا HEK293T تم عابر شارك transfected مع BLF1 وBLF2 اندماج هو مبين في (A) وتفاعلات البروتين البروتين تم الكشف عن استخدام الجينات السترة ™ المقابلة في فيفو الكشف كيت (إينفيتروجن). ثمانية وأربعون ساعة بعد خلايا ترنسفكأيشن كانت محملة الخلية نفاذية الفلورسنت الركيزة CCF2 / AM تحتوي على اثنين fluorophores، الكومارين وفلوريسئين. في غياب أعيد النشاط β-اكتاماز تبقى الركيزة سليمة والإثارة من الكومارين في 409 نانومتر يؤدي إلى الحنق وانبعاث الضوء الأخضر من فلوريسئين في 520 نانومتر. في ظل وجود المعاد النشاط β-اكتاماز CCF2 / AM والمشقوق وتعطل الحنق مما يؤدي إلى انبعاث الضوء الأزرق من الكومارين في 447 نانومتر. الخلايا التي تحتوي إيجابي تفاعل البروتين البروتين يتألق الزرقاء، وتلك التي لا يتألق الأخضر. (I) النشاط β-اكتاماز وكميا في الجسم الحي عن طريق حساب العدد الكلي للخلايا الأخضر والأزرق في 10 مجالات مختلفة من الرأي في ترنسفكأيشن. (J) التمثيل البياني للنسبة المئوية من مجموع الخلايا إيجابية للنشاط β-اكتاماز من 10 حقول نظر.

في ثماني تجارب مستقلة لاحظنا باستمرار زيادة كبيرة في النشاط β-اكتاماز عندما كان CHMP1B-BLF1 والبروتينات الانصهار Spastin-BLF2 المشارك أعرب، بالمقارنة مع مستويات النشاط احظ عندما أعرب عن BLF1 غير مدمجة وشظايا BLF2 معا (الشكل 7 B). لاحظ مستوى النشاط β-اكتاماز عندما كان CHMP1B-BLF1 والبروتينات الانصهار Spastin-BLF2 المشارك أعرب كانت قابلة للمقارنة على نطاق واسع لتلك التي لوحظت عندما استخدمت السيطرة الإيجابية ATP6E-BLF1 وATP6G-BLF2 شظايا معا (الشكل 7 B وC). لاختبار خصوصية التفاعل CHMP1B spastin في هذا النظام، لاحظ النشاط β-اكتاماز النسبي عندما كانت CHMP1B-BLF1 وSpastin-BLF2 ومقارنة مع تلك التي يحصل عليها عندما إما CHMP1B-BLF1 أو Spastin-BLF2 بناء أعرب المشترك استعيض عن المقابلة ATP6E-BLF1 أو ATP6G-BLF2 بناء (الشكل 7 B و C). في كل حالة لاحظت مستوى النشاط β-اكتاماز تم تخفيض ملحوظ عندما تم استبدال شريك معين. وقد لوحظ نفس النمط من خصوصية في مكررات متعددة من هذه التجارب.
كنا بجوار أحد في الجسم الحي β-اكتاماز البروتين جزء تكامل فحص للتحقق من النتائج التي تم الحصول عليها من في المختبر الكلي المحللة الخلية β-اكتاماز الفحص. لفي الجسم الحي ويتم فحص في الخلايا الحية وحتى يوفر نهجا أكثر الفسيولوجية لاستكشاف البروتين البروتين التفاعلات (30، 31). و transfected الخلايا HEK293T على الشرائح غرفة زجاجية والنشاط β-اكتاماز وتصور في الجسم الحي باستخدام مجهر epifluorescence مقلوب. β-اكتاماز تم الكشف عن النشاط انبعاث مضان الأزرق، والذي يحدث في التحلل من الفلورة الركيزة CCF2 / AM، وتم تقييمها من قبل احتساب العدد الكلي للخلايا الزرقاء والخضراء في 10 حقول نظر. وكانت النتائج مشابهة جدا لتلك التي حصلت مع في المختبر فحص. مرة أخرى، لاحظنا باستمرار زيادة في النشاط β-اكتاماز عندما كان CHMP1B-BLF1 والبروتينات الانصهار Spastin-BLF2 المشارك أعرب، بالمقارنة مع مستويات النشاط احظ عندما أعرب عن BLF1 غير مدمجة وشظايا BLF2 معا (الشكل. 7 D، H-J). لاحظ مستوى النشاط β-اكتاماز عندما كان CHMP1B-BLF1 والبروتينات الانصهار Spastin-BLF2 المشارك أعرب كانت قابلة للمقارنة على نطاق واسع لتلك التي لوحظت عندما استخدمت السيطرة الإيجابية ATP6E-BLF1 وATP6G-BLF2 شظايا معا (الشكل 7 E ، وأنا وJ). تم تخفيض النشاط β-اكتاماز عندما تم استبدال إما CHMP1B-BLF1 أو بناء Spastin-BLF2 قبل المقابلة ATP6E-BLF1 أو ATP6G-BLF2 بناء (الشكل 7 F، G، I و J). تم نسخ هذه النتائج في ثلاث تجارب مستقلة. معا، في المختبر والمجراة β-اكتاماز فحوصات البروتين جزء تكامل تشير بقوة إلى أن التفاعل بين spastin وCHMP1B هو ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

المقايسات المشترك مناعي دعم التفاعل بين spastin وCHMP1B في خلايا الثدييات

أجرينا التجارب المشتركة مناعي لمزيد من التحقق من أهمية الفسيولوجية للتفاعل بين spastin وCHMP1B. قمنا أولا بدراسات تجزيء التحت خلوية لتحديد ما إذا كان من الممكن أن تشارك في immunoprecipitate spastin وCHMP1B من الكسور الخلوية الذائبة. وأشارت تجزيء التحت خلوية من MYC-Spastin transfected كوس-7 الخلايا التي spastin موجود في عصاري خلوي، غشاء، النووي، في الغالب، في هيكل الخلية / الكسور التحت خلوية غير قابلة للذوبان (الشكل 8 A). كان CHMP1B-GFP توزيع التحت خلوية مماثل (الشكل 8 B)، ولم تغير توزيع التحت خلوية من البروتين إما بشكل ملحوظ عن طريق المشاركة في التعبير مع الآخرين (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن التعبير عن كل بروتين كان أقوى في جزء غير قابلة للذوبان، بسبب الصعوبات التقنية المشترك مناعي من بيليه غير قابلة للذوبان، حاولنا شارك في مناعي من spastin وCHMP1B من الكسر للذوبان. نحن عابر شارك في اعرب Spastin MYC وCHMP1B-GFP أو MYC-Spastin وGFP ناقلات فارغة في الخلايا HEK293T. انفصلنا في MYC-Spastin / CHMP1B-GFP أو MYC-Spastin / خالي GFP لست] خلية كاملة إلى أجزاء قابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي. أكدنا أن البروتينات من الفائدة كانت موجودة في كل من اثنين من كسور القابلة للذوبان التي كتبها immunoblotting مع مكافحة MYC ومكافحة GFP الأضداد (الشكل 8 C و D)، ثم immunoprecipitated من الكسر للذوبان باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP. لاحقا غرب النشاف مع الأجسام المضادة لمكافحة MYC أظهرت أن MYC-Spastin كان شارك immunoprecipitated مع CHMP1B-GFP (الشكل 8 E)، ولكن هذا لا MYC-Spastin وشارك immunoprecipitated-من MYC-Spastin / خالي GFP ناقلات المشترك -transfection (الشكل 8 F). لم يتم الكشف عن MYC-Spastin في وهمية شارك في immunoprecipitations التي نفذت دون GFP الأضداد (الشكل 8 E و F).

الرقم 8. MYC-Spastin هي في الغالب موجودة في جزء التحت خلوية غير قابلة للذوبان وشارك في immunoprecipitates مع CHMP1B. (A و B) Immunoblotting الكسور التحت خلوية من كوس-7 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع MYC-Spastin (A) أو CHMP1B-GFP (B)، وذلك باستخدام مكافحة MYC ومكافحة GFP الأجسام المضادة، على التوالي. ترتيب حارة في (B) كما هو مبين في الفقرة (أ). تقع عصابات المقابلة لأحجام المتوقعة لكلا البروتينات في جميع الكسور الخلوية الأربع، مع أسمى تعبير في جزء التحت خلوية تحتوي على عناصر هيكل الخلية ومكونات غير قابلة للذوبان الأخرى. وقد تم الحصول على الكسور التحت خلوية استخدام عدة بروتيوم التحت خلوية استخراج (Calbiochem)، بعد 48 ساعة ترنسفكأيشن الخلية. (C-F)، MYC Spastin المشارك immunoprecipitates مع CHMP1B-GFP. خلايا HEK293T وقد شارك transfected مع-MYC spastin وCHMP1B-GFP، أو كما تحكم، MYC-Spastin وفارغ ناقلات EGFP. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت تحصد الخلايا في عازلة تحلل وتفصل إلى أجزاء قابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي. ويظهر التعبير عن البروتينات من حجم المتوقع في نسبة ذوبان من كل شارك في ترنسفكأيشن في (C) (MYC-Spastin / CHMP1B-GFP شارك في ترنسفكأيشن) و (D) (MYC-Spastin / فارغة ناقلات EGFP شارك في ترنسفكأيشن) . تم immunoprecipitated الصورتين القابلة للذوبان باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة GFP، تم فصل البروتينات immunoprecipitated بواسطة SDS-PAGE ثم immunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة MYC. لMYC-Spastin / CHMP1B-GFP شارك في ترنسفكأيشن،-Spastin MYC وشهدت الفرقة المقابلة لفي immunoprecipitate (E). لم يكن حاضرا هذه الفرقة عندما تم حذف الأجسام المضادة لمكافحة GFP من مناعي (E). في السيطرة MYC-Spastin / فارغ ناقلات EGFP مناعي، لم تكن هناك عصابات MYC Spastin الحالية (F).

تم بوساطة التفاعل بين spastin وCHMP1B من المنطقة N-الطرفية من spastin

درسنا التي كانت متواليات من الجزيء spastin المسؤولة عن التفاعل مع CHMP1B، وذلك باستخدام الخميرة اثنين الهجين الفحص. التي قطعناها على أنفسنا الخميرة اثنين الهجين "الطعم" التي تحتوي على كامل طول spastin، spastin مع حذف-C محطة إزالة المجال AAA كامل (spastinΔAAA)، spastin مع حذف N-محطة إزالة أول 194 الأحماض الأمينية من البروتين، بما في ذلك مجال MIT (spastinΔN1) وspastin مع الحذف-N محطة إزالة أول 80 الأحماض الأمينية وترك المجال MIT سليمة (spastinΔN2) (الشكل 2). على الرغم من أن فريسة CHMP1B تفاعلت بقوة مع من النوع البري spastin، spastinΔAAA وspastinΔN2 الطعم، فشل الطعم spastinΔN1 للتفاعل (الشكل 9).

الرقم 9. يتم بوساطة التفاعل بين spastin وCHMP1B من منطقة spastin الذي يحتوي على مجال MIT. وأجري التحقيق في المجالات المسؤولة عن التفاعل بين spastin وCHMP1B خارج باستخدام الخميرة اثنين الهجين. العمود 1 يبين نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان ويسين (-U / L) لتحديد وجود كل من الطعم وناقلات فريسة. ويبين العمود 2 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان، ليسين والحامض الاميني، الأمر الذي يتطلب تفعيل صاحب مراسل الجينات، في حين يبين العمود 3 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان، ليسين والأدنين، الأمر الذي يتطلب تفعيل مراسل الجين أدي. في كل spastin قضية أو متحولة spastin كان يستخدم البروتين "الطعم"، في حين كان يستخدم CHMP1B باسم 'فريسة'. كامل طول spastin، spastinΔAAA وspastinΔN2 عن التفاعل مع CHMP1B، ولكن spastinΔN1 لا.

التعبير عن-حاتمة الموسومة CHMP1B يمنع تطوير microtubular النمط الظاهري الخلوية الشاذ المرتبطة أتباز معيب spastin

درسنا القادم تأثير التعبير عن CHMP1B على النمط الظاهري الخلوية microtubular الشاذة التي وصفت مع التعبير عن أتباز معيب spastin (13). ولدت لنا لبناء N-محطة الموسومة MYC التي تم حذف-C محطة نهاية تحتوي AAA-المجال كاملة من spastin (MYC-SpastinΔAAA، الشكل 2). ونحن أيضا بنيات الموسومة MYC N-الطرفية التي تحتوي على ثلاثة الطفرات مغلطة مختلفة، S362C، K388R وT615I. الطفرات S362C وK388R هي في الكاسيت أتباز وكما هو معروف الطفرة K388R لمنع وظيفة أتباز العادية. طفرة T615I هي في نهاية C-محطة القصوى من البروتين، خارج نطاق AAA. عندما عبرنا عن عابر هذه التركيبات في كوس-7 الخلايا، وجدنا العلامات المترجمة إلى منقط، والهياكل محيط بالنواة في الخلايا مع مستويات التعبير منخفضة (الشكل 10 A). ومع ذلك، مع المعتدلين (الشكل 10 ب) ارتفاع (الشكل 10 مستويات التعبير C)، وجدنا الهياكل الخيطية المسمى بارزة في جميع الخلايا تقريبا. هذه النتائج هي مشابهة جدا لأوصاف السابقة من النمط الظاهري الخلوية الناتجة عن التعبير عن spastin مع وظيفة أتباز المعيبة، واتسمت خيوط حزم كما ممدود بشكل غير طبيعي وسميكة من الأنابيب الدقيقة (13). التي قطعناها على أنفسنا أيضا بناء الموسومة MYC تحتوي على التغيير تسلسل S44L التي تم العثور عليها في ولاية متماثل في مريض واحد مع الشلل النصفي التشنجي، على الرغم من أنه ليس من الواضح ما إذا كانت الطفرة المسببة للمرض في هذه الحالة. كما ذكرت سابقا، فإن نمط التعبير عن هذا التصور لا يختلف عن النوع البري spastin (13).

الرقم 10. المشارك التعبير مع CHMP1B عكس النمط الظاهري الخلوية التي تسببها أتباز معيب spastin. (A-C) تظهر ثلاث خلايا منفصلة تبين مظاهر مختلفة من MYC-SpastinΔAAA transfected كوس-7 الخلايا. مع مستويات التعبير منخفضة، ويتركز MYC-Spastin في منطقة محيط بالنواة (A). مع زيادة مستويات التعبير، والخلايا لديها مختلطة الخيطية توزيع / منقط التسمية (B). مع ارتفاع التعبير، وهناك العديد من الهياكل الخيطية في السيتوبلازم (C). (D-F) تظهر مظهر نموذجي لكوس-7 transfected المشترك مع خلية CHMP1B-GFP (D) وMYC-SpastinΔAAA (E). ظهور الخيطية غير موجود وبقوة شارك المترجمة SpastinΔAAA وCHMP1B في هياكل دائرية. في بعض الأحيان، كانت الحويصلات حشوية أكبر ينظر أحيانا مع CHMP1B-GFP التعبير شارك الملطخة (السهم). تم العثور على نتائج مماثلة عندما أعرب عن نفس متحولة spastin مع GFP-CHMP1B وعندما أعرب عن MYC-SpastinK338R مع GFP-CHMP1B أو CHMP1B-GFP. وهناك نسبة صغيرة من الخلايا transfected شارك الإبقاء على النمط الظاهري الخيطية، وأظهرت مظهر نموذجي واحدة من هذه الخلايا في (G-I). نمط العلامات CHMP1B-GFP (G) وغيرت تماما عن تلك الموجودة عادة، وبدلا من ذلك بشدة شارك يموضع مع MYC-SpastinΔAAA المسمى خيوط (H وI). كان CHMP1B-GFP التعبير وحدها أي تأثير الإجمالي على الأنابيب الدقيقة بلمرة (J-L). الساحات ملونة يظهر في الزاوية اليمنى السفلي من كل صورة على نطاق والرمادي تشير إلى لون من تلك الصورة في الصورة اندمجت المقابلة (C، F، I و L). تم إصلاح الخلايا كوس-7 وتجهيزها للفحص المجهري 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

لتقييم ما إذا CHMP1B التعبير تعديل النمط الظاهري الخلوية الشاذ المرتبطة المسوخ spastin، شاركنا اعرب GFP-CHMP1B أو CHMP1B-GFP مع كل بناء متحولة. في حالة MYC-SpastinΔAAA، MYC-SpastinK388R، MYC-SpastinS362C أو MYC-SpastinT615I يبني، أسفرت شاركت في التعبير مع أي CHMP1B بناء في خسارة كاملة من النمط الظاهري الخيطية تقريبا في جميع الخلايا التي كانت المشترك transfected. وقد شارك بقوة المترجمة للspastin متحولة مع CHMP1B في السيتوبلازم. في حالة CHMP1B-GFP، وكان هذا التعاون التعريب على هياكل دائرية بأحجام مختلفة داخل السيتوبلازم (الشكل 10 D-F). كان أقوى شارك في التعريب في الهياكل منقط الصغيرة، على الرغم من أن نسبة من الحويصلات أكبر ينظر أحيانا مع CHMP1B-GFP التعبير المزدوج المسمى أيضا. هذه الحويصلات أكبر ملطخة إيجابية مع فيليبين، مشيرة إلى أنها كانت الغنية بالكوليسترول ويعني أنهم كانوا من أصل endosomal (لا تظهر البيانات). في أقلية صغيرة من الخلايا transfected المشترك التي لم يكن لها ظهور الخيطية (~5٪ مقابل> 60٪ من الخلايا عندما أعرب عن متحولة spastin مستقل)، تم توزيعها CHMP1B ومترجمة شارك مع spastin متحولة على خيوط (الشكل. 10 G-I). المظاهر مع زملاء التعبير عن MYC-SpastinS44L مقابل GFP-CHMP1B أو CHMP1B-GFP لم تختلف عن المشاركة في التعبير عن CHMP1B يبني مع من النوع البري الموسومة حاتمة spastin (لا تظهر البيانات). وشوهد العديد من حزم أنيبيب من طول ما يبدو العادي وقطر عندما أبديت بنيات CHMP1B وحدها (الشكل 10 J-L).

وأعرب عن CHMP1B في دماغ الجنين وتعليم الكبار

ومن المتوقع CHMP1B أن تكون موجودة في أنسجة الجهاز العصبي المركزي، وإذا كانت التفاعلات بينه وبين spastin لها علاقة كبيرة في التنكس العصبي ينظر في HSP. حددنا به تسلسل أعرب (التكنولوجيات السليمة بيئيا) الموافق CHMP1B من خلال تنفيذ عملية بحث BLAST ضد قواعد البيانات EST الإنسان (34). وقد استمدت العديد من التكنولوجيات السليمة بيئيا، بما في ذلك طول كامل أو شبه cDNAs كامل طول (على سبيل المثال BX418704، BI596792) من الكبار أو مكتبات [كدنا مخ الجنين، مما يدل على أن يتم التعبير عن CHMP1B في الجهاز العصبي المركزي.

طفرة فحص CHMP1B في الأسر HSP

كما وجدنا دليلا قويا على أن CHMP1B شريك ملزم المحتمل لspastin، رأيناها CHMP1B وHSP مرشح الجينات المرض. لذا قمنا بها طفرة فحص الجينات في مجموعة من العائلات HSP. وCHMP1B كدنا] لديه تسلسل الترميز من 600 سنة مضت الموجه على الحمض النووي الجيني في اكسون واحد. لقد قمنا بتصميم الاشعال PCR لتضخيم التسلسل الجيني الترميز من الجينات، جنبا إلى جنب مع المرافقة DNA غير المشفر، في اثنين من شظايا متداخلة. وتضخمت هذه الشظايا من عينات الحمض النووي الجيني من أحد الأعضاء المتضررين من 25 عائلة مع HSP (في 23 منها نمط الميراث كان متوافق مع راثي الميراث المهيمنة، في اثنين متوافق مع الميراث مقهورة). تسعة عشر من هذه الأسر قد تم فرزهم لspastin الطفرات و 24 تم فرزهم لatlastin الطفرات، وكانت النتائج سلبية. تسلسل CHMP1B تضخيم شظايا كشف أي تغييرات تسلسل الترميز.

نقاش

شرعنا في التبصر وظيفة spastin، وهو بروتين تحور في HSP، من خلال تحديد الشركاء المحتملين ملزم. باستخدام نهج يومين الهجين الخميرة، حددنا تفاعل معين بين spastin وCHMP1B، وهو بروتين endosomal تشارك في أحداث المرور الغشاء. وقد دعمت أهمية فسيولوجية لهذا التفاعل في خلايا الثدييات بقوة من خلال ضرب شارك في توطين الموسومة حاتمة spastin مع CHMP1B، من خلال النتائج الإيجابية ومحددة في المختبر والمجراة β-اكتاماز البروتين جزء المقايسات تكامل والتعاون مناعي الدراسات. وبالإضافة إلى ذلك، شاهدنا آثار على توزيع التحت خلوية من الموسومة حاتمة من النوع البري وspastin متحولة مع التعبير عن CHMP1B. معا، تعطي هذه البيانات دعما قويا للتفاعل الفسيولوجية بين spastin وCHMP1B في خلايا الثدييات، مع التحذير من أن جميع التجارب التأكيدية تستخدم أنظمة overexpression. وهذا يعني أنه من الممكن أن بعض النتائج الإيجابية قد يكون الإفراط في التعبير القطع الأثرية والدراسات التي تهدف إلى إيجاد دليل على أهمية الذاتية للتفاعل spastin-CHMP1B أن تكون مفيدة.
وتدعم دراسة ملاحظاتنا السابقة بشأن توزيع الموسومة حاتمة من النوع البري spastin في كوس-7 الخلايا، مع الحاضر spastin في منقط أو الهياكل الأنبوبية داخل سيتوبلازم الخلية (13). بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم البيانات على توطين التحت خلوية من الموسومة حاتمة spastin في خط الخلية PC12 الفئران، خط خلية من خلايا ورم القواتم مشتق التي يمكن أن تكون متباينة في النمط الظاهري العصبية باستخدام عامل نمو الأعصاب (NGF). في الخلايا PC12 غير متمايزة، كان spastin الحاضر عن الهياكل منقط داخل السيتوبلازم. في الخلايا أكثر متباينة، كان spastin الحاضر مرة أخرى كما في نقاط وسوما، ولكن كان حاضرا في ملحقات محوار، مع أقوى تعبير غالبا في نهاية البعيدة للمحوار. هذا التوزيع هو مماثلة لتلك التي وصفها لspastin الذاتية في خط الخلية العصبية الحركية، حيث تم إثراء التعبير في المحور العصبي البعيدة والمناطق المتفرعة (11). ومع ذلك، فإنه يختلف عن نمط التعبير عن الموسومة FLAG من النوع البري spastin في العصبونات القشرية الفئران، حيث اقتصر التعبير إلى سوما ولم تمتد إلى محور عصبي أو التشعبات (14). أسباب هذا التباين ليست واضحة، ولكن يمكن أن تشمل آثار الخلية من نوع أو العلامة حاتمة معينة المستخدمة.
يميز هذه الدراسة أيضا للمرة الأولى توزيع التحت خلوية من CHMP1B ونحن نبين أن لديها نمط التعبير النووي وحشوية مختلطة في كوس-7 والخلايا PC12. في الخلايا PC12، تم العثور حشوية التعبير CHMP1B في الهياكل منقط في سوما الخلية، وأيضا في ملحقات محوار، مع نهايات البعيدة من neurites التي وصفت تظهر في كثير من الأحيان تعبير قوي. داخل سيتوبلازم كوس-7 الخلايا، وCHMP1B عادة موجودة في قبعة محيط بالنواة البؤري من الحويصلات وأكثر الطرفية، والهياكل منقط أصغر. وكانت حويصلات محيط بالنواة إيجابية على الأقل نسبة من CHMP1B الإندوسومات، لأنها تشارك الملون مع علامات الإندوسومات المبكرة والمتأخرة والكولسترول الوارد. وقد لوحظت بعض الاختلافات التي تعتمد على بناء في توزيع التحت خلوية من CHMP1B في كوس-7 الخلايا. وشوهدت القبعات محيط بالنواة هياكل حويصلي عادة مع MYC-CHMP1B وCHMP1B-GFP، ولكن ليس GFP-CHMP1B، في حين شوهدت الهياكل حويصلي حشوية تضخم غير طبيعي فقط مع CHMP1B-GFP. ومن المرجح أن تكون ثانوية بالنسبة للآثار الموقع وطبيعة العلامة حاتمة هذه الآثار. أحد التفسيرات المحتملة لهذه الملاحظات هو أن (ط) العلامة GFP N-محطة تعوق ملزمة لأغشية حويصلي، لذلك GFP-CHMP1B لا تسمية الهياكل حويصلي محيط بالنواة ينظر مع البروتينات الانصهار أخرى، (ب) علامة GFP-C محطة يسمح ملزمة لأغشية حويصلي ولكن يسبب تضخم غير طبيعي للالإندوسومات عن طريق منع إزالة CHMP1B، (ج) يسمح للN-محطة العلامة ج-MYC الظروف العادية ملزمة والعزل من الأغشية، مما أدى إلى حويصلات محيط بالنواة المسمى التي لم يتم الموسع. يمكن هذا التفسير أيضا شرح بعض الاختلافات التي تعتمد على بناء وجدنا في منطقتنا spastin-CHMP1B دراسات شارك في التعريب. في دراسات شارك في التعريب التي كانت MYC-CHMP1B مقابل البروتينات الانصهار spastin، كان معظم المشاركين في التعريب في الهياكل منقط والأنبوبية التي وزعت في السيتوبلازم محيط بالنواة وأكثر هامشية. وكانت مباراة محيط بالنواة هياكل حويصلي ينظر عادة مع MYC-CHMP1B عادة غائبة، مما يشير إلى أن التعبير spastin تسبب CHMP1B لتعبئتها من هذه البؤر الحويصلي. ومع ذلك، في دراسات شارك في توطين باستخدام CHMP1B-GFP، على الرغم من أن عثر منقط الطرفية شارك في الترجمة، وكان أقوى شارك في توطين الحالي عادة في الحد الأقصى محيط بالنواة هياكل حويصلي، مما يشير إلى أنه في هذه الحالة هو spastin التي يعاد توزيعها إلى غير متحرك CHMP1B. وقد وصفت آثار علامات حاتمة على وظيفة البروتينات CHMP (23). هذه الآثار يمكن أن تعتمد على طبيعة ومكانة العلامة، على الرغم من عدم قاعدة واضحة على النحو الذي به يكون لها تأثير سلبي المهيمن على وظيفة CHMP برزت حتى الآن.
عندما عبرنا عن مجموعة متنوعة من بنيات spastin أتباز معيبة في كوس-7 الخلايا، وجدنا نمط التعبير مطابقة لتلك التي سبق وصفها. وspastin متحولة أصبحت مرتبطة مع الهياكل الخيطية غير طبيعية، والتي تتكون من خيوط سميكة وممدود من الأنابيب الدقيقة (13). إلى حد كبير، وتبين لنا أن CHMP1B التعبير له آثار وخيمة على نمط التعبير عن أتباز معيب الموسومة حاتمة spastin. اختفت الهياكل الخيطية المسمى spastin من الخلايا، معربا عن المشترك فقط تقريبا، وبدلا من ذلك spastin متحولة بقوة شارك المترجمة مع CHMP1B. هذه الملاحظات، التي اتخذت مع حقيقة أن الخلايا معربا عن مستويات منخفضة من spastin أتباز معيب لا تظهر النمط الظاهري الخيطية، تشير إلى أن في هذه النماذج خلية spastin متحولة قد ربط الأنابيب الدقيقة مرة واحدة فقط مواقع ملزم للبروتينات أخرى، بما في ذلك CHMP1B، والمشبعة . التعبير عن CHMP1B خارجية المنشأ قد تزيد من مواقع الربط المتاحة، ومنع النمط الظاهري الخيطية من البلدان النامية. على الرغم من أن من غير المحتمل، لا يمكننا استبعاد تماما على إمكانية البديلة التي CHMP1B التعبير في حد ذاته يسبب أنيبيب إعادة التنظيم التي بدورها يمكن أن يكون لها تأثير غير مباشر على توزيع spastin.
رسمناها منطقة spastin التي تتفاعل مع CHMP1B كما الواقعة بين بقايا 80 و 196. Spastin معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا النطاق تقع بين بقايا 116 و 194، التي تشكل أكثر من CHMP1B التفاعل المنطقة، ويبدو من المرجح أن المجال MIT هو المسؤول عن التفاعل بين spastin وCHMP1B. وهذا يتفق مع البيانات على ربط Vps4p إلى الإندوسومات في الخميرة، والذي يحدث عبر مجال MIT ويعتمد على وجود Vps2 وVps24، المتماثلات من CHMP2 البشرية وCHMP3 (22، 25). ولذلك يبدو أنه في حالتين على الأقل، spastin وVPS4، ملزمة لأحد أفراد الأسرة CHMP بوساطة المجال MIT. يبقى أن نرى ما إذا كان غيرها من البروتينات التي تحتوي على مجال MIT تتفاعل أيضا مع أفراد الأسرة CHMP، وإذا كان الأمر كذلك، ما إذا كان الفرق أو التفاعل عدائية من البروتينات التي تحتوي على مجال MIT مختلف مع البروتينات CHMP يمكن أن تكون آلية هامة لتنظيم المسار. منطقة التفاعل spastin مع CHMP1B منفصلة عن تلك المطلوبة للتفاعل مع الأنابيب الدقيقة، والتي تمت مؤخرا تم تحديدها على أنها واقعة بين بقايا 50 و 87 (11). وجود مواقع متميزة ملزمة لCHMP1B والتفاعل أنيبيب يتفق مع الحقائق التي لدينا CHMP1B لا يزال شارك توطين مع أتباز معيب spastin على خيوط، في تلك الخلايا نادرة المشترك معربا على حد سواء البروتينات التي تطور النمط الظاهري الخيطية.
الأسرة CHMP من البروتينات وتشارك كلها في أحداث المرور غشاء الخلايا، على الأقل، ولكن ربما ليس على سبيل الحصر، على مستوى الإندوسومات (24). الخميرة البروتينات آلية تبادل المعلومات والمتماثلات CHMP الإنسان تشكل، أو ترتبط ارتباطا وثيقا، ومجمع ESCRT-III، والتي قد تشكل العنصر الأخير من سلسلة من ثلاثة أجزاء التي تستهدف شحنات غشاء المرتبطة للجسم عديد الحويصلات (22). وليس من الواضح ما إذا كان CHMP1B هو جزء من مجمع ESCRT-III، أو ما إذا كان يلعب دور تنظيمي على وظيفة معقدة. في الوقت الحاضر، يمكننا التكهن فقط على دور وظيفي أن التفاعل spastin مع CHMP1B قد يستغرق. يتم تنظيم جمعية غشاء ESCRT-III CHMPs، بما في ذلك CHMP1B، من خلال VPS4، وهو بروتين AAA التي لديها أوجه التشابه مع spastin، لأن كلاهما يحتوي على مجال MIT وأعضاء من نفس AAA فرعية الأسرة (+22 - 25). كما يرتبط spastin هيكليا لVPS4، فمن الممكن أن تفاعلها مع CHMP1B قد تتخذ شكل تنظيم جمعية غشاء من هذا الجزيء بالمثل. في هذا السياق، من المثير للاهتمام أن وجدنا شارك التعبير من spastin مع MYC-CHMP1B بدا لتعبئة البروتين CHMP1B من توزيع حويصلي محيط بالنواة. بديل وإمكانية ربما أكثر بعد أن CHMP1B قد يكون لها وظائف المرتبطة تفاعله مع spastin التي تختلف عن دورها في حركة الغشاء.
وجدنا بعض التعبير CHMP1B في النواة. هذا النووية / نمط التعبير حشوية المختلط مماثلة لتلك التي وصفها لجزيء CHMP1A ترتبط ارتباطا وثيقا، والتي قد يكون لها شكل الإسوي النووي دورا في استقرار إسكات الجينات (27). على أساس نتائج هذه الدراسة، والعديد من الدراسات التي بحثت في توزيع التحت خلوية من spastin (7، 8، 10، 11)، يبدو من المرجح أن لديها أيضا النووي / توزيع هيولي مختلطة. وهكذا CHMP1B وspastin قد تقع في مجموعة من الجزيئات (التي استعرضت في 27) التي لها وظائف منفصلة في مسارات حركة الغشاء وفي النواة.
وهناك دور للspastin في الاتجار غشاء متوافق مع اقتراح أن spastin قد يكون لها دور في تنظيم أنيبيب (11، 13، 15). وبالنظر إلى الترابط الوثيق بين حركة البضائع متجهة الحويصلة والنقل بواسطة جزيئات السيارات على خيوط هيكل الخلية، فمن المتصور أن جزيء يشارك في أحداث المرور غشاء الخلايا قد تتفاعل أيضا مع الأنابيب الدقيقة أو يكون لها تأثيرات الثانوية على ديناميات أنيبيب، وبالفعل عدد قليل من هذه وقد وصفت جزيئات (إعادة النظر في 17). على هذه الخلفية، فمن المثير للاهتمام أن رأينا بؤر منقط من CHMP1B مترجمة شارك وspastin المنظمة على المصفوفات الخطية، تذكرنا الحويصلات التي يجري نقلها على الأنابيب الدقيقة. بل هو أيضا الجدير بالذكر أنه على الرغم من ذبابة الفاكهة spastin كان لها آثار على الأنابيب الدقيقة محور عصبي، كان نمط التعبير التحت خلوية من الأنابيب الدقيقة مستقرة وD-spastin متميزة، مع-D spastin بدلا شارك توطين-مع متشابك تجمع حويصلة علامة synaptotagmin (15). هذا ربما يشير إلى أن D-spastin قد يكون لها وظائف أخرى التي تختلف لتنظيم أنيبيب. سوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتشريح هذه القضايا.
إذا spastin لها دور في مسار التقامي، وهذا يثير مسألة كيفية خلل في هذه العملية قد تؤدي إلى HSP النمط الظاهري الاعصاب. مسار التقامي دورا هاما في تنظيم غشاء المرتبطة المستقبلات، مع تنظيم مستقبلات أن تعتمد على التوازن بين تدهور في المقصورة lumenal للعديد الحويصلات الجسم / يحلول مقابل إعادة التدوير إلى غشاء البلازما (19). شذوذ الفرز في مسار التقامي قد يؤدي في المستقبل حتى- أو لأسفل التنظيم. ولذلك يمكن خلل في مسار التقامي يسبب تشوهات متعددة في مستويات مستقبلات غشاء البلازما ويترتب على ذلك خلل في الإشارات، وربما بما في ذلك تفعيل مسارات أفكارك، أو قمع مسارات البقاء على قيد الحياة. نهايات البعيدة من المحاور طويلة جدا قد تكون عرضة بشكل خاص لهذه العملية، لأن مسارات المصب قد يكون بالفعل تعمل على المستويات الدنيا تقريبا في مثل هذه البيئة القاسية. والاحتمال الآخر هو أن الشذوذ في حركة endosomal قد التشويش على إشارات مباشرة المصب، بغض النظر عن مستويات مستقبلات غشاء البلازما. صيانة الخلايا العصبية تعتمد على عوامل بقاء عصبية الصادرة عن أهداف تعصيب. هذه العوامل بقاء إشارة من قبل تنشيط مستقبلات وما شابه ذلك على الغشاء قبل المشبكي الخلايا العصبية (35). على الأقل في بعض الخلايا العصبية NGF إشارات يمكن نقلها في الإندوسومات المتخصصة الأولى التي يتم نقلها إلى جسم الخلية العصبية بواسطة وسائل النقل محور عصبي الوراء (35، 36). وبالتالي يمكن أن فشل الاتجار الاندوسوم يشير تؤدي إلى تنكس عصبي، والخلايا العصبية مرة أخرى مع محاور عصبية طويلة جدا يمكن أن تكون عرضة لتشوهات من هذا النوع من العمليات.
هناك أدلة متزايدة على أن العيوب في وظائف ذات الصلة النقل داخل الخلايا وحركة الغشاء قد تكون آليات مشتركة لالتنكس العصبي ينظر في HSP. قد تورطت عدة بروتينات HSP في النقل الجزيئي، بما في ذلك الخلايا العصبية محددة كينيسين السلسلة الثقيلة KIF5A (37 - 39)، أو أحداث المرور الغشاء، بما في ذلك alsin، atlastin، maspardin، spartin وNIPA1 (غير مطبوع في Angelman's1) (16 ، +40 - 46). على نطاق أوسع، وتحليل أسباب الأمراض الوراثية من LMNs يشير إلى أنها هي أيضا عرضة للعيوب في النقل داخل الخلايا أو حركة الغشاء، مع المحرك كينيسين KIF1Bbeta، خيط عصبي ضوء سلسلة، المتعلقة myotubularin 2 بروتين الفوسفاتيز، gigaxonin والبروتينات Rab7 يجري كل المتورطين في هذه العمليات (+47 - +52).
وباختصار، فإننا نقدم البيانات التي نقترح بقوة على التفاعل في خلايا الثدييات بين spastin وCHMP1B. هذه النتائج تدعم فكرة أن spastin يلعب دورا في حركة الغشاء، وتسهم في اعتراف الناشئة التي عيوب في آليات النقل والمرور غشاء الخلايا هي سبب كبير من الخلايا العصبية الحركية علم الأمراض.

المواد والأساليب

بناء الخميرة اثنين الهجين والمناعي ناقلات

وتضخمت الإطارات القراءة مفتوحة كاملة من spastin وCHMP1B كل قراءة دليل PFX البلمرة (إينفيتروجن) PCR من الحيوانات المستنسخة IMAGE 4829087 و3928338، على التوالي، وذلك باستخدام بوابة ™ (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المتوافقة مع نظام مصمم من تسلسل [كدنا مرجعية لكل جين. لتوليد spastinΔAAA، spastinΔN1 وspastinΔN2 المسوخ، PFX أجريت PCR خارج باستخدام المناسبة عبارة (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المتوافقة مع نظام مصمم من داخل كدنا] إشارة. ولدت متحولة spastin T615I بواسطة PCR باستخدام التمهيدي العكسي الذي تضمن تغيير تسلسل المناسب. تم إنشاء أشكال متحولة أخرى من spastin باستخدام الربط عن طريق التداخل منهج الإرشاد، كما هو موضح سابقا، مرة أخرى باستخدام عبارة (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المرافقة المتوافقة مع نظام (53). تم بناء ناقلات دخول بوابة نظام إعادة التركيب استنساخ pENTR201 و / أو pENTR207 تحتوي على cDNAs تضخيم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم التحقق من تسلسل الدخول يبني ناقلات بواسطة التسلسل على ABI377 أو 3700 المنظم، وذلك باستخدام BigDyeDT الكيمياء (النظم البيولوجية التطبيقية).
ثم تم subcloned وspastin وCHMP1B من النوع البري محاضر في ناقلات بوابة المتوافقة مع pcDNA3-NG-MYC، PE-GFP-N وPE-GFP-C، الذي تضمن 5'-MYC، 3'-GFP أو 5'-GFP الحواتم، على التوالي. تم subcloned بنيات متحولة Spastin في ناقلات بوابة متوافق مع pcDNA3-NG-MYC. تم التحقق من التوجه للتسلسل spastin وCHMP1B داخل بنيات بواسطة التسلسل المباشر على ABI377 أو 3700 المنظم، أو عن طريق PCR مع تركيبات مناسبة للناقلات وإدراج بادئات محددة التسلسل.
لخميرة التجارب يومين الهجينة، وsubcloned والتي تحتوي على spastin pENTR201 دخول المتجه إلى ناقلات الطعم بوابة متوافق مع pGBDU-G، والتي تم بناؤها من قبل استنساخ قراءة بوابة إطار كاسيت B إلى pGBDU-C1 (54) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة .

الخميرة يومين الهجينة فحص مكتبة ومراسل المقايسات

PJ69-4A سلالة الخميرة (حصيرة على trp1-901 leu2-3، 112 ura3-52، his3-200 gal4Δ gal80Δ LYS2 :: GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2 :: GAL7-lacZ (54)) تحولت بواسطة الصعق الكهربائي (55 ) مع البلازميد الطعم، والتي تحمل URA3 علامة. لم يتم الحصول على تنشيط الذاتي للجينات مراسل سلالة الطعم على الاصطناعية التسرب (SD) -Ura / أدي وSD -Ura / صاحب. تم عرض الطعم spastin ضد K562 erythroleukaemia مكتبة كدنا] صانع عيدان الثقاب (Clontech)، الذي يحتوي على LEU2 علامة، وتتضخم وتتحول إلى نوع التزاوج تحول، MAT α مشتق من سلالة PJ69-4A الخميرة. وتمثل هذه المكتبة 3.5 × 10 6 استنساخ مستقلة مع الحجم المقدر إدراج [كدنا تتراوح 0،4-3،8 كيلو بايت، مع متوسط ​​حجم إدراج 1.9 كيلوبايت.
الخميرة الطعم (~10 9 وت) وتزاوج بشكل فردي إلى المكتبة فريسة الخميرة (~6 × 10 8 كفو) باستخدام إجراء لوحة التزاوج معدلة من طريقة موضح سابقا (56). أعطى هذا التزاوج من الكفاءة> 2٪، مما يتيح تغطية ~4 أضعاف من المكتبة. وقد نمت خليط من التزاوج على 16 × 150 مم SD لوحات -Ura / لوي / أدي لمدة تصل الى 2 أسابيع لاختيار من الحيوانات المستنسخة معربا عن ADE2 المراسل. تم القبض على المستعمرات في شكل 96-الشبكة على لوحات SD -Ura / لوي / آدي هذه أن كل معالجة لاحقة يمكن أن يؤديها باستخدام المكرر 96 دبوس. تفعيل lacZ كان يعاير مراسل التي تنمو الخميرة على ورق الترشيح على لوحات YPAD بين عشية وضحاها، الناشر الخلايا في النيتروجين السائل ثم يحتضنها المرشحات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على مرشحات مسبقا غارقة في 6 مل Z العازلة (100 متر م نا 2 هبو 4، 40 م م ناه 2 PO 4، 10 م م بوكل، 1 م م MgSO 4، ص 7)، و 100 ميكرولتر 4٪ X-غال و 11 ميكرولتر β المركابتويثانول. وسجل المستعمرات بأنها إيجابية لتفعيل lacZ إذا كان التلون أكبر من أن الخميرة التي تحتوي على ناقل الطعم وحده. نحن لم يسجل لتفعيل HIS3 الجينات لأنه في تجربتنا> 99٪ من المستعمرات التي تنشط ADE2 أيضا تفعيل HIS3، كما ذكرت سابقا (54).

تحديد البروتينات التفاعل في الخميرة الشاشتين الهجين

وتضخمت إدراج فريسة مباشرة من الخميرة باستخدام بادئات ناقلات محددة. تم القبض على مستعمرات الخميرة إلى 20 م م هيدروكسيد الصوديوم و lysed لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمت إضافة قسامة 1.5 ميكرولتر من مزيج تحلل لمعيار 25 ميكرولتر PCR رد فعل تحتوي على الاشعال ناقلات محددة. كانت ساخنة تفاعل PCR لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية تليها 35 دورات من 1 دقيقة تمسخ في 95 ° C، 1 دقيقة الصلب في 58 ° C و 3.5 دقيقة التمديد في 72 ° C. تم تشغيل أربعة microlitres من كل تفاعل PCR على 0.8٪ هلام الاغاروز لتقدير حجم إدراج. للتعرف على إدراج فريسة، والتسلسل 3-5 ميكرولتر من كل منتج PCR كما هو موضح أعلاه.

إعادة تأكيد وخصوصية اختبار الخميرة المقايسات يومين الهجينة

لإعادة اختبار كل تفاعل في الخميرة الطازجة، تم استنساخ كل منتج PCR فريسة باستخدام بوابة نظام إعادة التركيب الاستنساخ في بوابة متوافق pGAD-G ناقلات، كما هو موضح أعلاه. المختصة MAT تحولت α خلايا الخميرة PJ69-4A بواسطة الصعق الكهربائي (55) مع كل من هذه فريسة متجه تحتوي على البلازميدات ومطلي مباشرة على SD -Leu لوحات. بعد النمو عند 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام، وكانوا تزاوج بواسطة الطلاء طبق على حشيش MAT الخميرة التي تحتوي إما على الطعم ذات الصلة، واثنين من الطعوم ذات صلة مختلفة أو الطعم متجه فارغة، ثم حضنت ل> 5 ساعات على لوحات YPAD. وقد تم اختيار Diploids على SD -Ura / لوي قبل الاختبار لتفعيل مراسل عن طريق تكرار على SD -Ura / لوي / آدي.

التحليل الحسابي

كما تم البحث في تسلسل فريسة ضد الإصدارات التي تعقد محليا من الانسان العاقل Unigene وقواعد البيانات EMBLminus باستخدام BLAST الآلي (34) الخوارزمية. استخدمت بنيت خصيصا حدات بيرل والكتابات على prefilter وتنسيق الإخراج BLAST الخام، وتحديد ما إذا كان تسلسل 5 'قراءة تتداخل مع منطقة ترميز البروتين من الجين. مباريات فقط لمناطق ترميز البروتين المعروف والتكنولوجيات السليمة بيئيا التي لم تدرج إطار القراءة المفتوح الذي يعرف بأنه ايجابيات. تم استبعاد مباريات ل3 'UTRs والحمض النووي الجيني مع عدم وجود التنبؤ الجينات المرتبطة بها. مفرد، استبعدت التكنولوجيات السليمة بيئيا unspliced ​​التي لم تتوافق مع أي توقعات الجينات أيضا، لأنها ربما تمثل التلوث الجيني للمكتبات كدنا].

الأجسام المضادة

تم الحصول على الأجسام المضادة الأولية لمكافحة MYC وحيدة النسيلة (الماوس استنساخ 4A6) من Clontech. وقد تم الحصول على وحيدة النسيلة الأجسام المضادة لمكافحة أنيبيب (الفئران استنساخ YL1 / 2) ومكافحة GFP الأضداد الأرنب بولكلونل من abcam (كامبردج). EEA1، كانت M6PR وLamp1 الأجسام المضادة هدية عينية من بول Luzio (كامبردج). تم الحصول على الأجسام المضادة الثانوية مترافق البيروكسيد عن النشاف الغربي من سيجما. تم الحصول على الأجسام المضادة الثانوية للالمناعي من جاكسون ImmunoResearch، وشركة

زراعة الخلايا، وترنسفكأيشن المناعي

وكانت المصنفة خلايا كوس-7 على coverslips زجاجية معقمة في ست لوحات جيدة (~2.5 × 10 5 خلايا / جيد). بعد 24 ساعة و transfected الخلايا مع ~400 نانوغرام من الحمض النووي ناقلات، وذلك باستخدام Effectene ® كاشف ترنسفكأيشن (QIAGEN)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد ترنسفكأيشن، وحضنت الخلايا لمدة 24 أو 48 ساعة في المعدل المتوسط ​​النسر Dulbecco و(DMEM) (لايف تكنولوجيز) التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) (LABTECH الدولية)، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (الحياة تكنولوجيز). كانت خلايا غير متمايزة PC12 مثقف في DMEM تحتوي على 10٪ مصل الحصان (HS)، و 5٪ FBS و 1٪ البنسلين والستربتومايسين (لايف تكنولوجيز). وكانت المصنفة الخلايا في 1 × 10 5 إلى ست لوحات جيدة تحتوي على coverslips الزجاج المطلي مسبقا مع بولي د -Lysine (سيغما). كانت خلايا غير متمايزة ثم إما عابر مع transfected Effectene ® ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمدة 48 ساعة أو عابر transfected تليها التمايز مع 50 نانوغرام / مل NGF (سيغما) في انخفاض DMEM مصل يحتوي على 1٪ HS و 0.5٪ FBS. كانت خلايا متباينة مثقف في NGF تحتوي على وسائل الإعلام لمدة 48 ساعة على الأقل بعد ترنسفكأيشن.
بعد ترنسفكأيشن، وكانت تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني (الحياة تكنولوجيز) وثابت مع 3.8٪ امتصاص العرق و 4٪ السكروز في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وجرفت المياه خلايا ثابتة في برنامج تلفزيوني قبل permeabilized في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (سيغما) أو 0.05٪ سابونين (سيغما) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. خلايا Permeabilized ثم تم غسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني، المحتضنة لمدة 15 دقيقة في عرقلة الحل (PBS، و 10٪ FBS، ± 0.05٪ سابونين) ومن ثم نقلها إلى عرقلة الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة حاتمة محددة المناسب في التخفيف المناسبة. بعد 60 دقيقة الحضانة، وكانت تغسل coverslips ثلاث مرات في عرقلة الحل ثم تم حضنت لمدة 60 دقيقة في عرقلة العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، بتركيز 1/100. تم زلات غطاء ثم يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ومرة واحدة في H المقطر 2 O، وبعد ذلك تم تركيبه في Vectorshield ™ (ناقلات مختبرات شركة) المتوسطة على شريحة زجاجية. وقد تم تحليل عينات الملون على المجهر نيكون الكسوف E800 وبيو راد microradience معدات تحليل متحد البؤر. وسجلت الصور باستخدام برنامج الليزر-حاد OS2 وتمت معالجة البيانات في وقت لاحق باستخدام برامج أدوبي فوتوشوب و Microsoft PowerPoint.

بيتا لاكتاماز البروتين جزء تكامل فحص

بيتا لاكتاماز كدنا] يبني.

الجينات المقاومة الأمبيسلين (بلوخ كانت تستخدم) كهدف لPCR اثنين شظايا β-اكتاماز، BLF1 (الأحماض الأمينية 24-197) وBLF2 (الأحماض الأمينية 198-288)، وذلك باستخدام الأمام وعكس الاشعال تحتوي على تقييد مواقع التوقيت الصيفي الباسفيكي الأول وXho I ، على التوالي. [أليغنوكليوتيد التكميلية التي تحتوي على العديد من المواقع الفريدة تقييد (هند III، هبان I، الباسيفيكي الأول وXho I) والترميز في إطار ل15 الأمينية الحمضية ببتيد مرونة رابط (GGGGS) 3 تم تهجين معا وligated إلى pcDNA3.1 / زيو (+ ) خطي مع هند الثالث وXho I. تم ligated BLF1 وBLF2 شظايا β-اكتاماز بين التوقيت الصيفي الباسفيكي الأول وXho المواقع أنا المصب وفي الإطار مع (GGGGS) 3 رابط لإعطاء متجهين منفصلة معربا عن شظايا مختلفة من الجين β-اكتاماز (pcDNA3.1 / زيو (+ ) (GGGGS) 3 BLF1 وpcDNA3.1 / زيو (+) (GGGGS) 3 BLF2). والمنبع هبان كان يستخدم موقع I إلى ligate بوابة القراءة إطار كاسيت (RF B). واستخدمت هذه العبارة القراءة إطار كاسيت لligate إما بالطول CHMP1B الإنسان أو المنبع spastin من BLF1 في pcDNA3.1 / زيو (+) (GGGGS) 3 أو BLF2 في pcDNA3.1 / زيو (+) (GGGGS) 3. وتم التحقق من جميع البناءات في إطار وأكد من تسلسل الحمض النووي.

β-اكتاماز بمساعدة بروتين تكامل فحص اللونية.

واستند الفحص على الطريقة الموصوفة سابقا (30، 31)، مع تعديلات طفيفة. تم تقسيم الخلايا HEK293T 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن والمصنف عند 2.5 × 10 5 في 12 لوحات جيدة (نونك ™) في DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين والستربتومايسين. و transfected خلايا عابر مع 300 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد باستخدام Effectene® ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم غسلها ثمانية وأربعين ساعة بعد خلايا ترنسفكأيشن مرتين مع برنامج تلفزيوني وإعادة علقت في 100 ميكرولتر من 100 م م الفوسفات عازلة درجة الحموضة 7.4 ثم هي lysed من قبل ثلاث دورات تجميد ذوبان الجليد من خلال تجميد في الثلج الجاف / الإيثانول لمدة 10 دقيقة والذوبان في 37 ° C حمام الماء لمدة 10 دقيقة. وبعد ذلك تستخدم الكلي المحللة خلية لاختبار النشاط β-اكتاماز في 96 لوحات جيدة (الصقر ®). مائة microlitres 100 م م العازلة أضيف الفوسفات 7.4 درجة الحموضة إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا لتركيز النهائي من 60 ملم تحتوي على 20 ميكرولتر من مجموع الخلايا المحللة و2 ميكرولتر 10 م م Nitrocefin (بيكتون ديكنسون والشركة، سباركس، MD؛ النهائي تركيز 100 μ م) والمخفف إلى 200 ميكرولتر مع الماء منزوع الأيونات. ويعاير عينات في ثلاث نسخ باستخدام قارئ لوحة فيوجن ™ ألفا العالمي (بيركن إلمر الآلات ™) مزودة 485 نانومتر (20 نانومتر عرض النطاق الترددي) مرشح في وضع الامتصاص.
تم حساب معدلات التحلل Nitrocefin من كيد مجموعة خطية من زيادة امتصاص رصدت أكثر من 60 دقيقة. تم تطبيع البيانات من محتوى البروتين الكلي المحللة الخلية التي يحددها بيو راد فحص البروتين (بيو راد) استنادا إلى طريقة برادفورد (57).

في الجسم الحي β-اكتاماز البروتين مضان جزء تكامل الفحص.

تم تقسيم الخلايا HEK293T 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن والمصنف عند 2.5 × 10 5 لكل بئر في 2 جيدا الشرائح غرفة زجاجية (نونك ® مختبر التكنولوجيا II نظام الشرائح غرفة) في DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين والستربتومايسين. و transfected خلايا عابر مع DNA البلازميد 300 نانوغرام باستخدام Effectene ® ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وبعد مرور ثمانية وأربعين ساعة تم غسلها خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومعلق في 750 ميكرولتر هانك محلول ملحي متوازن (HBSS) (لايف تكنولوجيز). β-اكتاماز النشاط ثم تم الكشف باستخدام أدوات الكشف GeneBLAzer ™ (إينفيتروجن) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد إضافة الخلية الفلورة الركيزة منفذة CCF2 / AM، حضنت الشرائح الغرفة لمدة 1 ساعة محمية من الضوء ومن ثم تصور لمضان. تم إجراء الفحص المجهري مضان من الخلايا HEK293T الحية على الشرائح الزجاجية الغرفة باستخدام أوليمبوس IX81 مجهر مقلوب برنامج التحصين الموسع ومضان مع 40 × موضوعي (أوليمبوس). تم تنفيذ الاستحواذ في وقت واحد من مضان اللونين في الوقت الحقيقي باستخدام 400DF15 مرشح الإثارة والمزدوجة عرض نظام التصوير ™ (رؤى بصرية)، التي تحتوي على مكعب التصفية التي كان 450DF65 و535DF35 المرشحات الانبعاثات (OMEGA الضوئية). خلية ∧ تم استخدام برامج التصوير R (أوليمبوس) لتحليل الصور متعدد الألوان. تقدير حجم النشاط β-اكتاماز في الجسم الحي أجري عن طريق حساب عدد الخلايا الزرقاء والخضراء في 10 حقول نظر من كل المفترض البروتين البروتين التفاعل الاقتران.

التحليل المشترك مناعي من Spastin CHMP1B التفاعلات

خلايا HEK293T مع transfected spastin. Myc على وCHMP1B-GFP وحده أو شارك في transfected مع spastin. Myc على وCHMP1B أو spastin. Myc على وEGFP-C1 تم غسلها مرتين مع PBS و lysed في 600 ميكرولتر المنظفات NP40 العازلة التي تحتوي على 1٪ (ت / ت ) NP-40، 150 م م كلوريد الصوديوم، و 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (pH7.5)، 0.02٪ أزيد الصوديوم، 1 ملغ / مل BSA و 0.5٪ مثبط البروتياز كوكتيل. تم إزالة أحد aliquote من 100 ميكرولتر من كله جزء المحللة الخلية وال 500 ميكرولتر المتبقية طرد في 000 13 غرام لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. ثم إزالة جزء القابلة للذوبان وحضنت مقتطفات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية الأرنب بولكلونل مكافحة GFP (abcam) بتركيز 1: 250. خمسون microlitres من 50٪ بروتين الخرز A-سيفاروز ثم أضاف وحضنت مع مجمعات للبروتين الأجسام المضادة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. والخرز ثم عزل عن طريق الطرد المركزي وجيزة وغسلها ثلاث مرات في NP-40 العازلة التي تحتوي على BSA مع غسل النهائي في NP-40 العازلة دون BSA. ثم تم معلق حبات في 5 × SDS-PAGE العازلة عينة ويسخن لمدة 5 دقائق عند 95 ° C. تم حل البروتينات ملزمة SDS-PAGE وimmunoblotted مع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للMyc على استنساخ 4A6 الأجسام المضادة الأولية بتركيز 1: 250 (ريف).

تجزيء التحت خلوية

تم تقسيم خلايا كوس-7 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن والمصنف في 0.75 × 10 6 لكل لوحة في 10 سم أطباق الثقافة. بعد مرور أربع وعشرين ساعة أنهم و transfected باستخدام Effectene® ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN). بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، تم تنفيذ تجزئة التحت خلوية من استخدام عدة استخراج بروتيوم التحت خلوية (Calbiochem)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للخلايا ملتصقة. حيث أصبحت بعض الخلايا غير ملتصقة خلال البروتوكول، ونسج عصاري خلوي، الغشاء والكسور النووية في 750 غرام، 5500 ز و6800 غرام، على التوالي، لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، لإزالة أي تلوث من الكسور في وقت لاحق. تم حل البروتينات بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotted مع الأجسام المضادة المناسبة.

PCR وتسلسل الحمض النووي الجيني

منحت الموافقة الأخلاقية من قبل لجنة أخلاقية نفيو أدينبروكس. تم تضخيمه تسلسل الترميز، مع المرافقة تسلسل الجينوم، من اكسون CHMP1B واحد عن طريق PCR والتسلسل في اثنين من شظايا متداخلة. وقد أجريت PCR وتسلسلها من كما هو موضح سابقا (37). وكانت تسلسل التمهيدي تستخدم لتضخيم اثنين شظايا CHMP1B من الحمض النووي الجيني: F1: GCTCTGACGTCACCACCTG، R1: CGAATTTGTCCATCAAAGCA، F2: AACATGGAAGTTGCGAGGAT، R2: GGTAGAAGGGCATTTCAGCA.

المواد التكميلية

المواد التكميلية متوفرة في HMG على الانترنت.

شكر وتقدير

نشكر العائلات الذين وافقوا التكرم المشاركة في بحثنا على HSP. نشكر بول Luzio لإجراء مناقشات مفيدة. سلسلة pGBDU-C النواقل وPJ69-4A MAT على وMAT α سلالات الخميرة قدمت التفضل الدكتور فيليب جيمس (قسم الكيمياء الجزيئية البيولوجية، جامعة ويسكونسن في ماديسون، WI 53706-1532، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد تم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة ويلكوم ترست وبحوث العمل لER، وهو زميل السريرية يلكوم ترست المتقدم.

ملاحظات

  • ↵ † الكتاب أتمنى أن يكون معروفا أنه، ينبغي أن ينظر إلى الكتاب الأولين في رأيهم كما المؤلف الأول المشترك.
  • علم الوراثة الجزيئية البشرية، المجلد. 14، رقم (1) © جامعة أكسفورد 2005؛ جميع الحقوق محفوظة
المراجع

  • ↵
    بار، ML و كيرنان، JA (1983) بالجهاز العصبي للانسان. هاربر والصف، فيلادلفيا، PA.
  • ↵
    ريد، E. (2003) العلوم في الحركة: مواضيع المرضية الجزيئية مشتركة تظهر في paraplegias تشنجي وراثي. J. ميد. جينيه.، 40، 35 -39.
  • فينك، JK (2002) الشلل النصفي التشنجي وراثي. في Rimoin، DL، Pyeritz، RE، كونور، JM وKORF، BR (محرران) إيموري والمبادئ وRimoin وممارسة الطب الوراثي، EDN 4TH. هاركورت، لندن، المملكة المتحدة، 3124 -3145.
  • ↵
    هاردينغ، AE (1984) وراثي الترنحات والاضطرابات ذات الصلة. تشرشل ليفينغستون، أدنبره.
  • ↵
    حزان، J.، Fonknechten، N.، MAVEL، D.، Paternotte، C.، شمشون، D.، Artiguenave، F.، Davoine، CS، Cruaud، C.، Dürr ألف، A.، Wincker، P. وآخرون . (1999) Spastin، وهو بروتين AAA جديد، يتم تبديل في الشكل الأكثر شيوعا من راثي الشلل النصفي التشنجي المهيمن. نات. جينيه.، 23، 296 -303.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    سوتر، S.، Miterski، B.، Klimpe، S.، Bonsch، D.، Schols، L.، Visbeck، A.، بابكي، T.، هوبف، HC، إنجل، W.، Deufel، T. وآخرون . (2002) تحليل الطفرة من الجين spastin (SPG4) في المرضى الذين يعانون في ألمانيا مع مرض وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي وراثي. همهمة. Mutat.، 20، 127 -132.
    CROSSREF ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Charvin، D.، سيفوينتس-دياز، C.، Fonknechten، N.، جوشي، V.، حزان، J.، ملكي، J. وBetuing، S. (2003) الطفرات من SPG4 هي مسؤولة عن فقدان وظيفة spastin، وهو بروتين الخلايا العصبية وفيرة المحلية في النواة. همهمة. مول. جينيه.، 12، 71 -78.
    الملخص / الحرة النص الكامل
  • ↵
    وارتون، SB، ماكديرموت، CJ، غريرسون، AJ، الخشب، JD، Gelsthorpe، C.، اينس، PG وشو، PJ (2003) وعلم الأمراض الخلوي والجزيئي للنظام المحرك في خزل سفلي تشنجي وراثي نتيجة لطفرة من spastin الجينات. J. Neuropathol. إكسب. Neurol.، 62، 1166 -1177.
    ميدلاين ويب للعلوم
  • ↵
    Svenson، IK، اشلي، كوخ. AE، جاسكل، PC، Riney، TJ، كومينغ، WJ، كينغستون، HM، هوجان، EL، بستاني، RM، فانس، JM، نانس، MA آخرون (2001) تحديد والتعبير تحليل الطفرات الجينية spastin في راثية تشنجي الشلل النصفي. آم. J. هوم. جينيه.، 68،

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #2  
قديم 11-22-2015, 08:38 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Spastin وatlastin، اثنين من البروتينات المتحورة في راثي المهيمنة الشلل النصفي التشنجي وراثي، وشركاء ملزمة

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/15/2/307.full


ملخص

وparaplegias تشنجي وراثية نقية (شركائنا HSPs) هي مجموعة من الظروف التي يوجد فيها تقدمية تعتمد على طول انحطاط الغايات البعيدة للمحاور السبيل القشري، مما أدى إلى شلل تشنجي في الساقين. في معظم الأحيان يتم توريث شركائنا HSPs نقية في نمط وراثي جسمي وتسبب عادة من قبل الطفرات إما في spastin SPG4 الجينات أو في atlastin SPG3A الجينات. تحديد الشركاء ملزم للspastin، قمنا بإجراء الخميرة شاشة يومين الهجين على مكتبة [كدنا الدماغ، وذلك باستخدام spastin كطعم. بشكل ملحوظ، وكلها تقريبا من المتفاعل استنساخ فريسة إيجابية مشفرة لatlastin. لقد تحققنا من أهمية الفسيولوجية لهذا التفاعل باستخدام المشارك مناعي، الجلوتاثيون S -transferase المنسدلة والخلايا التجارب المشارك الترجمة. وتبين لنا أن المجال spastin اللازمة للربط إلى atlastin يكمن داخل N-80 محطة بقايا من البروتين، وهي المنطقة التي هي موجودة فقط في الغالب حشوية، كامل طول الإسوي spastin. وتشير هذه البيانات إلى أن spastin وظيفة atlastin في نفس مسار الكيمياء الحيوية، وأنها هي وظيفة حشوية من spastin وهو أمر مهم لإمراض HSP. كما أنها توفر المزيد من الأدلة على وجود دور الفسيولوجية والمرضية من spastin في ديناميات غشاء.
مقدمة

وparaplegias تشنجي وراثي (شركائنا HSPs) هي مجموعة متنوعة من الظروف العصبية مصممة وراثيا التي تشترك كل ميزة السريرية الرئيسية من الشلل التشنجي التدريجي في الأطراف السفلية. فإنها تصنف تقليديا كما نقية، أو عندما يترافق الشلل النصفي التشنجي بمظاهر سريرية أخرى بارزة، المعقدة (+1 - 3). ويعتبر النقي HSP عموما كنوع الأكثر شيوعا في شمال أوروبا وأمريكا الشمالية (4). في شركائنا HSPs نقية، والخلايا أهم إصابة هي الخلايا العصبية الحركية الجهاز القشري (غالبا ما تسمى "الخلايا العصبية الحركية العليا)، وتنعكس الصورة السريرية للشلل سفلي تشنجي التدريجي في النتائج المرضية التدريجي، طول التابعة، البعيدة 'dying- عودة 'انحطاط المحاور السبيل القشري (1). تحديد الجينات المسؤولة عن شركائنا HSPs وتوضيح وظيفة البروتينات المقابلة هو بداية لتوفير معلومات هامة في المسارات الجزيئية التي هي مهمة للحفاظ محور عصبي والحركية وظيفة الخلايا العصبية.
وقد تم تعيين ثمانية جسمية مهيمنة مواضع HSP نقية دراسات الربط الوراثية (إعادة النظر في 1،2،5). وقد تم إحراز تقدم سريع في تحديد جينات المرض في هذه المكاني، مع خمسة، atlastin (SPG3A)، spastin (SPG4)، NIPA1 (SPG6)، KIF5A (SPG10) وHSP60 (SPG13)، بعد أن تم عزلها حتى الآن (6 - 10). الطفرات في spastin وatlastin هي الأكثر شيوعا وتقدر لحساب 40 و 10٪ من الأسر HSP نقية جسمية مهيمنة على التوالي (5، 6، 11 - 13).
وأعرب عن نص spastin على نطاق واسع داخل الجهاز العصبي والأنسجة في غير العصبية، ولكن يتم التعبير بشدة في الفئات الفرعية من الخلايا العصبية (7، 14، 15). وقد اقترحت الدراسات Immunolocalization في مجموعة متنوعة من الأنسجة وأنواع الخلايا عموما أن البروتين على حد سواء توزيع حشوية والنووي (+14 - 17). في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن هذا هو بسبب الفرق توطين اثنين إيسفورمس الرئيسية للبروتين: شكل اقتطاع N-المحطة الطرفية النووي وحشوية، في حين يتم تصدير شكل كامل طول أقل وفرة بنشاط من النواة إلى السيتوبلازم ( 18). وقد وصفت توزيع حشوية كما منقط ومحيط بالنواة في دراسة واحدة (16)، في حين أنه في آخر، تم العثور spastin في المناطق الخلوية هيولية تحتوي على الأنابيب الدقيقة الحيوية، والتي تضمنت في خط الخلية العصبية محور عصبي القاصي ونقاط فرع محور عصبي (17). في الأنسجة العصبية البشرية، يقع spastin في السيتوبلازم ومتشابك محطات عدة أنواع الخلايا العصبية، بما في ذلك الخلايا العصبية الحركية، وإن كان في غيرها من أنواع الخلايا العصبية، تم الكشف عن ذلك في النواة (15).
وفيما يتعلق ظيفة حشوية من spastin، الرئيسيتين، وربما ذات الصلة، وقد اقترحت الأدوار الخلوية. Spastin هو AAA أتباز ترتبط ارتباطا وثيقا في تسلسل لP60 katanin، وهو أنيبيب قطع البروتين، ومجموعة متنوعة من البيانات تشير إلى أن spastin من المرجح أن يكون لها دور في الأنابيب الدقيقة قطع (19، 20). في الخلايا المستزرعة معربا عن الموسومة حاتمة spastin، ارتبط التعبير عن بروتين مع ظهور حزم أنيبيب كسر في غضون السيتوبلازم. في هذه التجارب، والبروتين المترجمة إلى منقط منفصلة الهياكل حشوية لا تقابل العضيات معروفة، ولكن تذكر من تلطيخ منقط ينظر في بعض الدراسات الأجسام المضادة لبروتين الذاتية (19). وعلاوة على ذلك، أدى التعبير عن تحور-أتباز خلل spastin في ضرب خيوط حشوية التي تحتوي على واحدة الأنابيب الدقيقة (19، 21). هذه النتائج متوافقة مع توطين spastin الذاتية للمناطق حشوية الغنية في الأنابيب الدقيقة الحيوية. بيانات من نماذج ذبابة الفاكهة أيضا دعم وجود علاقة بين ذبابة الفاكهة spastin (D spastin) ومنظمة أنيبيب في الخلايا العصبية والأنسجة الأخرى (22، 23، 24).
وبصرف النظر عن دوره في تنظيم أنيبيب، كما أشير إلى أن spastin قد يكون متورطا في أحداث المرور غشاء الخلايا. وقدم هذا الاقتراح لأول مرة عندما كان من المسلم به أن spastin له أنيبيب N-محطة التفاعل والاتجار (MIT) المجال (25، 26). معظم، إن لم يكن كلها، والبروتينات الأخرى التي تحتوي على هذا النطاق لها أدوار في حركة الغشاء (26). وقد عززت الأدلة على تورط spastin في أحداث المرور غشاء مؤخرا تعريفنا لمنطقة CHMP1B البروتين endosomal كشريك ملزم للspastin (27). CHMP1B يموضع إلى الإندوسومات ويرتبط مع ESCRT-III (endosomal الفرز المعقدة اللازمة لنقل-III)، وهو بروتين معقد الذي يعمل في فرز بروتينات ubiquinated أحادية للجسم عديد الحويصلات، حجرة التقامي prelysosomal (إعادة النظر في 27). حددت هذه الدراسة أيضا بروتين الغشاء جولجي، gp25L2، كشريك محتمل ملزم لspastin، على الرغم من عدم يتميز هذا التفاعل تماما حتى الآن (27). كما ترتبط العديد من الفعاليات المرورية غشاء بالنقل القائم على أنيبيب، فمن غير المستبعد أن حركة الغشاء والأدوار التي تنظم أنيبيب من spastin قد تكون بين ذات الصلة.
يتكون هذا الجين atlastin من 14 الإكسونات، الذي رمز لبروتينا 558 الأحماض الأمينية طويلة (6). يتم التعبير عن الجينات في العديد من أنسجة الجسم، مع أعلى التعبير في الدماغ والحبل الشوكي (6). مع استثناءات نادرة، والطفرات في بداية مرحلة الطفولة atlastin سبب HSP. وكانت معظم الطفرات atlastin نشرت حتى الآن الطفرات مغلطة، مع طفرة انزياح الإطار وصفه (28 - 34).
البروتين atlastin هو GTPase رواية مشابهة لأفراد الأسرة dynamin من GTPases كبيرة (6). فقد اثنين من المجالات عبر الغشاء المفترضة مع طوبولوجيا غشاء مما أدى إلى N- وC-تيرميني التعرض إلى السيتوبلازم (35). الموقع GTPase نشطة وتتشكل من بقايا في ثلاثة أفكار، وP-حلقة، DxxG وRD الزخارف. قد oligomerize البروتين لتشكيل homotetramers (35).
وقد تمت دراسة توزيع الخلوي للatlastin في أقسام الدماغ الفئران (35). هنا، كانت خلايا إيجابية atlastin الأكثر وفرة في الصفيحة V من القشرة الدماغية، مع كل من سوما الخلايا العصبية وشجيري شجرة تحتوي على atlastin. على المستوى التحت خلوية في الفئران مثقف الخلايا العصبية تحت القشرية، وatlastin تقع في الغالب في جهاز رابطة الدول المستقلة -Golgi، مع منقط تلطيخ ينظر أيضا في المحاور والتشعبات. واعتبر بعض محدود شارك في التعريب مع الشبكة الإندوبلازمية (ER) علامات أيضا (35). يبقى دور وظيفي دقيق لatlastin في غشاء جولجي أو في غيرها من مواقع عضية الغشاء إلى توضيح.
في هذه الدراسة، شرعنا في اكتساب رؤى إضافية إلى وظيفة spastin، من خلال تحديد الشركاء ملزم جديد للبروتين. وجهت لنا السابقة الخميرة spastin شاشة يومين الهجين ضد مكتبة erythroleukaemia كدنا] (27). من أجل تحديد الشركاء ملزم التي قد تكون مهمة لوظيفة spastin في النظام العصبي المركزي، كررنا الخميرة شاشة يومين الهجين باستخدام مكتبة [كدنا مخ الجنين. بشكل ملحوظ، الواردة عن ما يقرب من الحيوانات المستنسخة التفاعل الإيجابي كدنا] atlastin، مما يشير بقوة إلى أن هذين البروتينات HSP تتفاعل مع بعضها البعض. لقد أكد هذا التفاعل المحتملين من خلال التجارب المشتركة مناعي وسحب إلى أسفل، جنبا إلى جنب مع دراسات شارك في توطين باستخدام الموسومة حاتمة من النوع البري والبروتينات متحولة في خطوط الخلايا العصبية وغير العصبية. معا، وتوفر هذه البيانات والأدلة التجريبية الأولى التي اثنين من البروتينات المشاركة في HSP التفاعل بأنفسهم. أنها توحي بأن spastin وatlastin المشاركة في نفس مسار الكيمياء الحيوية وعلم الأمراض الجزيئي أن من spastin وatlastin HSP هو ذات الصلة. كما أنها توفر دليلا إضافيا على أن spastin تشارك في أحداث المرور الغشاء.

النتائج

الخميرة اثنين الهجين، الجلوتاثيون S -transferase (GST) المنسدلة وشارك في مناعي التجارب تحدد atlastin كشريك ملزم من spastin

استخدمنا كامل طول spastin البروتين ك "الطعم" لفحص الخميرة الإنسان يومين الهجينة مكتبة كدنا] دماغ الجنين عالية التعقيد (Clontech)، وذلك باستخدام الأساليب المذكورة سابقا (27). هذه الشاشة ولدت 15 استنساخ مضاعفا الإيجابية التي نمت على انتقائية وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الأدينين وكانت ايجابية للنشاط β غالاكتوزيداز. عندما تم اختبار هذه التفاعلات الأساسية في الخميرة الطازجة، تم العثور على ثمانية على حد سواء استنساخه والطعم محددة، مع إعطاء قوي النشاط β غالاكتوزيداز والنمو القوي في المتوسط ​​انتقائية تفتقر التربتوفان، ليسين والأدينين (-W / L / A). بشكل ملحوظ، ولكن كل اثنين من الإيجابية "فريسة" استنساخ الواردة atlastin تسلسل الترميز.
من أجل التحقق من مدى أهمية التفاعل المفترض بين spastin وatlastin، قمنا أولا من التجارب GST المنسدلة. انسحب GST-spastin بنجاح أسفل atlastin من المحللة من خلايا عابر مع ناقلات التعبير الثدييات يحتوي ج. Myc على الموسومة atlastinΔTM (MYC-atlastinΔTM؛ الشكل 1)، مشيرا إلى أن اثنين من البروتينات قادرة على التفاعل الكيميائي (الشكل. 2 A). نحن تتميز بجانب المجالات البروتين spastin اللازمة للتفاعل مع atlastin، باستخدام الخميرة اثنين الهجين وGST التجارب المنسدلة. اختبرنا atlastin ناقلات فريسة ضد الخميرة ناقلات الطعم يومين الهجينة التي تحتوي على إدراج الترميز لعدة أشكال اقتطاع من spastin، spastinΔAAA، spastinΔN1 وspastinΔN2 (الشكل 1). وجدنا أن الخميرة واستمر التفاعل هجين اثنين مع spastinΔAAA الطعم متجه، لكنه خسر عندما استخدمت spastinΔN1 وspastinΔN2 الطعوم (الشكل 2 B). المقايسات أسفل سحب باستخدام GST-atlastinΔTM ولست] خلية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع أشكال متحولة من spastin كانت أيضا بما يتفق مع هذه النتائج؛ كان GST-atlastinΔTM قادرة على هدم MYC-spastinΔAAA وMYC-spastinK388R (شكل من أشكال spastin تحتوي على طفرة مغلطة الأمراض المرتبطة)، ولكن ليس MYC-spastinΔN1 أو spastinΔN2-GFP، من لست] من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع بناء ذات الصلة (الشكل . 2 C). وتشير هذه البيانات إلى أن منطقة spastin المسؤولة عن التفاعل مع atlastin تكمن في N-محطة من البروتين، من بقايا 1-80. وقد أظهرت البيانات الأخيرة أن spastin فقد اثنين من مواقع الترجمة بدء، الأولى في كودون 1 والثانية في كودون 87، مما أدى إلى إنتاج اثنين إيسفورمس spastin الرئيسية، نادر، في الغالب حشوية، شكل كامل طول (~68 كيلو دالتون حجم) وأكثر وفرة أقصر، الإسوي النووي وحشوية (~60 كيلو دالتون) (18). الوضع تعقيدا بسبب وجود أحداث الربط بديلة، مما يؤدي إلى وجود إصدارات اكسون طفيفة 4 حذف للإيسفورمس طويلة وقصيرة (في ~64 و 55 كيلو دالتون، على التوالي). لذا بيانات التفاعل لنا المجال تشير إلى أن فقط طويلة (أي 68 و 64 كيلو دالتون) إصدارات الإسوي من spastin قادرة على التفاعل مع atlastin.

الشكل 1. التركيبات المستخدمة في هذه الدراسة. رسم تخطيطي يظهر بنية المجال البرية من نوع (WT) spastin وatlastin، جنبا إلى جنب مع هيكل إدراج الأخرى المستخدمة في التركيبات. وتعطى الترقيم الأحماض الأمينية فوق كل بناء، في حين يتم عرض موقف طفرة نقطة K388R التي شملتها الدراسة في الخط الرمادي فوق التوضيح spastin WT. HR، المنطقة مسعور. AAA، AAA أتباز كاسيت. GTPase، GTPase كاسيت. TM، مجال الغشاء.


الشكل 2. Spastin وatlastin تتفاعل كيميائيا.
> كان يستخدم (A) GST-spastin في تجربة المنسدلة باستخدام المحللة خلية من خلايا هيلا مع transfected MYC-atlastinΔTM. واعتبر فرقة من الحجم الصحيح لMYC-atlastinΔTM في حارة المنسدلة (حارة 4)، ولكن ليس في الممرات من التجارب التي تفتقر إلى البروتين GST (حارة 1)، والتجارب باستخدام فارغة ضريبة السلع والخدمات بدلا من GST-spastin (حارة 2 )، أو التجارب التي تم فيها إضافة أي المحللة خلية (حارة 3). ونفذت (B) التحقيق في المجالات spastin المسؤولة عن التفاعل مع atlastin خارج باستخدام الخميرة اثنين الهجين. يظهر سيطرة العمود 1 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان ويسين (-W / L) لتحديد وجود كل من الطعم وناقلات فريسة. ويبين العمود 2 نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان، ليسين والأدينين (-W / A / L)، الأمر الذي يتطلب تفعيل مراسل الجين أدي، في حين أن العمود السيطرة 3 يظهر نمو المستعمرات مضاعفا على وسائل الإعلام التي تفتقر التربتوفان، يسين والحامض الاميني (-W / H / L)، الأمر الذي يتطلب تفعيل صاحب مراسل الجينات. في كل حالة، تم استخدام spastin أو متحولة spastin كما البروتين "الطعم"، في حين كان يستخدم atlastin باسم 'فريسة'. كامل طول spastin وspastinΔAAA التفاعل مع atlastin، ولكن spastinΔN1 وspastinΔN2 لا. لم يكن التفاعل الحالي مع فريسة غير محددة (LSM2). تجارب (C) GST المنسدلة باستخدام GST-atlastinΔTM مقابل لست] خلية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع ذكر يبني أكدت الخميرة النتيجتين الهجينة. كان البروتين GST الانصهار قادرة على هدم MYC-spastinΔAAA وMYC-spastinK388R، ولكن ليس MYC-spastinΔN1 أو spastinΔN2-GFP. (D) المشارك مناعي من عابر. MYC-spastin وatlastin-GFP في الخلايا HEK293T. بعد أربع وعشرين ساعة ترنسفكأيشن، وimmunoprecipitated البروتينات الموسومة (IP) باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل مكافحة GFP وimmunoblotted (IB) مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للMYC. وكانت فرقة من الحجم المتوقع لtransfected كامل طول MYC-spastin شارك في immunoprecipitated مع atlastin-GFP. كان لا الفرقة الحالية عندما تم حذف الأجسام المضادة لمكافحة GFP من رد فعل مناعي. (E) محاولة المشارك مناعي من عابر. MYC-spastin وناقلات فقط EGFP كعنصر تحكم السلبية لل(D). لم يشارك immunoprecipitated-MYC-spastin مع GFP. لقطع (D) و (E)، وتبين الممرات إدخال ألفا-MYC وα-GFP immunoblots الكسور المدخلات، مؤكدا التعبير من البروتينات ذات الصلة في الخلية لست] تستخدم لimmunoprecipitations. (F) spastin الذاتية وatlastin موجودة في الخلايا NSC34. تم تحديد Spastin باستخدام الأجسام المضادة spastin S51. هذه الأجسام المضادة يكشف عن ثلاث فرق في هذا صمة عار، الموافق إيسفورمس مختلفة من spastin كامل طول (68 كيلو دالتون، السهم إلى اليمين من الممر موقف علامات)، شكل قصيرة (60 كيلو دالتون) والبديل النموذج القصير تفتقر اكسون 4 (55 كيلو دالتون). اكسون كامل طول الإسوي تفتقر 4 (64 كيلو دالتون) هو من هذا القبيل وفرة المنخفضة التي لا ينظر إليها على هذا وصمة عار. باستخدام 5409 الأجسام المضادة لمكافحة atlastin، شوهدت فرقة واحدة من ~55 كيلو دالتون. (G) في ظل ظروف تغيير طبيعة، وimmunoprecipitated atlastin بقوة من خلايا NSC34 من قبل الضد 5409 atlastin. يظهر الممر الأيسر والمحللة خلية الإدخال، بينما يظهر في الممر الأيمن لimmunoprecipitate. وقد نشف على حد سواء مع الأجسام المضادة atlastin. (H) atlastin الذاتية وMYC-spastin وشارك في immunoprecipitated من خلايا NSC34. كان يستخدم لمكافحة atlastin 5409 أجسام مضادة لimmunoprecipitate في ظل ظروف تغيير طبيعة وأجريت immunoblotting استخدام الألغام المضادة MYC. فرقة من حجم المتوقع لMYC-spastin موجودة في المحللة المدخلات وفي immunoprecipitate. وكانت هذه الفرقة غائبة عندما تم استخدام الأجسام المضادة السيطرة زائف (مكافحة GFP) لتنفيذ مناعي. العلامات النجمية علامة على موقف المناعي كانت أيضا موجودة عندما تم حذف الأجسام المضادة لمكافحة MYC الأساسي من إجراء immunoblotting (لا تظهر البيانات) العصابات هذه. يتم عرض موقف العصابات علامة ذات الصلة إلى اليسار من كل وصمة عار.

حاولنا المقبل للتحقق من ملاءمة الفسيولوجية للتفاعل spastin atlastin من خلال التجارب المشتركة مناعي. شاركنا immunoprecipited-حاتمة الموسومة MYC spastin وatlastin-GFP، معربا عن عابر هذه البروتينات في الخلايا HEK293T وimmunoprecipitating مع مكافحة GFP الأضداد. immunobloting اللاحقة من الراسب مع مكافحة MYC كشفت عن وجود عصابة من حجم المتوقع ل-MYC spastin (~68 كيلو دالتون؛ الشكل 2 D). وكانت هذه الفرقة لم تكن موجودة عندما تم حذف الأضداد GFP من رد فعل مناعي أو عندما تم تنفيذ مناعي من استخدام الخلايا transfected المشترك مع-MYC spastin وناقلات GFP فارغة (الشكل 2 E).
وأخيرا، حاولنا إجراء التجارب المشتركة مناعي باستخدام الأجسام المضادة لspastin الذاتية وatlastin. كنا اثنين من الأجسام المضادة التي نشرت في هذه التجارب. كان أول S51، الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة لمكافحة spastin (هدية كريمة من ايلينا Rugarli) (17). هذه الأجسام المضادة يمكن الكشف عن إيسفورمس spastin الرئيسية في الخلية لست] NSC34 (الشكل 2 F)، وقادر على immunoprecipitating spastin. كان الضد الثاني الأرنب بولكلونل مكافحة atlastin الأجسام المضادة (5409 وهدية عينية من كريغ بلاكستون) (35). هذه الأجسام المضادة يكشف عصابة قوية واحدة تقريبا في حجم توقع لatlastin (ج 55 كيلو دالتون) على النشاف الغربي من NSC34 المحللة خلية (الشكل 2 F). على مناعي خلايا NSC34 في ظل ظروف غير تغيير طبيعة استخدام إما spastin S51 الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة atlastin، كنا قادرين على إثبات أي شريك مناعي الشريك ملزم المفترض الذاتية. كما كنا بالقلق من أن مناعي من atlastin من الأجسام المضادة atlastin كان ضعيفا في ظل ظروف غير تغيير طبيعة، ونحن التحقيق في قدرة هذه الأجسام المضادة إلى immunoprecipitate atlastin من خلايا NSC34 في ظل ظروف تغيير طبيعة وجدت مناعي قوي (الشكل 2 G). لذا أجرينا التجارب المشتركة مناعي في ظل ظروف تغيير طبيعة، علاج الخلايا مع dithiobis الكيميائية عبر رابط [succinnimidyl بروبيونات] (DSP) قبل تحلل، من أجل الحفاظ على تفاعلات البروتين البروتين. ومع ذلك، كنا لا نزال غير قادرين على إثبات أي شريك مناعي من spastin الذاتية (لا تظهر البيانات).
نحن افترضنا أن السبب في أننا لم يستطع إثبات أي تفاعل بين البروتينات الذاتية كان بسبب وفرة منخفضة جدا من كامل طول 68 كيلو دالتون spastin (الشكل 2 F)، وشكل قادر على التفاعل مع atlastin. في ضوء ذلك، بحثنا ما إذا كان توفير إضافي كامل طول spastin خارجية المنشأ قد يسمح لنا لإظهار المشترك مناعي مع atlastin الذاتية ووجدنا أن هذا هو الواقع بالفعل. عندما كنا الأجسام المضادة atlastin تحت تغيير طبيعة الظروف لimmunoprecipitate atlastin من خلايا NSC34 معربا عن MYC-spastin، وجدنا أن MYC-spastin كان المشارك immunoprecipitated (الشكل 2 H). لم MYC-spastin المشارك immunoprecipitated عندما تم استخدام الأجسام المضادة immunoprecipitating زائفة (الشكل 2 H).
وباختصار، كنا قادرين على التعرف على التفاعل بين spastin وatlastin بواسطة الخميرة اثنين الهجين، GST المنسدلة والتجارب المشتركة مناعي. وتوفر هذه النتائج دليلا قويا جدا أن spastin وatlastin قادرة على الربط مع بعضها البعض وأن هذا التفاعل له أهمية فسيولوجية.

atlastin الموسومة حاتمة وspastin شارك في توطين في خلايا هيلا وNSC34

وبعد إثبات وجود تفاعل بين spastin وatlastin، وذهبنا بعد ذلك إلى تحديد ما إذا كان هناك أي توطين المشترك بين البروتينات في خلايا الثدييات، وإذا كان الأمر كذلك حيث كان الموقع للتفاعل، عن طريق فحص التوزيع داخل الخلايا حاتمة البروتينات -tagged.
قبل فحص ما إذا كان spastin وatlastin أظهرت الخلايا شارك في الترجمة، وأنشأنا توزيع الخلايا في خلايا الثدييات من الإصدارات الموسومة حاتمة من atlastin، وهذا لم يسبق وصفه. لتقليل احتمالات التغيرات التي يسببها العلامة في التوزيع، التي قطعناها على أنفسنا بنيات معربا إما N-محطة ج-Myc- أو الإصدارات الموسومة GFP C-محطة من كامل طول atlastin ودرست نمط التعبير عن كل بناء المناعي باستخدام متحد البؤر مجهر. في كل حال، يبدو الموسومة حاتمة atlastin في نمط شبكي في جميع أنحاء سيتوبلازم خلايا هيلا عابر.. هذا النمط تلطيخ شبكي بقوة شارك المترجمة مع calreticulin، علامة من ER (الشكل 3 A-F)، ومع الأجسام المضادة لاثنين من البروتينات ER أخرى، PDI (بروتين ثاني كبريتيد مزامرة)، وهو بروتين lumenal، وsec61α، وهو ER بروتين الغشاء (لا تظهر البيانات). في ضوء التفاعل بين spastin وatlastin، والعلاقة بين spastin والأنابيب الدقيقة، درسنا أيضا ما إذا كان atlastin شارك المترجمة مع تويولين. وجدنا جزئي شارك في التعريب بين atlastin الموسومة حاتمة والأجسام المضادة لمكافحة تويولين YL1 / 2 (الشكل 3 G-I)، رغم عدم وجود تأثير الإجمالي لatlastin التعبير على العمارة أنيبيب. هذا التعريب المشترك بين atlastin والأنابيب الدقيقة وربما ليس من المستغرب، كما هو معروف في ER أن يكون لها ارتباط وثيق مع الإطار أنيبيب. اختبرنا أيضا لاشتراكهما في التعريب بين atlastin الموسومة حاتمة وبطارية من علامات الأضداد الأخرى، والتي شملت EEA1 (لالإندوسومات المبكر)، M6PR (لالإندوسومات المتأخرة وشبكة -Golgi غير المشبعة)، Lamp1 (لالجسيمات الحالة)، GM130 (ل جهاز جولجي) وTGN46 (لشبكة -Golgi غير المشبعة). وجدنا بعض محدود شارك في التعريب بين atlastin-GFP وM6PR (الشكل 3 J-L) وGM130 (الشكل 3 M-O)، على الرغم من أننا لا يمكن أن يكون متأكدا ما إذا كان هذا قد يعكس ببساطة حقيقة أن العضيات هذه العلامات كشف وتقع على مقربة من مركز أنيبيب المنظمة، حيث التعبير عن علامات ER هي أيضا قوية جدا.

الشكل 3. حاتمة الموسومة النوع البري ومتحولة atlastin شارك في توطين مع ER وأنيبيب علامات. الصور تظهر خلايا هيلا المسمى مع علامة الضد هو مبين في (A، D، G، J، M). (B، E، H، K، N) إظهار نمط التعبير في نفس الخلايا، عابر. مع بناء يظهر في كل لوحة. لون النص في كل من هذه اللوحات يمثل لون الصورة في المقابلة وحات المدمجة (C، F، I، L، O). كلا N-محطة-MYC الموسومة (A-C) والموسومة GFP C-محطة (D-F) atlastin شارك في توطين بإحكام مع calreticulin. من النوع البري atlastin أيضا جزئيا شارك يموضع مع علامة أنيبيب YL1 / 2 (G-I). كان هذا التعريب شارك الأقوى في المنطقة محيط بالنواة. وهناك أيضا الجزئي شارك في التعريب مع الراحل endosomal المانوز-6-فوسفات مستقبلات (M6PR) (J-L) وGM130 جولجي علامة (M-O)، لا سيما في منطقة محيط بالنواة التنسيق حيث أظهر atlastin تعبير قوي. الخلايا كانت ثابتة 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. الحانات حجم تشير إلى 10 ميكرون.

بالإضافة إلى التجارب في خلايا هيلا، درسنا نمط التعبير عن الموسومة حاتمة atlastin في ماوس المحرك نوع من الخلايا العصبية، NSC34. ويستمد هذا نوع من الخلايا الهجين من الانصهار بين الفأر الشوكي الخلايا العصبية الحركية الحبل وخط الخلية العصبية والعديد من التشريحية، الدوائية والكهربائية خصائص الخلايا العصبية (36). لج. Myc على وatlastin -GFP الموسومة، وكان نمط التعبير في الخلايا NSC34 مشابهة جدا لتلك التي المقابل البروتين في خلايا هيلا. كان Atlastin التعبير موجودة في كل خلايا الجسم وملحقات محوار (لا تظهر البيانات).
بعد أن أنشأ التوزيع داخل الخلايا الموسومة حاتمة atlastin، درسنا شارك في توطين spastin الموسومة حاتمة وatlastin في خلايا هيلا (الشكل 4 A-G) وNSC34 الخلايا (الشكل 4 H-J). وجدنا جزئي لكنه واضح شارك في التعريب بين spastin وatlastin البروتينات وهذا لا يعتمد على طبيعة أو موقع العلامة حاتمة المستخدمة. كان في توطين شارك في خلايا هيلا عادة في نقاط وحشوية / الأنابيب الصغيرة، والتي أيضا شارك المترجمة مع calreticulin ER علامة (الشكل 4 A-G). في الخلايا NSC34، وقع شارك في التعريب في سوما وneurites التي (الشكل 4 H-J).

الرقم 4. حاتمة الموسومة atlastin وspastin شارك في توطين في خلايا هيلا وNSC34. خلايا هيلا (A - G و K - W) أو خلايا NSC34 (H - J) كانت المشترك مع transfected MYC-spastin وatlastin-GFP (A-J)،-MYC spastin وحدها (K-M)، MYC-spastinK388R وatlastin-GFP (N-Q)، MYC-spastinK388R وحدها (R-T) أو MYC spastin وGFP-VPS4-EQ (U-W). وصفت الخلايا هو مبين في (D-G) و (K-T) أيضا مع ER علامة المضادة للcalreticulin (F، L، P، S). (C، G، J، M، Q، T، W) تظهر الصور المدمجة من الخلايا هو موضح في (A و B)، (D-F)، (H وI)، (K و L)، (N ف)، (R و S) و (U و V)، على التوالي، مع لون النص في كل لوحة تشير إلى صورة ملونة في الصورة المدمجة. في كل من الخلايا هو موضح في (A-J)، هناك محدد شارك في التعريب بين spastin وatlastin البروتينات. كل من البروتينات المترجمة المشترك (D-G) وMYC spastin أعرب وحدها (K-M) كما شارك في توطين مع calreticulin. في الخلايا NSC34 (H-J)، واعتبر المشارك التعريب في كل من سوما ومحوار ملحقات. في الخلايا معربا عن spastin متحولة والبرية من نوع atlastin (N-Q)، وإعادة توزيع atlastin وcalreticulin للمشاركة في توطين مع spastin متحولة في خيوط. خارجي التعبير atlastin ليس من الضروري لcalreticulin ليتم إعادة توزيعها بهذه الطريقة (R-T). وكانت نسبة من-MYC spastin التعبير أيضا على الإندوسومات، كما شارك جزئيا المترجمة مع GFP-VPS4-EQ (U-W، السهام). الخلايا كانت ثابتة 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. الحانات حجم تشير إلى 10 ميكرون.

كما الموسومة حاتمة spastin شارك المترجمة مع atlastin على ER، نحن مصممون المقبل ما إذا كانت بعض spastin الموسومة حاتمة غير موجودة على ER في غياب atlastin خارجي أو ما إذا كان التعبير عن atlastin تسبب في إعادة توزيع spastin إلى ER. وجدنا كبير شارك في التعريب في نقاط ووالأنابيب من مجموعة فرعية من بين MYC spastin مع calreticulin (الشكل 4 K-M)، ولكن هذا لم يكن قويا كما كان توطين ER عندما كان MYC-spastin المشارك أعرب مع atlastin-GFP (الشكل 4 D-G)، مما يشير إلى أن شاركت في التعبير مع atlastin تسبب توظيف spastin لER، ربما لأن مواقع الربط إضافية قدمت هناك من atlastin التعبير. عندما أبديت-GFP spastin وspastin-GFP وحده، وكان شارك في التعريب مع calreticulin الحالي، ولكن ذاتي محدود أكثر من ذلك مع MYC-spastin أيضا.
درسنا القادم ما إذا كانت atlastin شارك المترجمة مع أشكال أتباز معيبة من spastin. درسنا آثار atlastin التعبير على طفرة spastin المسببة للأمراض، K338R. طفرة K388R spastin تلغي وظيفة أتباز ويرتبط مع وضع غير طبيعي، والنمط الظاهري الخيطية عندما أعرب في الخلايا المستزرعة. شعيرات طبيعية جزئيا شارك توطين مع علامات الأنابيب الدقيقة (19، 27). وجدنا أن متحولة spastin الاحتفاظ مظهر الخيطية عندما تم تغيير مع الموسومة حاتمة atlastin وأن توزيع atlastin-أعرب شارك بشكل كبير بحيث أظهر بروتين قوي شارك في التعريب مع خيوط غير طبيعية (الشكل 4 N-Q). في الخلايا NSC34، وخيوط غير طبيعية امتدت إلى عمليات محوار، وكان ينظر قوي شارك في توطين هنا، وكذلك في سوما (لا تظهر البيانات). ورافق إعادة توزيع atlastin بواسطة إعادة توزيع calreticulin، والتي أيضا شارك المترجمة مع خيوط spastin متحولة (الشكل 4 P). واعتبرت إعادة توزيع مماثل للER عندما أعرب عن MYC-spastinK388R في خلايا هيلا في غياب atlastin الخارجية (الشكل 4 R-T).
وقد اقترحنا في وقت سابق ان بعض التعبير spastin قد يكون على الإندوسومات، على أساس البيانات التي تظهر التفاعل بين spastin وCHMP1B البروتين endosomal. وصفناها أيضا colocalization بين-MYC spastin وGFP الموسومة علامة endosomal RhoB (27). ومع ذلك، استخدمت تجاربنا السابقة شارك في توطين وRhoB بناء الموسومة GFP (Clontech) التي كانت غير لائقة، حيث أنه يشتمل على حاتمة ج. Myc على. وبالتالي فإننا إعادة التحقيق توطين endosomal من spastin أعرب عابر من خلال فحص خلايا هيلا التعاون مع transfected-MYC spastin وN-محطة-GFP الموسومة الثدييات VPS4-E235Q (هدية عينية من بول وايتلي) (37). البروتين GFP-VPS4-E235Q-أتباز خلل يتراكم على الإندوسومات تورم، التي تحتفظ مكونات المجمع ESCRT-III على الأغشية الحد منها (37). وجدنا كبير جزئي شارك في التعريب بين MYC-spastin وGFP-VPS4-E235Q، مما يشير بقوة إلى أن جزء من السكان من spastin موجود على الأغشية endosomal (الشكل 4 U-W). ولذلك يبدو من المرجح أن spastin يمكن أن تكون موجودة على اثنين على الأقل من سكان الغشاء، الإندوسومات وER.
من أجل الحصول على مزيد من المعلومات حول تكوين شعيرات المرتبطة أتباز معيب spastin، ونحن التحقيق على الصعيد التركيبية. نحن عابر شارك transfected خلايا هيلا مع MYC-spastinK388R وatlastin-GFP وفحص الخلايا تحت المجهر الالكتروني. وجدنا حزم من الأنابيب الدقيقة في سيتوبلازم خلايا transfected المشترك (الشكل 5 A). كان الأنابيب الدقيقة الفردية ضمن هذه الباقات مظهر غير طبيعي، وجود التصدعات الإلكترون الكثيفة.ورأينا أيضا هياكل حشوية مع مثل العسل مظهر غير طبيعي في هذه الخلايا (الشكل 5 B) وكانت هذه الهياكل المستمر في بعض الأحيان مع ER (الشكل 5 B) أو الغلاف النووي (الشكل 5 C). في بعض المقاطع، كانت الهياكل العسل متجاورة مع حزم أنيبيب غير طبيعية (الشكل 5 D).

الرقم 5. فإن التركيب الدقيق للخيوط المرتبطة أتباز معيب
spastin.> وعلى الصعيد المجهر الالكتروني، وخلايا transfected المشترك مع MYC-spastinK388R وكان atlastin-GFP حزم غير طبيعية من الأنابيب الدقيقة في السيتوبلازم (A). كانت الأنابيب الدقيقة إلكترون طلاء كثيفة غير عادية. وشوهدت أيضا هياكل العسل كثيفة، وفي بعض الأماكن، وكانت هذه المستمر مع ER (B، رأس السهم) أو مع الغشاء النووي (C، السهام). في بعض الحالات، كانت متجاورة مع حزم أنيبيب غير طبيعية (D، السهم). تظهر جميع لوحات خلايا هيلا التي تم إصلاحها 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. ويمثل حجم شريط 200 نانومتر. جميع الصور هي في نفس التكبير.

نقاش

في هذه الدراسة، كنا الخميرة نهج هجين اثنين لتحديد الشركاء المحتملين لالمتفاعل spastin، وهو بروتين تحور في جسمية مهيمنة النقي HSP. بشكل ملحوظ، حدد هذا النهج atlastin، بروتين آخر تحور في جسمية مهيمنة النقي HSP، كشريك ملزم spastin المحتملين. نحن التحقق من أهمية هذا التفاعل في خلايا الثدييات من قبل مجموعة متنوعة من الأساليب، والتي توفر معا أدلة دامغة على أن spastin وatlastin شركاء ملزم صحيح. هذا التفاعل هو اول دليل على وجود علاقة وظيفية مباشرة بين اثنين من البروتينات المشاركة في HSP. وجودها تشير بقوة إلى أن spastin وatlastin المشاركة في نفس مسار الكيمياء الحيوية وعلم الأمراض الجزيئي أن من spastin وatlastin HSP مرتبط.
ومن المسائل التي كانت دراستنا غير قادرة على معالجة قاطع الموقع التحت خلوية من التفاعل spastin atlastin. لدينا البيانات مع البروتينات الموسومة حاتمة تشير إلى أن تتفاعل على ER، كما وجدنا أن atlastin الموسومة حاتمة بقوة شارك المترجمة مع علامات ER (وإلى حد أقل مع جهاز جولجي)، أن-حاتمة الموسومة كامل طول spastin أظهر جزئي، ولكن واضح، وشارك في التعريب مع calreticulin ER علامة وأنه عندما شارك أعرب، الموسومة حاتمة كامل طول spastin وatlastin شارك المترجمة مع بعضها البعض ومع calreticulin. فمن الممكن أن مجموعة فرعية من spastin الذاتية قد يكون موجودا على لائحة أو الدراسات immunolocalization شبكة السابقة أنيبيب متجاورة لم فحص على وجه التحديد ما إذا كانت نسبة من التعبير حشوية من spastin قد تكون في أو قريبة جدا من ER. على الرغم من أن الدراسة immunolocalization السابقة وجدت بعض atlastin الذاتية على ER، الموقع الرئيسي للبروتين الذاتية على جهاز جولجي، وهو الموقع الذي كان أقل وضوحا مع الموسومة حاتمة atlastin (35). ويمكن أن تشمل تفسيرات لهذا التفاوت والمناعي عبر رد فعل من الأجسام المضادة atlastin مع بروتين آخر، فإن وجود ER وجولجي أشكال atlastin مع حساسية مختلفة / الحواتم المتاحة لالأجسام المضادة أو آثار العلامة حاتمة على توطين البروتين. ومع ذلك، كان التعريب أننا لاحظنا مستقلة عن موقع أو طبيعة العلامة حاتمة المستخدمة. التعبير عابر atlastin ربما كان لها تأثير على توزيعه، مع الإفراط في التعبير تشبع ER إلى جولجي مسارات النقل أو تؤثر على التوازن بين تقدمي ورجعية مسارات ER / جولجي، مما أدى إلى زيادة نسبية في ER تلطيخ بالمقارنة مع نمط الذاتية . وأخيرا، كان التوزيع المستمر للatlastin التي رأيناها في جميع أنحاء ER يست نموذجية للكتل مجمعة مميزة من الإفراط أعرب البروتينات التي تتجمع في ER. سوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات مع spastin وatlastin الأجسام المضادة إضافية لإيجاد حل نهائي للموقع التحت خلوية من التفاعل spastin atlastin.
أم لا توطين atlastin الأصلي هو الغالب في ER، في جولجي، أو على حد سواء، وحقيقة أنه يتفاعل مع spastin يجعل من المرجح جدا أن spastin تنشط في موقع الغشاء أكثر من واحد. حددنا سابقا CHMP1B البروتين endosomal كشريك ملزم للspastin ونحن نبين هنا أن كامل طول spastin جزئيا شارك يموضع مع GFP-VPS4-E235Q، علامة endosomal (27). ولذلك صورة تظهر من spastin كما بروتين التنظيم أنيبيب التي يمكن تجنيده من قبل البروتينات محول مختلفة لعدة مواقع غشاء، حيث يمكن أن تلعب دورا في تنظيم المحليين من الأنابيب الدقيقة، وربما إلى جانب لحركة العضيات بغشاء (خاصة في المحاور) و / أو إعادة تشكيل بنية عضية، أو حتى يكون لها دور منفصل تماما لا علاقة لها وظيفتها قطع أنيبيب. العوامل التي تؤثر على توظيف spastin لموقع واحد مقابل أخرى غير معروفة حتى الآن، ولكن سوف يكون من المهم توضيح الخاصة بهم في زيادة فهم دور الفسيولوجية الدقيق للبروتين.
قد يكون Spastin أيضا وظائف أخرى لا علاقة لها تفاعلات الغشاء. وأشارت العديد من الدراسات باستخدام الأجسام المضادة لspastin الذاتية أنه في بعض أنواع الخلايا أو في بعض مراحل دورة الخلية، قد يكون spastin توطين النووي (14، 15، 17). هذا spastin النووية تتكون في الغالب من القصير الإسوي اقتطاع N-محطة وظيفتها غير معروفة حاليا (18). سيناريو أحد أفراد العائلة AAA وجود مواقع متعددة من العمل ليس غير مسبوق، مع العديد من الأمثلة الموثقة من البروتينات AAA الفردية ممارسة وظيفة محددة، وغالبا ما تنطوي على تنظيم البروتين الركيزة التشكل، في مواقع متعددة داخل الخلايا العمل (38، 39).
درسنا المجالات spastin التي تتوسط التفاعل مع atlastin، والمنطقة المسؤولة يقيمون داخل بقايا 80 الأولى من البروتين (الشكل 6). وهكذا، إلا أن الغالب حشوية، كامل طول الإسوي spastin يحتوي على المنطقة المسؤولة عن ملزم لatlastin، مما يشير إلى أنها هي وظيفة هذا الإسوي التي تكتسي أهمية مباشرة لإمراض HSP. ومن المثير للاهتمام، وأثرى كامل طول الإسوي في الدماغ والحبل الشوكي، والمواقع التشريحية للHSP علم الأمراض (18). المنطقة ملزم atlastin تتداخل المجال (بقايا 50-87) هي المسؤولة عن الربط إلى الأنابيب الدقيقة والبروتين NA14 centrosomal، ولكن تتميز عن المنطقة التي تتفاعل مع CHMP1B (بقايا 81-194) (17، 19، 27) . وهكذا، يبدو أن تنعكس المواقع والوظائف spastin المختلفة التي تمت مناقشتها في وقت سابق وجود مواقع للبروتينات محول مختلفة في المنطقة-N محطة لها صفة الإلزام.

الرقم 6. كارتون الرسم البياني للتفاعل بين spastin وatlastin. منطقة atlastin مسؤولة عن الربط لspastin تكمن N-محطة لأول TM. لspastin، المنطقة المسؤولة عن ملزم لatlastin يكمن داخل بقايا 80 الأولى من البروتين. هذا التداخل في المنطقة من البروتين (بقايا 50-87) هي المسؤولة عن الربط إلى الأنابيب الدقيقة، ولكن يختلف من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وAAA أتباز المجالات.

يعرض دراستنا أيضا مزيد من المعلومات حول تكوين شعيرات الخلايا نشاهد في التعبير عن المسوخ spastin أتباز معيبة. على الرغم من أنه من غير المرجح أن هذه الخيوط هي ذات الصلة لتلك الطفرات التي تسبب haplo spastin-قصور وأنه من الممكن أن أنها تمثل الإفراط في التعبير الحرفية، قد يكون تكوينها ذات الصلة HSP الناجمة عن الطفرات spastin أتباز مغلطة. على مستوى المجهر الضوئي، atlastin الموسومة حاتمة وcalreticulin ER علامة كان كلا إعادة توزيعها على حزم أنيبيب غير طبيعية. في المجهر الإلكتروني في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع MYC-spastinK388R وatlastin-GFP، لاحظنا المجمعة الأنابيب الدقيقة والهياكل العسل غير طبيعية، والتي كان ينظر إليها في بعض الأحيان بالاشتراك مع حزم أنيبيب. في بعض الحالات، كان من الواضح أن الهياكل العسل كانت مستمرة مع ER العادي ومع الغلاف النووي، مما يشير إلى أنها قد تمثل ER غير طبيعي. وليس من الواضح ما إذا كانت إعادة تنظيم ER الذي شهدناه هو نتيجة للربط المباشر بين spastin متحولة وatlastin أو ما إذا كان لها تأثير غير مباشر عن طريق إعادة تنظيم شبكة أنيبيب المرتبطة ER، على الرغم من أنه يبدو واضحا أن خيوط ترتبط ارتباطا وثيقا مع مكونات الغشاء.
وباختصار، حددنا اثنين من البروتينات HSP، spastin وatlastin، كشركاء ملزم. هذا يشير إلى أن التسبب في HSP الناجمة عن طفرة في هذه البروتينات اثنين يرتبط في الأساس، ويوفر أول دليل تجريبي HSP قد تكون ناجمة عن خلل في البروتينات التي هي أعضاء في نفس مسار الكيمياء الحيوية. وهناك فهم أكثر تفصيلا وظيفة هذا المسار تعطي ليس فقط الأفكار الرئيسية في أسباب التنكس العصبي في HSP والحالات العصبية وربما غيرها ولكن يجب أيضا توضيح الآليات الجزيئية التي تعتبر مهمة للالمسالك طويلة صيانة العصبية.

المواد والأساليب

بناء الخميرة اثنين الهجين، GST والمناعي ناقلات

شيدت الخميرة Spastin يومين الهجين والتعبير الثدييات بنيات كما هو موضح سابقا (27، 40). وتضخمت بنيات Atlastin كل قراءة دليل PFX البلمرة (إينفيتروجن) PCR من IMAGE استنساخ 3869877، وذلك باستخدام بوابة TM (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المتوافقة مع نظام مصمم من تسلسل [كدنا مرجعية لكل الجينات. ليبني [كدنا مبتورة، PFX أجريت PCR خارج باستخدام المناسبة عبارة (إينفيتروجن) إعادة التركيب استنساخ الاشعال المتوافقة مع نظام مصمم من داخل كدنا] إشارة. تم بناء ناقلات دخول بوابة نظام إعادة التركيب استنساخ pENTR201 و / أو pENTR207 تحتوي على cDNAs تضخيم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم التحقق من تسلسل الدخول يبني ناقلات بواسطة التسلسل على ABI377 أو 3700 المنظم، وذلك باستخدام BigDyeDT الكيمياء (النظم البيولوجية التطبيقية).
ثم تم subcloned النصوص atlastin إلى ناقلات بوابة المتوافقة مع pcDNA3-C-Myc على و / أو pEGFP-N، الذي تضمن 5'-MYC أو 3'-GFP الحواتم، على التوالي. تم التحقق من التوجه للتسلسل atlastin داخل بنيات بواسطة التسلسل المباشر على ABI377 أو 3700 المنظم.
لإنتاج بنيات كدنا] GST الانصهار، وتضخمت كامل طول كدنا] spastin وatlastinΔTM كدنا] بواسطة PCR باستخدام PFU توربو ® إنزيم البلمرة (Stratagene). وقد صممت هذه البادئات المستخدمة في رد فعل لإنتاج منتج PCR مع 5 'و 3' ينتهي متوافقة مع GST الجينات الانصهار ناقلات، pGEX-4T-3 (أمرشام العلوم البيولوجية). بعد التقييد مع غير الأول وسال I (نيو إنجلاند Biolabs)، كان ligated المنتج PCR في ناقلات التعبير باستخدام T4 DNA يغاز (نيو إنجلاند Biolabs). تم التحقق من تسلسل يبني في وقت سابق.

إنتاج البروتينات GST الانصهار

تحويل GST الانصهار بناء إلى أجري BL21 (DE3) خلايا pLysS وفقا لتعليمات الشركة المنتجة (إينفيتروجن). أجريت إنتاج sonicates البكتيرية على نطاق واسع، وبعد ذلك GST الانصهار تنقية البروتين وفقا لتعليمات نظام GST الجينات الانصهار في أمرشام العلوم البيولوجية ".

الخميرة يومين الهجينة فحص مكتبة، المقايسات مراسل وتحديد البروتينات التفاعل

وقد أجريت الخميرة فحص هجين اثنين مع الطعم استنساخ spastin خارج كما هو موضح سابقا، باستثناء أجريت الشاشة ضد دماغ الجنين مكتبة كدنا] صانع عيدان الثقاب (Clontech) (27). للتعرف على التفاعل البروتينات، تم إدراج فريسة تضخيم مباشرة من الخميرة باستخدام بادئات ناقلات محددة، كما هو موضح سابقا، وكان التسلسل 3-5 ميكرولتر من كل منتج PCR كما هو موضح سابقا (27).
كما تم البحث في تسلسل فريسة ضد الإصدارات التي تعقد محليا من الانسان العاقل Unigene وقواعد البيانات EMBLminus باستخدام BLAST الآلي (41) الخوارزمية. استخدمت بنيت خصيصا حدات بيرل والكتابات على prefilter وتنسيق الإخراج BLAST الخام وتحديد ما إذا كان تسلسل 5 'قراءة تتداخل مع منطقة تشفير البروتين من الجين. مباريات فقط لمناطق تشفير البروتين المعروف والتكنولوجيات السليمة بيئيا التي لم تدرج إطار القراءة المفتوح الذي يعرف بأنه ايجابيات. تم استبعاد مباريات ل3'-UTRs والحمض النووي الجيني مع عدم وجود التنبؤ الجينات المرتبطة بها. مفرد، استبعدت أيضا التكنولوجيات السليمة بيئيا unspliced ​​التي لم تتوافق مع أي توقعات الجينات.

إعادة تأكيد وخصوصية اختبار الخميرة المقايسات يومين الهجينة

لإعادة اختبار كل تفاعل في الخميرة الطازجة، تم استنساخ المنتج PCR فريسة باستخدام بوابة نظام إعادة التركيب الاستنساخ في بوابة متوافق pGAD-G ناقلات، كما هو موضح سابقا. المختصة MAT تحولت α خلايا الخميرة PJ69-4A وتزاوج كما هو موضح سابقا. تم تزاوج هم مع الطعم ذات الصلة، واثنين من الطعوم ذات صلة مختلفة أو الطعم متجه فارغة، ثم حضنت ل> 5 ساعات على لوحات YPAD. وقد تم اختيار Diploids على SD-أورا / لوي قبل الاختبار لتفعيل مراسل عن طريق تكرار على SD-أورا / لوي / آدي.

الأجسام المضادة

الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للMYC الأساسي (الماوس استنساخ 4A6) تم الحصول عليها من شمالي ولاية (نيويورك). تم الحصول على وحيدة النسيلة الأجسام المضادة لمكافحة أنيبيب (الفئران استنساخ YL1 / 2) ومكافحة GFP الأضداد الأرنب بولكلونل من Abcam (كامبردج). تم الحصول على الأرنب بولكلونل المضادة للcalreticulin الضد من Calbiochem (سان دييغو). تم الحصول على الأغنام بولكلونل المضادة للTGN46 من Serotec (أكسفورد)، وكان الأرنب بولكلونل مكافحة M6PR والماوس وحيدة النسيلة المضادة للLamp1 الأجسام المضادة المتوفرة في المنزل. تم الحصول على الماوس وحيدة النسيلة المضادة للEEA1 والماوس وحيدة النسيلة المضادة للGM130 من مختبرات تنبيغ دينار بحريني (أكسفورد). تم الحصول على الأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق الثانوية للالنشاف الغربي من سيجما. تم الحصول على الأجسام المضادة الثانوية Alexafluor المسمى لالمناعي من المسابر الجزيئية (ولاية أوريغون). كان S51 أرنب المضادة للspastin الأجسام المضادة بولكلونل هدية كريمة من ايلينا Rugarli والأرنب مكافحة atlastin كان 5409 الضد هدية عينية من كريغ بلاكستون.

زراعة الخلايا، وترنسفكأيشن المناعي

وكانت المصنفة خلايا هيلا على العقيمة زلات غطاء زجاجي في لوحات ستة جيدا (~0.5 × 10 5 خلايا / جيد). بعد 24 ساعة، و transfected الخلايا مع ~400 نانوغرام من الحمض النووي ناقلات، وذلك باستخدام كاشف ترنسفكأيشن Effectene® (QIAGEN)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. بعد ترنسفكأيشن، وحضنت الخلايا لمدة 24 أو 48 ساعة في المتوسط ​​RPMI-1640 (سيغما) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) (سيغما)، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (سيغما) و 2 م مل -glutamine (سيغما). وقد حافظت خلايا NSC34 في تعديل متوسطة Dulbecco والنسر (لايف تكنولوجيز)، على أن تستكمل في نفس الطريق باعتبارها وسيلة RPMI-1640 تستخدم لخلايا هيلا. كانت المصنفة خلايا NSC34 في 1 × 10 5 إلى لوحات ستة جيدا تحتوي على زلات غطاء زجاجي المكسوة مسبقا والمحمولة مع بولي د -lysine (سيغما). ثم تم transfected أنها عابر مع Effectene ترنسفكأيشن الكاشف (QIAGEN)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، لمدة 24-48 ساعة قبل التثبيت.
بعد ترنسفكأيشن، وكانت تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني (سيغما) وثابت مع 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني، في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وجرفت المياه خلايا ثابتة في برنامج تلفزيوني قبل permeabilized في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (سيغما) أو 0.05٪ سابونين (سيغما، وتستخدم مع M6PR وLamp1 الأجسام المضادة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة. خلايا Permeabilized ثم تم غسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني، المحتضنة لمدة 15 دقيقة في عرقلة الحل (PBS، و 10٪ FBS، ± 0.05٪ سابونين) ومن ثم نقلها إلى عرقلة الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة حاتمة محددة المناسب في التخفيف المناسبة. بعد 60 دقيقة الحضانة، وجرفت المياه زلات غطاء ثلاث مرات في عرقلة الحل ثم تم حضنت لمدة 60 دقيقة في عرقلة العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المناسبة، بتركيز 1/300. تم زلات غطاء ثم يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ومرة واحدة في H المقطر 2 O، وبعد ذلك تم تركيبه في Vectashield TM (ناقلات مختبرات شركة) المتوسطة على شريحة زجاجية. وقد تم تحليل عينات الملون على زايس 510 المجهر متحد البؤر ميتا. وسجلت الصور باستخدام LSM صورة محلل البرمجيات، وتمت معالجة البيانات في وقت لاحق باستخدام برامج أدوبي فوتوشوب والمصور.

المجهر الإلكتروني

وأجري تثبيت وتجهيز أقسام للفحص المجهري وفقا لأساليب موضح سابقا (42).

التجارب المشتركة مناعي

عن محاولة المشارك مناعي من spastin الذاتية وatlastin في ظل ظروف غير تغيير طبيعة، كانت مطلية خلايا NSC34 untransfected إلى ثلاث لوحات 15 سم في 1 × 10 7. بعد مرور أربع وعشرين ساعة، وجرفت المياه خلايا متكدسة في برنامج تلفزيوني و lysed في 1 مل الجليد الباردة NP-40 العازلة تحلل (انظر 27 وصفة). ثم إزالة قسامة 100 ميكرولتر لاستخدامها بوصفها جزء مدخلات المركزة. وقدم حجم NSC34 المحللة تصل إلى 10 مل، وكان هذا الانقسام إلى اثنين من الكسور. جزء 1 يمثل مجموع المحللة الخلية، في حين تم طرد جزء 2 في 000 13 غرام لمدة 5 دقائق وطاف إزالة لاستخدامها بوصفها جزء القابلة للذوبان. ثم تم تقسيم كل من الكسور الى مزيد من 2.5 مل عينات لإيجابية / تحكم المشترك immunoprecipitations. ثم أضاف مكافحة atlastin أو مصل بولكلونل المضادة للspastin ل+ كسور في 1/100، في حين تم ادراج مكافحة GFP (ab290 Abcam) الأجسام المضادة للسيطرة على الكسور. ثم تم تحضين الكسور على طاولة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. بعد حضانات الضد، تم إضافة 200 ميكرولتر من الطين 50٪ من البروتين-A حبات سيفاروز (سيغما) في NP-40 العازلة تحلل لجميع الكسور وحضنت بين عشية وضحاها على طاولة هزاز في 4 درجات مئوية. بعد حضانات البروتين الأجسام المضادة المعقدة، تم عزل بروتين-A حبات سيفاروز بواسطة الطرد المركزي وجيزة ثم تغسل خمس مرات لمدة 20 دقيقة في 10 مل NP-40 العازلة تحلل. ثم إزالة طاف غسل النهائي وكان معلق حبات في 2 × SDS-PAGE عينة العازلة. ثم تم إجراء SDS-PAGE وimmunoblotting نفذت مع أمصال مضادة المناسب.
لخلايا HEK293T عابر.، كانت مطلية الخلايا إلى قسمين 15 سم وحات في 1 × 10 7، وبعد 24 ساعة، خلايا وشارك transfected مع atlastin-GFP وMYC spastin أو pEGFP وMYC spastin. بعد أربع وعشرين ساعة ترنسفكأيشن، كانت هي lysed الخلايا في 1 مل الجليد الباردة العازلة تحلل، وقسامة 100 ميكرولتر إزالة لاستخدامها بوصفها جزء مدخلات المركزة. ثم تم معالجة الخلايا كما هو موضح لخلايا NSC34. تمت إضافة الجسم المضاد بولكلونل مكافحة GFP (Abcam ab290) ل+ الكسور الأجسام المضادة في 1/1000، و+/- ثم تم تحضين الكسور الأضداد على طاولة هزاز في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. وأجري مزيد من المعالجة بها في وقت سابق.
تم استخدام البروتوكول المعدل ل-immunoprecipitations شارك نفذت في ظل ظروف تغيير طبيعة. وقد أجريت هذه التجارب في الخلايا NSC34 باستخدام ظروف تغيير طبيعة في وجود الكيميائي عبر رابط DSP (بيرس). تم حصاد الخلايا NSC34 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 م م DSP وحضنت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. 1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.5، وأضيف إلى تركيز النهائي من 10 م م لإرواء النشاط DSP وحضنت الخلايا لمدة 15 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. ومعلق الخلايا في 100 ميكرولتر لكل 1 × 10 7 خلايا تغيير طبيعة العازلة تحلل تحتوي على 1٪ SDS، 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 5 م م EDTA، الدناز الأول (سيغما) ومثبطات الأنزيم البروتيني (روش). ثم تم تخفيفه المحللة التشويه والتحريف إلى غير تغيير طبيعة العازلة تحلل تحتوي على 1٪ تريتون X-100، 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 300 م م كلوريد الصوديوم، 0.5 م م EDTA ومثبطات الأنزيم البروتيني إلى تركيز النهائي من 0.1٪ SDS. تم تطهير الكلي المحللة الخلية بواسطة الطرد المركزي في 000 دورة في الدقيقة 13 لمدة 10 دقيقة والإبقاء على جزء قابل للذوبان. تم precoupled الخرز البروتين-A سيفاروز إلى 20 ميكروغرام من مكافحة atlastin (5409) الأجسام المضادة بولكلونل وإلى عنصر تحكم الضد زائف (مكافحة GFP Abcam 6556)، في وجود DSP. وتطفأ النشاط DSP مع 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، في وقت سابق. ثم تم المضافة إلى جانب الأجسام المضادة الخرز البروتين-A سيفاروز إلى الخلية لست] القابلة للذوبان. سمح مجمعات للمستضد لتشكيل عند 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. وكانت حبات ثم معزولة وغسلها عدة مرات في حالة عدم تغيير طبيعة العازلة تحلل. تم المشقوق DSP عبر ربط بإضافة SDS-PAGE عينة العازلة التي تحتوي على 5٪ β المركابتويثانول عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والبروتينات تم حلها بواسطة SDS-PAGE.

البروتين GST الانصهار التجارب المنسدلة

تم غسلها الخرز الجلوتاثيون-سيفاروز (أمرشام العلوم البيولوجية) في منطقة عازلة المنسدلة التي تتألف من 1٪ NP-40 و PBS حل مع مثبطات الأنزيم البروتيني (أقراص كوكتيل الكامل البسيطة مثبط البروتياز، روش التشخيص) وتتكون لالطين 50٪ في هذا المخزن المؤقت. و transfected خلايا هيلا عابر مع بنيات ناقلات التعبير عن الموسومة حاتمة spastin أو atlastin، وذلك باستخدام مجموعة Effectene ترنسفكأيشن (QIAGEN)، كما هو موضح سابقا. تم حصاد الخلايا 24-48 ساعة بعد ترنسفكأيشن في غسل العازلة وتجميد / إذابة إلى -20 ° C.
تألف رد فعل المنسدلة 50 ميكرولتر من 50٪ الخرز الجلوتاثيون-سيفاروز، 500 العصارة الخلوية الخلية ميكروغرام و 100 ميكروغرام البروتين GST الانصهار. وجاء إجمالي حجم ما يصل الى 0.5 مل في أنبوب 1.5 مل مع العازلة المنسدلة (1٪ NP-40، PBS، 5 م م MgCl 2 و 5 م م ATP). سيطرة سلبية GST استخدمت مبلغ-متساو المولي من البروتين GST. وحضنت الأنابيب عند 4 درجات مئوية على الدورية بين عشية وضحاها عجلة القيادة. وقد نسج الخرز في 13 000 لمدة 15 ق في أعلى الطرد المركزي مقاعد البدلاء ثم تغسل مع 1 مل من العازلة. وتكررت هذه الدورة أربع مرات. قبل غسل الرابع، تم نقل مزيج المنسدلة لتنظيف أنابيب 1.5 مل للقضاء على أي ممكن ملزمة من البروتين إلى داخل أنبوب من البلاستيك. ومزال بروتين منضمة إلى حبات بعد أربعة دورات الغسيل / تدور مع 55 ميكرولتر من SDS عينة العازلة (188 م م تريس، 6٪ SDS، 30٪ الجلسرين، 0.03٪ برموفينول الأزرق، و 10٪ β المركابتويثانول، ودرجة الحموضة 6.8). تم تسخين العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم نسج على 000 13 سرعة في أعلى الطرد المركزي مقاعد البدلاء لمدة 15 ثانية. تم تحميل supernatants على 10٪ SDS-بولكرلميد هلام وimmunoblotted مع مكافحة MYC أو مكافحة GFP الأجسام المضادة الأولية حسب الاقتضاء.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #3  
قديم 11-22-2015, 08:48 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي Oligomerization، وجمعية غشاء من راثي مشلول الشلل النصفي 3A (SPG3A) البروتين Atlastin

 

http://www.jbc.org/content/278/49/49063.full

ملخص

تضم paraplegias تشنجي وراثي مجموعة من المتلازمات غير متجانسة سريريا تتميز أقل التشنج أقصى والضعف، مع انحطاط المحاور البعيدة في تصاعدي طويلة ومساحات تنازلي من الحبل الشوكي. ويتسبب في وقت مبكر بداية راثي تشنجي الشلل النصفي SPG3A عن طفرات في atlastin / الإنسان ملزم guanylate البروتين 3 الجين (التي أعيدت تسميتها هنا atlastin-1)، الذي رموز لأحد أفراد 64 كيلو دالتون من dynamin / MX / ملزم guanylate البروتين الفصيلة GTPases من الكبيرة. يتم ترجمة البروتين atlastin-1 في الغالب في الدماغ، حيث يتم تخصيبه في الخلايا العصبية الهرمية في قشرة الدماغ والحصين. في العصبونات القشرية مثقف، atlastin-1 شارك المترجمة أبرزها مع علامات من جهاز جولجي، وكشف الفحص المجهري immunogold الإلكترون توطين السائد للatlastin-1 إلى رابطة الدول المستقلة -Golgi. وأظهرت التحليلات الخميرة يومين الهجينة والدراسات المشارك مناعي أن atlastin-1 يمكن الزميلة الذاتي، وهلام الاستبعاد اللوني والدراسات عبر ربط الكيميائية أشارت إلى أن atlastin-1 موجود باعتباره قليل وحدات في الجسم الحي، وعلى الأرجح tetramer. كشفت تجزئة الغشاء والمقايسات حماية البروتيني الذي atlastin-1 هو بروتين الغشاء لا يتجزأ مع توقع اثنين من المجالات عبر الغشاء. كل من يتعرض المجالات ملزم GTP وC-محطة N-الطرفية إلى السيتوبلازم. معا، وهذه النتائج تشير إلى أن بروتين SPG3A atlastin-1 هو multimeric لا يتجزأ GTPase الغشاء الذي يمكن أن تشارك في ديناميات غشاء جولجي أو الاتجار حويصلة.
القسم السابق القسم التالي
paraplegias تشنجي وراثي (شركائنا HSPs) 1 هي مجموعة من الاضطرابات العصبية تتميز بشكل رئيسي من قبل التشنج التدريجي وضعف في الأطراف السفلية (1 - 5). وعادة ما تظهر انحطاط محور عصبي في الأجزاء البعيدة من تصاعدي طويل الألياف العمود الظهري وتنازلي مساحات القشري من الحبل الشوكي، والتي تشكل أطول الحركية والحسية المحاور في النظام العصبي المركزي (6). تاريخيا تم تصنيفها شركائنا HSPs بأنها "نقية" أو "غير معقدة" في حالة حدوث الشلل النصفي التشنجي في عزلة و "معقدة" في حالة وجود تشوهات عصبية أخرى (7). وفي الآونة الأخيرة، يسمح بتحديد مواضع جينية جديدة لشركائنا HSPs تصنيف الجزيئي شركائنا HSPs (+2 - +5). من 20 مواضع معروفة (SPG1-20)، 11 هي مرض وراثي جسمي، ستة هي مقهورة، والثلاثة هم X-ربط. على الرغم من أن معظم المرضى HSP تجربة التدريجي تفاقم الأعراض، وبالنسبة للبعض، لا يظهر هذا الاضطراب أن تكون تقدمية (3، 4). وهكذا، على الرغم من أن بعض شركائنا HSPs بشكل واضح الاضطرابات العصبية (مثل SPG4)، والبعض الآخر مثل SPG1 (بسبب طفرات في L1 جزيء التصاق الخلية) وSPG3A (بسبب طفرات في GTPase atlastin) قد يكون من اضطرابات النمو العصبي (3، 4).
وقد تم تحديد ثمانية جينات المرض لشركائنا HSPs. واستنادا إلى البروتينات المعنية، وقد تقدمت عدة آليات المرضية. وتشمل هذه الإشارات الشاذة خلية أو الهجرة، تشوهات مرافقين الميتوكوندريا، شذوذ تكون الميالين، وعيوب في الاتجار داخل الخلايا والنقل (+2 - 5). البروتينات المتحورة في شركائنا HSPs التي تورطت في البروتين الخلوي أو الاتجار حويصلة تشمل KIF5A (SPG10)، spastin (SPG4)، spartin (SPG20؛ متلازمة تروير)، وatlastin (SPG3A) (استعراضها في المرجعان +2 - 5). KIF5A هو كينيسين العصبية السلسلة الثقيلة بروتين السيارات تشارك في نقل الجزيئات والعضيات غشائي على طول محور عصبي (8). Spastin، وهو عضو في AAA (لA TPases على ssociated مع مجموعة متنوعة من الأنشطة المحددة الخلوية) أسرة البروتين، الزميلة مع الأنابيب الدقيقة، وoverexpression spastin يسبب أنيبيب التفكيك (9). البروتين spartin يشبه VPS4، SNX15 (ق ن ه س ORTING IN-15)، وSKD1 البروتينات، التي تشارك في التشكل الاندوسوم والاتجار البروتين حجرات endosomal (10). شارك هذه البروتينات الأخيرة مع كل من spastin وspartin منطقة تسمى معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (الواردة في م icrotubule- ط nteracting ور rafficking الجزيئات) أو ESP (موجود في E nd13 / VPS4، S NX15، وP ALB) المجال (2، 11) . واستنادا إلى تشابهه مع أعضاء dynamin / MX / بروتين ملزمة guanylate (GBP) الفصيلة من GTPases كبيرة (12)، وatlastin البروتين SPG3A (التي أعيدت تسميتها هنا atlastin-1) وقد تورط في الاتجار داخل الخلايا، ولكن لا يعرف إلا القليل فيما يتعلق توطين الخلوية أو وظيفة (13).
بين شركائنا HSPs، SPG3A الجدير بالذكر بشكل خاص لبداية مبكرة جدا من الشلل النصفي التشنجي النقي. 1 atlastin تم الابلاغ عن خمسة الطفرات مغلطة واحد الإدراج قاعدة واحدة مع إنهاء السابق لأوانه توقع 558 الأحماض الأمينية المنطقة الترميز من (13 - 16). وكان قد تردد أن هذه الطفرات قد يغير هيكل، والتفاعلات، أو النشاط GTPase من atlastin-1 (+13 - +16). أعضاء من dynamin / MX / GBP الفصيلة، atlastin-1 هو الأكثر مشابهة لجيجابايت في الثانية. مثل جيجابايت في الثانية، atlastin-1 تمتلك حلقة RD بدلا من الكلاسيكي (N / T) تسلسل K X D داخل عزر الثالث من ثالوث الإجماع الملزم guanylate (13). ومع ذلك، atlastin-1 تفتقر إلى isoprenylation عزر-C محطة و-C محطة α12 / 13 الحلزون عزر، واثنين من السمات الهيكلية المميزة للعديد من جيجابايت في الثانية (12). هنا، علينا أن نبرهن على atlastin-1 هو GTPase بلازميدة قليلة القسيمات التي، على عكس جيجابايت في الثانية، وتتألف من وحدات فرعية التي هي بروتينات الغشاء لا يتجزأ، مع كل من N و C تيرميني تتعرض للمقصورة حشوية. Atlastin-1 يموضع بشكل بارز إلى جهاز جولجي وأثرت في الخلايا الهرمية القشرية الدماغية، جزء من السكان من الذي يحمل على "axonopathy طويلة" في المرضى الذين يعانون من SPG3A.

إجراءات تجريبية

وقد تم تحديد تسلسل Analysis- Atlastin-1 homologs مع انفجار (17). وقدمت تعيينات الكروموسومات باستخدام NCBI خريطة عارض. 2 الغشاء وتوقع المجالات حلزونية باستخدام نظام SOSUI (18). أجريت التحالفات البروتين مع ClustalW (19). حسبت التشابه تسلسل البروتين باستخدام تحليل BESTFIT (ولاية ويسكونسن الإصدار رزمة 10.3، Accelrys، سان دييغو، CA).
حقيقية النواة التركيبات التعبير الخلايا والحمض النووي Transfection- تسلسل الترميز الكامل للGTPase atlastin-1 (بنك الجينات ™ / بنك الإمارات الدولي رقم انضمام NM_015915 تم تضخيمه) من خلال PCR باستخدام PFU توربو (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا) من الدماغ البشري ماراثون (القشرة المخية ) مكتبة كدنا] (Clontech) وأكده تسلسل الحمض النووي. تم استنساخ [كدنا] بالطول atlastin-1 إلى موقع XmaI من حقيقية النواة pGW1 ناقلات التعبير مع Myc على أو هيماغلوتينين (HA) علامات حاتمة في محطة N كما هو موضح سابقا (20). تم استنساخ كامل طول atlastin-1 [كدنا أيضا في موقع XmaI من pRK5 (جينينتيك، جنوب سان فرانسيسكو، CA) للتعبير عن بروتين غير محدد. Torsin A (رقم القيد AF007871 تم استنساخ) مثل جزء HindIII-BglII إلى pGW1، الذي يسبق-C محطة Myc على العلامة في الإطار. تم تنفيذ موقع الموجه الطفرات باستخدام طريقة QuikChange (Stratagene). خلايا القرد الأخضر COS-7 الأفريقية (أمريكا نوع الثقافة مجموعة CRL-1651) تم الحفاظ عليها، transfected، وتحصد كما هو موضح سابقا (20).
Antibodies- الأجسام المضادة الانجذاب تنقية ضد بقايا 18/01 (رقم 5409؛ MAKNRRDRNSWGGFSEKTC-أميد) و544-558 (رقم 4735؛ أسيتيل CTPKSESTEQSEKKKM-OH) للأعدت atlastin-1 تجاريا (بيوسورس الدولية، هوبكينتون، MA) ، مع cysteines محطة تضاف إلى تسهيل اقتران. تم إعداد الأجسام المضادة أيضا ضد بقايا 947-960 (رقم 5174؛ أسيتيل CEKLDAFIEALHQEK-OH) من OPA1 البشرية / Mgm1 (بنك الجينات ™ / بنك الإمارات الدولي رقم انضمام NM_ 015560) (21، 22). وكانت الماوس وحيدة النسيلة المضادة للMyc على (9E10)، الأرنب بولكلونل مكافحة HA التحقيق (Y-11)، والماعز المضادة للcalregulin (T-19) الأجسام المضادة من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز، كاليفورنيا). الأرنب بولكلونل لمكافحة الصمم-خلل التوتر / وصفت البروتين 1 (DDP1) الأجسام المضادة TIMM8a سابقا (20). وكانت الماوس وحيدة النسيلة المضادة للcalnexin (مفتش 1)، ومكافحة GM130 (مفتش 1)، ومكافحة P115 (مفتش 1) الأجسام المضادة من Pharmingen. وكانت الماوس وحيدة النسيلة أضداد KDEL (استنساخ 10C3، مفتش 2A) من Stressgen في مجال التكنولوجيا الحيوية شركة (فكتوريا، كولومبيا البريطانية، كندا). تم الحصول على الماوس وحيدة النسيلة المرتبطة مكافحة أنيبيب البروتين-2 الأجسام المضادة (استنساخ HM-2، الماوس استسقاء) من سيجما.
وقد تم الحصول على الأنسجة إعداد والتحت خلوية Fractionation- الخليط الأنسجة البشرية من Clontech. أعدت الدماغ الكسور التحت خلوية من الفئران سبراغ داولي (150-175 غرام؛ مختبرات نهر تشارلز، ويلمنجتون، MA). والمتجانس العقول تشريح في 0.32 متر السكروز و 10 HEPES م م (7.4 درجة الحموضة) وطرد في 1330 × ز لمدة 3 دقائق، وتوليد بيليه (P1) وطاف (S1). تم طرد طاف S1 في 21200 × ز لمدة 10 دقيقة، مما ينتج عنه بيليه (P2) وطاف (S2). وبعد ذلك طرد طاف S2 في 200،000 × ز لمدة 1 ساعة، وتوليد بيليه P3 وطاف S3. تم تحديد تركيزات البروتين مقايسة BCA (بيرس) مع ألبومين المصل البقري كمعيار.
تم حل هلام الكهربائي وImmunoblotting- البروتينات بواسطة SDS-PAGE على 10 أو 14٪ والمواد الهلامية الأكريلاميد ونقل electrophoretically إلى النيتروسليلوز (Hybond ECL، أمرشام العلوم البيولوجية). بعد حجب مع الحليب الخالي 5٪، 0.1٪ توين 20، والمالحة تريس مخزنة (الرقم الهيدروجيني 7.4) بين عشية وضحاها، وأضيفت الأجسام المضادة (0،1-1،0 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة عند 25 ° C. بعد عدة غسلات مع 0.1٪ توين 20 و المالحة تريس مخزنة، الفجل-البيروكسيديز مترافق الأجسام المضادة الثانوية (1: 3000 تخفيف؛ أمرشام العلوم البيولوجية) وأضيفت لمدة 30 دقيقة. أخيرا، وبعد عدة يغسل مع العازلة حظر، تليها المالحة تريس مخزنة، تم الكشف عن البروتينات مناعيا باستخدام النهضة تعزيز كاشف التوهج (PERKINELMER علوم الحياة).
تم perfused Immunohistochemistry- ثلاثة الذكور البالغين سبراغ داولي الفئران (150-200 ز) transcardially تحت التخدير بنتوباربيتال العميق مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم في 0.1 م العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة)، تليها 4٪ لامتصاص العرق، وأخيرا 10٪ سكروز في 0.1 م الفوسفات العازلة. العقول وظيفة ثابتة لمدة 1 ساعة وحضنت بين عشية وضحاها في الفوسفات مخزنة 30٪ سكروز. وبعد ذلك وضعت العقول على مشراح تجميد ومقطعة إلى المادتين 50 ميكرون سميكة. وقد تم جمع هذه المقاطع في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) وتخزينها في -20 درجة مئوية في حل واق من البرد وتتألف من 30٪ سكروز و 30٪ جلايكول الإثيلين في 0.05 م العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.2) حتى استخدامها.
وقد أجريت رد الفعل المناعى من استخدام عدة ABC النخبة (ناقلات مختبرات، وشركة، بورلنجام، CA) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم preincubated المقاطع في 1.0٪ مصل الماعز العادي (خ ع)، 10٪ ألبومين المصل البقري، وبرنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية ثم حضنت لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة لمكافحة atlastin-1 (رقم 5409؛ 0.7 ميكروغرام / مل) في 0.1٪ NGS، 1٪ ألبومين المصل البقري، وبرنامج تلفزيوني. في تجارب السيطرة، وpreincubated المضادة للatlastin-1 الأجسام المضادة (رقم 5409) مع الببتيد مناعة (0.25 μ م) قبل استخدامها. وثم تشطف الأقسام مع برنامج تلفزيوني وحضنت مع مفتش المعقدة البيروكسيديز المضادة للأرنب (ناقلات مختبرات، وشركة) في برنامج تلفزيوني مع 1.5٪ NGS لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية. بعد الشطف مع PBS، حضنت المقاطع مع مجمع ABC (ناقلات مختبرات، وشركة) لمدة 45 دقيقة وتشطف مرة أخرى. تم الكشف عن الغلوثانيون تلطيخ باستخدام 3،3'-diaminobenzidine (مجموعة DAB سريعة، سيغما). وقد شنت المقاطع على Superfrost زائد الشرائح (فيشر)، المجففة، وcoverslipped مع Cytoseal 60 (ستيفنز العلمي، ريفرديل، NJ) المجفف في الهواء.
وأعدت العصبية الثقافة وImmunocytochemistry- الابتدائية ثقافات العصبونات القشرية الفئران الجنينية من الأجنة يوم 18 الفئران وصيانتها كما هو موضح سابقا (23). بعد 6 أيام في الثقافة، تم إصلاح الخلايا العصبية مع 4٪ الفورمالديهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية. غسلها عدة مرات مع برنامج تلفزيوني. ثم permeabilized ومنعت لمدة 30 دقيقة في 5٪ NGS، 0.2٪ سابونين، وبرنامج تلفزيوني. وحضنت الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة ضد atlastin-1 (رقم 5409 و 10 ميكروغرام / مل)، وأنيبيب المرتبطة بروتين-2 (1: 200 تمييع)، P115 (0.5 ميكروغرام / مل)، GM130 (0.5 ميكروغرام / مل)، أو KDEL (1.9 ميكروغرام / مل) في 3٪ NGS، 0.05٪ سابونين، وبرنامج تلفزيوني. بعد غسل ثلاث مرات مع PBS، حضنت الخلايا مع اليكسا فلور 488- واليكسا فلور الأجسام المضادة الثانوية 568-مترافق (1: 500 التخفيف؛ المسابر الجزيئية، وشركة، يوجين، OR) في 3٪ NGS، 0.05٪ سابونين، وPBS لمدة 30 دقيقة، تليها ثلاث يغسل مع برنامج تلفزيوني. وكانت Coverslips ثم شنت باستخدام هلام / جبل (Biomeda، فوستر سيتي، كاليفورنيا). تم الحصول على صور الفلورسنت مع المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر زايس Axiovert 100M ومعالجتها مع برنامج أدوبي فوتوشوب.
أعدت Immunogold الكترون Microscopy- الفئران الثقافات الخلايا العصبية القشرية كما هو موضح أعلاه. بعد 6 أيام في الثقافة، تم إصلاح الخلايا العصبية مع بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات (7.4 درجة الحموضة) لمدة 30 دقيقة ثم يغسل مع العازلة 0.1 م الفوسفات. تم permeabilized الخلايا ومنعت في 5٪ NGS، 0.1٪ سابونين، وبرنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة وحضنت مع مكافحة atlastin-1 الأجسام المضادة (رقم 5409) أو بدون الأجسام المضادة الأولية كعنصر تحكم في عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة. بعد غسل مع 1٪ NGS في برنامج تلفزيوني مع 2٪ الحليب الخالي في برنامج تلفزيوني، وحضنت الخلايا مع 1.4 نانومتر Nanogold الذهب مترافق المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية (1: 250 التخفيف؛ Nanoprobes، Yaphank، NY) في 2٪ الحليب الخالي في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. بعد غسل مع 2٪ الحليب الخالي في برنامج تلفزيوني، تم إصلاح الخلايا مع 2٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. وأخيرا، فإن خلايا غسلها جيدا مع PBS والماء المقطر، محسنة الفضة (HQ طقم فضة، Nanoprobes)، وغسلها مرة أخرى بالماء و 0.1 م العازلة الفوسفات. تم علاج الخلايا مع 0.2٪ أوسو 4 في 0.1 م العازلة الفوسفات لمدة 30 دقيقة، mordanted ككل مع 0.25٪ خلات اليورانيل في المخزن خلات (الرقم الهيدروجيني 5.0) بين عشية وضحاها، وغسلها والمجففة مع تركيزات المسلسل من الإيثانول، وأخيرا تسلل وجزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي. أقسام رقيقة من ~70 نانومتر كانت counterstained مع خلات اليورانيل وسترات الرصاص وفحصها تحت المجهر الإلكتروني JEOL 1200 نقل EXII. وقد تم جمع الصور الرقمية مع كاميرا XR-100 CCD (تقنيات متقدمة الميكروسكوب، دانفرس، MA).
جمعية غشاء Assays- COS-7 خلايا overexpressing تم غسلها atlastin-1 مرتين مع 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) ومن ثم تحصد في 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 10 م م كلوريد الصوديوم، و 1.5 م م MgCl 2. بعد مرور عدة من خلال إبرة عيار 25، وطرد جناسة في 1330 × ز. كان sonicated طاف ما بعد النووي ومن ثم recentrifuged في 200،000 × ز لمدة 60 دقيقة، مما أسفر عن بيليه (هي lysed جزء الغشاء) وجزء للذوبان. كان يعالج جزء الغشاء مع 1 م كلوريد الصوديوم و 25 م عازلة م الفوسفات (7.4 درجة الحموضة)، مع 100 متر عازلة م الجلايسين (درجة الحموضة 2.8)، مع 100 متر عازلة م كربونات (درجة الحموضة 11.0)، مع 0.1٪ تريتون X-100 و PBS، أو مع 1.0٪ deoxycholate الصوديوم وPBS كما هو مبين وطرد على 200،000 × ز لمدة 60 دقيقة لتوليد بيليه النهائي وطاف. في تجارب أخرى، أعدت كسور قابلة للذوبان وغشاء من COS-7 خلايا overexpressing Myc على الموسومة البرية من نوع atlastin-1 أو مختلف MYC الموسومة atlastin-1 بنيات الحذف. ثم تم immunoblotted بنسب متساوية من الكسور القابلة للذوبان والغشاء مع أضداد Myc على. تعرض الأغشية من الخلايا COS-7 overexpressing لازال الكسور atlastin-1 و غشاء P3 أعدت من دماغ الفئران للتخلص التقسيم مع تريتون X-114 كما وصفها برودييه (24)، وبنسب متساوية من مائي والمنظفات مراحل تم immunoblotted مع anti -atlastin-1 الأجسام المضادة (رقم 5409).
1 atlastin تم غسلها البروتيني الهضم وDeglycosylation Assays- COS-7 خلايا overexpressing غير محدد مرتين مع 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) ومن ثم جمعها في 10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 10 م م كلوريد الصوديوم، 1.5 م م MgCl 2، و 10٪ سكروز. صدرت الخلايا من خلال إبرة عيار 25، وطرد جناسة في 3000 × ز لمدة 3 دقائق. تم تجاهل بيليه، وطرد طاف في 130،000 × ز لمدة 60 دقيقة. كان معلق هذا بيليه الأخير في المخزن نفسه مع أو بدون بروتين K (EC 3.4.21.64؛ سيغما) في أي من 50 μ م (30 دقيقة، 25 ° C) أو 200 μ م (15 دقيقة، 37 ° C). أنهيت ردود الفعل مع 2 م م phenylmethylsulfonyl الفلورايد، يليه مباشرة تحلل في SDS-PAGE عينة العازلة. ثم تم immunoblotted العينات مع الأجسام المضادة ضد محطة C (رقم 4735) أو N محطة (رقم 5409) من atlastin-1 أو مع أضداد calregulin. تم تنفيذ كما هو موضح سابقا (؛ deglycosylation بروتين الببتيد مع N -glycosidase F (نيو إنجلاند Biolabs شركة، بيفرلي، MA EC 3.5.1.52) 25).
أجريت الخميرة ثنائي هجين الخميرة Tests- الاختبارين الهجين باستخدام الخميرة سلالة L40 إيواء الجينات مراسل HIS3 وβ غالاكتوزيداز تحت سيطرة مواقع ملزم LexA المنبع كما هو موضح سابقا (20). أنتجت Atlastin-1 بنيات الحذف بواسطة PCR التضخيم باستخدام PFU توربو واستنسخ في الإطار إلى pGAD10 الفريسة وpBHA ناقلات الطعم (Clontech). وقد أكد كل بنيات من تسلسل الحمض النووي. كان يعاير قوة التفاعل من قبل بيتا غالاكتوزيداز وHIS3 الاستقراء كما هو موضح سابقا (20).
الخلايا COS-7 مناعي والكيميائية عبر linking- شارك transfected مع HA- وMyc على-atlastin-1 أو مع transfected Myc على-atlastin-1 تم غسلها وحدها مرتين مع برنامج تلفزيوني ثم تحصد في 0.5٪ تريتون X-100 و PBS و وأوضحت بواسطة الطرد المركزي في 130،000 × ز لمدة 30 دقيقة. وحضنت مقتطفات (100 ميكروغرام من البروتين) لمدة 1-2 ساعات في 4 درجة مئوية مع 5 ميكروغرام من أرنب بولكلونل مكافحة HA الأجسام المضادة التحقيق (Y-11) إلى جانب مسبقا إلى البروتين A-سيفاروز CL-4B (أمرشام العلوم البيولوجية). تم غسلها حبات ثلاث مرات مع 0.5٪ تريتون X-100 و PBS. تم حل البروتينات ملزمة SDS-PAGE وimmunoblotted مع الماوس وحيدة النسيلة المضادة للأضداد Myc على. تم إجراء الكيميائية مع dithiobis (succinimidyl بروبيونات) ربط الصليب (بيرس) باستخدام الكريات سرعة عالية من طاف بعد النووي المستمدة من Myc على-atlastin-1-overexpressing الخلايا COS-7. تمت إضافة الكريات ومعلق في برنامج تلفزيوني، وdithiobis (succinimidyl بروبيونات) لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم حل المنتجات المرتبطة الشاملة التي SDS-PAGE تحت ظروف امختزل وimmunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على.
هلام استبعاد FPLC- Myc على الموسومة من النوع البري أو حذف المسوخ من atlastin-1 overexpressed في COS-7 خلايا كانت هي lysed في 0.1٪ تريتون X-100 و PBS وأوضحت بواسطة الطرد المركزي في 130،000 × ز لمدة 30 دقيقة. تم تطبيق استخراج القابلة للذوبان إلى Superdex 200 HR10 / 30 FPLC العمود (أمرشام العلوم البيولوجية) بمعدل تدفق 0،25 مل / دقيقة في 0.1٪ تريتون X-100 و PBS. تم جمع الكسور (0.25 مل)، وحلت البروتينات بواسطة SDS-PAGE ثم immunoblotted باستخدام أجسام مضادة لمكافحة Myc على. تم تطبيق معايير البروتين (سيغما وأمرشام العلوم البيولوجية) في 0.1٪ تريتون X-100 و PBS إلى العمود لتوليد منحنى القياسية، والتي تم حساب الجماهير الجزيئية الأم لمن النوع البري وطفرات حذف atlastin-1.
GTPase آخر Assays- وكدنا] atlastin-1 وsubcloned إلى pCAL-N-EK لإنتاج ملزم كالمودولين الببتيد (CBP) البروتينات الانصهار (Stratagene). وكان المستحث التعبير عن CBP-atlastin-1 في القولونية BL21 (DE3) من خلال 100 μ M-الآيزوبروبيل β- د -thiogalactopyranoside ل 4.5 ساعة عند 25 ° C. بعد التكوير، ومعلق الخلايا في 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 150 م م كلوريد الصوديوم، 5 م م MgCl 2، 2 م م CaCl 2، 10٪ الجلسرين، 10 م م β المركابتويثانول، 1.0٪ تريتون X وأوضح -100، و 0.5 م م phenylmethylsulfonyl الفلورايد وتمزق من قبل اثنين من الممرات من خلال خلية الضغوط الفرنسية على 10000 رطل استخراج بواسطة الطرد المركزي في 50000 × ز لمدة 30 دقيقة ومن ثم تطبيقها على الراتنج كالمودولين تقارب (Stratagene). بعد غسل مع 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 150 م م كلوريد الصوديوم، 5 م م MgCl 2، 2 م م CaCl 2، 10 م م β المركابتويثانول، و 0.1٪ تريتون X-100، وكانت البروتينات الانصهار ملزمة مزال مع 50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 150 م م كلوريد الصوديوم، و 10 م م β المركابتويثانول، 2 م م EGTA، و 0.1٪ تريتون X-100. كان مدال-تنقية تقارب CBP-atlastin-1 انصهار بروتين ضد عازلة فحص (20 م م HEPES (درجة الحموضة 7.2)، 2 م م MgCl 2، و 1 م م dithiothreitol). وشمل خليط التفاعل لفحص GTPase مدال CBP-atlastin-1 مع 0.05٪ ألبومين المصل البقري و0.825 μ م [α- 32 P] GTP (3000 تسى / مليمول؛ ICN Biomedicals، إرفين، كاليفورنيا) في المخزن الفحص. وقد شوهدت عينات من خليط التفاعل عند نقاط زمنية مختلفة (0-60 دقيقة) على السليلوز polyethyleneimine على لوحات البوليستر TLC (سيغما). تم فصل النيوكليوتيدات جوانين التي كتبها تصاعدي اللوني في 1 م LiCl و 1.2 متر حمض الفورميك. و[32 P] الناتج المحلي الإجمالي، وحددت [32 P] البقع GTP، وكان كميا شدة باستخدام PhosphorImager والبرمجيات ImageQuant (أمرشام العلوم البيولوجية). وأعرب عن النشاط GTPase كنسبة من الناتج المحلي الإجمالي لمجموع النيوكليوتيدات جوانين (GTP + GDP) في كل نقطة زمنية.

النتائج

Atlastin عائلة GTP ملزم Proteins- بحثنا النوكليوتيدات والبروتين قواعد بيانات لبروتينات بشرية مماثلة لatlastin (التي أعيدت تسميتها atlastin-1) وجدت اثنين من البروتينات ذات الصلة للغاية (الشكل 1). واحد، والتي تم تحديدها سابقا ARL-6-التفاعل البروتين 2 (بنك الجينات ™ / بنك الإمارات الدولي رقم انضمام NM_022374)، أننا قمنا بتغيير اسم atlastin-2. الآخر قمنا اسمه atlastin-3 (انضمام عدد AK097588). في حين تم العثور على الجين atlastin-1 على 14q22.1 الصبغي (ID موضع 51062)، يموضع الجين atlastin-2 إلى 2p22.3 كروموسوم (ID موضع 64225)، وهذا الجين atlastin-3 إلى الكروموسوم 11q13.1 (ID مكان 25923). تظهر هذه البروتينات التماثل واسعة، مع نواة مركزية كبيرة من أعلى التشابه التي تضم منطقة ملزم GTP في الجزء N-المحطة. يحدث أكبر قدر من الاختلاف في C و N تيرميني (الشكل 1). هناك 69٪ الهوية الأحماض الأمينية و 79٪ تشابه بين atlastin-1 وatlastin-2 على 533 بقايا و 66٪ الهوية المركزية و 75٪ تشابه بين atlastin-1 وatlastin-3 على 476 المخلفات. Atlastin-2 والهوية atlastin-3 حصة 67٪ و 78٪ تشابه أكثر من 482 المخلفات. أيضا، توقع اثنين من اللوالب عبر الغشاء (SOSUI) (18 تم حفظها) في جميع البروتينات الثلاثة. باستخدام نفس البرنامج التنبؤ SOSUI، GBP1 البشري (عدد الانضمام NM_002053) والمتعلقة GTPase ماج 2 (عدد الانضمام M81128) عدم وجود أي توقع المجالات عبر الغشاء، بما يتفق مع التقارير السابقة (12). تسلسل توافق في الآراء بشأن N -linked بالغليكوزيل وMYB DNA ملزمة سابقا ذكرت لatlastin-1 (13) لا يتم حفظها في atlastin-2 وatlastin-3 (الشكل 1).

F IG. 1.
. عائلة Atlastin من البروتينات في البشر Atlastin (التي أعيدت تسميتها هنا atlastin-1 (ATL1)) هي مشابهة جدا لاثنين من البروتينات لدينا اسم atlastin 2 (ATL2، ويعرف أيضا باسم ARL-6-التفاعل البروتين 2) وatlastin-3 (ATL3 ). مظللة بقايا متطابقة في جميع البروتينات ثلاثة البرتقال، وتلك متطابقة في اثنين من البروتينات ثلاثة مظللة الأخضر. خطوط عريضة تشير إلى توقع المجالات عبر الغشاء. ومحاصر الزخارف ملزم GTP. النجمة للدلالة مواقع الطفرات مغلطة في المرضى الذين يعانون من SPG3A. يتم حفظها بشدة هذه المخلفات في atlastin-2 وatlastin-3. سهم يصادف موقع طفرة انزياح الإطار في عائلة واحدة مع SPG3A. مواقع توافق في الآراء بشأن N -linked بالغليكوزيل (#) والحمض النووي ملزم نطاق MYB (^) في atlastin-1 يشار؛ هي الحفاظ أيا من هذه في كل atlastin-2 وatlastin-3. A البديل من atlastin-3 مع الإدراج حمض 26-الأمينية التالية سر 74 (بنك الجينات ™ / بنك الإمارات الدولي رقم انضمام CAB56010) والبديل من atlastin-2 مع محطة رواية C (38 بقايا) التالية فال 545 (انضمام عدد AAM97342)، سواء الناتجة عن الربط البديلة، كما تم الإبلاغ عنها.

تحديد والتحت خلوية توطين Atlastin-1 بروتين ولدت أضداد الببتيد محددة ضد متباينة N (رقم 5409) وC (رقم 4705) تيرميني من atlastin-1. تم الكشف عن Atlastin-1 في ~64 كيلو دالتون على immunoblots من الخليط من COS-7 الخلايا، بما يتفق مع حجمها المتوقع، ولكن ليس في تلك الخلايا من untransfected (atlastin-1-overexpressing الشكل 2 A). وتم الحصول على نتائج مماثلة مع أضداد الببتيد التي أثيرت ضد كل من N (الشكل 2 A) وC (لا تظهر البيانات) تيرميني. تم الكشف عن Atlastin-1 أيضا في الخليط من أنسجة الفئران والدماغ البشري، مع عدم الرد عبر العصابات البروتين (الشكل 2 A). تم إلغاء إشارة مناعيا عندما preadsorbed الأجسام المضادة مع الببتيد مناعة (1 μ م) (لا تظهر البيانات). والأكثر ثراء Atlastin-1 في المخ، ولكن كان حاضرا أيضا في العديد من الأنسجة البشرية الأخرى في مستويات أقل من ذلك بكثير (الشكل 2 B). وعلى سبيل المقارنة، كان الميتوكوندريا البروتين الفضاء intermembrane DDP1 / TIMM8a توزيع الأنسجة أكثر تجانسا (الشكل 2 B). درسنا توطين التحت خلوية من atlastin-1 باستخدام الكسور الدماغ الفئران بواسطة الطرد المركزي التفاضلي (إعداد الشكل 2 C). وقد أثرى كلا atlastin-1 وهيولي باطني البروتين شبكية calregulin في جزء الميكروسومي P3. في المقابل، كان الميتوكوندريا البروتين OPA1 / Mgm1 الأكثر وفرة في بيليه P2، مع مستويات أقل من ذلك بكثير في جزء P3.

F IG. 2.
توطين التحت خلوية من atlastin-1. A، توصيف بولكلونل مكافحة atlastin-1 الأجسام المضادة. تم immunoblotted؛ لست] من همية transfected (10 ميكروغرام من البروتين / حارة) أو atlastin-1 (AT1) -transfected (5 ميكروغرام من البروتين) COS-7 الخلايا وكذلك الخليط الدماغ البشري والفئران (20 ميكروغرام من البروتين H) مع الأجسام المضادة ضد atlastin-1 (رقم 5409). وترد الهجرات المعايير الكتلة الجزيئية (في kilodaltons). B، توزيع الأنسجة من atlastin-1. جرى التحقيق مجموع الخليط (20 ميكروغرام / حارة) من الأنسجة البشرية المشار إليها مع الأجسام المضادة لمكافحة atlastin-1 (رقم 5409) أو معاداة DDP / TIMM8a (DDP1) ن خ الأجسام المضادة، على نحو سلس؛... كورونا، الهيكل العظمي C. تجزئة البيوكيميائية من atlastin-1. تم إعداد الكسور التحت خلوية من دماغ الفئران بواسطة الطرد المركزي التفاضلي (انظر "الإجراءات التجريبية" لمزيد من التفاصيل). تم immunoblotted الكسور (20 ميكروغرام من البروتين / لين) مع الأجسام المضادة لatlastin-1 (رقم 5409)، وهيولي باطني البروتين شبكية calregulin (Calreg)، والبروتين OPA1 الميتوكوندريا.

درسنا توطين الذاتية atlastin-1 في أقسام دماغ الفئران باستخدام الأجسام المضادة الناتجة ضد N محطة من atlastin-1 (رقم 5409) (الشكل 3). كانت خلايا immunopositive غاية الأكثر وفرة في الصفيحة V من القشرة الدماغية، بما في ذلك القشرة الحركية. على الرغم من أن سوما الخلايا العصبية وصفت بشدة، كانت ملطخة أيضا شجرة شجيري (الشكل 3، A-C). وكان القضاء المناعية عندما preadsorbed الأضداد المضادة للatlastin-1 لأول مرة مع الببتيد مناعة (الشكل 3 D). كان وضع العلامات أيضا بارز في قرن آمون، لا سيما في الخلايا العصبية الهرمية في CA1 CA3 و(الشكل 3، E و F). من ناحية أخرى، لم يكن هناك أي تلطيخ للكشف في المخيخ. على الرغم من مناعية قليلة كان حاضرا في المخطط، مع المناعية المعتدل يقتصر على جزء من السكان من الخلايا العصبية كوليني كبيرة، وتلطيخ أكثر قوة واضحا في الخلايا العصبية داخل اللوزة والعديد من النوى المهادية. 3 A عدد الخلايا في عدة نوى mesopontine، بما في ذلك substantia الظهرية المادة الرمادية في الدماغ بارس المكتنزة ومنطقة retrorubal، ملطخة باعتدال. 3

F IG. 3.
توطين Immunocytochemical من atlastin-1 في دماغ الفئران. A، atlastin-1 هو وفرة في الخلايا الهرمية في الصفيحة V من القشرة الدماغية. B و C والصور التكبير أعلى من هذه الخلايا الهرمية القشرية تظهر مناعية شديدة في سوما وشجرة شجيري . D، preadsorption من الأجسام المضادة لمكافحة atlastin-1 (رقم 5409) مع الببتيد مناعة القضاء على المناعية محددة في قشرة الدماغ (قارن مع B). E و F، الخلايا الهرمية في المنطقة CA1 من الحصين تظهر أيضا immunolabeling القوي للمقصورة somatodendritic. أشرطة النطاق = 200 ميكرومتر (A)، 50 ميكرون (B، D و E)، و 25 ميكرون (C و F).

لإنشاء توطين atlastin-1 على مستوى التحت خلوية، تم فحص مثقف الخلايا العصبية القشرية الدماغية باستخدام مزدوج التسمية المناعي. تم العثور Atlastin-1 تلطيخ أبرزها في سوما الخلية، مع تلطيخ ضعف في العمليات العصبية، التي تضم كلا من المحاور والتشعبات (الشكل 4). وقد شارك في توطين محدودة للغاية مع علامات للالشبكة الإندوبلازمية (أضداد KDEL)، وكان ينظر أي تداخل من atlastin-1 وضع العلامات مع الميتوكوندريا ملطخة MitoTracker CMXRos (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، P115، وهي علامة للحصول على جهاز جولجي، بإحكام شارك المترجمة مع atlastin-1 (الشكل 4، A-C). واعتبر المشاركة في توطين مع atlastin-1 أيضا مع علامة GM130 جولجي، ولكن بدرجة أقل (لا تظهر البيانات). تم حجب إشارة مناعيا atlastin-1 من قبل preadsorption من الأجسام المضادة مع الببتيد مناعة (لا تظهر البيانات). في التعرض أطول، كان ينظر منقط تلطيخ في التشعبات والمحاور (الشكل 4، D-F). ومع ذلك، كان هذا تلطيخ أقل كثافة بكثير من تلك التي شوهدت المرتبطة جهاز جولجي في خلايا الجسم العصبية.

F IG. 4.
. توطين التحت خلوية من atlastin-1 إلى جهاز جولجي بالنقر المزدوج التسمية المناعي يظهر هو المشارك توطين atlastin-1 المناعية (أحمر، A) مع P115 جولجي علامة (الأخضر؛ B). وأظهرت الصورة المدمجة في C. في التعرض أطول، خافت atlastin-1 المناعية (الأحمر؛ D) غير مرئية داخل التشعبات (الأسهم الصغيرة)، والتي تم تحديدها من قبل costaining مع المرتبطة مكافحة أنيبيب الأجسام المضادة بروتين-2 (الأخضر؛ E)، والمحاور (النصال ). يظهر الصورة المدمجة في F. الحانات النطاق = 20 ميكرومتر.

لتأكيد هيمنة جولجي من الذاتية atlastin-1 بروتين، درسنا توطين atlastin-1 في الخلايا العصبية القشرية مثقف من قبل immunogold المجهر الإلكتروني (الشكل 5). وفرة من العلامات immunogold زينت جهاز جولجي، في الغالب رابطة الدول المستقلة -Golgi صهاريج (الشكل 5، A و B). كان هذا وضع العلامات غير موجودة في أقسام التحكم التي تم حذف الأجسام المضادة الأولية (الشكل 5، C و D). واعتبر أي تلطيخ محددة في الميتوكوندريا أو في النواة.

F IG. 5.
توطين التحت خلوية من atlastin-1 إلى جهاز جولجي من قبل immunogold المجهر الإلكتروني. A و B، توطين atlastin-1 داخل جهاز جولجي، وخاصة رابطة الدول المستقلة -Golgi صهاريج. C و D، أقسام التحكم فيها الانتخابات التمهيدية المناهضة للatlastin- 1 antibodies were omitted. Scale bars = 500 nm ( A and C ) and 100 nm ( B and D ).

Atlastin-1 هل يتجزأ غشاء بروتين استنادا إلى نتائج تجزيء التحت خلوية وimmunolabeling، درسنا ما إذا atlastin-1 هو الغشاء لا يتجزأ أو بإحكام غشاء المرتبطة البروتين جولجي، ومقارنتها مع البروتينات المعروفة تحت مختلف الظروف استخراج الغشاء. Atlastin-1 overexpressed في الخلايا COS-7 تقسيم حصرا لكسر الغشاء، الذي كان قد هي lysed صوتنة للافراج عن البروتينات اللمعية القابلة للذوبان وتعرض لتنبيذ فائق (الشكل 6 A). والجدير بالذكر، تم العثور على نسبة كبيرة من البروتين للذوبان اللمعية calregulin في طاف، مؤكدا تحلل كفاءة microsomes ل. تم العثور على بروتين الغشاء لا يتجزأ calnexin حصرا في جزء الغشاء (الشكل 6 A). وقد تعرض هذا جزء الغشاء لمختلف الظروف استخراج (أي ملح عالية، وانخفاض درجة الحموضة، ودرجة الحموضة العالية، والمنظفات الصناعية) لتحديد ما إذا atlastin-1 هو بروتين الغشاء لا يتجزأ. Atlastin-1 تقسيم لطاف بطريقة مشابهة للبروتين الغشاء لا يتجزأ calnexin. لا atlastin-1 أفرج عنه ولا calnexin من جزء الغشاء مخازن درجة الحموضة منخفضة أو عالية، ولكن كلا atlastin-1 وcalnexin تم solubilized بكفاءة عن طريق المنظفات (الشكل 6 A). في المقابل، تم الإفراج عن جزء المرتبطة غشاء calregulin من الأغشية ليس فقط عن طريق المنظفات، ولكن أيضا من جانب كل من مخازن درجة الحموضة العالية والمنخفضة (الشكل 6 A). مرحلة التقسيم مع تريتون X-114 تظاهر توزيع atlastin-1 في الغالب إلى مرحلة المنظفات، في حين تم العثور على غشاء المرتبطة قابل للذوبان البروتين calregulin في المرحلة المائية (الشكل 6 B).

F IG. 6.
Atlastin-1 هو بروتين الغشاء لا يتجزأ. A، جمعية غشاء atlastin-1. و transfected COS-7 الخلايا مع غير محدد atlastin-1. Atlastin-1 مجزأة في غشاء الكرية هي lysed (Memb)، ولكن ليس جزء عصاري خلوي للذوبان (سول) المستمدة من ارتفاع الطرد المركزي سرعة طاف ما بعد النووي (Homog)، والكشف عنها من قبل immunoblotting مع مكافحة atlastin-1 الأجسام المضادة. كان معلق هذا بيليه في وقت لاحق في أملاح المحددة أو المنظفات ثم refractionated عن ارتفاع الطرد المركزي بسرعة إلى طاف (S) وبيليه غشاء (P). وأطلق سراح Atlastin-1 من الأغشية بطريقة مشابهة لغشاء لا يتجزأ من البروتين calnexin، ولكن ليس للبروتين calregulin القابلة للذوبان وغشاء المرتبطة. DOC، 1.0٪ deoxycholate الصوديوم، TX-100، 0.1٪ تريتون X-100 B، تريتون X-114 مرحلة التقسيم. تم تقسيم الأغشية من atlastin-1 transfected-COS-7 الخلايا والفئران الدماغ الكسور P3 مع تريتون X-114 (TX-114)، وقسامات من المواد ابتداء من (المدخلات) وكذلك مائي والمنظفات (تريتون X-114) تم immunoblotted مراحل مع أضداد calregulin مكافحة atlastin-1 و. وقد أثرى Atlastin-1 في المرحلة المنظفات، في حين تم العثور على calregulin في المرحلة المائية. C، يطلب من المجالات مسعور من atlastin-1 للجمعية الغشاء. supernatants آخر النووية من COS-7 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع ومجزأة من النوع البري atlastin-1 أو حذف المسوخ كما هو موضح لMyc على الموسومة A وimmunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. حذف كل من توقع المجالات عبر الغشاء (H)، ولكن N- وC-محطة الحذف ليس أصغر، وانخفاض ملحوظ جمعية غشاء atlastin-1 (السهم). يشار إلى الأحماض الأمينية الحدود.

لتحديد ما إذا كان اثنين من المجالات مسعور في atlastin-1 تمثل المجالات عبر الغشاء، استخدمنا عدة Myc على الموسومة N- وC-محطة atlastin-1 الحذف لتقييم التوطين لطاف أو الكسور غشاء (الشكل 6 C). كان من النوع البري atlastin-1 موجودة في جزء الغشاء، ولم الحذف صغيرة في N وC تيرميني لا يغير من جمعية الغشاء بشكل ملحوظ (الشكل 6 C). ومع ذلك، توقع الحذف-C المحطة أن إزالة اثنين من المجالات عبر الغشاء، atlastin-1- (1-447)، تسبب في إعادة توزيع البروتين إلى جزء طاف (الشكل 6 C)، مشيرا إلى أن هذه المجالات المطلوبة للغشاء المرفق. كان A-C محطة 111 بقايا atlastin-1 جزء يحتوي على المجالات عبر الغشاء توقع (بقايا 448-558) كافية لجمعية غشاء (الشكل 6 C).
لتقييم طوبولوجيا عبر الغشاء من البروتين atlastin-1، استخدمنا الحويصلات الميكروسومي سليمة من COS-7 خلايا overexpressing atlastin-1 في مقايسة حماية البروتيني (الشكل 7 A). فقد مناعية لكلا N و C تيرميني على علاج microsomes ل مع بروتين K، على الرغم من أن تركيزات أعلى هناك حاجة لإزالة كاملة للنطاق N-محطة (الشكل 7 A). وتشير هذه النتائج التي يتعرض لها كل من N و C تيرميني لمواجهة حشوية من الغشاء. في تجارب السيطرة، كان calregulin البروتين اللمعية محمية تماما من التحلل البروتيني في نفس العينات (الشكل 7 A)، حتى بتركيزات أعلى من الأنزيم البروتيني (لا تظهر البيانات). وتمشيا مع هذا الاستنتاج هو أن تحور المواقع إجماع الثلاثة لN -linked بالغليكوزيل في atlastin-1 (N177Q، N236Q، وN436Q) لم يغير هجرة atlastin-1 على SDS-PAGE، ولم المعاملة مع الببتيد N - غليكوزيداز F (الشكل 7 B). في تجارب السيطرة، وبروتين سكري يعرف torsin ألف (26، 27) overexpressed في COS-7 خلايا وdeglycosylated بكفاءة عن طريق الببتيد N -glycosidase F (الشكل 7 B). وبالتالي، ليس لدينا أي دليل على أن هذه المواقع إجماع في atlastin-1 وN -glycosylated في الجسم الحي، بما يتفق مع دينا نموذج مقترح الغشاء طوبولوجيا (الشكل 7 C).

F IG. 7.
الغشاء طوبولوجيا atlastin-1. A، المقايسات حماية البروتيني. تركيزات المشار إليها (في ميكروغرام / مل) من بروتين K (بروت K أضيفت) لmicrosomes ل سليمة أعدت من COS-7 خلايا overexpressing غير محدد atlastin-1. تم immunoblotted العينات مع الأجسام المضادة ضد N (رقم 5409) أو C (رقم 4735) محطة من atlastin-1 أو مع أضداد calregulin. هاجر سليمة atlastin-1 في ~64 كيلو دالتون، وcalregulin سليمة (Calreg) في ~60 كيلو دالتون. سهام دلالة منتجات الهضم الجزئي. يشار إلى مناصب هجرة معايير الكتلة الجزيئية (في kilodaltons). B، لا atlastin-1 N -glycosylated. مقتطفات من COS-7 الخلايا معربا عن torsin A-Myc على أو Myc على الموسومة البرية من نوع atlastin-1 أو atlastin-1 مع الطفرات في المواقع إجماع الثلاثة لN -linked بالغليكوزيل (N177Q، N263Q، وN436Q؛ Glycos موت) وحضنت مع الببتيد N -glycosidase F (PNGase F) كما هو مبين وimmunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. لا الطفرات ولا الببتيد N -glycosidase F العلاج غيرت هجرة atlastin-1 من قبل SDS-PAGE. Torsin A-Myc على، وهو بروتين سكري معروف، وdeglycosylated التي كتبها الببتيد N -glycosidase F في ظل نفس الظروف. C، الهيكل التخطيطي المقترح atlastin-1 الغشاء طوبولوجيا.

Atlastin-1 هو بلازميدة قليلة القسيمات بروتين أعضاء dynamin / MX / GBP شكل الأسرة المجمعات البروتين وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الجسم الحي، وسعينا لتحديد ما إذا atlastin-1 أشكال oligomers كذلك. باستخدام الخميرة الاختبارين الهجين، اكتشفنا التفاعل القوي من كامل طول atlastin-1 مع نفسه (الشكل 8 A). كنا قادرين على تضييق المجالات المطلوبة للتفاعل الذاتي من قبل يحلل الحذف. وقد انخفض التفاعلات أو القضاء عليها مع كل من N- والحذف-C محطة (الشكل 8 A). أيضا، لم نجد رابطة بين المجالات بين عدة N- مختلفة وC-الطرفية يبني المجال (الشكل 8 A)، على الرغم من بين المجالات وضمجزيئي التفاعلات أثبتت للأعضاء الآخرين من dynamin / MX / GBP الفصيلة (12، 28 - 31). في التجارب المشتركة مناعي، تفاعلت Myc على-atlastin-1 مع HA-atlastin-1 (الشكل 8 B)، مما يدل على الارتباط الذاتي من atlastin-1 overexpressed في COS-7 الخلايا. وبناء على نتائج التجارب عبر ربط الكيميائية، ويبدو atlastin-1 الأكثر احتمالا أن يكون homotetramer، مع المنتجات في ~110، ~160، و~230 كيلو دالتون بالإضافة إلى الفرقة مونومر في 64 كيلو دالتون (الشكل 8 C) . باستخدام هلام استبعاد FPLC، وجدنا أن المنظفات solubilized atlastin-1 مزال في حجم الأصلي لل~280 كيلو دالتون، بما يتفق مع هيكل رباعي القسيمات المقترحة (الشكل 8 D). ومع ذلك، لأن عبر ربط atlastin-1 المنتج في ~230 كيلو دالتون كان مرئيا ضعيفة، وكان من الصعب تقدير مساهمة المنظفات لتقديرات لحجم قليل وحدات atlastin-1 من قبل هلام الاستبعاد اللوني، ونحن لا يمكن أن يستبعد هيكل رباعي مثلوثي للبروتين atlastin-1 في الجسم الحي. ومن المثير للاهتمام، هاجر atlastin-1- (1-516)، الذي يحتوي على المجالات عبر الغشاء المفترضة أيضا في حجم الأصلي مماثل على هلام الاستبعاد اللوني. ومع ذلك، مزال atlastin-1- (1-447)، الذي يفتقر إلى المجالات عبر الغشاء، كما قمم متعددة (الشكل 8 D)، مما يدل على أن اثنين توقع يطلب من المجالات عبر الغشاء لالتشكل السليم و / أو oligomerization من atlastin-1.

F IG. 8.
أشكال 1 Atlastin-وطي oligomers. A، مصفوفة من الخميرة المقايسات يومين الهجينة تظهر تفاعلات مختلف atlastin-1 (AT) N- وبنيات الحذف C-المحطة. يشار إلى حدود بقايا الأحماض الأمينية. وكان يعاير قوة التفاعل من قبل HIS3 وβ غالاكتوزيداز الاستقراء كما وصفها بلاكستون وآخرون. (20). في جميع الحالات، HIS3 وβ غالاكتوزيداز تحريض المترابطة. B، وشارك في مناعي من Myc- وHA الموسومة atlastin-1 البروتينات. و transfected الخلايا COS-7 مع أشارت atlastin-1 بنيات وimmunoprecipitated (IP) مع مكافحة HA الأجسام المضادة التحقيق. ثم تم immunoblotted رواسب مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. الإدخال يمثل 20٪ من المواد الاساسية. C والكيميائية عبر ربط. وعولج مقتطفات من الخلايا COS-7-overexpressing Myc على atlastin-1 مع تركيزات أشار من dithiobis (succinimidyl بروبيونات) (DSP)، تعرض لSDS-PAGE باستخدام المواد الهلامية امختزل، وimmunoblotted مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. يتم تحديد ثلاثة منتجات الدرجة الأعلى (السهام 2-4)، بالإضافة إلى مونومر (السهم 1). D، هلام استبعاد FPLC. تم immunoblotted aliquots من كل جزء مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على. وأظهرت حجم وشطف قمم الفراغ للبروتينات علامة (في kilodaltons) في أعلى. يشار إلى أرقام جزء على طول الجزء السفلي. على الرغم من Myc على-atlastin-1- (1-558) وMyc على-atlastin-1- (1-516) coeluted في ذروة جزء واحد، وكان Myc على-atlastin-1- (1-447) نمط شطف أوسع.

Atlastin-1 هو GTPase- عن طريق تنقية البروتينات CBP-atlastin-1 الانصهار، درسنا ما إذا atlastin-1 تمتلك النشاط GTPase. كميات متزايدة من atlastin-1 البروتين زاد تباعا نسبة GTP المائي (الشكل 9). وهكذا، atlastin-1 يرتبط ليس فقط GTP، كما هو مبين في الدراسات السابقة (32)، ولكن أيضا يعمل بمثابة GTPase (الشكل 9).

F IG. 9.
Atlastin-1 هو GTPase. وحات العليا، تنقية CBP-atlastin-1 انصهار بروتين (1،1-4،4 μ م، كما هو مبين) أو ألبومين المصل البقري (السيطرة) وحضنت مع [α- 32 P] GTP ل0-60 دقيقة . [32 P] الناتج المحلي الإجمالي و[32 تم حلها P] GTP من قبل الانفصال على لوحات TLC. اللوحة السفلى، [32 ف] الناتج المحلي الإجمالي و[32 وتم قياس كمية P] GTP، وتم احتساب النسبة المئوية للGTP المائي كما هو موضح تحت عنوان "الإجراءات التجريبية ".

نقاش

الطفرات في SPG3A الجين يسبب الاصابة المبكرة جدا النقي HSP (2 - 5). في هذه الدراسة، وجدنا أن SPG3A منتج الجين atlastin-1 هو GTPase بلازميدة قليلة القسيمات تتألف من وحدات فرعية التي هي بروتينات الغشاء لا يتجزأ، مع كل من C و N تيرميني يتعرض إلى السيتوبلازم. حددنا أيضا عضوين آخرين من الأسرة atlastin من GTPases التي تشترك تشابه تسلسل كبير مع atlastin-1 وعلى الأرجح نفس السمات الهيكلية: atlastin-2 وatlastin-3 (الشكل 1). هذه البروتينات هي مشابهة من حيث الحجم ولها نفس الحفظ جدا الزخارف ملزم GTP فضلا عن توقع اثنين من المجالات عبر الغشاء. ومن المثير للاهتمام، وخرائط atlastin-3 الجين إلى منطقة داخل SPG17 (متلازمة فضة، MIM 270685) موضع (33)، وبالتالي قد يكون الجين مرشح لSPG17. الجين atlastin-2 في محيط SPG4 spastin الجينات على الكروموسوم 2.
هيكل الغشاء نقترح لatlastin-1 (الشكل 7 C) ليست نموذجية من جيجابايت في الثانية، والأسرة من GTPases الكبيرة التي وatlastins هي الأكثر مثلي (11، 12، 30). ومع ذلك، على الرغم من أن atlastins وجيجابايت في الثانية كل حصة حلقة RD بدلا من (N / T) K X D في عزر الثالث ضمن الكلاسيكية ملزم guanylate ثالوث، وهناك العديد من الاختلافات البنيوية بين atlastin والأسر GBP (12، 13، 32). أولا، على عكس atlastins، جيجابت في الثانية لديها محطة C-α حلزونية مجال إضافية أن تطوي إلى التفاعل مع المزيد من المناطق القريبة (12). ثانيا، الكثير جيجابت في الثانية لديها C-C محطة AAX (حيث A يمثل الأحماض الأمينية الأليفاتية) عزر لisoprenylation، وكلها من atlastins تفتقر (الشكل 1). ثالثا، لقد أظهرت دراستنا أن atlastin-1، ومن المرجح atlastin-2 وatlastin-3 هي البروتينات الغشاء لا يتجزأ مع اثنين من المجالات عبر الغشاء المفترضة. على النقيض من ذلك، جيجابت في الثانية ليست بروتينات الغشاء لا يتجزأ. في هذا الصدد، وatlastins أكثر تذكرنا FZO / mitofusins، GTPases الكبيرة التي تمتد غشاء الميتوكوندريا الخارجي مرتين، مع كل من N و C تيرميني التي تواجه السيتوبلازم (34، 35). لأن FZO / mitofusins ​​تعتبر بالغة الأهمية لالانصهار الميتوكوندريا السليم، قد يكون atlastin-1 أيضا دورا في الأحداث الانصهار هومو أو غيروي. وأخيرا، مثل العديد من dynamin / MX / GBP الفصيلة (أعضاء 12، 30، 31، 36)، atlastin-1-أشكال وطي oligomers. على الرغم من أن دراستنا تشير إلى أن atlastin-1 على الأرجح تجمع باعتباره homotetramer، فإنه ليس من الواضح ما إذا كان يمكن أن تشكل أيضا مجمعات مغايرة التغصن مع atlastin-2 وatlastin-3. ومن غير الواضح أيضا ما إذا كان atlastins تكون قادرة على تشكيل هياكل النظام أعلى، كما تبين لأعضاء آخرين في dynamin / MX / GBP الفصيلة (12، 31، 36).
على الرغم من وظائف البروتينات atlastin غير معروفة، وقد حددت عدة مجموعات البروتينات التفاعل atlastin بواسطة الخميرة فحص اثنين من الهجين (32، 37). وقد تبين Atlastin-1 / GBP3 البشري إلى التفاعل مع الإنسان NIK / HGK، التي تعد واحدة من المجموعة الأولى جرثومي تحركات مركز، مجموعة من MAPK تحركات كيناز كيناز الذي ينشط شلال SAPK / JNK في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا (32 ). التفاعل مع atlastin-1 يحدث عن طريق يسين الغنية CHN مجال NIK / HGK. تظهر بقايا 1-129 من atlastin-1 أن تكون كافية للتفاعل (32). وقد تبين Atlastin-2 / ARL-6-التفاعل البروتين 2 للتفاعل مع ARL-6، وA DP- ص ibosylation factor- ل آيك البروتين الذي هو في الغالب عصاري خلوي، ولكن الزميلة مع الأغشية ردا على GTPγS (37). الثالث-C النهائي للatlastin-2 (بما في ذلك اثنين من المجالات عبر الغشاء المقترحة) كافية لهذا التفاعل. ومن المثير للاهتمام، العديد من العوامل ADP-ribosylation وADP-ribosylation عامل مثل البروتينات مهمة لتجنيد البروتينات مثل golgins وCOPI إلى جهاز جولجي (38، 39). الآثار الوظيفية لهذه التفاعلات التي تم تحديدها atlastin البروتين غير معروفة، ولكن.
كيف الطفرات في الجين atlastin-1 تغير البروتين atlastin-1؟ لكن كل واحد من التقارير atlastin-1 الطفرات في المرضى الذين يعانون من SPG3A تمثل الطفرات مغلطة. والآخر هو الإدراج النوكليوتيدات مما أدى إلى الإنهاء المبكر في المجال محطة C (13 - 16). طفرة مغلطة واحد (R217Q) تغير بقايا الحفظ جدا في حلقة RD داخل جيب ملزم GTP من atlastin-1، وبالتالي قد يغير GTP ملزمة أو النشاط GTPase (14). على الرغم من أن الطفرات مغلطة أخرى تحدث في بقايا الحفظ جدا بين الأسرة atlastin، آثارها لا تزال غير واضحة. ومن المثير للاهتمام، وتقع هذه الطفرات في كل N- والمناطق C-الطرفية، مما يشير إلى أن التغيرات الطفيفة حتى في التسلسل الأساسي في مناطق مختلفة متعددة قد تكون لها آثار هيكلية أو وظيفية عميقة. يمكن لهذه التغيرات تسلسل يحتمل أن تتداخل مع oligomerization وتكوين الجمعيات غشاء المناسبة، توطين الخلوية، والنشاط GTPase، وتفاعلات atlastin-1 مع بروتينات أخرى.
البروتين atlastin-1 هو الأكثر وفرة في الدماغ، على الرغم من أنه موجود أيضا في مستويات أقل من ذلك بكثير في الأنسجة الأخرى، بما في ذلك الرئة، العضلات الملساء، الغدة الكظرية والكلى، والخصية. داخل الدماغ، وأثرى atlastin-1 بارز في الصفيحة V الخلايا العصبية الهرمية في قشرة الدماغ، جزء من السكان من التي تظهر على axonopathy البعيدة في المرضى الذين يعانون من SPG3A. هذه الخلايا العصبية الحركية العليا مشروع لخفض الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي القطني، والنتائج خلل في وخزل سفلي تشنجي، ميزة الكاردينال شركائنا HSPs. لأن هذه الخلايا العصبية لها بين أطول المحاور في النظام العصبي المركزي، واختلال وظيفي في المرضى SPG3A قد يعكس دورا حاسما في المناسبة atlastin-1 وظيفة في هذه الفئة من القطعان من "محور عصبي طويل" الخلايا العصبية الحركية العليا. بناء على توطين التحت خلوية من atlastin-1 إلى جهاز جولجي والتشابه الهيكلي لأعضاء dynamin / MX / GBP الفصيلة من GTPases، قد يكون atlastin-1 المهم لديناميات غشاء جولجي المناسبة أو الاتجار حويصلة.
كيف يمكن المعيبة جولجي هيكل الغشاء أو الاتجار حويصلة يسبب axonopathy البعيدة في الخلايا العصبية الحركية العليا مع محاور عصبية طويلة؟ النقل عيب على طول المحاور التي تورطت مباشرة في عدد من axonopathies طويلة وراثي، بما في ذلك HSP SPG10 (طفرات في كينيسين KIF5A العصبية) (8) والاعتلال العصبي وراثي شاركو ماري توث نوع 2A (طفرات في بروتين السيارات KIF1Bβ) (40)، وكذلك في شكل جسمية مهيمنة انخفاض مرض العصبون الحركي (طفرات في P150 فرعية من dynactin) (41). على الرغم من أن هذه البروتينات الحركية تؤثر بشكل مباشر على النقل، تشكيل السليم للبضائع داخل الخلايا مهم كذلك. ونظرا للوقت مبكر من بداية SPG3A والاقتراحات التي قد يكون بسبب تشوهات للتنمية الخلايا العصبية (3، 4)، فمن المثير للاهتمام أن علاج الخلايا العصبية قرن آمون مع brefeldin A، المستقلب الفطرية أن يعطل جهاز جولجي، ويحول دون نمو محور عصبي (42 ). وبالتالي، مطلوب جهاز جولجي سليمة للنمو محور عصبي (42)، والتي قد تكون ذات أهمية خاصة لتشكيل محور عصبي طويل خلال تطوير النظام العصبي المركزي. تصور، قد الطفرات من atlastin-1 في المرضى الذين يعانون من وظيفة SPG3A يؤدي إلى هيكل جولجي أو ضعف وظائف، مما يؤدي إلى نمو محور عصبي ضعف. الدراسات المستقبلية من آثار الطفرات المريض SPG3A على هيكل جولجي وظيفة وكذلك نقل محور عصبي والنمو قد توضح المرضية الخلوية من HSP SPG3A

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #4  
قديم 11-22-2015, 09:14 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي دراسة سريرية والجينية والبيوكيميائية من الطفرات spg7 في الشلل النصفي التشنجي وراثي

 

http://brain.oxfordjournals.org/content/127/5/973.full


الملخص

الطفرات في الجين SPG7، ترميز البروتين paraplegin الميتوكوندريا، وكان أول من ذكر اسمه في راثي متنحي الشلل النصفي التشنجي وراثي (ARHSP). وقد وصفت أربع طفرات SPG7 مختلفة حتى الآن بالتعاون مع كل نقية ومعقدة الظواهر HSP. وقد أظهرت الخزعات العضلية من المرضى الأكثر تضررا دليل النسيجي للعيب الفسفرة المؤكسدة. حددنا ست قبائل ARHSP، ومنهم من الربط SPG7 لا يمكن استبعاد، و 29 متقطع مرضى الشلل النصفي التشنجي. تم فحص والإكسونات 17 والمناطق المحيطة من الجين SPG7 للطفرات باستخدام مزيج من واحد الذين تقطعت بهم السبل تعدد الأشكال التشكل (SSCP) تحليل والتسلسل. تم العثور على ثلاثة مرضى لتنفيذ مجمع الطفرات SPG7 متخالف، تتألف من خمسة رواية واحدة الطفرة التي سبق وصفها. لم الخزعات العضلية من مريضين طفرة SPG7 لا تظهر أي دليل النسيجي للعيب الفسفرة المؤكسدة. ومع ذلك، كشفت التحاليل البيوكيميائية انخفاض في سترات لتصحيح سينسيز المجمع الأول ومجمع II الأنشطة / III في العضلات والنشاط I معقدة في الكسور التخصيب الميتوكوندريا من myoblasts مثقف، مما يدل على أن إما الابتدائي أو عيب الثانوي من سلسلة وظيفة الجهاز التنفسي قد تلعب دورا هاما في التسبب في المرض.
  • الشلل النصفي التشنجي راثي؛ paraplegin. SPG7
  • ARHSP = راثي متنحي الشلل النصفي التشنجي راثي؛ HSP = الشلل النصفي التشنجي راثي؛ SSCP = واحد الذين تقطعت بهم السبل تعدد الأشكال التشكل
مقدمة

الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP) يشمل مجموعة من الاضطرابات غير المتجانسة سريريا وراثيا التي الميزة الغالبة هي التشنج التدريجي وضعف في الأطراف السفلية. قد يكون وراثة وراثي جسمي، جسمي مقهور (ARHSP) أو X-ربط. يتم تصنيف النمط الظاهري كما النقي HSP عندما تقتصر أعراض وعلامات لتلك التي من خزل سفلي تشنجي التدريجي مع احتمال العمود الخلفي أو تورط المثانة (بولو وآخرون، 1993). وقد وصفت الظواهر HSP المعقدة بالتعاون مع مجموعة واسعة من المظاهر السريرية العصبية أو غيرها إضافية (ماكديرموت وشو، 2002).
في معظم الحالات HSP (~80٪) إثبات أدلة على ميراث السائد (بولو وآخرون، 1991). حتى الآن، تم تعيين 10 جسمية مواضع HSP المهيمنة، والتي من الطفرات في خمسة جينات، SPG3A (atlastin)، SPG4 (spastin)، SPG6 (NIPA1)، SPG10 (KIF5A) وSPG13 (Hsp60)، وقد تم تحديد (حزان وآخرون آخرون، 1999.؛ تشاو وآخرون، 2001.؛ هانسن وآخرون، 2002.؛. ريد وآخرون، 2002؛. رينييه وآخرون، 2003). يبدو الميراث مقهورة مناطق خارج شائعة نسبيا حيث توجد معدلات عالية من زواج الأقارب (Sridharan وآخرون، 1985)، على الرغم من أنها قد يشكلون نسبة كبيرة من الحالات فيما يبدو متفرقة. حتى الآن، وقد تم تحديد ستة مواضع ARHSP والطفرات المسببة العثور عليها في اثنين من الجينات، SPG7، الترميز paraplegin، وSPG20، ترميز spartin البروتين (. Casari وآخرون، 1998؛. باتل وآخرون، 2002).
كان SPG7 أول جسمية HSP الجينات تتسم. تقع على الصبغي 16، ويضم 17 الإكسونات تمتد ~52 كيلوبايت. المنتج البروتين، paraplegin، ويتكون من 795 الأحماض الأمينية ويموضع إلى الميتوكوندريا. وتشترك في أقرب الأحماض الأمينية تسلسل تناظر مع الخميرة metalloproteases الميتوكوندريا Afg3، Rca1 وYme1 (Casari وآخرون، 1998.؛ Settasatian وآخرون، 1999.). هذه البروتينات هي أعضاء الفصيلة البروتين AAA (أتباز المرتبطة بالأنشطة الخلوية المتنوعة) التي توجد على نطاق واسع في كل من خلايا أولية النواة وحقيقية النواة وتلعب دورا هاما في مجموعة متنوعة من الأنشطة الخلوية بما في ذلك انقسام الخلايا، والنسخ، وعضية نشوء حيوي والنقل حويصلة و التجمع انزيم (باتل وLatterich، 1998). الخميرة ATPases الميتوكوندريا تمتلك كل من بروتين والأنشطة مثل كوصي على الغشاء الداخلي الميتوكوندريا حيث كانوا يشاركون في التجمع وتدهور البروتينات في سلسلة معقدة التنفسي (بيرس، 1999). طفرة من هذه الجينات في الخميرة يستحث سلسلة عيب في الجهاز التنفسي بسبب كتلة في البرلمان من مفارز في الانزيمات وظيفية (بول وTzagoloff، 1995). وفي وقت لاحق، عددا من الجينات البشرية إضافية ترميز البروتينات عالية مثلي لparaplegin مثل تم اكتشافها AFG3L1، AFG3L2 وYME1L1 (بانفي وآخرون، 1999.؛. كوبولا وآخرون، 2000؛. Kremmidiotis وآخرون، 2001). وتظل الوظيفة الدقيقة للparaplegin والبروتينات ذات الصلة في البشر غير مؤكدة.
حتى الآن، وقد وصفت أربعة SPG7 الطفرات الناتجة في أي نقية أو معقدة الظواهر HSP. بعد الربط 16q24.3 في أسرة إيطالية الأقارب كبيرة مع النمط الظاهري معقد متغير (دي ميشيل وآخرون، 1998)، Casari وآخرون. (1998) اكتشف الحذف 9.5 كيلوبايت المقابلة لالإكسونات الخمس الماضية من الجين SPG7. وكشف تحليل خزعة العضلات من شخصين تضررا التغييرات المميزة من الميتوكوندريا العيوب الفسفرة المؤكسدة بما في ذلك ألياف خشنة الحمراء، السيتوكروم ج-أوكسيديز سلبي وسوسينات ألياف نازعة إيجابي. أكد المجهر الإلكتروني تراكم الميتوكوندريا غير طبيعية تحتوي على شوائب paracrystalline في 'موقف للسيارات' النمط. ومع ذلك، في اثنين من الأفراد المتضررين أقل بشدة، وشوهدت قليلة فقط، أوكسيديز السلبية المنتشرة السيتوكروم ج الألياف. اثنين من طفرات انزياح الإطار إضافية، حذف 2 سنة مضت في اكسون 6 في عائلة ايطالية صغيرة مع خالص HSP والإدراج قاعدة واحدة في اكسون 17 في HSP الفرنسي المشابهة مع النمط الظاهري تعقيدا بما في ذلك البصرية، وضمور القشرية والمخيخ، كما تم تحديد. وكانت كل من الأسر والأقارب متماثلة اللواقح بالنسبة للطفرة (Casari وآخرون، 1998). في الآونة الأخيرة، وقد تم الإبلاغ عن متخالف 9 الحذف غليان في اكسون 11 من SPG7 في أب وابنه تتأثر خزل سفلي تشنجي، مما يشير إلى احتمال النمط السائد وراثي جسمي من الميراث في هذه العائلة (ماكديرموت وآخرون، 2001).
وكان الهدف من هذه الدراسة هو فحص لفيف كبير من الحالات مقهورة HSP المتنحية ومتفرقة من المملكة المتحدة إلى تقدير مدى انتشار الطفرات SPG7 في هذه الفئة من السكان وزيادة تحديد طبيعة الخلل الميتوكوندريا في الأفراد المتضررين.

طرق

المواضيع

وتم تحديد عشرين قبيلة HSP أدلة على راثي الميراث المتنحية ومزيد من 29 مريضا بشكل متقطع وليس لهم تاريخ العائلة، ومنهم من الأسباب البديلة لشلل سفلي تشنجي استبعدت، إما من خلال قاعدة البيانات التي أنشئت من المرضى HSP البريطانية (التي يوجد مقرها في المراكز الثلاثة المشاركة الذين أجروا البحث في HSP لعدة سنوات) أو عن طريق وحدة البريطاني العصبية المراقبة، التي تنقل بانتظام مع جميع أطباء الأعصاب مستشار المملكة المتحدة يطلب فيها معلومات عن فئات محددة المريض. جميع الأفراد أعطى موافقة مستنيرة للمشاركة في الدراسة، التي حصلت على موافقة متعددة الإقليمية جنة أخلاقية.
التنميط الجيني والربط تحليل

تم استخراج DNA من الدم الجينوم بأكمله باستخدام البروتوكولات القياسية. تم التحقيق الربط موضع SPG7 في 20 عائلة ARHSP باستخدام متعددة الأشكال من الواسمات الوراثية D16S413، D16S3023 وD16S303. وكانت تضخيم تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) حجم المنتجات مجزأة من قبل الكهربائي باستخدام 8٪ المواد الهلامية بولي أكريلاميد وتصور من قبل تلطيخ الفضة. حسبت عشرات زوجيا اللد باستخدام MLINK في ظل افتراض الترددات أليل المتساوية والمساواة الذكور والإناث معدلات إعادة التركيب. كان يفترض أن تكون وراثة المرض باعتباره مقهورة مع انتفاذ كامل وتردد أليل من 10 -4.
الكشف عن الطفرات

وقد صممت ثمانية عشر زوجا من الاشعال، بناء على الصبغي 16 مشروع تسلسل البيانات، لتضخيم المنطقة الترميز والمرافقة تقاطعات لصق جميع الإكسونات 17 من الجينات SPG7. أجريت تقارير إتمام المشروعات (50 ميكرولتر) في ظل ظروف الأمثل (الجدول 1). واحد الذين تقطعت بهم السبل التشكل تعدد الأشكال تم تنفيذ (SSCP) التحليل باستخدام 0.6٪ والمواد الهلامية والكشف عن الطفرات تعزيز تشغيل في 4-10 درجة مئوية لمدة 10-16 ساعة لتحقيق الانفصال الأمثل للفروع. وتميزت التحولات التنقل عن طريق التسلسل المباشر لمنتجات PCR تنقيته باستخدام BIGDYE (النظم البيولوجية التطبيقية) وتحليلها على تحليل الوراثي ABI 3100.

الجدول 2
تردد من الأشكال SPG7 في المريض والسيطرة الكروموسومات
موقع تغيير النوكليوتيدات توقع تغيير البروتين الكروموسومات المرضى (ن = 70) الكروموسومات التحكم (ن = 100) اكسون 1 120G → A G40G 1 1 إنترون 4 IVS4 + 12C → T - 36 56 إنترون 7 IVS7 + 5G → A - 2 3 إنترون 7 IVS7 + 17G → C - 2 2 إنترون 7 IVS7 + 38G → A - 3 5 إنترون 10 IVS10 + 19G → A - 2 5 اكسون 11 1507A → G T503A 2 6 اكسون 11 1529C → T A510V 1 4 إنترون 12 IVS12 + 13C → T - 1 4 إنترون 13 IVS13 + 45G → C - 14 31 اكسون 14 1816C → T G605G 0 1 اكسون 15 2063G → A R688Q 5 24 اكسون 17 2283G → A Q761Q 2 2 اكسون 17 2292C → T I764I 2 4
A = ألانين. G = الجلايسين. I = آيسولوسين؛ Q = الجلوتامين. R = أرجينين. T = ثريونين. V = حمض أميني أساسي.


الجدول 3
الطفرات SPG7 الكشف
صبور موقع تغيير النوكليوتيدات توقع تغيير البروتين 1 اكسون 1 28G → A A10S
اكسون 13 1729G → A G577S 2 اكسون 8 1057-1085del29 انزياح الإطار 353-384X385
اكسون 13 1715C → T A572V 3 اكسون 11 1450-1458del9 E، R، R484-486del
اكسون 15 2026T → C F676L
A = ألانين. E = حمض الجلوتاميك. F = الفينيل ألانين. G = الجلايسين. L = يسين. R = أرجينين. S = سيرين. V = حمض أميني أساسي.


الجدول 4
الخصائص السريرية للمرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7
صبور 1 2 3 عمر (سنة) 21 51 42 جنس م F م العمر عند بداية (سنة) 11 14 19 التلفظ - + + الرأرأة تذبذب المقلتين السريع اللإرادي - + + ضعف المثانة - - + الطرف العلوي


الشلل التشنجي + + + ضعف - - - ترنح - + + فرط المنعكسات + + + حسي - - - الطرف السفلي


قدم جوفاء + + - الشلل التشنجي + + + ضعف - + + ترنح - + + فرط المنعكسات + + + حسي - + - ردود الفعل أخمصي ↑↑ ↑↑ ↑↑ مشية تشنجي تشنجي-رنحي تشنجي-رنحي الحالة الوظيفية مستقل يتطلب عصا مستقل EMG / NCS لم تفعل طبيعي طبيعي التصوير بالرنين المغناطيسي الدماغ طبيعي تلين hyperintensity T2. ضمور المخيخ ضمور المخيخ الحبل الشوكي التصوير بالرنين المغناطيسي طبيعي طبيعي طبيعي
M = ذكور؛ F = أنثى؛ + = الحاضر. - = غائبة. ↑↑ = ثنائيا الباسطة. دراسات NCS = التوصيل العصبي.


الجدول 5
الميتوكوندريا أنشطة مجمع السلسلة التنفسية تصحيح لسينسيز سيترات في المرضى الذين يعانون طفرة SPG7، غير مرضى SPG7 ARHSP والضوابط

مجمع I II معقدة / III مجمع IV عضلة


المريض 2 0،182 0.132 0.018 المريض 3 0،115 0.14 0.017 ضوابط 0.227 ± 0.037 0.217 ± 0.032 0.0196 ± 0.0043 عدم SPG7 ARHSP 0.185 ± 0.085 0.211 ± 0.116 0.171 ± 0.012 بالخلايا العضلية الجذعية


المريض 2 0.09 0.27 0.025 المريض 3 0،044 0.28 0.018 ضوابط 0.158 ± 0.046 0.288 ± 0.046 0.027 ± 0.011
± فاصل الثقة 95٪.


الجدول 1
الاشعال وشروط إتمام المشروعات SPG7
اكسون التمهيدي إلى الأمام التمهيدي العكسي الصلب temperatue (° C) ملي MgCl 2 PCR حجم المنتج (بي بي) 1 5 'ATCACGCAGGCGCGGCTTTCAG 3' 5 'CTGGGCCTTACAGAGCAGA 3' 60 15 270 2 5 'AGTCTGCATTGCTTTGGTACT 3' 5 'TAGCTGAGGCGATAAGTGTG 3' 57 15 228 3 5 'GGAGTACACTGTTGTCCTGT 3' 5 'ACAGAAATGTAAAGACATCCAG 3' 55 15 226 4 ا 5 'AAGCTCTGGATGTCGCCCGT 3' 5 'AGGAAATGCTGCCTCCGCTG 3' 57 15 193 4B 5 'GCGGTTGTCATGAGCCTCCT 3' 5 'CTCACTCTCACAGGCTGCCA 3' 57 2.0 241 5 5 'GACTGTAGGGTTGCTCGTCT 3' 5 'CAGATTACAAAGCCAAGTTAGG 3' 55 15 260 6 5 'TTGGAAGCCTGCGTCTGTCA 3' 5 'GTATTCAGCAAACACAAACCAG 3' 57 15 225 7 5 'CTGGCATCGTGCTGCTGATT 3' 5 'CCCTTCTGGGAGAGGAGGA 3' 57 15 257 8 5 'AGTGTTGCATTGTCTGCTGC 3' 5 'ATGTGTGAAAGGAGCCAGGT 3' 57 2.0 252 9A 5 'CCTTGGTGTAGAACTTTGTCT 3' 5 'TGTTGGAGAAGCCGGACATG 3' 55 15 221 9B 5 'GCATCGTCTACATCGATGAG 3' 5 'CCTGTTCTGAAAGACATCGG 3' 55 15 187 10 5 'TCCCTCCTGTGTCCTGAAGG3 " 5 'CCAGACCACTCAGAGCGAGT 3' 57 15 283 11 5 'ACCTGTGGCAGTAACTAGGT 3' 5 'GCCTTGATGCTGTTTGCGCA 3' 57 15 211 12 5 'CTCTTAAGCCCTGATAGCAG 3' 5 'TCACCTCTCAATACCTGCCT 3' 55 2.0 252 13 5 'GTCTCGAACTCCTGTCCTCA 3' 5 'AGTCAGCTACAGACACAGGC 3' 60 15 300 14 5 'ACGGAGACCTCTTAGTCCCA 3' 5 'CATGGCATGCACTGGAACAG 3' 55 2.0 321 15 5 'ACTGCTCTGCGCCTGCAGT 3' 5 'CCTTGTGTGGTAGACCCA 3' 57 15 294 16 5 'TCTGTGCTTTGGTGCTGGAG 3' 5 'ACCGTGGGTGCTGTGTGGA 3' 57 15 206 17 5 'ACATGCATATGCCTGTTCTTT 3' 5 'CTCAGCTGAAAAGCAACTCAG 3' 55 15 312
تحليل خزعة العضلات

أجريت الخزعات العضلية مفتوحة تحت مخدر موضعي من الوحشية المتسعة في اثنين من المرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7. تم تحليل العضلات لردود الفعل النسيجية القياسية بما في ذلك متتابعة السيتوكروم أوكسيديز وردود الفعل نازعة سكسينات. عينات العضلات من كل من المرضى، وأعدت أيضا أربعة مرضى إضافية مع ARHSP ومنهم من الربط SPG7 قد استبعدت و19 العمر كعينة ضابطة ويعاير لالميتوكوندريا I معقدة، II / III، IV وسينسيز سترات كما هو موضح سابقا (شابيرا وآخرون .، 1990). تم تصحيح أنشطة سينسيز سترات والبروتين (Biorad)، وذلك باستخدام ألبومين المصل البقري كمعيار قياسي. وقد تم قياس السلسلة التنفسية النشاط المعقد أيضا في شظايا الميتوكوندريا المعزولة من myoblasts مثقف بواسطة الطرد المركزي التفاضلي من كل من المرضى وتسعة في العمر كعينة ضابطة.

النتائج

التنميط الجيني والربط تحليل

تم استبعاد الربط موضع SPG7 في 14 من 20 ARHSP قبيلة (لا تظهر البيانات). لم يستبعد ست عائلات المتبقية نظرا لحجم نسب صغيرة أو علامات uninformative. لذا تم فحص واحد الفرد المصاب من كل من هذه العائلات إلى جانب متفرقة الحالات الشلل النصفي التشنجي 29 للطفرات SPG7.
الكشف عن الطفرات

بعد تحليل SSCP الأولي وتسلسل كل التحولات التنقل، تم تحديد ما مجموعه 12 التغييرات تسلسل متخالف في المناطق ترميز الجين SPG7. أربعة تم الإبلاغ سابقا الأشكال. ثلاثة تغييرات تسلسل الأخرى المحفوظة، 120G → A (G40G)، وقد تم تحديد 1816C → T (G605G) و2283G → A (Q761Q)، وأيضا في عينات مراقبة، وتحديد لهم كما الأشكال الجديدة. لم تحديد خمسة تغييرات تسلسل الترميز المتبقية في 200 الكروموسومات السيطرة، ودعم هذه الطفرات المسببة للأمراض كما. وقد تم تحديد وسبعة الأشكال intronic إضافية أيضا في عينات المريض والسيطرة عليها. ويرد موجز من الأشكال SPG7 والترددات النسبية في المريض والسيطرة الكروموسومات في الجدول 2.
في المجموع، تم تحديد ستة SPG7 الطفرات، خمسة منها رواية (الجدول 3). وكان اثنان من المرضى (1 و 2) الزيجوت المركبة، كل من لديه اثنين من الطفرات المختلفة. المريض 1 زيارتها لديهم تاريخ عائلي موحية من الميراث مقهورة، ولكن كان المريض 2 متفرقة. مريض مزيد متفرقة (3) ظهرت في البداية على تحمل سوى طفرة متخالف واحدة، وحذف 9 غليان في اكسون 11 (1450-1458del9) التي سبق ارتبط الممكن راثي الميراث المهيمن. التسلسل المباشر لجميع الإكسونات المتبقية في هذا المريض كشف التغيير الثاني في تسلسل اكسون 15، 2026C → T (F676L)، التي لم تنتج تحولا التنقل مرئية على SSCP تحت أي ظرف من الظروف اختبارها. وبالتالي زوج جديد من الاشعال تحتوي على تغيير تسلسل في قاعدة الأولى من التمهيدي العكسي تصميم، وPCR في ظل الظروف الأمثل تضخيم بنجاح DNA المريض ولكن أيا من 100 عينة السيطرة، ودعم هذا النحو الطفرة الثانية في هذا المريض.
الخصائص السريرية للمرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7

ارتبطت طفرات SPG7 مع الظواهر HSP معقدة بنسب مختلفة في جميع المرضى الثلاثة (الجدول 4). عمر البدء يتراوح 11-19 عاما، مع التدهور التدريجي ببطء. كل ذلك أظهر زيادة لهجة في جميع أطرافه الأربعة، أكثر وضوحا في الساقين، مع قوة الحفاظ نسبيا. وكان المرضى 2 و 3 على حد سواء مثلت علامات المخيخ، مع أطرافهم وترنح، والتلفظ ورأرأة. ولم يكن لدى أي من المرضى ضمور العصب البصري.
وأظهرت مسح الدماغ بالرنين المغناطيسي في المرضى الذين يعانون 2 و 3، الذي كان وترنح، وضمور المخيخ (الشكل 1). ولوحظت مجالين صغيرة من الآفات عالية إشارة T2 حول البطينات الدماغية من أهمية مؤكدة أيضا في المرضى 2. المظاهر MRI من الحبل الشوكي والطبيعي في جميع المرضى الثلاثة. EMG، كانت طبيعية أيضا دراسات التوصيل العصبي والاستجابات البصرية أثار في المرضى الذين يعانون 2 و 3.

تين. 1 محوري T2 التصوير بالرنين المغناطيسي في المرضى 3 تظهر ضمور المخيخ.

كان كلا الوالدين من المريض 3 على الفحص العصبي الطبيعي كجزء من هذه الدراسة. وكان المريض 1 نتاج زواج ابن عم الأول، وكان أربعة أشقاء وشقيقة واحدة. التاريخ، كما قد تأثرت أخ واحد. ومع ذلك، كانت لا أفراد العائلة الأخرى المتاحة للفحص، على الرغم من أن الآباء قد سبق فحص وشعروا أن تكون طبيعية. كان والدي المريض 2 كما لا تتوفر (توفيت والدته، ورفض الأب أن تشارك)، ولكن لم يكن لأيهما تشوهات عصبية أو المشية قبل التاريخ.
تحليل خزعة العضلات

خزعات العضلات من المرضى 2 و 3 أظهر كلا من التغيرات من إزالة التعصيب مع عودة التعصيب محدودة. في كل حالة، أظهرت الألياف الكتابة فائض ملحوظ من النوع 1 الألياف مع العديد صغير، ضامر، والألياف مزوى، في الغالب من النوع الثاني. واعتبرت أي ألياف خشنة الحمراء، ورغم وجود عدد قليل من متناثرة السيتوكروم ج-أوكسيديز سلبي الألياف في جميع أنحاء الخزعات والبقع أكسدة، بما في ذلك سكسينات نازعة، واعتبرت ضمن الحدود الطبيعية بالنسبة لعمر في المرضى.
ويظهر تحليل الميتوكوندريا وظيفة السلسلة التنفسية في العضلات من المرضى 2 و 3 في الشكل 2. مقارنة مع الضوابط، وأنشطة لتصحيح سينسيز سيترات لأني معقدة ومعقدة II / III انخفض تحت نطاق السيطرة يعني في كل من المرضى، في حين أن النشاط الرابع معقد يبدو الحفاظ نسبيا (الشكل 2 A). وكانت صورة مماثلة واضحة عندما تمت مقارنة اثنين SPG7 المرضى طفرة مع المرضى ARHSP الآخرين ومنهم من الربط SPG7 قد استبعدت، مع أنني معقدة ومعقدة II / III الأنشطة التي تقع تحت يعني الضوابط. ولكن نظرا لصغر حجم العينة في هذه المجموعة، وكانت فترات الثقة لأنشطة مكافحة يعني كبيرة والاختلافات غير الجوهرية (الجدول 5). كما أظهر الجهاز التنفسي المقايسات وظيفة سلسلة حول الكسور الميتوكوندريا المعزولة من myoblasts مثقف في كل من المرضى طفرة SPG7 انخفاض في سترات لتصحيح سينسيز الأنشطة المعقدة أنا خارج الخطأ القياسي لأسعار السيطرة متوسط، على الرغم من / الأنشطة المعقدة II III ومجمع IV كانت في وضعها الطبيعي مجموعة (الشكل 2 B).

تين. 2 التنفسي سلسلة النشاط المعقد تصحيح لسينسيز سترات. يتم التعبير عن بيانات التحكم كما يعني فاصل الثقة ± 95٪. أعرب النشاط الرابع معقدة × 10. (A) في العضلات المتجانسة. (B) بالخلايا العضلية الجذعية الكسور الميتوكوندريا.

نقاش

منذ اكتشاف SPG7 كما الجين الأول المسؤول عن ARHSP، تم الإبلاغ عن الطفرات أربعة فقط. ثلاثة وقعت في الأنساب الأقارب تمتلك طفرات متماثل، في حين تم العثور على معظم ذكرت مؤخرا متخالف 9 الحذف غليان في اكسون 11 (1450-1458del9) في الأب وابنه من عائلة والذي اقترح الممكن راثي الميراث المهيمن. حددنا ستة SPG7 الطفرات، في حالة واحدة من عائلة مع الممكن راثي الميراث المتنحية، وحالتين HSP يبدو متفرقة. كانوا جميعا الزيجوت المركبة لمدة طفرات منفصلة. هذا أمر غير مألوف بالنسبة للمريض 1 الذي كان نتاج الآباء الأقارب. ولوحظ وجود النمط الظاهري مماثلا مع رنح مخيخي بارز في الحالتين متفرقة. وقد تم تحديد الطفرات في أي من ستة راثي المرضى HSP المتنحية من الأسر ومنهم من الربط إلى مكان SPG7 لا يمكن استبعاده.
الشكل 3 يبين توزيع الطفرات في SPG7. الطفرات مغلطة اثنين في المريض 1 تحدث في مجالات وظيفية الحفظ للغاية. طفرة A10S في اكسون 1 نتيجة في الاستعاضة عن مسعور مع بقايا الأحماض الأمينية ماء في الببتيد زعيم paraplegin. وتحتاج هذه قصيرة تسلسل الأحماض الأمينية في N-محطة للبروتينات الميتوكوندريا المشفرة النووية لتشكيل الأساسي، الحلزون متقابلة الزمر من أجل السماح استهداف البروتين على الميتوكوندريا (يثغو، 2000). لذا من المتوقع إدخال ماء بقايا الأحماض الأمينية في الببتيد زعيم لعرقلة توطين الميتوكوندريا من paraplegin. الطفرة الثانية، G577S، ويقع ضمن الحفاظ ملزم الزنك عزر (HESGH)، وتوفير مزيد من الأدلة لأهمية وظيفية لهذا المجال في paraplegin.

تين. 3 التمثيل التخطيطي للجين SPG7 تبين المجالات والمواقع من الطفرات وظيفية.

في المريض 2، وطفرة مغلطة في اكسون 13 (A572V) النتائج في استبدال حمض أميني اثنين من مخلفات قبل المجال ملزم الزنك. على الرغم من أن كلاهما غير القطبية، والأحماض الأمينية مسعور صغيرة، ووضع نماذج من البروتين متحولة مع برنامج التنبؤ GOR4 (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl أظهرت) التشكل المتغيرة في المنطقة المجال ملزم الزنك من نمط لفائف α-الحلزون α حلزون عشوائي إلى حبلا الموسعة. هذا تغيير في هيكل الثانوي من المرجح أن يعطل النشاط الوظيفي لهذا المجال. الطفرة الثانية في المريض 2، حذف 29 نقطة أساس في اكسون 8 (1057-1085del29)، هي ضمن كاسيت AAA التي تنطوي على جزء من عزر ATP ملزم الحفظ جدا. فإنه يؤدي إلى انزياح الإطار مع كودون وقف سابق لأوانه في بقايا 385، وتوقع أن تسفر عن بروتين اقتطاع.
في المريض 3، وكانت طفرة واحدة حذف 9 غليان في اكسون 11 (1450-1458del9) ذكرت سابقا طفرة المهيمنة الممكن راثي (ماكديرموت وآخرون، 2001). هذا هو داخل الكاسيت AAA، مما أدى إلى فقدان ثلاثة أحماض أمينية (E، R، R484-486del). فشل تحليل SSCP أيضا لتحديد طفرة ثانية في مريضنا، وكان فقط عن طريق التسلسل المباشر لالإكسونات المتبقية التي تغير تسلسل آخر، 2026C → T (F676L)، تم الكشف. الفحص العصبي للوالدين، سواء في 70S، وأعراض، كان طبيعيا تماما. وأكد تسلسل الإكسونات اثنين في كل من الآباء والأمهات أن الأم قامت بحذف 9 غليان في اكسون 11 والد طفرة مغلطة في اكسون 15. وفي هذه الحالة، 1450-1458del9 يعمل بشكل واضح بطريقة مقهورة مع مزيج من اثنين الطفرات متخالف المطلوبة لإنتاج النمط الظاهري المرض. لم استبدال F676L لا تحدث في مجال وظيفي واضح داخل paraplegin. أنه يؤدي إلى إحلال يسين للفينيل ألانين، ولم يتم الكشف عن هذا التغيير في 200 الكروموسومات السيطرة، ودعم دورها بوصفها الطفرة المسببة للأمراض.
فشل التحليل النسيجي للعضلات من اثنين من المرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7 لإظهار التغيرات المورفولوجية عنها سابقا مرتبطة بضعف الفسفرة التأكسدية، على الرغم من كل ما زالوا متنقل وأقل تضررا من الحالات السابقة. غياب هذه الميزات على خزعة العضلات وبالتالي لا يمكن أن تستبعد SPG7 كسبب للمرض. وتمثلت النتيجة متسقة الوحيد من التغييرات إزالة التعصيب مع وجود فائض من نوع الألياف I مما يعكس على الأرجح منذ فترة طويلة التشنج.
الميتوكوندريا الأنشطة السلسلة التنفسية في العضلات من المرضى 2 و 3، ومع ذلك، أظهرت انخفاضا في مجمع الأول ومجمع النشاط II / III مقارنة مع الضوابط، وعندما تصحيح لسينسيز سترات. وتم الحصول على نتائج مماثلة عند مقارنة مع المرضى الآخرين مع ARHSP ومنهم من قد استبعدت الطفرات SPG7، مما يشير إلى أن هذا التأثير قد لا تعكس ببساطة تأثير على العضلات من التشنج منذ فترة طويلة وقلة الحركة. ولكن نظرا لقلة عدد المرضى غير SPG7 ARHSP، والاختلافات بين المجموعتين لم تصل دلالة إحصائية.
وشملت دراسة سابقة من سلسلة وظيفة الجهاز التنفسي في العضلات من المرضى HSP اثنين من المرضى الذين يعانون من ARHSP، ومنهم من تم استبعاد طفرات SPG7 (بيمونتي وآخرون، 2001). كان واحدا من هذه التغيرات النسيجية مميزة مرتبطة بضعف الفسفرة التأكسدية، وسواء كانت معزولة أوجه القصور I المعقدة. أظهرت دراسة حديثة من وظيفة الميتوكوندريا في المرضى الذين يعانون HSP ومنهم على حد سواء SPG4 وSPG7 الطفرات قد استبعدت أيضا انخفاضا في كل من الأنشطة IV I ومعقدة تعقيدا (ماكديرموت وآخرون، 2003)، مما يوحي بأن العيوب السلسلة التنفسية قد يكون أمرا شائعا أكثر من شكل واحد من ARHSP.
نمط معقد نقص I-III في العضلات والهيكل العظمي مماثلة لتلك التي وجدت في أنسجة القلب من المرضى الذين يعانون من ترنح فريدريك (برادلي وآخرون، 2000). في رنح فريدريك، ويعتقد أن نقص frataxin أن يؤدي إلى تشكيل كتلة الحديد الكبريت غير طبيعي في سلسلة بروتينات الجهاز التنفسي، مما يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي والتلف. ويعتبر هذا النمط من نقص معقدة I-III أيضا في الماوس SOD2 خروج المغلوب (Melov وآخرون، 1999). ولذلك فمن الممكن أن نمط التنفس سلسلة خلل في العضلات من المرضى الذين يعانون من الطفرات SPG7 قد تمثل ضرر الجذور الحرة بوساطة الزائد. حقيقة أنه ليس هناك سوى خلل في النشاط I معقدة وقد لوحظ في myoblasts قد تمثل مجرد تراكم الضرر التأكسدي في ثابت بدلا من تقسيم الأنسجة.
تظهر الطفرات SPG7 أن يكون سبب نادر نسبيا من HSP، التي تم تحديدها في ثلاث فقط من أصل 49 (6٪) من المرضى دراستها. هذا الرقم، ومع ذلك، ينبغي اعتبار الحد الأدنى للتقدير كما SSCP قد فشلت في الكشف عن الطفرات. بالإضافة إلى ذلك، يوضح هذه الدراسة أيضا أن مركز SPG7 هو متعدد الأشكال للغاية. SSCP ليس أداة فعالة لفحص للطفرات، والتسلسل المباشر هو الأفضل.
وباختصار، فقد حددت هذه الدراسة ستة الطفرات في ثلاث حالات جديدة من SPG7 HSP. تم العثور على التغيرات البيوكيميائية، ولكن ليس النسيجية في عينات العضلات، مشيرا إلى أن معيار خزعة العضلات تلطيخ ليس اختبار تشخيصي مفيدة. وجود ترنح مع HSP، حتى في حالة متفرقة، يجب تنبيه الطبيب إلى إمكانية حدوث طفرات SPG7 كسبب.
المرضية الكامنة التي تنطوي على ضعف الميتوكوندريا قد تجعل هذه الحالات أكثر قابلية للتدخلات العلاجية من الأشكال الأخرى للمرض. هناك حاجة لدراسات إضافية لتحديد وظيفة محددة من paraplegin في الميتوكوندريا الإنسان في الصحة والمرض من أجل تسهيل تطوير علاجات محتملة المعدلة للمرض لهذا النوع من HSP.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #5  
قديم 11-22-2015, 09:54 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي طيف spg4 الطفرات في مجموعة كبيرة من الأسر أمريكا الشمالية وراثي مشلول الشلل النصفي

 

http://archneur.jamanetwork.com/arti...ticleid=781440

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #6  
قديم 11-22-2015, 10:17 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي النقي وراثي جسمي قاهر الشلل النصفي التشنجي: والسريرية، اسريرية، ودراسة وراثية

 

http://jnnp.bmj.com/content/64/1/61.full



وقد وصفت الأهداف لا يقل عن ثلاثة أنواع تمييزه سريريا لكن مختلفة وراثيا من مرض وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي النقي (ADPSP). في هذه الدراسة تمت دراسة الخصائص السريرية، وراثية، العصبية، والتصوير بالرنين المغناطيسي من ADPSP.
طرق ستين ثلاثة على أعضاء خطر من خمس أسر قيمت سريريا. وقد تم إنشاء مؤشر التشخيص للدراسة. تم تحديد المورثات الصغرية للصبغيات 2P، 14Q، وأجريت 15q علامات وتحليلات متعددة الربط. دراسات الساعة التوصيل المحرك المركزي (CMCT)، أثار الحسية الجسدية المحتملة (SSEP) القياس، وأجريت أشعة الرنين المغناطيسي للدماغ والحبل الشوكي الكلي في 16 مريضا من أربع أسر.
النتائج وأعرب عن الملامح الأساسية السريرية لADPSP متجانس في جميع المرضى ولكن تم العثور على بعض الميزات فقط في بعض العائلات وليس في جميع المرضى داخل الأسرة. في عائلتين غير تقدمية "خلقي" كان ينظر ADPSP في بعض أعضاء المتضررين في حين كان الكبار ADPSP تقدمية بداية موجودة في غيرها من أفراد الأسرة المصابين. كعرض الراحل كان المبلغ عنها وغير الموصوفة سابقا الظهر انخفاض بنسبة 47٪. العمر عند بداية تختلف على نطاق واسع، وكان هناك ميل إلى الانخفاض في الأجيال المتعاقبة في الأسر، مما يشير إلى الترقب. تحليل الربط الجيني تقتصر موضع ADPSP إلى الكروموسوم 2p21-P24 في الأسر الخمس. وكانت عشرات اللد التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل متعددة الربط إيجابية مع أقصى درجة اللد مجتمعة Z = 8.60. وأظهرت الدراسات العصبية فقط إطالة طفيفة وضئيلة من الوقت التوصيل المحرك المركزي وكذلك أن التوصيل الطرفية وسلامة الأعمدة الظهرية كانت في معظمها طبيعية. لم الدماغ والحبل الشوكي مجموع MRI عدم الكشف عن أي تشوهات كبيرة مقارنة مع الضوابط.
الاستنتاجات ADPSP مرتبطة الكروموسوم 2p21-P24 هو اضطراب غير متجانسة المظهري تتميز كلا interfamilial والاختلاف داخل الأسرة. في بعض العائلات قد يكون المرض "نقية" ولكن اقترح وجود "نقية بالإضافة إلى" الأسر في مناطق أخرى. وقال إن التحقيقات العصبية والتصوير العصبي لا تظهر أي تشوهات كبيرة.
تضم paraplegias تشنجي وراثي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات العصبية النادرة. تقليديا تم تقسيمها إلى مجموعتين، وهذا يتوقف على ما إذا كان اضطراب هو الشلل النصفي التشنجي النقي أو متلازمة أكثر تعقيدا مع الميزات الأخرى المرتبطة بها. 1 وراثي جسمي الشلل النصفي التشنجي النقي (ADPSP) يتميز سريريا من قبل التشنج ببطء تدريجي وضعف في الساقين، فرط المنعكسات، وعلامة بابنسكي، بمشاركة ضئيلة أو معدومة من الأطراف العلوية؛ التعبير phenotypical من ADPSP يجري متغير بدرجة كبيرة، ولا سيما فيما يتعلق العمر عند بداية. من خلال الربط يحلل تم تعيينها ADPSP إلى الكروموسومات 14Q (موضع SPG3)، 2P (SPG4)، و15q (SPG6). 2-4 كما ADPSP في بعض الأسر لا تعين أي من هذه المكاني، الجينات لا تزال مجهولة الهوية إضافية قد الوجود. 5
تقتصر النتائج عصبية مرضية بشكل حصري تقريبا على الحبل الشوكي وتشمل انحطاط مساحات القشري الجانبي تناقص من انخفاض أسفل الظهر إلى مستوى عنق الرحم العلوي. في كثير من الأحيان، وكما وصفت مشاركة مساحات هرمي امتصالب وزيادة انحطاط الناحلة الحزمة من الفقرات القطنية إلى مستوى عنق الرحم العلوي. 6 وجزئيا انعكست هذه النتائج في النتائج اسريرية باستخدام التحفيز المغناطيسي أو الكهربائي عبر الجمجمة من القشرة الحركية، الحسية الجسدية أثار إمكانيات (SSEPs)، ودراسات التوصيل العصبي. 7-9 على الرغم من أن التصوير بالرنين المغناطيسي توفر صورا فائقة من جذع الدماغ، المخيخ، والنخاع الشوكي، إلا سلسلة صغيرة من المرضى الذين يعانون من ADPSP تم دراستها. 10 11 والغرض من هذه الورقة هو تقديم السريرية، اسريرية، والسمات الوراثية في كل من خمس عائلات مع ADPSP، ومناقشة interfamilial والاختلاف داخل الأسرة.
المرضى والطرق

المرضى

تم تفتيش Probands لفي السجلات من العيادة الخارجية العصبية في مستشفى هافيدوفر وفي معهد علم الوراثة الطبية في كوبنهاغن. بعد الموافقة المسبقة، وشوهد أفراد الأسرة في المنزل أو في المستشفى. تم التشخيص على أساس وجود تاريخ عائلي موثقة جيدا ومعايير التشخيص من هاردينغ 1 وبروين وScheltens. 12 وكانت معايير الحد الأدنى للتشخيص التشنج في الأطراف السفلية، عادة ما تكون أكثر وضوحا من الضعف، وردود الفعل وتر مفرط، وعلامة بابنسكي . وقد تم إنشاء مؤشر لتشخيص الدراسة (الجدول 1).

الجدول 1
مؤشر لتشخيص ADPSP

تم فحص ثلاث وستين شخصا من خمس أسر (المعين AE) شخصيا، باستثناء ثلاثة أشخاص من عائلة و(IV-10، V-7، V-8، التين 1)، الذين يعيشون في السويد. كل ثلاثة، ومع ذلك، تم الإبلاغ عن عدد من أفراد الأسرة أن تتأثر وأكد تاريخهم اتصال هاتفي. وقد تم تعيين الأشخاص الذين قد لقوا حتفهم كما تتأثر إذا قيل لهم كان "المرض الأسرة" بأكثر من واحد من أفراد الأسرة أو من خلال سجلات المستشفى. تم الحصول على عينات من الدم لعزل الحمض النووي.

الشكل 1
الأنساب من العائلات الخمس (AE) مع ADPSP. الأرقام المذكورة أعلاه رموز تشير العمر عند بداية.

A ثلاث نقاط على نطاق والدرجات الوظيفية، من تعديل بيهان ومايا اعتمد للدراسة. 13 درجة 1 يناظر المريض غير متناظرة مع وجود علامات الهرمية في الأطراف السفلية مع مشية عادية أو تشنجي فقط قليلا. الصف 2 يشير إلى المريض مع مشية تشنجية، وقادرة على المشي بشكل مستقل مع أو بدون دعم. الصف 3 يشير إلى chairbound أو مريض طريح الفراش.
وخضع خمسة مرضى من عائلة A، أربعة مرضى من العائلة B، أربعة مرضى من عائلة C، وثلاثة مرضى من عائلة D، بدءا من الصف 1-3 التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة والدراسات SSEP، والرنين المغناطيسي للدماغ والحبل الشوكي. لأسباب جغرافية كان المرضى من E الأسرة غير متوفر للدراسات اسريرية.
دراسات الربط الجينية

تم استخراج DNA الجينومية من الكريات البيض باستخدام إجراءات القياسية. تم تحديد المورثات الصغرية لSPG3، SPG4، وSPG6 مواضع. واحد من كل زوج التمهيدي ونهاية المسمى، وذلك باستخدام (γ- 32 P) ATP وكيناز عديد النوكليوتيد T4 (فارماسيا في مجال التكنولوجيا الحيوية).
وأجري تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) في نظام بيركن إلمر GeneAmp PCR 2400 باستخدام الشروط التي قدمها برجر وآخرون 14 مع تعديلات طفيفة: كانت التليين درجات الحرارة 59 درجة مئوية لمدة D2S400. 57 ° C لD14S266، D14S269، وD15S156. 55 ° C لD15S128 وD15S986.
تم احتساب الدرجات اللد عن طريق تحليل متعددة باستخدام برنامج LINKMAP من حزمة FASTLINK 15 مع علامات وضعه وفقا لخريطة Généthon. 16 وكانت علامات والمسافات (سم) المستخدمة لتحليل متعددة كروموسوم 2: D2S400- (0.0) - D2S352- (0.01) -D2S2351 - (0.01) - D2S2374 - (0.0) - D2S367. كروموسوم 14: D14S266- (6.0) -D14S269. كروموسوم 15: D15S128- (8.0) -D15S156.
تقنيات الكهربية

أجريت المركزي الساعة التوصيل السيارات (CMCT) القياسات على اليمين واليسار الخاطف القصيرة لإبهام اليد، العضلة ذات الرأسين العضدية، المتسعة الإنسية، عظام الساق الأمامية، باسطة القصيرة، والمبعدة لإبهام العضلات. وضعت القطب المشاركين في midpart من العضلات، وإشارة على القاصي وتر للتسجيل الكهربائي. تم تحديد عتبة السيارات كما أدنى كثافة التحفيز التي أعطت أثار لاستنساخه المغناطيسي المحتملة (MEP) مع اتساع تتجاوز 50 μV في خمسة المحفزات متتالية. طبقت التحفيز للمنطقة القشرية المقابل تمثل العضلات، على النحو المحدد في المنطقة مع عتبة أدنى المحرك. طبقت كل التحفيز مع استرخاء (غير سهل) العضلات. كانت كثافة التحفيز 1،5 × عتبة الحركية. طبقت تحفيز عنق الرحم وأسفل الظهر. تم قياس الكلية والرقبية القطنية الإختفاء وحسبت CMCTs.
وقد تم الحصول على SSEPs من تحفيز الأعصاب متوسط ​​اليسار واليمين في المعصم والأعصاب عظام الساق في الكعب الإنسي. وقد تم الحصول على SSEPs من الأعصاب متوسط ​​من وجهة Erbs، C7، من وإلى المنطقة التالية للتلم المركزي المقابل. سجلت SSEPs من الأعصاب عظام الساق من المنطقة الألوية، Th12، ومن المنطقة postvertex. كانت كثافة التحفيز نحو 50٪ أعلى من الحد الأدنى لانكماش مرئية للالقصيرة المبعدة لإبهام والمبعدة لإبهام العضلات. وقدمت تقريرا مفصلا للطريقة والبيانات المعيارية التي كتبها بيدرسن وTrojaborg. 17 وتمت مقارنة النتائج من جميع القياسات مع النتائج من الاصحاء مع التقدم في السن وارتفاع توزيعات مماثلة.
التصوير بالرنين المغناطيسي

أجريت الدماغ والحبل الشوكي MRI في 1.0 تسلا نظام فائق التوصيل (سيمنز الأثر). تم تصوير الدماغ باستخدام المحورية والاكليلية تدور مزدوج تسلسل صدى (مللي 2200/20/80 (الوقت التكرار (TR) / صدى الزمن (TE) / صدى الزمن (TE)))، والسهمي T1 المرجحة تدور الصور صدى (570 / 15 (TR / TE)). في النخاع الشوكي تم الحصول السهمي تدور مزدوجة الصور صدى (مللي 2200/20/80 (TR / TE / TE)) وT1 الصور المرجحة (500/15 (TR / TE)). تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي مماثلة في ضوابط صحية مطابقة للعمر والجنس. اثنين من أطباء الأشعة خبرة تقييم الصور من المرضى والضوابط وذكرت بتوافق الآراء لعلامات أمراض. تم تقييم المخ، المخيخ، جذع الدماغ، والنخاع المستطيل وجود ضمور على نطاق والدرجات ثلاث نقاط (0: لا ضمور؛ 1: ضمور خفيف؛ 2: ضمور شديد). احصي الآفات Hyperintense على T2 الصور المرجحة وولوحظ أي علامة أخرى من الأمراض. تم تقييم النخاع الشوكي لوجود ضمور في T1 الصور المرجحة وفحص للآفات hyperintense على T2 الصور مرجح.
إحصائيات

وتمت مقارنة العمر في توزيعات الحدوث قبل اختبار كروسكال واليس والمتوسطات التي كتبها t الاختبار. تم فحص العلاقة بين CMCT والارتفاع عن طريق الانحدار الخطي. وتمت مقارنة الترددات χ 2 الاختبار. واتخذت مستوى الدلالة 0.05.

النتائج

كان ميراث السائد واضح من الأنساب (الشكل 1). لم يكن لوحظ انتفاذ غير مكتملة. في الفحص السريري من 63 شخصا، 30 استوفى معايير مؤشر ADPSP 3 (الجدول 2). وسجل اثني عشر شخصا من عائلات A، B، C، D و0-1، 1 أو 2، تسعة منهم ليس لديه أعراض، ولكن كشف علامات في الامتحان. وكان ثمانية عشر شخصا من دون أي أعراض أو علامات ADPSP (مؤشر ADPSP 0). في جميع المرضى كان بداية غدرا وتقتصر على الساقين.

الجدول 2
مؤشر التشخيص والعمر عند بداية ومدة المرض، ودرجة الإعاقة (متوسط، المدى) في خمس عائلات مع ADPSP

الجدول 2 يبين الأعمار في بداية في الأسر الخمس. سن بداية المتنوعة داخل وبين العائلات على حد سواء، إلا أن خمسة توزيع الأعمار في بداية لا تختلف كثيرا ووجدنا هناك فرق الجنس. لم نكن قادرين على تحديد وقت مبكر أو متأخر الأسر الظهور الموافق المعايير المقترحة من قبل هاردينغ، 18 فيما عدا أسرة B. التي قد تكون عائلة بداية مبكرة. تم العثور على ميزة وليس وصفها من قبل في الأسر A و E، التي كان خمسة أعضاء بداية الطفولة غير تقدمية في حين كان غيرهم من أفراد الأسرة المصابين المراهق التدريجي أو بداية البالغين. 32 أزواج الآباء والأبناء ومنهم من تضرر كل من الأم والطفل (مؤشر ADPSP 3)، وقعت بداية من ADPSP في العقد السابق من الحياة في الطفل مما كانت عليه في الأصل في 24 زوجا ("المجموعة تحسبا") وفي العقد نفسه أو في عقد لاحق في ثمانية أزواج (P <0.01). للقضاء على التحيز التثبت المباشر، تم استبعاد اثنين من أزواج الآباء والأبناء التي تضم مرضى مؤشر. من 30 زوجا المتبقية 22 كانوا في مجموعة الترقب وكان هذا لا يزال فائض كبير (P <0.02)، مما يشير إلى الترقب. وكان متوسط ​​العمر عند بداية للنسل في نقل الأب 20.6 عاما، وعلى نقل الأمهات 27.2 عاما ولكن الفرق لم يكن كبيرا. في كل خمس أسر كان المتوسط ​​لدرجة العجز 2 وهو ما يتفق مع المسار إلى حد ما "حميدة" من ADPSP. رجلين من الأسر C (II-3) وE (II-1)، مع تقدم العمر عند بدء في 40 و 41 عاما هم المرضى chairbound الوحيد. في كلتا الحالتين كان المرض التدريجي بسرعة مع مدة تسعة فقط و 12 عاما حتى تم يجمد فيها.
الجدول 3 يلخص توزيع المظاهر السريرية المحدد في 30 مريضا مع مؤشر ADPSP 3. جميع المرضى، باستثناء ثلاثة مع ظهور الأعراض من مرحلة الطفولة، وكان معالم السيارات العادية. وكانت الأعراض الأولية الأكثر شيوعا تصلب في الساقين (93٪)، تليها الأحذية السريعة البالية، وخاصة في الخارج في الجبهة (87٪)، وعدم الثبات بالمشي (87٪). كعرض أواخر أفيد انخفاض آلام الظهر بنسبة 47٪ من المرضى.

الجدول 3
الأعراض والعلامات في 30 من الأشخاص المتضررين (مؤشر ADPSP 3) في الأسر الخمس

لاختبار وجود ارتباط بين مدة المرض وحدوث ستة الخصائص السريرية تم تقسيم المرضى الذين يعانون من مؤشر ADPSP 3 إلى مجموعتين وفقا لما إذا كانت مدة المرض كان أكثر أو أقل من 10 عاما. حدث انخفاض آلام الظهر لأقل نسبيا المرضى إذا كانت مدة المرض كان أقل من 10 عاما مما لو كانت مدة أكثر من 10 سنة (2 من 7 = 29٪ ضد 12 من 23 = 52٪). أيضا لفرط المنعكسات العلوي أطرافه، وضعف في الساقين، وانخفاض الشعور الاهتزاز، والأعراض البولية، ورأرأة النسب كانت أقل لمجموعة من المرضى الذين يعانون من قصر مدة. ومع ذلك، ربما يرجع ذلك إلى أي مجموعات صغيرة من الاختلافات كانت كبيرة.
وقد تم الحصول على عشرات اللد إيجابية للعلامات SPG4 على الصبغي 2P مع أقصى درجة متعددة اللد للالجمع بين خمس عائلات من Z = 8.60 (لا تظهر البيانات).
يحلل الربط في مواضع ADPSP على الكروموسومات أظهرت 14Q و15q recombinations في كل واحد منهم في كل خمس أسر. لذلك النمط الظاهري من غير المرجح أن يكون سبب حدوث تحور في جين ينتمون إلى واحدة من تلك مواضع اثنين. وهكذا تحليل الربط تقتصر موضع ADPSP إلى الكروموسوم 2p21-P24 (SPG4) في كل من أسر خمسة.
في الفحص الكهربية كانت SSEPs وضعها الطبيعي في تحفيز الأعصاب الوسيطة في 15 من 16 مريضا. قدم أحد المريض إطالة طفيف في الوقت التوصيل المركزي. في تحفيز الأعصاب الظنبوب تم العثور على 11 من 16 وضعها الطبيعي. كانت تشوهات في خمسة مرضى بسيطة وتافهة، تقتصر في معظمها على الأطراف السفلية. الرسم البياني مبعثر في الشكل 2 يوضح CMCT في مللي تآمر ضد الارتفاع. لأصابع الباسطة القصير للقيم CMCT تميل إلى أن تكون أعلى للمرضى من لضوابط. لضوابط القيم CMCT زادت في المتوسط ​​مع ارتفاع. وقد لوحظ اتجاه مماثل للمرضى، ولكن الانحدار ليس كبيرا، وربما يعود ذلك إلى عدد قليل. بالنسبة للمرضى ويبدو أيضا أن النقاط المنتشرة إلى حد أكبر حول خط الانحدار مقارنة مع الضوابط. لم نعثر على أي خلافات بين العائلات الأربع وعدم وجود ارتباط بين السن عند بداية ومدة المرض، أي علامة واحدة، والنتائج العصبية.

الرقم 2
المركزي الساعة التوصيل السيارات (CMCT) ضد ارتفاع في 16 مريضا مع ADPSP والضوابط. مجلس التنمية الاقتصادية = باسطة القصيرة. APB = المبعدة لإبهام القصيرة. الدوائر شغل = المرضى. الدوائر المفتوحة = الضوابط. خطوط الانحدار (1) و (4) للمرضى، (2) و (3) لترد على الضوابط: (1) CMCT = -19.46 + 0.23 × الارتفاع. (2) CMCT = 2.20 + 0.08 × الارتفاع، (ن = 28)؛ (3) CMCT = 6.07 + 0.01 × الارتفاع، (ن = 50)؛ (4) CMCT = 1.64 + 0.04 × الارتفاع. كان معامل الانحدار 0.08 أكبر بكثير من 0 (P = 0.01).

التصوير بالرنين المغناطيسي كشف ضمور النخاع الشوكي معتدل في شقيقان من عائلة C؛ في المريض II-1 على مستوى ث 4-6 وII-7 على مستوى ث 3-7. ومع ذلك، أفيد هذه النتيجة عن طريق الأشعة واحد فقط. تم العثور على ضمور القشرية المعتدلة في مريض واحد من الأسرة D (II-10)، وكذلك في عنصر تحكم واحد، سواء كبار السن من 50 عاما. وشوهدت آفات النظر hyperintensity البيضاء في نصفي الكرة المخية في ستة مرضى من عائلات مختلفة أربعة، مقارنة مع شخصين في 15 الضوابط (6 من 16 = 38٪ ضد 2 من 15 = 13٪، والفرق ليس كبيرا). لم اجه المخيخ أو ضمور الدماغ.

نقاش

الربط تحليلات تقتصر موضع ADPSP في كل خمس أسر في الكروموسوم 2p21-P24. وبالتالي فإن الأسر تمثل واحدة ونفس النوع من ADPSP.
كان Interfamilial والاختلاف داخل الأسرة في سن بداية اضح. تذبذب داخل الأسر قد يعكس حقيقة أن العمر عند بداية قد يكون من الصعب للغاية حتى الآن على وجه التحديد، وخاصة في ADPSP، وهو اضطراب ببطء تدريجي، والتي الأعراض يمكن أن تمر مرور الكرام لسنوات كما يتضح من تسعة مرضى من بين 12 مع مؤشر ADPSP 0-1 و 1 و 2.
لم نجد قفزات جيل. وذكر انتفاذ غير مكتملة من قبل بولو وآخرون 19 ولكن كما ذكرت نسبة عالية من المرضى الذين يعانون أعراض في ADPSP يجعلها محفوفة بالمخاطر للنظر تتأثر كما سلف الذين لم يتم فحصها.
هذه الظاهرة من الترقب قد يكون نتيجة لتحيز تجنيد لصالح الأسر التي يتم اكتشاف المرض في وقت سابق من الأطفال مما كانت عليه في الآباء والأمهات على النحو الذي اقترحه Dürr ألف آخرون 11 أو ظاهرة بيولوجية كما هو مبين على الأقل في حالات "خلقي" ADPSP ينظر في الأسر ألف وهاء وغيرها جسمية الاعصاب اضطرابات يورث مثل مرض هنتنغتون، 20 ضمور dentatorubropallidoluysian، 21 وماتشادو يوسف المرض 22 حالة الترقب راسخة والناجم عن استطالة futher للتوسع CAG تكرار في الجينات المعنية.
مثل الدر وآخرون 11 لم نعثر على أي تحيز الوالدين ولكن كان هناك اتجاه نحو انخفاض سن بدء في النسل عندما أحيل جين المرض أبويا مقارنة مع انتقال الأمهات، الذي يوصف أيضا في علاج الاضطرابات العصبية الثلاث المذكورة أعلاه.
كان التباين المظهري واضح، على الرغم من أن المعالم الأساسية لADPSP وأعرب عن متجانس في جميع المرضى. ومع ذلك، وآلام الظهر منخفضة، لا ترتبط سابقا مع ADPSP، كان ينظر في كل خمس أسر، وربما هذا العرض قد يكون نتيجة للشاقة، مشية قعسي من هؤلاء المرضى. خلل تناوبية الحركات، قد تكون ذات صلة رأرأة، والتلفظ إلى الدماغ أو مشاركة المخيخ. ومع ذلك، وقعت تلك الميزات في أقلية من أعضاء المتضررين فقط، وليس في الآخرين من نفس العائلة وأبدا في probands. ولذلك، لا تزال مدرجة تلك الأسر في فئة ADPSP نقية وإصابات أجهزة متعددة، وفقا لتقييم البصرية، والدماغ، أثار الحسية الجسدية الإمكانات، وقد اقترحت الدراسات حركات العين رمشي من قبل الآخرين أيضا. 11 17 23 24
وربما يرجع ذلك إلى اختلافات في المعايير السريرية، في شدة ومدة المرض، والتباين الوراثي، واختلاف تشريحي، وتقنيات التسجيل أن الدراسات العصبية من ADPSP يتعارض نوعا ما، ومتضاربة. لدينا في SSEPs المواد من الأطراف العلوية كانت طبيعية في 15 من 16 مريضا وفقا للتوزيع أعراض وعلامات ADPSP ونتائج بروين وآخرون 25 من 11 من 16 مريضا كانوا SSEPs من الأطراف السفلية ضمن طبيعي مجموعة في حين أن التشوهات في خمسة مرضى كانت طفيفة وضئيلة فقط، وهو على النقيض من ذلك مع نتائج بروين وآخرون، الذين كتبوا عن الشاذ SSEPs عظام الساق العصبية في 20 من 32 مريضا مع ADPSP من تسعة الصلات الأسرية الميراث غير المبلغ عنه في مقابل واحد من 17 ضوابط.
في دراسة CMCT لدينا، التي يؤديها التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة، وكانت من أعضاء البرلمان الأوروبي الأطراف العلوية والسفلية فقط ضمن المعدل الطبيعي، وجدت لا يوجد فرق كبير، مقارنة مع الضوابط، وبين أو داخل الأسر. ومع ذلك، كان هناك ميل لتأخر البرلمان الأوروبي في الأطراف السفلية. في دراسة قام بها نويل وآخرون 7 تم فحص أربعة مرضى ADPSP مع تسجيلات من كل أطرافه العلوية والسفلية. كان لديهم القيم الطبيعية للتسجيلات الطرف العلوي في ثلاثة مرضى ولكن القيم غير طبيعي لأطرافه السفلى في جميع المرضى الأربعة. وثمة مشكلة رئيسية في معظم الدراسات السابقة، ومع ذلك، هو ما إذا كان يتم تطبيق التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة مع كثافة كافية لاستحضار MEP. تأخر أو أن ينظر أعضاء البرلمان الأوروبي غائبة في المرضى الذين يعانون من زيادة عتبة الحركية. في دراستنا لذلك طبقنا التحفيز المغناطيسي عبر الجمجمة مع كثافة المتعلقة عتبة الحركية ونتائجنا تشير إلى أن التوصيل في مسارات السيارات المركزية في معظم الحالات أمر طبيعي وأن إزالة الميالين في أول الخلايا العصبية الحركية ليست ظاهرة المرضية الرئيسية. ولذلك، فإننا نقترح أن آلية الشوكي المحلية قد تكون أيضا تشارك في التسبب في والتشنج.
في دراسة التصوير بالرنين المغناطيسي وصفت ضمور النخاع الشوكي الصدري في شقيقان ولكن فقط عن طريق الأشعة واحد. وهكذا يبدو أن ضمور النخاع الشوكي قد يكون من الصعب تقييم ويفترض أن إيجاد متأخر جدا كما تقييمها نوعيا من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي. أيضا دراسة التصوير بالرنين المغناطيسي للمرضى من عائلة مع X مرتبطة النقي خزل سفلي تشنجي وراثي كشف الحبل الشوكي الطبيعي في المريض الوحيد الذي كان له الحبل الشوكي MRI تنفيذها. 26 MRI للمخ، المخيخ، وكان الدماغ العادي معظمها في مرضانا. Ormerod وآخرون 10 تقريرا عن سبعة مرضى الذين يعانون من مرض وراثي جسمي خزل سفلي تشنجي وراثي إما في شكل نقي (خمس حالات) أو مع ميزات إضافية الذي كان الرنين المغناطيسي للدماغ يقوم به. كان مريض واحد مع شكل نقي الآفات المسألة hyperintensity البيضاء في حين كان التصوير بالرنين المغناطيسي الطبيعي في أربعة مرضى آخرين مع ADPSP. وجدنا الآفات المسألة hyperintensity البيضاء في أقدم ستة مرضى ADPSP مقارنة مع اثنين من الضوابط وفقا للتقصي من زيادة خطية تقريبا في عدد من المتطوعين المصابين بآفات مسألة hyperintensity بيضاء مع الشيخوخة للرجال والنساء في دراسة التصوير بالرنين المغناطيسي من 142 صحي الناس كريستيانسن وآخرون 27
في الختام، الميزات الأساسية السريرية لADPSP مرتبطة أبديت متجانس في جميع المرضى الكروموسوم 2p21-P24 لكن تم العثور على بعض الأعراض والعلامات إلا في بعض الأسر وفقط في عدد قليل من المرضى من تلك الأسر، وهي ميزة في جزء قد تكون مسؤولة عن تعريف متفاوتة من ADPSP من دراسة إلى أخرى. وهكذا يبدو أن ADPSP قد يكون أكثر أو أقل "نقية"، وأنه "نقية زائد" قد توجد عائلات دون أن "معقدة"، ويفترض اعتمادا على حد سواء على طفرة معينة في الأسرة وعلى عوامل وراثية وبيئية غير معروفة تحوير كذلك. توقع، عمر متفاوتة في البداية، وعدم التجانس المظهري قد توحي بوجود تكرار ثلاثي النوكليوتيد غير مستقر كما الطفرة الجزيئية الكامنة، 28 ولكن المزيد من التحقيقات، بما في ذلك الدراسات الجينية الجزيئية، وسوف تكون هناك حاجة لتحديد الجينات المسؤولة ADPSP لتوضيح العمليات الفيزيولوجية المرضية والعمل على تسوية مسألة التصنيف.

شكر وتقدير

تم الحصول على دعم مالي من صندوق أبحاث الجمعية الطبية الدانماركية؛ مؤسسة مستشفى الدانماركية للبحوث الطبية، مقاطعة كوبنهاجن، جزر فارو، وغرينلاند. وسيغني وصندوق غريغرسن بطرس. صندوق لوند Benthine ليلى؛ واعترف الدكتور Eilif ترير هانسن وزوجته انو ترير هانسن صندوق الامتنان. أن هذه الدراسة لم يكن ممكنا من دون مشاركة من المرضى الذين يعانون من ADPSP وأسرهم.

المراجع

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #7  
قديم 11-22-2015, 10:38 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تكوين الوحدة الفرعية متغير والأنسجة محددة من الميتوكوندريا م -aaa البروتياز مجمعات ترتبط راثي مشلول الشلل النصفي

 

http://mcb.asm.org/content/27/2/758.full

البروتيني م -AAA، مجمع بروتين ATP التي تعتمد في الغشاء الداخلي الميتوكوندريا، يتحكم جودة البروتين وينظم التجمع الريبوسوم، وبالتالي ممارسة مهام التدبير المنزلي الأساسية داخل الميتوكوندريا. الطفرات في م -AAA البروتيني فرعية paraplegin تسبب انحطاط محور عصبي وراثي في الشلل النصفي التشنجي (HSP)، ولكن ليست مفهومة أساس لخصوصية الأنسجة غير متوقعة. Paraplegin يجمع مع مفارز Afg3l2 مثلي في المجمعات مغاير بلازميدة قليلة القسيمات التي يمكن أن تكون بديلا عن البروتياز الخميرة م -AAA، مما يدل على الحفظ وظيفية. وظيفة من paralogue الثالث، أعرب Afg3l1 في الماوس، غير معروف. هنا، نحن نحلل تجميع paraplegin إلى متر المجمعات -AAA ورصد الآثار المترتبة على نقص paraplegin في الخلايا الليفية HSP ونموذج الفأر لHSP. تكشف النتائج التي توصلنا إليها التغير في التجمع البروتياز م -AAA في الميتوكوندريا في الأنسجة المختلفة. يمكن تشكيلها Afg3l1 وAfg3l2 مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات والمجالس-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات كل من البروتينات مع paraplegin. وتبين الدراسات تكامل الخميرة النشاط بروتين من هذه التجمعات. نقص Paraplegin في HSP لا يؤدي إلى فقدان م -AAA نشاط الأنزيم البروتيني في الميتوكوندريا الدماغ. بدلا من ذلك، المجمعات Afg3l2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات تتراكم، ويمكن لهذه المجمعات بديلا عن مهام تدبير الشؤون المنزلية م المجمعات -AAA التي تحتوي على paraplegin. لذا فإننا نقترح تشكيل م البروتياز -AAA مع خصوصيات الركيزة تغييرها يؤدي إلى انحطاط محور عصبي في HSP.

الميتوكوندريا هي عضيات الأساسية وتنوعا. وتؤوي تلك المجمعات الجهاز التنفسي المنتجة للطاقة وتمثل المكان الرئيسي لإنتاج الأكسجين التفاعلي المحمول، ولكنها تحمل أيضا ردود فعل الابتنائية حاسمة وظائف مهمة خلال العمليات أفكارك والإشارات الخلوية. كشفت المسوحات البروتين الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة الثدييات المختلفة براعة كبيرة في تكوين البروتين من العضيات، والذي قد يعكس مختلف الاحتياجات الأيضية والمنشطة في خلايا مختلفة (14، 25). ونظرا لأهمية هذه العضيات لالفيزيولوجيا الخلوية، فإنه ليس من المستغرب أن الخلل الميتوكوندريا وقد تم ربط لمختلف الأمراض البشرية السائدة، بما في ذلك اضطرابات الاعصاب (9، 21، 34، 35). وقد تم تحديد الطفرات المسببة للأمراض في كل من البروتينات الميتوكوندريا الميتوكوندريا المشفرة والمشفرة النووية. ميزات مشتركة من اضطرابات الميتوكوندريا هي مجموعة متنوعة هائلة في شدة المرض وخصوصيات الأنسجة ملفتة للنظر. في حين أن هذا يمكن أن تكون على الأقل يفسر جزئيا heteroplasmy في حالة الطفرات الميتوكوندريا، وحاليا غير مفهومة عواقب الأنسجة محددة من الجينات المشفرة النووية المعيبة مع وظائف التدبير المنزلي.
ويتمثل ذلك من خلال استمارة مقهورة من الشلل النصفي التشنجي وراثي (HSP)، والذي كان سببه طفرات في paraplegin، وحدة فرعية من الحفظ ATP التي تعتمد م -AAA البروتيني في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا (29). فقدان النتائج paraplegin في انحطاط محور عصبي من الخلايا العصبية الحركية القشرية، مما أدى إلى جمود وضعف في الأطراف السفلية (8). دراسات مع خميرة الخباز الخميرة المخصصة النشاط المزدوج إلى البروتيني م -AAA لتدهور البروتين وتفعيل (27): أنه تجري مراقبة نوعية البروتين في الغشاء الداخلي ويحط بروتينات الغشاء nonassembled لالببتيدات (4، 22)؛ من ناحية أخرى، فإنه يتوسط معالجة البروتين وبالتالي ينشط بروتينات معينة الميتوكوندريا. وتشمل ركائز التي المشقوق بدلا من التي تدهورت بفعل البروتيني م -AAA السيتوكروم ج الغلوثانيون (12) والوحيدات الريباسي MrpL32 (26). انشقاق MrpL32 من قبل البروتيني م -AAA يضمن تجميع الريباسي وتخليق البروتين داخل الميتوكوندريا وضروري للتنفس (وبالتالي 26).
مثل كل مفارز المعروف البروتياز AAA، paraplegin ينتمي إلى الفصيلة AAA من ATPases ويتميز بوجود وحدة AAA أتباز الحفظ (15). على الرغم من تورطه في أنشطة الخلوية المتنوعة، وهي سمة مشتركة من البروتينات AAA هو أنها تنشط على التجمع هومو أو مغاير بلازميدة قليلة القسيمات فقط. ويفسر هذا من خلال تفعيل النشاط أتباز عن طريق التواصل بين المجالات بين المجالات المجاورة AAA (18، 28). وفقا لذلك، والبروتيني الخميرة م -AAA يشكل مجمع مغاير بلازميدة قليلة القسيمات مبنية من مثلي Yta10 (Afg3) وYta12 (Rca1) مفارز؛ هو المعطل المجمع في غياب فرعية واحدة (4). البروتينات مثلي لYta10 وYta12 موجودة بتواجد مطلق في الخلايا حقيقية النواة متعددة الخلايا (17)، ولكن من المفهوم وظيفة الثدييات البروتياز م -AAA سيئة فقط. وكشفت الدراسات تكامل حفظ الوظيفي للم البروتياز -AAA في الخميرة والثدييات وحددت مجموعة معقدة من paraplegin الثدييات وAfg3l2 (لAFG3 تشبه الجين 2) كما orthologue ظيفية من الخميرة م -AAA البروتيني (5، 26). نموذج الفأر لHSP تفتقر paraplegin يعيد الميزات الهامة من الأمراض التي تصيب البشر ويكشف التدريجي وخلية محددة تنكس محواري في الهابطة طويلة والصعود مساحات في العمود الفقري، في الأعصاب البصرية، والأعصاب الوركي (13). ميزات عصبية مرضية والأدلة التجريبية تشير إلى أن تنكس محور عصبي يرجع في النهاية إلى نقل محور عصبي ضعف. ومع ذلك، واحدة من العلامات الأولى للأمراض هو مظهر من الميتوكوندريا العملاقة وغير طبيعي من الناحية الهيكلية في المناطق البعيدة من المحاور، مما يدل على أن ضعف الميتوكوندريا محددة العصبية يطلق شلال المرضية (13). استنساخ النمط الظاهري الإنسان في نموذج الفأر لافت للنظر باعتبار أن ونديد إضافية من paraplegin، Afg3l1 (لAFG3 تشبه جينات 1)، موجود في الفأرة ولكن المشفرة من قبل جين كاذب في البشر (20).
عواقب الأنسجة محددة من فقدان paraplegin محيرة، وظائف التدبير المنزلي الحاسمة من البروتيني م -AAA، مثل تجهيز الوحيدات الريباسي MrpL32، يتم حفظها من الخميرة للثدييات (27). ومن المتوقع أن يؤدي إلى عيوب في الفسفرة التأكسدية نضوج ضعاف من MrpL32 في الميتوكوندريا الثدييات. ومع ذلك، في حين أن أوجه القصور في التجمع من مجمع لقد تم الإبلاغ عن HSP الليفية المريض (5)، لوحظت فقط العيوب تنفسية خفيفة في الأنسجة الماوس paraplegin ناقصة (13). في الآونة الأخيرة، وقد تم ربط paraplegin لتجهيز بروتين من OPA1 (16)، وهي تشبه dynamin GTPase المحفوظة في الغشاء الداخلي الذي ينظم ديناميات الميتوكوندريا (10). الطفرات في OPA1 سبب وراثي جسمي ضمور العصب البصري المهيمن تتميز خسارة في خلايا الشبكية (1، 11). كما الموسع والميتوكوندريا غير طبيعية تتراكم في المراحل المبكرة في المحاور في Spg7 - / - الفئران (13) ويلاحظ ضمور العصب البصري وأحيانا في أشكال معقدة من HSP وفي نموذج paraplegin الماوس (8، 13)، قد يتم تجهيز OPA1 ضعف من أهمية المسببة للأمراض.
للحصول على مزيد من الإيضاحات بشأن العواقب المترتبة على فقدان paraplegin، في هذه الدراسة، قمنا بتحليل تجميع المفترضة م مفارز -AAA البروتيني في الفئران والإنسان الميتوكوندريا. ونحن لشرح الاختلافات الأنسجة محددة في الوفرة النسبية للم مفارز -AAA البروتيني في الماوس وتقلب غير متوقع في جمعيتهم. وتشكل كل من Afg3l1 وAfg3l2 مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات وكذلك المجالس-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات التي تحتوي على paraplegin. وتشير دراساتنا أن الجمعية تغير من مفارز مثلي بدلا من فقدان كامل للم -AAA نشاط الأنزيم البروتيني ذو أهمية المسببة للأمراض في HSP.
المواد والأساليب

استنساخ الإجراءات على سبيل التعبير في الخميرة، وتنصهر في شكل ناضج من الفئران Afg3l1 (الأحماض الأمينية 25-789) إلى الميتوكوندريا استهداف تسلسل Yta10 (الأحماض الأمينية 1-61). تم استنساخ A جزء HindIII / BamHI DNA التي تحتوي على مروج YTA10 (480 بي بي) وبي بي 1-183 من YTA10 وجزء BamHI / KpnI DNA التي تحتوي على بي بي 73-2367 من Afg3l1 إلى البلازميد YEplac195 multicopy. وعلقت A حاتمة ج. Myc على لمحطة C من Afg3l1 للسماح للمناعي من البروتين الهجين Yta10 (1-61) -Afg3l1 (25-789) -Myc. البلازميدات الخميرة السماح تعبير مغايرة من AFG3L2 البشرية (hAFG3L2) -Myc (في YEplac112 ADH1)، الفئران Afg3l2-هيماغلوتينين (في YEplac112 YTA10)، وparaplegin (في YEplac181 YTA10) والبلازميدات pGEM4-Atp7 وpGEM4-Yme2ΔC لSP6-البلمرة وقد وصفت التعبير -driven في المختبر سابقا (5، 19، 26).
تم المعطل م -AAA مفارز البروتيني من استبدال بقايا الغلوتامات ناشطة تحفيزيا داخل مراكز بروتين مع بقايا الجلوتامين باستخدام QuikChange موقع الموجه عدة الطفرات (Stratagene). وقد تبدل الكودونات منها على النحو التالي: أكاديمية الخليج للطيران إلى الجهاز المركزي للمحاسبات عن hAFG3L2 (الأحماض الأمينية 575) والفئران Afg3l2 (الأحماض الأمينية 574) وGAG لCAG لparaplegin الفئران (الأحماض الأمينية 575) وAfg3l1 (الأحماض الأمينية 567). استخدمت [أليغنوكليوتيد التالية: 5'-GGT CGC CTT CCA TCA GTC TGG CCA TGC C-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-GGC ATG دول مجلس التعاون الخليجي AGA CTG ATG غا GGC GAC C-3" (التمهيدي العكسي) لparaplegin الفئران ؛ 5'-CTG TAG CCT ACC ACC AGG CTG GGC ATG CAG-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-CTG CAT دول مجلس التعاون الخليجي CAG CCT GGT GGT AGG CTA CAG-3" (التمهيدي العكسي) لالفئران Afg3l1. و5'-CGG TGG CTT ACC ACC AAG CAG دول مجلس التعاون الخليجي ATG CGG-3 "(التمهيدي إلى الأمام) و5'-CCG CAT GGC CTG CTT GGT GGT AAG CCA CCG-3" (التمهيدي العكسي) لالفئران Afg3l2. تم التحقق من الطفرات من تسلسل الحمض النووي.

سلالات الخميرة وظروف النمو. سلالات خميرة الخباز المستخدمة في هذه الدراسة هي مشتقات من W303. تم الحصول على yta10 Δ yta12 Δ (YKO200) سلالة من حذف YTA12 في Δ yta10 (YGS101 [3]) سلالة بواسطة PCR تستهدف إعادة التركيب مثلي باستخدام الحذف كاسيت kanMX6 (23). yta10 Δ yta12 Δ سلالات التعبير عن الإنسان أو تم إنشاء البروتياز الفئران م -AAA (انظر الجدول S1 في المواد التكميلية) من خلال التحول من YKO200 الخلايا مع البلازميدات YEplac112 ADH1 -Yta10 (1-61) -hAFG3L2 (36-798) -Myc، YEplac181 YTA10 -Yta10 (1 -61) -paraplegin (44-781)، YEplac195 YTA10 -Yta10 (1-61) -Afg3l1 (25-789) -Myc، وYEplac112 YTA10 -Yta10 (1-61) -Afg3l2 (36-802) -HA أو البلازميدات ترميز المتغيرات موقع بروتين منها (5، 26).
كانت تزرع خلايا الخميرة وفقا للاجراءات المتبعة عند 30 درجة مئوية في أي من الخميرة، ببتون المتوسط ​​أو الحد الأدنى من المتوسط ​​تستكمل مع auxotrophs المطلوبة. اثنين في المئة (وزن / المجلد) الجلوكوز، أو لعزل الميتوكوندريا، 2٪ (وزن / المجلد) اللبن و 0.5٪ (وزن / المجلد) اللاكتات، أو لفحص نمو الجهاز التنفسي، أضيفت 3٪ (وزن / المجلد) الجلسرين كما مصادر الكربون.

تم تنفيذ BN-PAGE. الأزرق الأصلي الكهربائي هلام بولي أكريلاميد (BN-PAGE) أساسا كما هو موضح سابقا (30). تم solubilized بروتينات الميتوكوندريا (150 ميكروغرام) المعزولة من الخميرة أو الخلايا الليفية الأولية الإنسان بتركيز 5 ملغ / مل في 1٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 5 ملي ε-جذر الأمينو ن حمض -caproic، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم ATP. بعد زيادة ونقصان توضيح لمدة 30 دقيقة في 125،000 × ز، تم تحميل مقتطفات الصعود إلى 3-13٪ (وزن / المجلد) هلام بولي أكريلاميد. تم الكشف عن مفارز الفردية المجمعات البروتيني م -AAA التي كتبها immunoblotting.

تم solubilized تحليل الترشيح هلام مقتطفات الميتوكوندريا. الميتوكوندريا الخميرة المعزولة التي تحتوي على hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (البروتين 1 ملغ الميتوكوندريا) بتركيز 5 ملغ / مل في 1٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 150 ملي K-خلات، ودرجة الحموضة 7.4، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، 1 ملي ATP. وهي lysed الفئران (1 ملغ الميتوكوندريا البروتين) بتركيز 5 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، 50 ملي كلوريد الصوديوم، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 4 مم - الميتوكوندريا الكبد من Spg7 - / MG-خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF. تمت إزالة المواد Nonsolubilized بواسطة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 125،000 × ز، وتعرض طاف لاستبعاد حجم اللوني باستخدام عمود Superose 6. تم جمع البروتينات مزال في الكسور 500 ميكرولتر، حمض ثلاثي كلور أسيتيك (TCA) عجل، وتحليلها بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS) -PAGE وimmunoblotting. وتم قياس كمية البروتينات الموجودة في الكسور شطافة التي كتبها كثافة الليزر.

تقرير من الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني. لمقارنة كميات النسبية paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا، وقد تم تحليل المستخلصات الميتوكوندريا التي كتبها SDS-PAGE وimmunoblotting. كانت مجزأة مقتطفات تحتوي على كميات مماثلة من Afg3l1 بواسطة SDS-PAGE وتحليلها بواسطة immunoblotting باستخدام Afg3l1-، paraplegin-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة و، من أجل السيطرة، الأجسام المضادة الموجهة ضد الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha). وتم قياس كمية البروتين كميات باستخدام نظام التصوير القائم على مضان (أوديسي؛ LI-COR العلوم البيولوجية). تم تطبيع إشارات لAfg3l2 وparaplegin باستخدام Afg3l1 كعنصر تحكم التحميل. تم احتساب الكمية النسبية للparaplegin وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا كنسبة من إشاراتها في كل التحضيرات الميتوكوندريا.

Coimmunoprecipitation وimmunodepletion على سبيل التجارب مناعي، وهي lysed الميتوكوندريا الفئران (400 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) بتركيز 1 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم PMSF تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز (روش). بعد زيادة ونقصان توضيح لمدة 15 دقيقة في 125،000 × ز، تم تحميلها مقتطفات على البروتين الخرز-A سيفاروز (2 ملغ) إلى جانب الأجسام المضادة تنقية تقارب أو مصل preimmune والمحتضنة لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية تحت الهز لطيف. وكانت تغسل حبات في وقت لاحق مع 0.5٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 1 ملم PMSF، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4. ومزال المجمعات الضد مستضد من الخرز ومجزأة على أساس للا مائية وذلك باستخدام 1٪ (وزن / المجلد) تريتون-X114 و 1٪ (المجلد / المجلد) حمض الخليك. تم انتشال البروتينات مزال من الكسر المنظفات التي كتبها TCA هطول الأمطار وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting.
وأجريت التجارب Immunodepletion باستخدام كميات تشبع من Afg3l2 أو الأجسام المضادة Afg3l1C بالإضافة إلى البروتين الخرز-A سيفاروز (10 ملغ). وهي lysed الميتوكوندريا (150 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) بتركيز 0.5 ملغ / مل في 2٪ (وزن / المجلد) ديجيتونين، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0، 50 ملي كلوريد الصوديوم، عازلة 50 ملي K-الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0 ، 4 ملي المغنيسيوم خلات، 10٪ (وزن / المجلد) الجلسرين، 1 ملم PMSF تستكمل مع كوكتيل مثبط البروتياز (روش) وتطبيقها على البروتين الخرز جانب الضد-A سيفاروز. أجريت الأمطار خارج كما هو موضح أعلاه. تعرض خمسين في المئة من الكسر طاف من هطول الأمطار (الموافق 75 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) لهطول الأمطار TCA، SDS-PAGE، وimmunoblotting.

وأثيرت الأجسام المضادة. الأجسام المضادة الموجهة ضد متر -AAA مفارز البروتيني في الأرانب (BioGenes، ألمانيا) باستخدام الببتيدات الموافق الأحماض الأمينية 121-139 من paraplegin الفئران (C-PEDDEEEKRRKEREDQMYR)، إلى الأحماض الأمينية 90-103 من Afg3l2 (C-KEAVGEKKEPQPSG ) والأحماض الأمينية 104-118 (C-NAGPGGDGGNRGGKG) أو الأحماض الأمينية 771-785 (C-WNKGREEGGTERGLQ) من Afg3l1 (Afg3l1 وAfg3l1C، على التوالي) المناعي النوعي غس الدولية المختصة بالسلع وتنقيته من الأمصال التي كتبها immunoabsorption على الببتيد، مترافق SulfoLink مصفوفة (بيرس) واختباره من قبل immunoblotting ومناعي من الميتوكوندريا yta10 Δ Δ yta12 الخميرة التي تحتوي إما paraplegin، Afg3l1 أو Afg3l2. تم التحقق من خصوصية Afg3l1 وAfg3l2 أمصال مضادة أيضا باستخدام شظايا البروتين الذي يحتوي على مناطق المستضدات المقابلة أعرب في القولونية.
تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المتاحة تجاريا للمناعي من الوحيدات 39 كيلو دالتون من مجمع I (Ndufa9؛ المسابر الجزيئية)، الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha؛ المسابر الجزيئية)، ج. Myc على (9B11؛ خلية اشارة التكنولوجيا )، والحواتم هيماغلوتينين (3F10؛ روش).

. متنوعة تم تنفيذ الإجراءات التالية أساسا كما هو موضح سابقا: عزل الميتوكوندريا من الخميرة، والخلايا الليفية الإنسان، والأنسجة الفئران (6، 24، 33)؛ توليف preproteins الميتوكوندريا رديولبلد. posttranslational استيراد البروتين في الميتوكوندريا المعزولة. والتحلل البروتيني من البروتينات المستوردة حديثا (33).

النتائج

مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا الإنسان. Paraplegin وhAFG3L2 مفارز تجميع في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا البشري إلى نشطة وظيفيا البروتيني م -AAA التي كون تشكيلها هو ضعف في خلايا المريض HSP تفتقر paraplegin (5). والمثير للدهشة، تم الكشف عن مجمع عالية الجزيئية الكتلة تحتوي على hAFG3L2 عندما تم solubilized الميتوكوندريا المعزولة من-paraplegin نقص الخلايا الليفية HSP في ديجيتونين وتحليلها بواسطة BN-PAGE. وكانت الكتلة الجزيئية لهذا المجمع ~900 كيلو دالتون ومماثلة لتلك التي للمغاير بلازميدة قليلة القسيمات م -AAA البروتيني تحتوي على hAFG3L2 وparaplegin موجودة في البرية من نوع البشري الميتوكوندريا (الشكل 1A).

تين. 1.
hAFG3L2 يشكل م -AAA مجمع البروتيني-وطي بلازميدة قليلة القسيمات مع نشاط بروتين. (A) مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا الليفية HSP. تم solubilized الميتوكوندريا في ديجيتونين وتحليلها بواسطة SDS-PAGE (50 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين، اللوحة العليا) أو BN-PAGE (150 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين، اللوحة السفلى)، تليها immunoblotting باستخدام paraplegin محددة (اللوحة العليا) وhAFG3L2 محددة ( العلوي والسفلي لوحة) أمصال مضادة. من أجل السيطرة، كانت مجزأة الخميرة yta10 Δ Δ yta12 تحتوي على hAFG3L2 الميتوكوندريا التي كتبها BN-PAGE بشكل متواز. واستخدمت ثايروجلوبولين (669 كيلو دالتون) وصميم الفريتين (443 كيلو دالتون) للمعايرة. (B) صيانة نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ Δ yta12 خلايا الخميرة التي كتبها hAFG3L2. البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا، وyta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا عن hAFG3L2 أو البديل غير نشط proteolytically hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ)، وقد نمت على تخمر (خلاصة الخميرة، ببتون-سكر العنب [YPD]) و nonfermentable (وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلسرين [YPG]) مصادر الكربون في 30 ° C. (C) المجمعات hAFG3L2-هومو بلازميدة قليلة القسيمات في yta10 Δ الميتوكوندريا yta12 Δ. وأعرب عن hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ) في الخلايا Δ Δ yta10 yta12، وتم عزل الميتوكوندريا. بعد الإذابة في المخزن التي تحتوي على ديجيتونين، كانت مجزأة مقتطفات الميتوكوندريا (1 ملغ الميتوكوندريا البروتين) من خلال Superose 6 التحجيم اللوني. وكسور شطافة TCA عجل وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام الأجسام المضادة hAFG3L2 محددة. وكان كميا hAFG3L2 (المربعات شغل) أو hAFG3L2 E575Q (الدوائر شغل) موجودة في الكسور شطافة التي كتبها كثافة الليزر، ويتم إعطاء النتائج كنسبة مئوية من البروتين منها في شطافة الإجمالية. مجمع أصغر hAFG3L2 التي تحتوي على، وضع علامة مع علامة النجمة، أكثر النتائج المحتملة من التفكك الجزئي للمجمع كبير. تم استخدام البروتينات علامة التالية للمعايرة: 1، Hsp60 (840 كيلو دالتون)؛ 2، صميم الفريتين (443 كيلو دالتون)؛ 3، نازعة الكحول (150 كيلو دالتون)؛ 4 البقري albumine المصل (66 كيلو دالتون). (D و E) تجهيز MrpL32 الخميرة وCCP1 التي كتبها hAFG3L2. تم تحليل معالجة البروتين في البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ Δ yta12 الخلايا، وyta10 Δ Δ yta12 الخلايا معربا إما hAFG3L2 أو hAFG3L2 E575Q (hAFG3L2 EQ) بواسطة SDS-PAGE. تم رصد (D) نضوج MrpL32 (L32) في الميتوكوندريا المعزولة (30 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من خلال immunoblotting باستخدام أمصال مضادة بولكلونل موجهة ضد ناضجة وأشكال السلائف من MrpL32 و، ​​كما تحكم التحميل، ضد المترجمة مصفوفة Mge1. تم فحص معالجة (E) CCP1 في مقتطفات الخلية باستخدام أمصال مضادة موجهة ضد CCP1 و، من أجل السيطرة، وبروتين الغشاء الخارجي Tom40. ص، السلائف. م، شكل ناضج. (F) تدهور للبروتينات غشاء nonassembled التي كتبها hAFG3L2 أعرب في الخميرة. تم استيرادها رديولبلد Yme2ΔC (اللوحة العليا) أو Atp7 (اللوحة السفلى) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 25 مئوية في الميتوكوندريا المعزولة من سلالات الخميرة المستخدمة لوحات D و E. استقرار البروتينات المستوردة حديثا في 37 ° C تم تحديدها من قبل SDS- PAGE وتصوير الإشعاع الذاتي. يظهر بمعدل ثلاث تجارب مستقلة (± الخطأ المعياري للمتوسط). الساحات شغلها، النوع البري. مثلثات شغلها، yta10 Δ Δ yta12. مثلثات مفتوحة، yta10 Δ Δ yta12 + hAFG3L2. الساحات المفتوحة، yta10 Δ Δ yta12 + hAFG3L2 E575Q.

لدراسة ما إذا كانت hAFG3L2 يجمع مع AAA البروتيني فرعية أخرى أو يشكل مجمع وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الغشاء الداخلي، عبرنا عن البروتين في خلايا الخميرة yta10 Δ Δ yta12 تفتقر إلى أي الوحيدات م -AAA البروتيني. تم عزل الميتوكوندريا من هذه الخلايا وsolubilized في ديجيتونين، وتم تحديد الكتلة الجزيئية الأم من hAFG3L2 بواسطة BN-PAGE (الشكل 1A). تم الكشف عن hAFG3L2 كجزء من مجمع ~900 كيلو دالتون، وبالتالي يشكل مجمع مماثلة في الحجم لأنه في الميتوكوندريا-paraplegin ناقصة الإنسان. وتشير هذه النتائج إلى أن hAFG3L2 يمكن بناء مجمع وطي بلازميدة قليلة القسيمات في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا.
التعبير عن hAFG3L2 استعادة حدها اختصاص الجهاز التنفسي من yta10 Δ خلايا yta12 Δ (الشكل 1B). هذه الملاحظة هي على النقيض من النتائج التي توصلنا إليها السابقة باستخدام م -AAA البروتيني نقص الخميرة سلالة أخرى وعلى الأرجح تعكس الاختلافات سلالة محددة (5). لتقييم اعتماد النمو التنفسي على التحلل البروتيني من قبل hAFG3L2، استبدلنا بقايا الغلوتامات ناشطة تحفيزيا 575 قبل الجلوتامين، وأعرب عن البروتين الطافر في yta10 Δ خلايا yta12 Δ. لم تحور أن تؤثر على تجميع hAFG3L2 إلى مجمع عالية الجزيئية الكتلة كما يتبين من هلام تحليل ترشيح-ديجيتونين solubilized الميتوكوندريا (الشكل 1C). ومع ذلك، كان نمو الخلايا التي تحتوي على الجلسرين المتوسطة يلغى كليا، مما يدل على الاعتماد من التنفس على نشاط بروتين من hAFG3L2 (الشكل 1B).

التحلل البروتيني من قبل المجمعات hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات. لمراقبة مباشرة التحلل البروتيني من قبل hAFG3L2، درسنا تجهيز اثنين preproteins الميتوكوندريا المشفرة النووية، وهي intermembrane البروتين الفضاء السيتوكروم ج الغلوثانيون (CCP1) والوحيدات الريباسي MrpL32، وكلاهما معروف ل أن المشقوق من الخميرة م -AAA البروتيني (12، 26). مطلوب نضوج MrpL32 لتجميع الريبوسوم، وبالتالي تخليق البروتين داخل الميتوكوندريا، وهو شرط أساسي لتجميع المجمعات الجهاز التنفسي في الغشاء الداخلي (26). بالاتفاق مع الظواهر وحظ نمو، والتعبير عن hAfg3l2 ولكن ليس hAfg3l2 E575Q في yta10 Δ Δ استعادة خلايا yta12 إلى حد كبير تجهيز MrpL32، كما يتضح من التحليل الغربي لطخة من الميتوكوندريا المعزولة من هذه الخلايا (الشكل 1D). وبالمثل، ناضجة CCP1 المتراكمة في خلايا yta10 Δ Δ yta12 إيواء hAfg3l2 ولكن ليس في وجود hAfg3l2 E575Q (الشكل 1E).
بالإضافة إلى دورها لمعالجة البروتين، والخميرة م جودة البروتين ضوابط -AAA البروتيني في الغشاء الداخلي وتتوسط تدهور كامل للبروتينات الغشاء غير الأصليين (4، 22). لدراسة ما إذا كان مجمع hAFG3L2 يمكن أيضا بديلا لهذا النشاط، تم توليفها اثنين من البروتينات الركيزة معروف من الخميرة م -AAA البروتيني في نظام خالية من الخلايا في وجود [35 S] ميثيونين واستيرادها إلى عزل yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا إيواء hAFG3L2 أو hAfg3l2 E575Q. واحدة من هذه الركائز، Yme2ΔC، المترجمة في الغشاء الداخلي ويحتوي على نطاق تتعرض لمصفوفة (22). حذف مجال الفضاء intermembrane-كربوكسي المحطة، موجودة في البرية من نوع Yme2، والنتائج في زعزعة استقرار Yme2ΔC وتدهور لاحق من م -AAA البروتيني (الشكل 1F) (19). حين تتراكم في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا، وقد تدهورت المستوردة حديثا Yme2ΔC بحضور hAFG3L2 (الشكل 1F). في المقابل، بقي Yme2ΔC مستقرة في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا إيواء hAfg3l2 E575Q. وقد لوحظت آثار مماثلة من خلال تحليل استقرار المستوردة حديثا Atp7، وهو الطرفية بروتين الغشاء الداخلي التي تدهورت بفعل م -AAA البروتيني وآخر، كما ولكن في ذات مجهولة الهوية البروتيني الميتوكوندريا (الشكل 1F) (19). في حين hAFG3L2 يسرع تدهور Atp7 في yta10 Δ Δ yta12 الميتوكوندريا، طفرة نقطة في المركز بروتين من hAFG3L2 (hAfg3l2 E575Q) ألغيت تماما هذا النشاط (الشكل 1F).
لذا نستنتج أن مجمع hAFG3L2-وطي بلازميدة قليلة القسيمات يمارس النشاط بروتين في الميتوكوندريا ويمكن أن تكون بديلا عن وظيفة الخميرة م -AAA البروتيني في تصنيع البروتين وتدهور للبروتينات غشاء nonassembled. وهكذا، hAFG3L2 تنشط proteolytically على حد سواء على التجمع مع paraplegin في مجمع مغاير بلازميدة قليلة القسيمات وعلى وطي oligomerization.

البروتياز م -AAA-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا الفئران. وكشفت هذه التجارب التباين في جمعية الإنسان م -AAA البروتيني فرعية hAFG3L2. آخر المفترضة م -AAA البروتيني الوحيدات، Afg3l1، يتم ترميز من قبل جين كاذب في الإنسان ولكنه أعرب عن الماوس في إشارة إلى تقلب حتى أعلى في الأخير (20). الفئران Afg3l1 وAfg3l2 تبادل الهوية تسلسل 68٪، مما يشير إلى أنشطة مماثلة من كل من البروتينات. ومع ذلك، لم يتم تحليل وظيفة أو تجميع Afg3l1.
من أجل دراسة تركيبة معقدة من الإنزيمات البروتينية م -AAA في الميتوكوندريا الفئران، أجريت التجارب coimmunoprecipitation بها. رفعنا الأجسام المضادة الببتيد محددة موجهة ضد المفترضة مفارز م -AAA البروتيني Afg3l1، Afg3l2، وparaplegin. تم عزل الميتوكوندريا من الكبد الفئران، والنظر في النمط الظاهري الخلايا العصبية محددة من HSP، وأيضا من الدماغ. بعد الإذابة الميتوكوندريا في ديجيتونين، وحضنت مقتطفات مع أمصال مضادة-تنقية تقارب موجهة ضد متر -AAA مفارز البروتيني ثلاثة المفترضة. وقد تم تحليل الرواسب في وقت لاحق من قبل immunoblotting (الشكل 2). تم الكشف عن Paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في immunoprecipitates بغض النظر عن الأجسام المضادة المستخدمة لهطول الأمطار (الشكل 2A). في المقابل، كان عجلت أيا من هذه البروتينات مع المصل preimmune، مما يدل على خصوصية التفاعل الملاحظة. وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام الكبد أو الدماغ الميتوكوندريا (الشكل 2B). لذا نستنتج أن Afg3l1 يتفاعل مباشرة مع paraplegin وAfg3l2 في كل من الكبد والدماغ الميتوكوندريا. في اتفاق مع هذه النتائج، تم الكشف عن البروتينات في مجمع عالية الجزيئية الكتلة وcoeluted من العمود على تجزئة مقتطفات الميتوكوندريا التي كتبها التحجيم اللوني (لا تظهر البيانات).

تين. 2.
جمعية paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 في الميتوكوندريا الفئران. الميتوكوندريا (400 ميكروغرام الميتوكوندريا البروتين) تم عزل من (A) الكبد و (B) الدماغ وsolubilized مع ديجيتونين. تمت إزالة عشرة (الكبد) أو 20٪ (المخ) من العينة من أجل السيطرة (المدخلات). أجريت Coimmunoprecipitations من استخدام منقى تقارب paraplegin-، Afg3l1-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. تم استخدام مصل Preimmune كوسيلة لمراقبة سلبية. وقد تم تحليل Immunoprecipitates (IP) من خلال SDS-PAGE وimmunoblotting.

م التجمع -AAA البروتيني في نموذج الفأر paraplegin ناقصة لHSP لرصد النتائج المترتبة على فقدان paraplegin على تشكيل الفئران المجمعات م -AAA الأنزيم البروتيني، درسنا تجميع Afg3l1 وAfg3l2 في الميتوكوندريا من Spg7 - / - الفئران. تم عزل الميتوكوندريا من الكبد والدماغ، solubilized في ديجيتونين، وتعرض لcoimmunoprecipitation باستخدام Afg3l2 محددة الأجسام المضادة تنقية تقارب والمصل preimmune (الشكل 3). وقد عجلت Afg3l1 مع Afg3l2 ولكن ليس مع المصل preimmune عندما مقتطفات من المنظفات Spg7 - / - تم تحليل الكبد أو الدماغ الميتوكوندريا (الشكل 3A وباء). باستمرار، اكتشفت جل التجارب الترشيح Afg3l1 وAfg3l2 كجزء من مجمع عالية الجزيئية الكتلة في الغشاء الداخلي للSpg7 - / - الميتوكوندريا الكبد (الشكل 3C). وهكذا، فإن فقدان paraplegin لا يمنع الجمعية من Afg3l1 وAfg3l2 في الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. وتشير هذه النتائج إلى التقلبات في التجمع من الفئران م البروتياز -AAA التي يبدو أن تعتمد إلى حد كبير على توافر مفارز الفردية.

تين. 3.
مجمع Afg3l1 / Afg3l2-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات في الميتوكوندريا من Spg7 - / - الفئران. مقتطفات ديجيتونين الميتوكوندريا (400 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من (A) الكبد و (B) في الدماغ من النوع البري (WT) وparaplegin ناقصة Spg7 - / - تعرض الفئران لcoimmunoprecipitations باستخدام الأجسام المضادة Afg3l2 محددة، تنقية تقارب كما وصفها في وسيلة إيضاح الشكل 2. تم استخدام المصل Preimmune كوسيلة لمراقبة سلبية. وقد تم تحليل الرواسب التي كتبها SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام paraplegin-، Afg3l1-، والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. مبالغ Afg3l1 في الرواسب المستمدة من النوع البري وSpg7 - / - الميتوكوندريا تختلف قليلا في تجارب مختلفة. (C) مجمع عالية الجزيئية الكتلة تحتوي على Afg3l1 وAfg3l2 في Spg7 - / - الميتوكوندريا. مقتطفات (1 ملغم بروتين الميتوكوندريا) الميتوكوندريا الكبد معزولة عن Spg7 - / - كانت مجزأة الفئران عن طريق Superose 6 التحجيم اللوني. وكسور شطافة TCA عجل وتحليلها بواسطة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام Afg3l1- والأجسام المضادة Afg3l2 محددة. وتم قياس كمية Afg3l1 (مثلثات شغل) وAfg3l2 (الدوائر شغل) في شطافة التي كتبها كثافة الليزر وتعطى كنسبة مئوية من البروتين منها في شطافة الإجمالية. علامات نجمية مجمع عالية الجزيئية كتلة من Afg3l1 وAfg3l2 التي coelutes مع prohibitins Phb1 وprohibitins Phb1 وPhb2، مما يدل على تفاعل م -AAA مجمع البروتيني مع prohibitins، كما لوحظ في الميتوكوندريا الخميرة (31). تم استخدام البروتينات علامة التالية للمعايرة: 1، مثنوي ATP سينسيز (1.5 MDA)؛ 2، أحادى ATP سينسيز (750 كيلو دالتون)؛ 3، صميم الفريتين (443 كيلو دالتون)؛ 4، نازعة الكحول (150 كيلو دالتون).

الاختلافات الأنسجة محددة في الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني. وفي سياق هذه التجارب، لاحظنا أن مستويات ثابتة للدولة من م -AAA مفارز البروتيني يبدو أن تختلف في الكبد والدماغ الميتوكوندريا. استبعاد التأثيرات غير المباشرة بسبب الاختلافات في نقاء الاستعدادات organellar من الأنسجة المختلفة، قارنا الوفرة النسبية للAfg3l1، Afg3l2، وparaplegin في الميتوكوندريا المعزولة من الكبد والدماغ.تم تحديد مستويات ثابتة للدولة النسبية Afg3l2 وparaplegin من قبل immunoblotting مقتطفات الميتوكوندريا التي تحتوي على كميات متساوية من Afg3l1 (الشكل 4A). لافت للنظر، Afg3l2 المتراكمة في ~10-أضعاف أعلى المستويات في الدماغ مما كانت عليه في الكبد (الشكل 4A). كان Paraplegin أيضا أكثر وفرة في الدماغ مما كانت عليه في الميتوكوندريا الكبد وكان حاضرا عند مستويات ~4-أضعاف العالي في العضيات المعزولة من الدماغ الفئران (الشكل 4A). في المقابل، كان Afg3l1 الحاضر في انخفاض طفيف فقط المبالغ في الميتوكوندريا الدماغ قريبة الوحيدات 70 كيلو دالتون من سكسينات نازعة (الشكل 4A).

تين. 4.
الوفرة النسبية للparaplegin، Afg3l1 وAfg3l2 في الكبد والدماغ الميتوكوندريا. تم عزل الميتوكوندريا من (A) من النوع البري أو (B) Spg7 - / - كبد الفئران والدماغ. وقد تم تحليل المستخلصات التي تحتوي على كميات متساوية من Afg3l1 بواسطة الأجسام المضادة SDS-PAGE وimmunoblotting باستخدام paraplegin-، Afg3l1-، وAfg3l2 محددة فضلا عن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة ضد الوحيدات 70 كيلو دالتون من نازعة سكسينات (Sdha). وتم قياس كمية Paraplegin وAfg3l2 موجودة في الكبد والدماغ الميتوكوندريا بواسطة التصوير القائم على مضان باستخدام Afg3l1 كعنصر تحكم التحميل. تم احتساب نسبة إشارات الكشف عن Afg3l2 وparaplegin في الدماغ مقابل الميتوكوندريا الكبد لمراقبة الوفرة النسبية للم -AAA مفارز البروتيني في كل الأنسجة. متوسط ​​ن وأظهرت تجارب مستقلة (± الخطأ المعياري للمتوسط) باستخدام الأنسجة المعزولة من مختلف الحيوانات اختيارها عشوائيا.

فمن المتصور أن الوفرة النسبية للAfg3l1 وAfg3l2 يتم تبديل في غياب paraplegin، مما يؤدي إلى تعويض جزئي عن فقدان paraplegin. وبالتالي فإننا مقارنة الوفرة النسبية للAfg3l1 وAfg3l2 في الميتوكوندريا المعزولة من الكبد والدماغ من Spg7 - / - الفئران التي تفتقر paraplegin (الشكل 4B). عندما تطبيع Afg3l1، Afg3l2 لا يزال المتراكمة في-أعلى ~10 أضعاف المستويات في الميتوكوندريا الدماغ من Spg7 - / - الفئران، مما يدل على أن الوفرة النسبية لكل من البروتينات لم تتغير في غياب paraplegin.
هذه التجارب تكشف عن اختلافات لم تكن متوقعة في الوفرة النسبية للم مفارز البروتيني -AAA في الأنسجة المختلفة. وبالنظر إلى التباين الملاحظ في جمعيتهم، يبدو من المرجح أن تكوين فرعية من المجمعات بروتين يختلف بطريقة الأنسجة محددة.

هومو ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م البروتياز -AAA في الميتوكوندريا الدماغ. لتقييم تجميع م -AAA مفارز البروتيني بطريقة أكثر الكمية، أجرينا تجارب immunodepletion. تم solubilized الميتوكوندريا الدماغ في ديجيتونين، وكانت تستخدم الأجسام المضادة Afg3l2 محددة، تنقية تقارب في استنزاف تماما مستخلص Afg3l2 (الشكل 5A). كان Afg3l2 مناعيا لا يمكن كشفها في جزء طاف بعد immunodepletion. كانت تصاحب Afg3l2، Afg3l1 وparaplegin الحالي عند مستويات فقط تضاءلت بشكل كبير (الشكل 5A). حضانة مقتطفات الميتوكوندريا مع المصل preimmune أثرت على مستوى الدولة المستقرة من لا Afg3l2 ولا Afg3l1 أو paraplegin (الشكل 5A). لذا نستنتج أن Afg3l1، Afg3l2، وparaplegin تجميع الكمية مع بعضها البعض في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا الدماغ.

تين. 5.
تعايش م البروتياز -AAA المبنية من مفارز مختلفة في الميتوكوندريا الدماغ. الميتوكوندريا (150 ميكروغرام البروتين الميتوكوندريا) من (A) من النوع البري (WT) و (B) Spg7 - / - وهي lysed الدماغ في ديجيتونين وحضنت مع تشبع كميات من المصل preimmune أو تنقية تقارب-Afg3l2- أو الأجسام المضادة Afg3l1C محددة. بعد إزالة راسب، وقد تم تحليل الكسور طاف (SN) بواسطة SDS-PAGE وفحصها لوجود paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 التي كتبها immunoblotting. تم استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة ضد الوحيدات 39 كيلو دالتون من مجمع I (Ndufa9) للسيطرة على قدم المساواة هلام التحميل. في حين Afg3l1 وAfg3l2 يمكن أن تنفد تماما من الكسر طاف باستخدام الأجسام المضادة Afg3l1- أو Afg3l2 محددة، تنقية تقارب، على التوالي، لا يمكن أن تستنفد مقتطفات من paraplegin باستخدام الأجسام المضادة paraplegin محددة المتاحة (لا تظهر البيانات).

والجدير بالذكر، عندما أجريت تجارب مماثلة مع الأجسام المضادة Afg3l1 محددة، Afg3l2 وparaplegin تم استنفاد إلا قليلا من مقتطفات الميتوكوندريا. هذا الأرجح أن ذلك يعكس وفرة انخفضت من Afg3l1 مقارنة بما كان عليه من Afg3l2 وparaplegin. وهكذا، على الأقل مختلفة م المجمعات البروتيني -AAA تتعايش في الميتوكوندريا الدماغ: Afg3l2 / paraplegin والمجمعات Afg3l1 أقل وفرة التي تحتوي أيضا Afg3l2، paraplegin، أو كليهما.
التي متر -AAA البروتيني المجمعات موجودة في الميتوكوندريا الدماغ paraplegin ناقصة؟ لمعالجة هذه المسألة، ونحن عزل الميتوكوندريا الدماغ من Spg7 - / - الفئران وتحليلها وتكوين معقد من م المجمعات -AAA البروتيني من قبل immunodepletion باستخدام Afg3l1- والأجسام المضادة Afg3l2 محددة (الشكل 5B). على غرار البرية من نوع الميتوكوندريا، وAfg3l1 المنضب بالكامل تقريبا من مقتطفات من Spg7 - / - الميتوكوندريا الدماغ مع الأجسام المضادة Afg3l2 يدل التجمع الكمي (الشكل 5B). في المقابل، كان مستوى ثابت للدولة من Afg3l2 لا يكاد يتأثر المستنفدة Afg3l1 (الشكل 5B). نستنتج أن Afg3l2 هي موجودة في الزائدة بالنسبة لAfg3l1 في الميتوكوندريا الدماغ من النوع البري وSpg7 - / - الفئران. بينما Afg3l1 تجميعها كميا مع Afg3l2، فإن غالبية Afg3l2 ليست جزءا من هذا الهيكل وعلى الأرجح تشكل مجمعا وطي بلازميدة قليلة القسيمات.

النشاط بروتين من هومو ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م البروتياز -AAA. هذه التجارب تثبت وجود م -AAA المجمعات البروتيني مع تكوين الوحيدات متغير في الميتوكوندريا الفئران. لدراسة النشاط بروتين للجمعيات مختلفة، أجرينا دراسات تكامل مع م -AAA البروتيني-ناقص yta10 Δ yta12 خلايا Δ الخميرة.
في التجارب الأولية، paraplegin، Afg3l1، وAfg3l2 وأعرب بشكل مستقل في yta10 Δ yta12 Δ الخلايا وتم فحص نمو الخلايا في الجهاز التنفسي (الشكل 6A). لافت للنظر، والتعبير عن إما Afg3l1 أو Afg3l2 ولكن ليس paraplegin استعادة نمو yta10 Δ yta12 خلايا Δ على المحتوية على الجلسرين المتوسطة (الشكل 6A). هذا يذكرنا hAFG3L2، والتي شكلت-وطي بلازميدة قليلة القسيمات، proteolytically مجمعات نشاطا عندما أعرب في الخميرة (الشكل 1). تحليل الترشيح هلام مقتطفات الميتوكوندريا كشف الحقيقة وطي oligomerization من Afg3l1 وAfg3l2 في الخميرة، في حين paraplegin لا تشكل مجمع عالية الجزيئية الكتلة في غياب الأخرى مفارز AAA البروتيني (لا تظهر البيانات). التعبير عن المتغيرات موقع بروتين من Afg3l1 (Afg3l1 E567Q) أو Afg3l2 (Afg3l2 E574Q لم) لا تعزز نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ، مشيرا إلى أن المجمعات وطي بلازميدة قليلة القسيمات تمارس النشاط بروتين (الشكل 6A). باستمرار، لاحظنا نضوج MrpL32 في yta10 Δ yta12 خلايا Δ إيواء Afg3l1 أو Afg3l2، في حين تم إلغاء هذا النشاط عن طريق الطفرات في مركز بروتين من كل من البروتين (الشكل 6B). وعلاوة على ذلك، تم استعادة تجهيز CCP1 على التعبير عن Afg3l1 أو Afg3l2 لكن إعاقة إلى حد كبير في وجود متغيرات الخاملة proteolytically من كل من البروتين (الشكل 6C). وتجدر الإشارة إلى أن نقص التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ لم ترد على التعبير عن paraplegin، كما لم تنضج MrpL32 أو CCP1 الحاضر في هذه الخلايا (الشكل 6). وهكذا، تظهر القدرة على تكوين مجمعات للوطي بلازميدة قليلة القسيمات أن يقتصر على Afg3l1 وAfg3l2.

تين. 6.
النشاط بروتين من هومو-بلازميدة قليلة القسيمات ومغاير بلازميدة قليلة القسيمات م المجمعات -AAA البروتيني في الخميرة. (A) نمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ معربا عن الفئران م مفارز -AAA البروتيني. البرية من نوع (WT) الخلايا، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا، وyta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا إما paraplegin، Afg3l1 (Afg3lX)، Afg3l2 (Afg3lX)، أو متحولة من المتغيرات Afg3l1 E567Q أو Afg3l2 E574Q (Afg3lX EQ كانت تزرع) في 30 ° C على (YPG) وسائل الاعلام (YPD) أو التي تحتوي على الجلسرين التي تحتوي على الجلوكوز لفحص كفاءة الجهاز التنفسي من الخلايا. لتقييم نشاط المجمعات مغاير بلازميدة قليلة القسيمات، متحولة المتغيرات Afg3l1 E567Q أو Afg3l2 E574Q تم coexpressed مع paraplegin (الفقرة / Afg3lX EQ) أو مع paraplegin E575Q (الفقرة EQ / Afg3lX EQ) في yta10 Δ yta12 تم تحليل Δ الخلايا والخلايا النمو على النحو الوارد أعلاه. (B و C) تجهيز MrpL32 الخميرة وCCP1 من قبل الفئران م البروتياز -AAA. تم تحليل معالجة البروتين في yta10 Δ yta12 خلايا Δ إيواء الفئران م -AAA مفارز البروتيني بواسطة SDS-PAGE كما هو موضح لوحة ألف وimmunoblotting كما هو موضح في أسطورة عن الشكل 1 باستخدام MrpL32 (L32) أمصال مضادة -specific (B) أو أمصال مضادة CCP1 محددة (C). ص، أشكال السلائف. م، أشكال ناضجة. استخدمت Mge1 وTom40 للسيطرة على قدم المساواة هلام التحميل.

في مزيد من التجارب، ونشاط بروتين من الفئران-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات م تم تقييم البروتياز -AAA تتألف من Afg3l1 وparaplegin أو من Afg3l2 وparaplegin في الخميرة. بعد coexpression إما زوج من مفارز، تم التحقق من التفاعل من خلال التجارب coimmunoprecipitation (لا تظهر البيانات). على غرار الخلايا التي تحتوي فقط Afg3l1 أو Afg3l2، ونمو الجهاز التنفسي من yta10 Δ yta12 خلايا Δ تم ترميمه إذا كان coexpressed paraplegin مع أي البروتين (لا تظهر البيانات). لدراسة ما إذا كان هذا النمط الظاهري هو بسبب مغاير oligomerization مع paraplegin بدلا من هومو-oligomerization من Afg3l1 أو Afg3l2، على التوالي، عبرنا عن proteolytically المتغيرات غير نشطة من هذه البروتينات. الدراسات السابقة على الخميرة م وقد أثبتت -AAA البروتيني أن البروتيني هو المعطل فقط عندما تحمل جميع مفارز الطفرات نقطة في المركز بروتين بها (3). في المقابل، مجمع AAA البروتيني-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات تتألف من وحدات فرعية النشطة وغير النشطة proteolytically يتوسط معالجة البروتين ويحافظ على نمو الجهاز التنفسي (3). في حين لا التعبير عن paraplegin ولا أن من Afg3l1 E567Q يسمح yta10 Δ yta12 Δ الخلايا لتنمو على المحتوية على الجلسرين المتوسطة، تم استعادة نمو الخلايا في الجهاز التنفسي على coexpression كل من البروتينات (الشكل 6A). في المقابل، yta10 Δ yta12 Δ الخلايا معربا عن خاملة proteolytically Afg3l1 E567Q وparaplegin E575Q كانت بالقصور التنفسي. وبالتالي، يمكن الحفاظ على نمو الجهاز التنفسي عن طريق مجمع / paraplegin نشط proteolytically Afg3l1.
لتقييم مباشرة النشاط بروتين من Afg3l1 مجمع / paraplegin-مغاير بلازميدة قليلة القسيمات، تم رصد نضوج CCP1 وMrpL32 في هذه الخلايا (الشكل 6B وC). تم الكشف عن أشكال ناضجة من كلا CCP1 وMrpL32 في الخلايا إيواء paraplegin وAfg3l1 E567Q ولكن ليس في وجود paraplegin E575Q وAfg3l1 E567Q. لذا نستنتج أن مجمع AAA البروتيني تتألف من Afg3l1 وparaplegin مفارز نشط proteolytically.
والجدير بالذكر، تم الحصول على نتائج مشابهة جدا عندما yta10 Δ yta12 Δ تم تحليل الخلايا معربا عن Afg3l2 وparaplegin (الشكل 6). إدخال طفرة نقطة في المركز بروتين من Afg3l2 (Afg3l2 E574Q) لم يلغ نمو الجهاز التنفسي إذا تم coexpressed paraplegin. وعلاوة على ذلك، تم تجهيز CCP1 وMrpL32 جزئيا في هذه الخلايا. على coexpression من Afg3l2 E574Q وparaplegin E575Q، ومع ذلك، لم ترد اختصاص الجهاز التنفسي من الخلايا، وكلا CCP1 وMrpL32 المتراكمة في شكل السلائف (الشكل 6). وهكذا، فإن مجمع / paraplegin Afg3l2 يمارس النشاط في بروتين الخميرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
إضافة رد

« الموضوع السابق | الموضوع التالي »
أدوات الموضوع
طريقة عرض الموضوع
العرض المتطور العرض المتطور

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك
BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة
الانتقال السريع

 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع |  المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية


الساعة الآن 06:18 AM.

الاتصال بنا - موقع أطفال الخليج ذوي الاحتياجات الخاصة - الأرشيف - الأعلى

Powered by vBulletin® Version 3.8.2
Copyright ©2000 - 2025, Jelsoft Enterprises Ltd

a.d - i.s.s.w