#1  
قديم 11-23-2015, 07:50 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي متلازمة بارديه-بيدل

 

التفاعل الوراثي للBBS1 الطفرات مع الأليلات في باقي BBS الامكنه يمكن أن يؤدي إلى غير مندلية بارديه-بيدل متلازمة

فيليب لام Beales1، *، خوسيه L. Badano3، *، أليسون J. Ross1، ستيفن J. Ansley3، بيثان E. Hoskins1، بريجيتا Kirsten2، تشارلز A. Mein2، فيليب Froguel2، 5، بيتر J. Scambler1، ريتشارد آلان Lewis6 ، 7، 8، 9، جيمس R. Lupski6، 8، نيكولاس Katsanis3، 4،،


متلازمة بارديه-بيدل هو اضطراب وراثيا وغير متجانسة سريريا التي تسببها طفرات في لا يقل عن سبعة مواضع (BBS1-7)، خمسة منها يتم استنساخ (BBS1، BBS2، BBS4، BBS6، وBBS7). وقد أشارت التحليلات الوراثية وطفرية أنه في بعض الأسر، وهو مزيج من ثلاثة الأليلات الطافرة على اثنين من مواضع (الميراث triallelic) ضروري لالمرضية. حتى الآن، أربعة مواضع BBS المعروفة الخمس قد تورطت في هذا النمط من انتقال المرض قليل الجينات. نقدم تحليلا شاملا لطيف، والتوزيع، والمشاركة في نقل سمة غير مندلية الأليلات الطافرة في BBS1، موضع BBS الأكثر شيوعا. تحليلات 259 أسرة مستقلة عزل النمط الظاهري BBS تشير إلى أن BBS1 تشارك في الميراث معقدة، وأنه في عائلات مختلفة، والطفرات في BBS1 يمكن أن تتفاعل وراثيا مع الطفرات في كل من غيرها من الجينات BBS المعروفة، وكذلك في مواضع غير معروف، لتتسبب في النمط الظاهري. وتمشيا مع هذا النموذج، حددنا الأليلات M390R متماثل، طفرة BBS1 الأكثر شيوعا، في الأفراد غير متناظرة في عائلتين. وعلاوة على ذلك، التحليلات الإحصائية لدينا تشير إلى أن انتشار أليل M390R في عموم السكان يتسق مع قليل الجينات بدلا من نموذج المتنحية من انتقال المرض. ويشير توزيع BBS الأليلات قليل الجينات أيضا أن جميع مواضع BBS قد تتفاعل وراثيا مع بعضها البعض، ولكن بعض الجينات، وخاصة BBS2 وBBS6، هم أكثر عرضة للمشاركة في الميراث triallelic، مما يشير إلى قدرة متغيرة من البروتينات BBS للتفاعل وراثيا مع بعضها آخر.
مقدمة

يحدث الميراث قليل الجينات عندما أليل محددة في مكان واحد أو أكثر تؤثر على سمة وراثية عن طريق التسبب و / أو تعديل شدة ونطاق النمط الظاهري. وقد اقترح عدد التوسع السريع للجينات المسببة للأمراض المعروفة وتحسين فهم الأسس الخلوية آليات طفرية أن العديد من الاضطرابات يعتقدون في السابق أن تكون أحادية المنشأ هي، بالأحرى، منتجات التفاعل الجيني لعدد صغير من مواضع (Badano و Katsanis 2002؛ مينغ وMuenke 2002).

متلازمة بارديه-بيدل (BBS [MIM ​​209900]) هو اضطراب عديد المظاهر غير متجانسة سريريا تتميز التدريجي ضمور شبكية العين، والسمنة المركزية، polydactyly، وخلل التنسج الكلوي، وتشوهات الجهاز التناسلي، وضعف الادراك (Schachat وMaumenee 1982؛ الأخضر وآخرون 1989) . وتتضمن الميزات الإضافية قصر القامة، endocrinopathies (بما في ذلك مرض السكري وقصور الغدة الدرقية)، وتشوهات خلقية في القلب، وكذلك الكلام واضطرابات سلوكية (الأخضر وآخرون 1989؛. Beales وآخرون 1999). BBS هو أيضا غير متجانسة وراثيا. على أساس وراثي نموذج انتقال المتنحية، تم تعيين سبعة مواضع في الجينوم: BBS1 على 11q13 (ليبرت وآخرون 1994)، BBS2 على 16q21 (Kwitek الأسود وآخرون 1993)، BBS3 على 3p12 (شيفيلد وآخرون 1994)، BBS4 على 15q22.2-Q23 (كرمي وآخرون 1995)، BBS5 على 2q31 (يونغ وآخرون 1999a)، BBS6 على 20p12 (Katsanis وآخرون 2000)، وBBS7 على 4q27 (Badano وآخرون. 2003). ومع ذلك، فإن استنساخ أول مكان BBS، BBS6 (Katsanis وآخرون 2000؛. Slavotinek وآخرون 2000)، تليها الطفرات يحلل على الفوج متعددة الأعراق كبيرة، يعني أن بعض الطفرات لا تتفق مع النموذج التقليدي للمرض وراثي جسمي مقهور نقل (Beales وآخرون 2001). بعد التعرف على اثنين إضافيين BBS مواضع، BBS2 (نيشيمورا وآخرون 2001) وBBS4 (Mykytyn وآخرون 2001)، وتسلسل أظهرت تحاليل أنه في بعض الأسر، أي ما مجموعه ثلاثة طفرات في اثنين من الجينات ضرورية لإمراض (Katsanis وآخرون 2001a، 2002)، وبالتالي إنشاء نموذج triallelic انتقال المرض ومما يدل على أن BBS قد تكون نموذجا مفيدا لدراسة الصفات قليل الجينات (Badano وKatsanis 2002).

وفي الآونة الأخيرة، تم استنساخ اثنين من الجينات BBS جديدة: BBS1 (Mykytyn وآخرون 2002). وBBS7 (Badano وآخرون 2003)، كل ترميز البروتين من وظيفة غير معروفة ولكن العارضة التشابه متواضع إلى أخرى. اقترح تحليل طفرية من BBS7 أن هذا الموضع قد يشارك أيضا في الميراث غير مندلية. ومع ذلك، فإن التحليلات الأولية المبلغ عنها BBS1 في 60 أسرة مع BBS لم تسفر عن أي دليل على الميراث triallelic، لأن كل من غياب المرضى الذين يعانون من ثلاث طفرات على اثنين من مواضع وعدم وجود الأفراد غير متناظرة مع اثنين من الطفرات BBS1 (Mykytyn وآخرون 2002) .

أجرينا تحاليل وراثية وطفرة شاملة من 259 أسرة، من مختلف الأعراق، مع BBS ووصف خصائص، والتردد، والموقف من الطفرات BBS1. توفر البيانات لدينا أدلة دامغة على مشاركة BBS1 في الميراث triallelic وتشير إلى أن BBS يمكن أن تنشأ من المزاوجة بين مجموعات مختلفة من الطفرات التي في كل مكان يمكن أن تسهم إما واحد أو اثنين من الأليلات الطافرة على ترددات مختلفة.
المرضى وطرق
المرضى

ومائتان وتسعة وخمسين الأسر التي لديها BBS، من أصول عرقية مختلفة، تم فحص للطفرات في BBS1. واستند تشخيص BBS على المعايير المحددة التي تتطلب أن أربعة من ستة الميزات الأساسية تكون موجودة (اندرسون لويس 1997؛. Beales وآخرون 1999). في العديد من الحالات، تم التأكد من التشخيص من قبل الأطباء المحليين والتحقق منها من خلال فحص السجلات الطبية من جانب واحد أو أكثر منا (RAL، PLB). تم الحصول على الدم مع الموافقة، وفقا للبروتوكولات التي وافق عليها المواضيع الإنسان لجان أخلاقيات المناسبة في كل مؤسسة مشاركة، وتم استخراج DNA كما هو موضح في مكان آخر (Katsanis وآخرون 2000).
التحليل الجيني والطفرات

تم محاذاة تسلسل [كدنا المبلغ عنها BBS1 (بنك الجينات عدد الانضمام AF503941) (Mykytyn وآخرون 2002) لتسلسل الجينوم من الجمعية الجينوم البشري يونيو 2002 مع الخوارزمية BLAT النوكليوتيدات-النوكليوتيدات في جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز. نحن مصممون حدود إنترون-إكسون لمدة 17 الإكسونات، وهو ما يتسق مع البيانات التي تم نشرها. استخرجنا 100-300 نقطة أساس تسلسل المرافقة كل اكسون الترميز وamplicons المصممة التي تمتد كل اكسون وكلا تقاطعات لصق، كما هو موضح في مكان آخر (Katsanis وآخرون 2000). نحن تنقية المنتجات PCR تضخيمها من المرضى وأقاربهم، والضوابط لا علاقة لها لكن عرقيا المتطابقة، سواء مع عدة إكسو-SAP تنظيف (USB) أو تنقية QIAquick كيت PCR (QIAGEN)، ويقوم التسلسل المباشر لمنتجات PCR مع dye- التمهيدي (النظم البيولوجية التطبيقية) أو صبغ فاصل (أمرشام العلوم البيولوجية أو النظم البيولوجية التطبيقية) الكيمياء. تم إجراء تسلسل على محلل ABI 377 وABI 3700 تسلسل (النظم البيولوجية التطبيقية) أو محلل تسلسل MegaBACE1000 (أمرشام العلوم البيولوجية).

أجرينا تحاليل وراثية عن طريق توليد الأنماط الجينية لكل مريض أو قريب الصلة مع تقارير المعاملات المشبوهة الفلورسنت وبناء النسخ المتنوعة عبر كل مكان BBS، كما هو موضح في مكان آخر (Katsanis وآخرون 1999؛. Beales وآخرون 2001). وقد تم الحصول على تسلسل الصغرية من أي قاعدة بيانات الجينوم أو مركز ايتهيد معهد للبحوث الجينوم.
تحليلات حفظ التطورية

تعرفنا على البطن ذبابة الفاكهة، ايليجانس Caenorhibditis، المصحف العضلة، الجرذ النرويجي، وorthologs دانيو rerio من BBS1، BBS2، BBS4، وBBS6 من خلال أداة بحث للSwissprot وTrembl مع تسلسل الببتيد البشري. تم محاذاة متواليات مع البرنامج ClustalW للعودة إلى تمثيل رسومي للمخلفات الحفظ وnonconserved. حددنا أيضا تسلسل جزئية من scrofa سوس، بوس الثور، القيطم المورق، وجالوس orthologs جالوس من BBS6 عن طريق إجراء عمليات البحث TBLASTN من تسلسل الببتيد BBS6 ضد / nonmouse قاعدة بيانات EST غير البشرية. نحن محاذاة متواليات ذات الصلة مع البرامج من حزمة تحليل GCG البرامج v.9.0، كما هو موضح في مكان آخر (Katsanis وفيشر 1998).
النتائج
طيف BBS1 الطفرات

لتحديد مدى ونوع من الطفرات في BBS1، ونحن التسلسل ما مجموعه 259 أسرة من مختلف الأعراق، والتي قسمت إلى قسمين الأفواج اعتمادا على المختبر مسؤول عن جمع والحفاظ على مخزونات DNA: لفيف الولايات المتحدة (147 أسرة) و فوج المملكة المتحدة (112 أسرة). وعلاوة على ذلك، بسبب الميراث معقدة من BBS (Katsanis آخرون 2001a، 2002)، ونحن التحقيق في جميع الأسر المتاحة بغض النظر عن البيانات الوراثية أو طفرية السابقة.

حددنا العديد من التعديلات، وهو ما حقق زيادة لالمرضية التي كتبها (أ) فصل بينها وبين النمط الظاهري في الأسر. (ب) التأكد مما إذا كانوا قد تعطل الربط. (ج) تقييم ما إذا كانت تمثل استبدال حمض أميني غير محافظ أو توقع سابق لأوانه إنهاء كودون. (د) التحقيق في ما إذا كانت موجودة في 200-400 غير ذات صلة، الكروموسومات السيطرة عرقيا يقابل. و (ه) تحديد مستوى الحفظ التطوري لكل بقايا.

عموما، اكتشفنا واحد على الأقل طفرة BBS1 المرتبطة المرض في 60 من 259 الأنساب (23.2٪ من الأسر، و 111 أليل متحولة) (الجدولين 1 و 2)، على الرغم من توقع ~40٪ -56٪ من الأليلات المرتبطة المرض، بناء على التحليلات السابقة من مساهمة هذا الموضع إلى BBS من قبلنا وغيرها (Bruford وآخرون 1997؛. Katsanis وآخرون 1999). من 24 مختلفة الأليلات BBS1 متحولة الكشف في بلدينا الأفواج، 2 كانت لصق الطفرات مفرق و 5 كانت الإدراج أو الحذف (الجدول 2). واحد من هؤلاء هو حذف 3-BP القضاء على يسوليوكيني في موقف 389، في حين أن الأربعة الأخرى نتيجة المفهوم في انزياح الإطار وإنهاء السابق لأوانه ترجمة الببتيد المشفرة. وكانت معظم التغييرات إما التحولات 1-BP أو transversions مما أدى إلى استبدال مغلطة (ن = 9) أو الطفرات هراء إدخال كودون وقف المبكرة (ن = 8). كان واحدا من الطفرات مغلطة إجراء تبديل 2-BP متجاورة، TT → AC (L503H)؛ وأشار subcloning وتسلسل كل أليل لاحق أن التعديلات اثنين تكمن في نفس حبلا، واحتلال المناصب الثانية والثالثة في نفس كودون.









باستثناء أليل متحولة M390R، تم العثور على معظم الطفرات في التردد المنخفض في كل فوج (الجدول 2). فقط أليل واحد، D148N، تم العثور في كل من جمع المريض المملكة المتحدة والولايات المتحدة، على الرغم من أن معدل انتشار بعض الطفرات رقي في واحد أو جماعة أخرى (على سبيل المثال، أربعة الأليلات R146X الولايات المتحدة وثلاثة الأليلات Y284fsX288 UK)، مما يوحي بأن كل مريض جمع قد يكون له التركيب الجيني متميزة. والجدير بالذكر، تم الكشف عن الطفرات BBS1 في المقام الأول في الأسر البيضاء. فقط 2 من 24 عائلة من أصل السعودي كان الطفرات BBS1 (8٪)، وعلى النقيض من ~20٪ من البيض، مشيرا إلى أن BBS1 قد لا يكون موضع BBS رئيسيا في هذه الفئة من السكان.

رسم موقف الطفرات في BBS1 كشفت عن وجود توزيع غير منتظم (الشكل 1)، والتي لا أحد من 26 الطفرات يكمن في المدقع N أو C تيرميني من البروتين المتوقعة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المنطقة التي تمتد من اكسون 6 إلى 9 اكسون تخلو من الطفرات، باستثناء أليل واحد، E234K.

توزيع الطفرات على طول BBS1. وصفت الإكسونات كما أشرطة زرقاء و ...
الشكل 1.

توزيع الطفرات على طول BBS1. وصفت الإكسونات كما أشرطة زرقاء وموقف كل طفرة يظهر أعلاه. السهام تشير إلى مواقف بدء وإنهاء الكودونات، في حين تشير العلامات النجمية الطفرات ذكر سابقا من قبل Mykytyn وآخرون. (2002)؛ المقياس هو تقريبي. البروتين BBS1 لا يوجد لديه المجالات ملحوظ، باستثناء منطقة التشابه بين بقايا 187-377 مع BBS2 وBBS7 التي يحتمل أن يشفر ستة البيضاء-β-المروحة (Badano وآخرون 2003).
خيارات الشكل

M390R هو السائد BBS1 الطفرة

وأشارت التحليلات طفرية السابقة من فوج أصغر المرضى أن تغيير مغلطة واحد في اكسون 12 من BBS1، M390R، هو الأكثر شيوعا BBS1 أليل متحولة، وهو ما يمثل 32٪ (38/120 أليل متحولة، في ظل افتراض نموذج المتنحية حصرا) جميع الطفرات BBS (Mykytyn وآخرون 2002). على الرغم من أن مساهمة M390R إلى BBS في فوج لدينا أقل (18٪)، وجدنا أليل M390R أن تكون الطفرة BBS1 الأكثر شيوعا في كل من الأفواج لدينا. في فوج الولايات المتحدة، M390R هي موجودة في 75.7٪ من مجموع الأسر مع الطفرات BBS1، و، في الفوج المملكة المتحدة، لاحظنا نسبة أعلى قليلا من 82.6٪ (جدول 4). عموما، كانت 45٪ من الأنساب مع الطفرات BBS1 متماثل للالنوكليوتيدات G (أرجينين ترميز)، في حين أن 33.3٪ منهم متخالف. كشفت تحليلات مستقلة عن بعضها الفوج المريض أيضا تخصيب طفيف للالزيجوت M390R (40.5٪) مقارنة مع أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل (35.1٪) في فوج الولايات المتحدة، على النقيض من الفوج المملكة المتحدة، التي الزيجوت المتماثلة الألائل (60.9٪) أكثر من مرتين المشتركة كما كما الزيجوت (21.7٪). قد يكون هذا الاختلاف يرجع، في جزء منه، إلى العرق الخلفية اثنين من المجموعات العائلية؛ في كل فوج، تم العثور على أليل M390R على وجه الحصر تقريبا في الأنساب من أصل أوروبي. هذه الملاحظة، إلى جانب ارتفاع وتيرة هذا الأليل في BBS، تشير إلى أن M390R قد يكون مؤسس القديم، نشر من خلال السكان إما عن طريق الانجراف الوراثي أو بعض ميزة انتقائية كما ولكن في ذات مجهولة الهوية في حالة متخالف.

جدول (4).

النسبي انتشار وتوزيع M390R أليل
البيانات في الفوج
المملكة المتحدة. الولايات المتحدة المشتركة M390R انتشار
M390R الحالة رقم الأسر التي لديها BBS1 الطفرات (ن = 23)٪ من جميع الأسر التي لديها BBS1 الطفرات عدد الأسر التي لديها BBS1 الطفرات (ن = 37)٪ من جميع الأسر التي لديها BBS1 الطفرات عدد الأسر التي لديها BBS1 الطفرات (ن = 60)٪ من جميع الأسر التي لديها BBS1 الطفرات عدد الأسر (ن = 259)٪ من جميع الأسر التي لديها BBS
أصحاب الزيجوت المتماثلة الألائل 14 60.9 13 35.1 27 45.0 27 10.4
الزيجوت 5 21.7 15 40.5 20 33.3 20 7.7
المجموع 19 82.6 28 75.7 47 78.3 47 18.1
M390R والطفرات elsewherea 4 5 17.4 13.5 15.0 9 9 3.5

ا

كما تم احتساب هذه العائلات كما الزيجوت المتماثلة الألائل M390R والزيجوت، اعتمادا على النمط الجيني لكل عائلة.

خيارات الجدول

تقييم الإرث مجمع في BBS1

توافر 259 أسر مع BBS، مع البيانات المرتبطة بها لكل من مواضع أخرى معروفة، تقدم الفرصة لإجراء تقييم شامل للمساهمة وراثية من الأليلات BBS1 إلى النمط الظاهري. نحن افترض أن أدلة داعمة لمشاركة BBS1 في الميراث معقدة تشمل الملاحظات التالية. أولا، ينبغي أن المرضى الذين يعانون من الطفرات BBS1 يكون الطفرات في مواضع أخرى BBS. ثانيا، أمثلة من الأفراد غير متناظرة الذين يحملون اثنين من الطفرات BBS1 حسن النية يجب أن تكون موجودة في الأفواج لدينا. ثالثا، قد تكون مرتفعة لانتشار الطفرات BBS1 تشارك في triallelism في عموم السكان تتجاوز القيمة المتوقعة بموجب نموذج المتنحية مندلية. للحد من التهديف المحتملين والتحيز السكان لاختبار هذه التنبؤات، كل مختبر تحليل حليفها منها بشكل مستقل بطريقة ملثمين وجرى تقاسم البيانات المتراكمة إلا بعد الانتهاء من المرحلة التجريبية.
المرضى الذين يعانون من الطفرات BBS1 يكون الطفرات في مواضع أخرى BBS

عن طريق إجراء تسلسل تحليلات لجميع الجينات BBS المعروفة، وجدنا دليلا تغيري المباشر لغير مندلية الميراث سمة في ثماني أسر مع الطفرات BBS1 (13.3٪ من مجموع هذه الأسر) (الجدولين 1 و 3). من هذه العائلات، ستة (10٪ من جميع الأسر التي لديها طفرات BBS1) واثنين من الطفرات في BBS1 وطفرة واحدة في مكان آخر، وعائلتين (3.3٪ من جميع الأسر التي لديها طفرات BBS1) تقديم مزيج المتبادل. وعلاوة على ذلك، فإن نصف هذه العائلات نشأت من الفوج المملكة المتحدة والنصف الآخر من الفوج الولايات المتحدة، مما يشير إلى معدلات انتشار مماثلة من غير مندلية BBS في المجموعتين.

الجدول 3.

الأسر التي لديها طفرات في BBS1 وغيره من الامكنه
أليل
العائلة 1 2 3 النمط الفرداني Mappinga
AR69 E234K T211I (BBS7) T211I (BBS7) 4q27
AR241 M390R IVSx2 (BBS2) R315Q (BBS2) تفاصيلها
AR396 Q291X M390R S236P (BBS6) غير واضح
AR710b M390R ... 16q21
AR729b M390R ... ... ليس 11q13
AR768 M390R L548fsX579 T325P (BBS6) 11q13
PB006c M390R M390R BBS8؟ 11q13
PB009 M390R M390R L349W (BBS2) 11q13
PB029c M390R M390R BBS8؟ 11q13
PB056 M390R M390R M472V (BBS4) غير واضح

ا

كلما أمكن ذلك، تم استبعاد الأسر من الطفرات المتنحية في مكان معين عن طريق إنشاء النسخ المتنوعة الموسعة. وتركزت هذه إما في الجين (عندما معروفة) أو علامة متعددة الأشكال وفقا لأعلى درجة اللد ومددت أبعد ذكرت أول علامة المؤتلف لكل مكان BBS.

ب

الأسر التي لديها طفرة BBS1 واحد استبعادها من 11q13 عن طريق تحليل النمط الفرداني. في AR710 الأسرة، تحليل النمط الفرداني في جميع المعروفة BBS مواضع يتسق مع الربط BBS2، ولكن لم يتم تحديد أي طفرات. وقد تم استبعاد AR729 الأسرة من جميع المعروفة BBS مواضع.

ج

الأسر التي يكون فيها الفرد يتأثر هو متماثل للطفرات M390R. في هذه الحالات، وافترض طفرة في رواية BBS مكان (أي BBS8؟) التي قد بذل إما سببية أو تأثير وقائي.

خيارات الجدول

في واحد نسب الإنجليزية، PB056، تتأثر كل من الأم وابنتها، الذي يشبه نمط شبه سائد من الميراث. كشف التسلسل لاحق وجود اثنين من الأليلات M390R في كل من المرضى (الشكل 2A). وعلاوة على ذلك، كل فرد المصاب لديه ثالث تغيير M472V متخالف في BBS4، الموروثة عن جده لأمه، الذي يحمل أيضا M390R أليل متخالف ولكن لا يتأثر. وعلاوة على ذلك، تم العثور على بقايا ميثيونين تشارك في M472V، على التحليل التطوري لاحقة، إلى أن الحفظ جدا (الشكل 5). لأن الأب في هذه العائلة لم يكن متوفرا، استبعدنا إمكانية M390R فردانية الزيجوت في disomy المستلفت أو أحد الأبوين (UPD) كما تفسيرات بديلة، من خلال التنميط الجيني STRPs الإقليمي وتعدد الأشكال داخل الجين (الشكل 2A).

الميراث Triallelic تنطوي BBS1. A، النسب PB56، والتي على حد سواء ...
الرقم 2.

الميراث Triallelic تنطوي BBS1. A، النسب PB56، الذي كل من الأم وابنتها تتأثر تأثرا هي M390R متماثل وأيضا يحمل طفرة M472V في BBS4. B، النسب AR396، الذي السيب المتضررين يحمل اثنين من الطفرات BBS1 (M390R وQ291X) وطفرة BBS6، S326P. C، AR241 الأسرة، الذي sibs المتضررة واثنين من الطفرات BBS2 (R315Q / R315Q؛ IVS1 + 1G) وطفرة BBS1 واحد (M390R). وتشير شرطات أن هؤلاء الأشخاص كانوا إما غير متوفرة أو غير راغبة في المشاركة في الدراسة.
خيارات الشكل

التحليل التطوري للطفرات تشارك في الميراث معقدة. ال ...
الرقم 5.

التحليل التطوري للطفرات تشارك في الميراث معقدة. تم فحص الحفاظ على كل من متحولة الأليلات BBS1، BBS2، BBS4، وBBS6 تشارك في الميراث معقدة بمقارنة تسلسل البروتين وتوقع من جميع الجينات BBS المعروفة مع orthologs وhomologs من جميع الأنواع المتاحة. ويرد أيضا في المنطقة حول كل بقايا ذات الصلة. الأزرق يمثل الهويات، والأصفر يمثل بدائل المحافظة.
خيارات الشكل

تم العثور على أمثلة من الميراث triallelic وإشراك الطفرات في اثنين مواضع متميزة أيضا في الفوج الولايات المتحدة. كان المستلفت في AR396 الأسرة متغايرة مجمع للأليل M390R وطفرة هراء Q291X وأيضا يحمل أليل S236P متخالف في BBS6 (الشكل 2B). على العكس من ذلك، بورتوريكو ذو قربى AR69 الأسرة يحمل أليل E234K متخالف في BBS1 ولكن تم استبعاد وراثيا من هذا الموضع. أثناء دراستنا، توصلنا إلى أن هذه العائلة وقد ورثت طفرة T211I متماثل في بقايا الحفظ جدا في BBS7 (Badano وآخرون 2003).

في الأسر المذكورة أعلاه، وأليل متحولة الثالث هو تغيير مغلطة. على هذا النحو، على الرغم من غيابها عن نحو 400 الكروموسومات السيطرة عرقيا المتطابقة، تبقى إمكانية أن بعض هذه الأليلات تمثل الأشكال حميدة، ونظرا لصغر حجم الأنساب، يمكن القول cosegregation هذه الأليلات مع اضطراب أن يكون من قبيل الصدفة. ومع ذلك، AR241، نسب المنحدرين من أصول أوروبية من الفوج الولايات المتحدة، ويقدم أدلة دامغة لمتطلبات الأليلات الطافرة على اثنين من مواضع. كل من الاخوة المتضررين، و-05 -06، هي متخالف لطفرة M390R BBS1. بالإضافة إلى ذلك، كل السيب يحمل أليلين BBS2 متحولة: طفرة مغلطة R315Q، وهي بقايا الأمراض المرتبطة في عائلة سعودية مع BBS، وطفرة لصق تقاطع في الموقع متقبل من اكسون 2 (Katsanis آخرون 2001a). (IVS1 + 1G → C؛ الشكل 2C). في حال من غير المحتمل أن R315Q أليل ثبت حميدة، والمرضى في هذه الأسرة لا تزال ورثت طفرات النية الحسنة في كل BBS1 وBBS2.
الأفراد غير متأثر مع اثنين من الطفرات BBS1

A التنبؤ الثاني من الفرضية triallelic هو أنه إذا الطفرات في اثنين مواضع ضرورية لالمرضية، يجب على الأفراد الذين لديهم لم يتأثر وجود اثنين من الطفرات في مكان واحد. وقد وجد هذا في السابق أن يكون صحيحا لغيرها من مواضع BBS (Katsanis آخرون 2001a؛ Katsanis وآخرون 2002)، ولكن لا BBS1 (Mykytyn وآخرون 2002). لدراسة هذا الجانب من نموذج لدينا، نحن مصممون على الفصل بين كل BBS1 أليل متحولة. على الرغم من أن في العديد من الحالات كان والدا و / أو sibs تتأثر متوفرة، يمكننا التأكد من التراكيب الوراثية لأكثر من كل فوج. وتمشيا مع وضع غير مندلية من انتقال المرض، حددنا اثنين الأنساب البريطانية (PB006 وPB029) فصل نسختين من M390R في probands، التي كان الآباء في كل حالة متماثل لطفرة BBS1 المشتركة، M390R (التين. 3A و3B). على الرغم من الحذر السريري إعادة تقييم هؤلاء الأفراد، يعرض أي من الأبوين أي ملامح النمط الظاهري BBS، وعلامة الفصل استبعاد إمكانية missampling. وهذا يطرح احتمالين: إما (1) أليل الثالث في لمكان مجهول ضروري لالمرضية في هاتين الأسرتين أو (2) أليل الثالث التي يحملها الأب ولكن ليس من قبل الأطفال يمنح حماية ضد طفرة M390R.

اثنين من الطفرات M390R ليست كافية لالمرضية. في الأنساب PB006 (A) ...
الرقم 3.

اثنين من الطفرات M390R ليست كافية لالمرضية. في الأنساب PB006 (A) وPB029 (B)، والد يتأثر هو متماثل للأليل M390R المشترك، وكذلك جميع الأشخاص المتضررين. لم يتم العثور على الطفرة الثالثة في هذه العائلتين.
خيارات الشكل

مرتفعة M390R تواتر الصبغيات في عدد السكان

A التنبؤ الثالث من نموذج السببية multilocus لBBS هو أن تردد الناقل من الطفرات تشارك في الميراث معقدة يجب أن يكون أكبر مما كان متوقعا لاضطراب المتنحية. وقد تم تقييم هذه الإمكانية من الصعب حتى الآن، لأن التردد المنخفض للBBS2 معروف، يمكن أن الطفرات BBS4، BBS6، وBBS7 في المرضى الذين يعانون من BBS يتطلب الاستعلام عن عدد كبير من الأصحاء، والأفراد غير ذات صلة. قدم وجود أليل M390R مشترك في نحو 18٪ من المرضى BBS، ومع ذلك، وإشراك هذا الأليل في عدة قضايا الميراث معقدة (الجداول 3 و 4) الفرصة لإجراء هذه الدراسة.

نحن يعاير بواسطة التسلسل 658 الكروموسومات السيطرة لا علاقة مباشرة لتغيير M390R، 75٪ منها من أصل أوروبي. اكتشفنا حاملتي متخالف، مشيرا إلى أن تردد الناقل تقريبي في البيض أوروبا وأمريكا الشمالية هو ~1: ​​325. من التحليلات طفرية لدينا، خلصنا إلى أن 10.4٪ من المرضى BBS هي متماثلة اللواقح لهذا الأليل (الجدول 4). انتشار BBS في أمريكا الشمالية وأوروبا يتراوح من 1: 100000 إلى 1: 160،000 (كلاين وآمان 1969؛ كروفت وآخرون 1995؛ Beales وآخرون 1997.). لذلك، في ظل الظروف المثالية من هاردي واينبرغ، التوازن، وتردد الناقل من M390R تحت نموذج المتنحية أن يتراوح من 1: 1000 إلى 1: 1200 الكروموسومات في عموم السكان. هذا الفرق مهم إحصائيا، لأن احتمال العثور على اثنين من الطفرات M390R في 658 الكروموسومات بالصدفة وحدها هي 2٪ فقط (اختبار دقيق ذي الحدين؛ P = 0.022). من تردد الناقل لوحظ، فإن للمرء أن يتنبأ أنه إذا أليل M390R فصل دائما مع النمط الظاهري أحادي الجين، فإن BBS يكون ~10 مرات أكثر انتشارا مما هو ملاحظ (1: 11000).
نقاش

نحن تقديم تقرير عن نتائج دراسة كبيرة بين مختبرين للكشف عن الطفرات في BBS1. نحن التحقيق 259 الأنساب المنشأ متعدد الأعراق، بغض النظر عن الكشف مسبق من الطفرات في جينات أخرى. في هذه الأسر، حددنا 26 مختلفة BBS1 أليل متحولة، وهو ما يمثل 23.2٪ من الأسر في فوج لدينا جنبا إلى جنب. غلبة M390R كما الطفرة BBS1 الرئيسية لافت للنظر (موجودة في 78.3٪ من الأسر التي لديها طفرات BBS1)، مما يوحي بأن الأليل M390R قد يكون طفرة القديمة، وخاصة منذ الطفرة ليست نتيجة لثنائي النوكليوتيد الانتقال الدليل السياسي الشامل. وعلاوة على ذلك، التحليل الجيني عبر موضع BBS1 يشير إلى وجود النمط الفرداني مشترك لجميع أرجينين التي تحمل 390 الكروموسومات (Mykytyn وآخرون 2003؛. بيانات غير منشورة المؤلفين). قد تعكس هذه ميزة انتقائية إيجابية لالزيجوت M390R أو الانجراف الوراثي. والجدير بالذكر أن وجدنا أليل أرجينين 390 بشكل حصري تقريبا في الأسر المنحدرة من أصول أوروبية، مما يشير إلى هذا الأليل قد تم إصلاحها في هذه الفئة من السكان.
دليل على أن BBS1 تشارك في Triallelic الوراثة

تحليلاتنا توفر ثلاثة خطوط مستقلة أدلة داعمة لفرضية أن تشارك BBS1 في الميراث triallelic. أولا، حددنا عدة عائلات BBS1 التي تفصل ما مجموعه ثلاثة أليل متحولة. في بعض الحالات، واثنين من الأليلات BBS1 cosegregate مع BBS2 واحد، BBS4، أو BBS6 أليل، بينما في حالات أخرى، فإن الطفرة BBS1 واحدة موجودة في المرضى، جنبا إلى جنب مع اثنين من الطفرات في BBS2 أو BBS7 (Badano وآخرون 2003 ). ونظرا لندرة من متلازمة وانخفاض مساهمة BBS2 المسببة للأمراض، الأليلات BBS4، BBS6، وBBS7 إلى BBS، واحتمال أن هؤلاء المرضى يحملون قبيل الصدفة من الطفرات في أكثر من واحد الجينات BBS لا يكاد يذكر (Katsanis آخرون 2001a). ثانيا، توصلنا إلى أن، في عائلتين لا علاقة لها، كان الأب في كل حالة لم يتأثر ومتماثل للأليل M390R المشترك، مشيرا إلى أن اثنين من الطفرات BBS1 ليست دائما كافية لالمرضية. وأخيرا، توصلنا إلى أن وتيرة الناقل للأليل M390R في عموم السكان لا يتفق مع وضع مقهورة حصرا من الميراث. الفرق 10 أضعاف بين التردد وتوقع وتصميما تجريبيا من BBS في الشعوب الأوروبية يصعب تفسيره على أنه مجرد نتيجة لتحيز التشخيص أو التحديد. وهناك تفسير أكثر احتمالا هو أن أليل M390R ليس دائما توغل بشكل كامل. نقترح أن وضع قليل الجينات الميراث في BBS قد تكون مسؤولة عن بعض nonpenetrance من M390R. وتمشيا مع هذه الفرضية، فقد قررنا أن 15٪ من الأسر التي لديها طفرات BBS1 التي تحمل واحدة على الأقل M390R أليل يحمل غير مندلية سمة الميراث (الجداول 3 و 4). نقترح أيضا أن nonpenetrance من M390R قد تنبع من متطلبات إما أليل الإمراض الثالث في المرضى أو أليل واقية الثالث في الأفراد تتأثر. منذ إضافي BBS مواضع من المحتمل أن تكون موجودة في الجينوم (> 50٪ من الأنساب لدينا تتحمل أي طفرات في الجينات الخمسة المعروفة واختبارها، ومعظم يمكن استبعاد بواسطة الربط من BBS3 وBBS5، وهما ما تبقى من مواضع معين)، وهذه الفرضيات البديلة لا يمكن بعد تقييمها بشكل كامل.

خلصت دراسة حديثة إلى أن BBS1 لا يحمل الإرث المعقدة القائمة على تحليل 43 probands لا علاقة لها مع اثنين من الطفرات BBS1 من لفيف من 129 عائلة مع BBS (Mykytyn وآخرون 2003). بياناتنا تتفق مع هذه الملاحظات في هذا BBS1 لا يبدو أن تشارك عادة في الميراث معقدة مع مواضع أخرى معروفة. وعلى النقيض من استنتاجات Mykytyn والزملاء، ومع ذلك، ونحن التقرير العديد من الأمثلة التي الطفرات في BBS1 وحدها غير كافية لالمرضية. قد يكون راجعا إلى الاختلاف في الحجم النسبي للفوج في كل دراسة هذا التباين. وعلاوة على ذلك، فوج لدينا هو على الأرجح أكثر تنوعا وراثيا، حيث أن حسابات أليل M390R 18٪ من الطفرات في مجموعتنا (مقابل> 30٪ في الدراسة التي Mykytyn وآخرون)، وبالتالي زيادة احتمال الكشف عن مجموعات أليل أكثر ندرة. نلاحظ أيضا، مع ذلك، أن بعض الجوانب التحليلية قدمت من قبل Mykytyn وآخرون. (2003) هي، بداهة، والتي تتنافى مع اختبار فرضية الميراث معقدة. أولا، تقييم الإرث المعقد في الأسر المستخدمة لتحديد وجود مكان BBS بواسطة الربط التقليدي من غير المرجح أن تقدم معلومات مفيدة، حيث إن وجود الإرث المعقد قد يكون الربط بعدم جواز في المقام الأول. ثانيا، الفحص التقليدي للصبغيات تحكم وحدها توجد أدلة كافية لتحديد تأثير العدوى من أي أليل معين، حيث من المتوقع أن يكون تردد الناقل مرتفعة في عموم السكان الطفرات المشاركة في الميراث معقدة. وأخيرا، نلاحظ باهتمام أن Mykytyn وآخرون. ذكرت عائلتين مع طفرة BBS1 واحدة مع عدم وجود دليل على وجود أليل BBS1 الثاني. الأهم من ذلك، أنهم تقرير الأليلات مغلطة في غيرها من مواضع BBS، التي لا تمثل بدائل المحافظة ولا تم العثور عليها في الكروموسومات السيطرة ولكن قد لا عزل المصابين بهذا الاضطراب. لقد وجدنا اثنين من الحالات التي أليل متحولة الثالث يمارس تأثير التعديل على النمط الظاهري وأظهرت النمط الظاهري الخلوية لمثل "nonsegregating" أليل الثالثة (بيانات غير منشورة المؤلفين). ولذا فإننا نقترح أن بعض الطفرات التي أعلن عنها في الجدول 2 من تقرير صدر مؤخرا عن Mykytyn وآخرون. قد لا تكون هذه الأشكال ولكن الطفرات المسببة للأمراض حميدة.
انتشار وتوزيع Triallelic الميراث في BBS

من وجهة نظرنا الطفرات، وراثية، والبيانات السكانية، فإننا نستنتج أن BBS1، مثل غيرها من BBS مواضع معروفة، وتشارك في كل جسمي الميراث المتنحية وقليل الجينات. ومع ذلك، خلافا لبعض مواضع BBS الآخرين، والغالبية العظمى من الطفرات BBS1 يبدو أن فصل بطريقة مقهورة. عموما، في نحو 75٪ من الأسر التي لديها طفرات BBS1، أليلين تظهر كافية لإمراض (الجدول 1). وبمقارنة هذه البيانات مع مواضع BBS آخر يشير إلى أن كل الجينات لديها مستوى متميز في تورطهم في triallelism (الشكل 4A). على الرغم من أن أعداد الأسر التي لديها طفرات المعقدة في BBS4 وBBS7 صغيرة جدا لمقارنة دقيقة، على ما يبدو، على أساس البيانات المحدودة المتاحة في الوقت الحاضر، أن الطفرات في BBS2 وBBS6 هي الأكثر كافية في كثير من الأحيان أن تسبب المرض في حد ذاتها. في تركيبات triallelic تحديدها حتى الآن، BBS6 يساهم أليل متحولة واحد ثلاث مرات بقدر ما BBS2 وضعفي ما BBS4 (الشكل 4A). ليس من المستغرب، والأكثر شيوعا BBS الاقتران الجين هو بين BBS2 وBBS6 (الشكل 4B)، على الرغم من أن يدعم هذه الملاحظة فقط كما يتم استنساخ الجينات BBS إضافية ويتم التأكد مجموعات تحور أكثر triallelic.

http://www.sciencedirect.com/science...02929707606466

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #2  
قديم 11-23-2015, 07:57 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بارديه-بيدل نوع متلازمة 4 (BBS4) الفئران -null توريط Bbs4 في تشكيل سياط ولكن ليس التجمع أهداب العالمي

 



وظائف البروتينات المشفرة بواسطة متلازمة بارديه-بيدل (BBS) جينات غير معروفة. الطفرات في هذه الجينات تؤدي إلى اضطراب البشري عديد المظاهر BBS، التي تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، الكلى وتشوهات القلب، وصعوبات التعلم، ونقص الأعضاء التناسلية. وتشمل الميزات الثانوية داء السكري وارتفاع ضغط الدم. في الآونة الأخيرة، وقد اقترح أن الظواهر BBS هي نتيجة لعدم تشكيل أهداب أو وظيفة. في هذه الدراسة، وتبين لنا أن الفئران التي تفتقر إلى البروتين Bbs4 على مكونات رئيسية من النمط الظاهري الإنسان، بما في ذلك السمنة وتنكس الشبكية. وتبين لنا أن الفئران Bbs4 فارغة تطوير كل من أهداب متحركة والابتدائي، مما يدل على أن Bbs4 غير مطلوب لتشكيل أهداب العالمي. ومن المثير للاهتمام، الفئران Bbs4 فارغة الذكور لا تشكل الحيوانات المنوية سياط، وBBS4 اعتلال الشبكية ينطوي الموت أفكارك من المستقبلات الضوئية، والخلايا المهدبة الابتدائية من شبكية العين. تدل هذه البيانات على طفرة اتصال بين وظيفة بروتين BBS وأهداب. لمزيد من تقييم وجود ارتباط بين أهداب وBBS، أجرينا مقارنات تناظر من البروتينات BBS في الكائنات نموذج وجدت أن البروتينات BBS يتم حفظها على وجه التحديد في الكائنات المهدبة.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب غير المتجانسة وراثيا مع الربط إلى ثمانية مواضع. وقد تم تحديد ستة جينات BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS6، BBS7، وBBS8) (1 - 7). باستثناء BBS6، التي لديها تشابه لكتابة II chaperonins (8)، والبروتينات BBS لا تظهر التماثل واسعة مع البروتينات وظيفة معروفة. BBS4 وBBS8 يحتوي على تكرار المجالات tetratricopeptide، ومنطقة BBS8 تبين التشابه إلى المجال pilF بدائيات النواة. استنادا إلى الملاحظات التي BBS8 يموضع إلى الجسم القاعدية من الخلايا المهدبة والتعبير عن انواع معينة ايليجانس orthologues من عدة بروتينات BBS تقتصر على الخلايا المهدبة، فقد تم الافتراض أن BBS هو نتيجة لخلل في التجمع أهداب أو وظيفة (7 ). كنا سابقا الاستنساخ الموضعية لتحديد الجين BBS4 الإنسان (3). للمساعدة في توضيح وظيفة البروتينات BBS، استهدفنا الآن الجين Bbs4 في الفئران Bbs4 - / - الفئران ألخص جوانب النمط الظاهري البشري: أن تصبح السمنة، تفشل في إعادة إنتاج، وعرض تنكس الشبكية. وتبين لنا وجود كل من أهداب متحركة والأساسي في هذه الفئران، مما يدل على أن نقص Bbs4 لا يمنع تكون الأهداب العالمي. ومن المثير للاهتمام، الفئران خروج المغلوب من الذكور لديهم انعدام تام للسياط، مما يدل على أن البروتين Bbs4 ضروري لتشكيل سياط خلال تكوين الحيوانات المنوية. وعلاوة على ذلك، الفئران Bbs4 فارغة تخضع تنكس الشبكية يرجع أساسا إلى فقدان خلايا مستقبلة للضوء المرتبطة توهين الجزء الخارجي، مما يشير إلى دور البروتينات BBS في الحفاظ على أهداب الحسية. تدل هذه البيانات على دور للبروتينات BBS في جوانب وظيفة الأهداب.
المواد والأساليب

بناء على تحليل الانفجار Bbs4 جين استهداف ناقلات. من سيليرا قاعدة بيانات الماوس جزء مع تسلسل تحديد تسلسل BBS4 كدنا] الإنسان الموافق الماوس الإكسونات Bbs4. شيد بديلا Bbs4 ناقلات في خطوتين الاستنساخ. ل 'تناظر 5، وsubcloned 3-KB PCR جزء يحتوي على تسلسل الحمض النووي الجيني الموافق الإكسونات 3-5 في مواقع NHE الأول وXho الأول من pOSdupdel (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل ). ل 'التماثل 3، وsubcloned 3.8 كيلوبايت PCR جزء يحتوي على الإكسونات 12-15 في سال الأول وليس المواقع I.
جيل من Bbs4 - / - الفئران وخطي وبناء الاستهداف في غير الموقع الذي فريدة من نوعها و electroporated إلى R1 الجذعية الجنينية (ES) خلايا (129 × 1 / SvJ3129S1 / سيفرت). وقد تم اختيار الخلايا ES في G418 وGanciclovir، وجرى توسيع المستعمرات الباقين على قيد الحياة في لوحات 96-جيدا لفرزها. تم عزل الجينوم DNA من خلايا ES التي يحتضنها في 50 ميكرولتر من تحلل العازلة (50 ملي تريس · حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5 / 2.5 ملي EDTA / 100 ملي كلوريد الصوديوم / 0.1٪ SDS / 500 ميكروغرام / مل بروتين K) لمدة 12-24 ساعة عند 55 ° C. بعد الحضانة، والمخفف لست] الخلية إلى 500 μlofddH 2 O، واستخدمت قسامات 2-ميكرولتر كقوالب لPCR التضخيم. الاشعال محددة ل 'أليل خروج المغلوب (إلى الأمام، 5'-CGTGTACCCACACATGGGGAGCCA-3' 5؛ عكس، 5'-CCGGAGAACCTGCGTGCAATCCAT-3 ') و 3' خروج المغلوب أليل (إلى الأمام، 5'-GGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTT-3 '؛ عكس، 5'- استخدمت TGCACCCAGGAGGGATGCCCATAA-3 ') في إتمام المشروعات طويلة المدى لتحديد الأحداث استهداف الصحيحة. تم تنفيذ PCR في التفاعلات 25 ميكرولتر تحتوي على 5 ميكرولتر من 5 × PCR العازلة [300 ملي تريس · SO 4، ودرجة الحموضة 9.1 / 90 ملم (NH 4) 2 SO 4/10 ملي MgSO 4]، 250 ميكرومتر كل من dATP، dCTP ، dGTP، وdTTP، 2.5 بمول من كل التمهيدي، و1 وحدة من Elongase (إينفيتروجن). تعرض عينات إلى 35 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. وتصور منتجات التضخيم على هلام الاغاروز 0.8٪. تم حقن خلايا ES متخالف لBbs4 أليل متحولة إلى C57BL / 6J الكيسات الأريمية. تم حقن اثنين من الحيوانات المستنسخة المستهدفة في الكيسات الأريمية، وكلا الوهم المنتجة. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Bbs4 متخالف (Bbs4 +/-) الفئران على خلفية وراثية مختلطة من قبل التزاوج مع C57BL / 6J الفئران. تم backcrossed الفئران على خلفية وراثية مختلطة لجيلين على الأقل لإثراء لC57BL / 6J الخلفية. تم intercrossed الفئران متخالف، وكان التنميط الجيني لسلالة بواسطة PCR باستخدام بادئات المشار إليها أعلاه لتحديد وجود أليل المستهدفة. تم تحديد وجود من النوع البري أليل باستخدام بادئات محددة ل5 'من النوع البري أليل (إلى الأمام، 5'-CGTGTACCCACACATGGGGAGCCA-3'؛ عكس، 5'-GGATCCGCAGGCCATGTGCTCAAA-3 ') و 3' من النوع البري أليل ( إلى الأمام، 5'-CACCGGACCTTCCAGACCGACCTC-3 '؛ عكس، 5'-TGCACCCAGGAGGGATGCCCATAA-3). شروط PCR وكما هو موضح أعلاه.
عزل الحمض النووي الريبي والشمالية وصمة عار التحليل. الأنسجة من إناث الفئران القديمة 8 أشهر تم تجميد بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. أجريت مجموع استخراج الحمض النووي الريبي الخلوية، هلام الكهربائي، النشاف والتهجين، وتصوير الإشعاع الذاتي خارج كما هو موضح (9). تم إنشاؤها الماوس Bbs4 كدنا] التحقيق باستخدام بادئات محددة ل 'UTR (إلى الأمام، 5'-CCATAACCTGGGAGTGTGCT-3 "3، عكس، 5'-AGCAGATTTGCTGCCTGAAT-3). تم تجريد لطخة من النشاط الإشعاعي وrehybridized مع لجنة التحقيق [كدنا لβ -actin للتحقق من التحميل على قدم المساواة من الحمض النووي الريبي.
النسيجية، Immunohistological، ومحطة Deoxynucleotidyltransferase بوساطة dUTP نيك نهاية وصفها (النفق) التحليل بعد الموت، ومنزوعة النواة عيون وثابتة عن طريق الغمر في محلول 4٪ لامتصاص العرق في 100 ملي العازلة كاكوديلات، ودرجة الحموضة 7.4. بعد 2-4 ساعة من التثبيت، وكانت تغسل العيون ثلاث مرات في 10 ملي PBS تليها تسلل والغرز في مادة الأكريلاميد، كما هو موضح (10). عندما يكون ذلك ممكنا، وتوجه الكتل بحيث أقسام السهمي تضمنت محاور الأعلى والأدنى. تم جمع المقاطع ناظم البرد في سمك 5-7 ميكرون، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. تم عزل الخصيتين وثابتة في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها. وكان الأنسجة ثم منعت في البارافين ومقطوع عن الهيماتوكسيلين / يوزين تلطيخ. تم إجراء وسم خلايا مستقبلة للضوء قضيب مع RET-P1 حيدة النسيلة الأجسام المضادة (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية) في 1: 1000 التخفيف، تليها التصور مع الأجسام المضادة اليكسا-488-مترافق الموجهة ضد مفتش الماوس (المسابر الجزيئية). لTUNEL تلطيخ، وفي الموقع موت الخلية عدة كشفها، TMR الأحمر (روش العلوم التطبيقية)، واستخدمت وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم counterstained النوى مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي؛ المسابر الجزيئية). كان ينظر المقاطع على أوليمبوس BX-51 المجهر وتم جمع الصور مع SPOT RT كاميرا رقمية (أدوات التشخيص).
الإلكترون التحليل المجهري القصبة الهوائية من Bbs4 - / - تم إصلاح الحيوانات في نصف القوة تثبيتي Karnovsky في (11) لعدة ساعات قبل postfixation الأوسيميوم، والجفاف، وتضمينها في الإي بي شوهدت 812. أقسام سامسونج في المجهر الإلكتروني النافذ، وكانت الصور التي اتخذت في × 35000 و× 2500 من خلال أهداب. الخصيتين من Bbs4 + / + وBbs4 - / - كانت جزءا لا يتجزأ الحيوانات في الراتنج سبر وملطخة 1٪ طولويدين الأزرق. الكلى من Bbs4 + / + وBbs4 - / - كانت الحيوانات المجففة في الإيثانول وجفت باستخدام جفافا نقطة حرجة. وكانت العينات ثم استوى على كعب الألومنيوم باستخدام المزدوج عصا الشريط الكربون، المغلفة مع الذهب / البلاديوم باستخدام المغطي تفل، ثم درست على فيليبس XL 30 مجهر المسح الإلكتروني.

النتائج

Bbs4 استهداف. استهدفنا الجينات Bbs4 في الفئران عن طريق بناء ناقلات تحتوي على مناطق الماوس Bbs4 الجين الذي، على إعادة التركيب مثلي، محل الإكسونات 11/06 مع كاسيت بالنيوميسين (الشكل 1 A). هذا الحدث يزيل ما يقرب من ثلث تسلسل Bbs4 الترميز، مما أدى إلى انزياح الإطار المتوقع أن تخلق أليل فارغة. تم إجراء تحليل لطخة الشمالية باستخدام الحمض النووي الريبي معزولة عن Bbs4 + / +، Bbs4 +/-، وBbs4 - / - الفئران للتأكد من أن استهداف الجينات أدى إلى أليل فارغة (الشكل 1 B.). أدى التنميط الجيني ليترات من intercrosses Bbs4 +/- في F 2 نسب لBbs4 + / + / Bbs4 +/- / Bbs4 - / - الحيوانات 0.36: 0.51: 0.13، مختلفة كثيرا عن المتوقع 0.25: 0.5: 0.25 نسب المندلية ( χ 2 = 7.21، P <0.05).

تين. 1.
استهداف الجين Bbs4. (A) رسم تخطيطي لBbs4 استهداف ناقلات والمنتج إعادة التركيب الناتجة عن ذلك. على إعادة التركيب المتماثل، يتم استبدال الإكسونات 11/06 مع كاسيت بالنيوميسين. (B) (العلوي) تحليل لطخة الشمالي من Bbs4 التعبير في الكلى مجموع RNA الخلوية من النوع البري (+ / +)، متخالف (+/-)، ومتماثل (- / -) الحيوانات. التحقيق هو 960-BP Bbs4 الجزئي 3 'كدنا]. (السفلى) نفس طخة بحث مع β -actin كعنصر تحكم التحميل.

الفئران Bbs4 خالية سمنة Bbs4 - / - يبدو أن الفئران إلى أن تكون صغيرة عند الولادة، تزن أقل من تتزاحم بهم في 3 أسابيع من العمر، وسمنة على مر الزمن (الشكل 2 A - C). بعد الفطام، Bbs4 - / - الفئران تبدأ في كسب المزيد من الوزن من النوع البري الفئران، المتزامنة مع قدر أكبر من الاستهلاك الغذائي (لا تظهر البيانات). قبل 12 أسبوعا من العمر، الفئران Bbs4 فارغة تزن أكثر بكثير من تتزاحم سيطرتهم. الفرق بين الوزن الحيوانات Bbs4 فارغة والضوابط يصبح أكبر في الحيوانات الأكبر سنا، وشهدت زيادة الوزن مماثل لكل من الذكور وإناث الحيوانات. النظر في توزيع الدهون في الحيوانات الأكبر سنا يدل على أن زيادة الوزن يتوافق مع زيادة في الأنسجة الدهنية المودعة مركزيا (الشكل 2 D).

تين. 2.
المقارنة بين الوزن وترسيب الأنسجة الدهنية في الفئران Bbs4. (A) ووزن كل من النوع البري (Bbs4 + / +، ن = 40)، متخالف (Bbs4 +/-، ن = 40)، ومتماثل (Bbs4 - / -، ن = 36) الفئران في 3 و 8 ، 12، 16، 20، و 24 أسابيع من العمر. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SEM. (B) وأوزان الذكور من النوع البري (Bbs4 + / +، ن = 20)، متخالف (Bbs4 +/-، ن = 20)، ومتماثل (Bbs4 - / -، ن = 20) الفئران. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SEM. (C) وأوزان الإناث البرية من نوع (Bbs4 + / +، ن = 20)، متخالف (Bbs4 +/-، ن = 20)، ومتماثل (Bbs4 - / -، ن = 16) الفئران. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± SEM. (D) فحص ترسيب الأنسجة الدهنية يوضح زيادة في كمية الأنسجة الدهنية المركزية في Bbs4 - / - الماوس (يمين)، بالمقارنة مع Bbs4 + / + ماوس (يسار). الفئران من الذكور القديمة ≈10 شهرا.

. الفئران Bbs4 خالية الخضوع أفكارك الشبكية البقعي واعتلال الشبكية هو الميزة الأساسية في BBS، درسنا شبكية العين من Bbs4 - / - الفئران Bbs4 - / - الفئران من تتراوح أعمارهم بين 7 أشهر أو المعرض الأكبر سنا غياب كامل للخلايا مستقبلة للضوء وفقا لتقييم عدم وجود طبقة النووية الخارجي وعدم وجود مبصرة قطاعات الداخلية والخارجية (الشكل 3 A - D). شبكية العين الداخلية من هذه الحيوانات على ما يبدو سليمة مع الداخلية طبقات الخلايا النووية والعقدية العادية.

تين. 3.
فحص شبكية العين الماوس. (A و B) الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ أقسام شبكية العين من Bbs4 + / + (A) وBbs4 - / - (B) الماوس. طبقة مبصرة كلها غائبة في Bbs4 - قسم - /. CH، choroids. RPE، في شبكية العين الظهارة الصبغية. OS، الجزء الخارجي؛ ONL، طبقة النووية الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية. GCL، طبقة الخلايا العقدية. (C و D) وصفها من قضبان مع مكافحة أوبسين (الأخضر) من Bbs4 + / + (C) وBbs4 - / - (D) الماوس. عدم وجود العلامات في Bbs4 - / - يؤكد قسم الشبكية غياب المستقبلات الضوئية. (E و F) وسمها قضبان مع مكافحة أوبسين (الأخضر) من Bbs4 + / + (E) وBbs4 عمره 6 أسابيع - / - (F) الماوس، مما يدل على وجود خلايا مستقبلة للضوء. طبقات النووية ومستقبلة للضوء الخارجي في Bbs4 - / - القسم ما يقرب من نصف سمك Bbs4 + / + قسم، مشيرا إلى انحطاط كبير خلية مستقبلة للضوء.

لتحديد ما إذا كان غياب المستقبلات الضوئية في الحيوانات الأكبر سنا هو نتيجة تنكس الشبكية أو يمثل الخلل التنموي، قمنا بتقييم عيون من الحيوانات الصغيرة. Bbs4 القديمة اسبوعين - / - يبدو أن الفئران أن يكون شبكية العين العادية. ومع ذلك، في 6 أسابيع من العمر، Bbs4 - / - أظهرت الفئران توهين الجزء الخارجي مبصرة وطبقة النووية الخارجي هو واحد نصف سمك أن الحيوانات التحكم (الشكل 3 E و F.). قبل ستة أسابيع من العمر، لوحظ حدوث مخطط كهربية غير طبيعية، مما يدل على وظيفة الشبكية غير طبيعية. في المرضى الذين يعانون BBS الإنسان، وتنكس الشبكية هو التدريجي بالمثل مع فقدان حدة البصر عادة ما تبدأ قبل 10 عاما من العمر، ومما أدى إلى العمى القانوني 20 سنة من العمر.
درسنا آلية موت الخلايا المستقبلة للضوء في Bbs4 عمرها 6 أسابيع - / - الفئران باستخدام تحليل النفق. الحيوانات السيطرة تمتلك نوى-TUNEL إيجابي نادرة للغاية في شبكية العين، وعلى النقيض من Bbs4 - / - الفئران، والتي تظهر نواة المسمى متعددة لكل قسم (لا تظهر البيانات). لم تراع نوى TUNEL إيجابية في طبقات الخلايا النووية والعقدة الداخلية، مشيرا إلى أنه ليس هناك سوى طبقة النووية الخارجي يتأثر. وتبين هذه النتائج أن Bbs4 - / - الفئران تخضع تنكس الشبكية من خلال آلية أفكارك التي تستهدف على وجه التحديد خلايا مستقبلة للضوء وينطوي على توهين مبصرة قطاعات الخارجي.
. ذكور الفئران Bbs4 خالية لا تتطور سياط لاحظنا أن Bbs4 - / - فشلت الذكور لنجب ذرية. للتحقيق في العقم عند الذكور، درسنا الأنابيب المنوية من Bbs4 - / - الفئران بما في ذلك الشباب الحيوانات الناضجة جنسيا وكذلك الحيوانات الأكبر سنا. في Bbs4 + / حيوانات، لوحظت الحيوانات المنوية مع التشكل الطبيعي في جميع الحيوانات فحصها كما يتضح من وجود سياط ونوى الحيوانات المنوية مكثف (+ الشكل 4 A و C). ومع ذلك، في Bbs4 - / - الذكور، هناك انعدام تام للسياط (الشكل 4 B.، حتى في الخلايا مع رئيس المكثف الحيوانات المنوية وجسيم طرفي) (الشكل 4 D.). عدم القدرة على الكشف عن أي الأسواط في الأنابيب المنوية من الذكور Bbs4 - / - الفئران من مختلف الأعمار، على الرغم من الأدلة تطوير الحيوانات المنوية، يشير إلى أن سياط لا تشكيلها.

تين. 4.
الفحص النسيجي من الماوس الأنابيب المنوية. (A) الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ قسم الخصيتين من Bbs4 + / + الماوس. سياط واضحة في تجويف أنبوب صغير. (B) الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ قسم الخصيتين من Bbs4 - / - الماوس يظهر غياب الأسواط في التجويف. (C) طولويدين تلطيخ الأزرق من قسم الخصيتين 1 ميكرون من Bbs4 + / + الماوس تظهر الحيوانات المنوية مع التشكل الطبيعي كما يتضح من وجود سياط ونوى الحيوانات المنوية المختصرة. (D) طولويدين تلطيخ الأزرق من قسم الخصيتين 1 ميكرون من Bbs4 - / - الماوس تبين وجود نواة الحيوان المنوي المختصرة في سياط الغياب.

عدم وجود Bbs4 لا يمنع متحركة أو الابتدائية سيليا تشكيل. ونظرا لتوهين الملحوظ من مبصرة قطاعات الخارجية، وغياب الحيوانات المنوية سياط، وذكرت مؤخرا أدلة على أن بعض البروتينات BBS توطين للهيئات القاعدية، كنا المجهر الإلكتروني لدراسة هيكل كلا متحركة وأهداب الابتدائي في Bbs4 - / - الفئران. تم استخدام المجهر انتقال الإلكترون إلى دراسة هيكل أهداب متحركة من القصبة الهوائية من Bbs4 - / - الفئران. وقد لوحظ هيكل الخيط المحوري العادي مع المقابلة الترتيب 9 + 2 أنيبيب في Bbs4 - / - الفئران (الشكل 5 A). لتقييم بنية أهداب الابتدائي، أجرينا المسح المجهر الإلكتروني على الخلايا الظهارية في الكلى. وقد لوحظ وجود أهداب الرئيسي الممتد من سطح الخلايا أنبوبي كلوي في Bbs4 + / + (الشكل 5 B. وBbs4، السهام) - / - (الشكل 5 C، السهام) الحيوانات. ولذلك، Bbs4 - / - الفئران تمتلك الأهداب كلا متحركة والأساسي الذي يبدو طبيعيا بشكل صارخ في الطول، عدد، والهيكل.

تين. 5.
الإلكترون التحليل المجهري للأهداب متحركة والابتدائي. (A) نقل الإلكترون صورة مجهرية لشريحة من أهداب في القصبة الهوائية لBbs4 - / - الماوس. تم تعريفها بوضوح تسعة الخارجي واثنين من الأنابيب الدقيقة الداخلية، مشيرا إلى أن البنية الداخلية للأهداب متحركة يبدو طبيعيا. (B و C) الضوئي الإلكترون صورة مجهرية من خلايا النبيبات الكلوية من Bbs4 + / + (B) وBbs4 - / - (C) الماوس. طبيعي الظهور أهداب الابتدائي (السهام) جلية في كل منهما.

حفظ النشوء والتطور من BBS البروتينات. لتحديد ما إذا كانت البيانات النشوء والتطور تدعم دور البروتينات BBS في وظيفة الأهداب، أجرينا تحليل انفجار BBS4 وغيرها من البروتينات BBS المعروفة ضد المتاحة قواعد البيانات تسلسل الجينوم من EnsEMBL (المصحف العضلة، دانيو rerio، ذبابة الفاكهة، وانواع معينة ايليجانس)، JGI (Ciona المعوية وكلاميدوموناس reinhardtii)، TIGR (المثقبيات البروسية والمثقبيات الكروزية)، SGD (خميرة الخباز)، سانجر (السكيراء pombe)، واسع (الرشاشيات nidulans)، وTAIR (نبات الأرابيدوبسيس thaliana). تم تقييم الكائنات التي تم تحديدها المتماثلات BBS المفترضة مزيدا من التحليل الانفجار ضد البروتينات المتوقعة لتلك الكائنات. وكان من النتائج إثارة للدهشة هو أنه، بصفة عامة، والكائنات المهدبة لها تسلسل المتجانسة للغاية لبروتينات BBS، في حين أن الكائنات nonciliated لا (الجدول 1). على سبيل المثال، وحيدة الخلية المهدبة حتى أقل الكائنات مثل T. البروسية، T. الكروزية، وC. reinhardtii يكون تسلسل المتجانسة للغاية لبروتينات BBS المعروفة. بالإضافة إلى ذلك، اللافقاريات مهدبة، Ciona المعوية، لديه تسلسل المتجانسة للغاية لبروتينات BBS. في المقابل، الكائنات بدون أهداب (أي، S. الخباز، السكيراء pombe، الرشاشية المعششة، وA. thaliana) لا تملك متواليات التي هي غاية مثلي لBBS تسلسل البروتين. ومن المثير للاهتمام، D. البطن له المتماثلات فقط لBBS1، BBS4، وBBS8. الاستثناء الملحوظ في حفظ العام للبروتينات BBS في الكائنات المهدبة هو BBS6، التي ليس لها إلا التماثل على مستوى منخفض في معظم الكائنات الحية nonvertebrate تقييمها.

الجدول 1. الشخصي النشوء والتطور من BBS homologies البروتين في جينومات مختلفة تظهر القيم المتوقعة الحصول عليها من تحليل الانفجار من البروتينات BBS الإنسان ضد قواعد البيانات البروتين وتوقع مجموعة من مهدب (MM، DR، CI، CE، CR، TC، السل، DM) و nonciliated (SC، SP، AN، AT) الكائنات الحية

نقاش

وتساهم هذه النتائج الموضحة هنا في فهمنا لوظيفة البروتين BBS4. وتبين لنا أن الفئران التي تفتقر Bbs4 تطوير والسمنة، وعرض تنكس الشبكية، وتفشل في تجميع سياط خلال تكوين الحيوانات المنوية. بناء على توطين بعض البروتينات BBS على الجسم القاعدية من الخلايا المهدبة (7)، يمكن من حيث المبدأ أن تشارك البروتينات BBS في تكون الأهداب، صيانة أهداب والنقل intraflagellar (IFT)، و / أو أنيبيب النقل داخل الخلايا التابعة. نتائجنا تظهر ان غياب البروتين Bbs4 لا يمنع التشكيل الأولي إما أهداب متحركة أو الأساسي، على الرغم من عدم وجود هذا البروتين لا يؤدي إلى فشل تشكيل الأسواط في الحيوانات المنوية الناضجة. هذه النتائج تشير إلى أن هناك اختلافات في متطلبات Bbs4 بين التجمع من الأسواط والأهداب. وقد تبين أن بعض مكونات IFT مطلوبة للأهداب والتجمع سياط (12). ومع ذلك، كما تم الإبلاغ عن بعض الاختلافات في هذه العمليات. على سبيل المثال، وقد تجلى ذلك في ذبابة الفاكهة ما هو مطلوب IFT للتمييز أهداب الحسية، ولكن ليس الحيوانات المنوية (13). مزيد من الدراسة سوف تكون ضرورية لتحديد ما إذا كانت وظائف بروتينات BBS تقتصر على مجموعة فرعية من الأهداب.
وقد أشير إلى أن البروتينات BBS من غير المرجح أن تلعب دورا في IFT لأنهم لا توطين للالخيط المحوري (7). ومع ذلك، وهذه البيانات توطين تتسق مع إمكانية أن البروتينات BBS بمثابة وسطاء للاتصال و / أو نقل الخلايا بين هدب والداخلية للخلية. بدلا من لعب دور مباشر في IFT، قد البروتينات BBS تلعب دور مساعد عن طريق إعداد جزيئات للنقل، أو من خلال لعب دور في النقل داخل الخلايا المرتبطة أنيبيب.
A خلل في IFT يتسق مع تنكس الشبكية التي ينظر اليها في Bbs4 - / - الفئران. ويعتقد أن هدب يربط بين الجزء الداخلي والخارجي للشبكية لتكون الطريق الحصري لنقل البروتينات تصنيعه حديثا من الداخلية إلى الجزء الخارجي. وقد تبين أن تعطل هذه العملية في كينيسين-II نموذج الماوس خروج المغلوب الشرطي أن يسبب تنكس الشبكية، مما يدل على أن IFT هو مطلوب للحفاظ على الجزء الخارجي من خلايا مستقبلة للضوء (14). وتبين لنا أن فقدان Bbs4 لا يمنع التشكيل الأولي للقطاعات مبصرة الخارجي، ونقترح أن غيابها يؤثر سلبا على النقل بين الخلايا ما هو مطلوب للحفاظ على تجديد بسرعة قطاعات الخارجي من هذه الخلايا. فشل تشكيل سياط ومبصرة صيانة الجزء الخارجي في Bbs4 - / - الحيوانات توفر البيانات طفرية الأولى مباشرة مما يدل على دور الهدبية للبروتينات BBS.
بالإضافة إلى البيانات طفرة الماوس، ونحن نقدم بيانات النشوء والتطور مقارنة البروتينات BBS الإنسان وجينومات الكائنات النموذجية. تدل هذه البيانات على الحفاظ على ذات دلالة إحصائية من البروتينات في الكائنات BBS المهدبة أقل، ودعم دور للبروتينات BBS في وظيفة الأهداب. والاستثناء الوحيد لهذه المحافظة هو BBS6. قد يشير هذا إلى أن هذا البروتين هو ليس من الضروري مباشرة للحصول على وظيفة الأهداب في هذه الكائنات. من الفائدة ملاحظة أن ذبابة الفاكهة لديهم المتماثلات لBBS1، BBS4، وBBS8، ولكن ليس لBBS2، وBBS7، مما يوحي بأن BBS1، BBS4، وBBS8 مطلوبة من أجل وظيفة. من المذكرة، وتوفر البيانات النشوء والتطور استراتيجية لتحديد الجينات البشرية الأخرى المعنية في وظيفة الأهداب، والمرشح بالتالي إضافي الجينات BBS. عن طريق تحديد الجينات البشرية التي يتم حفظها على وجه التحديد في الكائنات مهدبة (خصوصا الكائنات مع أحجام الجينوم صغيرة نسبيا) ولكن ليس الحفظ في الكائنات nonciliated، يمكن للمرء تحديد مجموعة فرعية من الجينات التي يتم إثراء للجينات التي تخدم وظائف أهداب ذات الصلة. قوة هذا النهج هو واضح عندما ينظر المرء أنه بالرغم من أن أحجام الجينوم من نوعين المثقبيات هي ≈1٪ من الجينوم البشري، ديهما المتماثلات للجينات BBS.
ومن غير الواضح لماذا عدم وجود Bbs4 يؤدي إلى السمنة. هذا وقد تمثل هذا التأثير مستقل عن دور Bbs4 في وظيفة الهدبية. بدلا من ذلك، فإن وجود السمنة باعتبارها عنصرا رئيسيا من النمط الظاهري BBS قد تشير إلى وجود صلة لم تكن معروفة سابقا بين الوظيفة الهدبية والحفاظ على وزن الجسم المناسب Bbs4 - / - الفئران تبين زيادة الاستهلاك الغذائي بالمقارنة مع الحيوانات مراقبة؛ وبالتالي، مهما كان الدور الذي تلعبه Bbs4 في تنظيم كتلة الجسم يبدو أن تنطوي على تنظيم الشبع. نقص Bbs4 قد يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية طائي المحددة المعنية في الشبع، أو قد يؤدي إلى فشل نقل الخلايا من المكونات الأساسية للخلايا العصبية المهاد.
وسوف تكون ذات فائدة لتحديد ما إذا كان التفاعل الجيني للبروتينات BBS تحدث، سواء الجينات BBS تشكيل مجموعات تكامل، وعما إذا كانت مجموعات من العجز الجزئي (أي الطفرات متخالف) في اثنين أو أكثر من مواضع تؤدي إلى الظواهر BBS. في البشر، هناك بين الوكالات واسعة والتباين المظهري داخل الأسرة، مما يشير إلى وجود مواضع معدل (15، 16). توليد Bbs4 الفئران خروج المغلوب هو خطوة نحو التحقيق في دور المعدلات الوراثية في BBS. وتجدر الإشارة إلى أن عناصر من النمط الظاهري (السمنة، وتنكس الشبكية، والعقم) يبدو أن توغل كبير في الحيوانات درس حتى الآن. هذه النتيجة تدعم الفرضية القائلة بأن في البشر، ورثت BBS ومرض وراثي جسمي مقهور مع التعبيرية متغير (17). بل هو أيضا من الفائدة التي Bbs4 - / - الفئران ليس لديها بعض مكونات النمط الظاهري البشري، وأبرزها polydactyly. وسوف تكون ذات فائدة لتحديد ما إذا كان عدم وجود polydactyly غير محددة لالفئران Bbs4 فارغة وإذا كانت هناك مكونات الجينات المحددة من النمط الظاهري BBS

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #3  
قديم 11-23-2015, 08:02 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي خصائص قليل الجينات متلازمة بارديه-بيدل

 



متلازمة بارديه-بيدل (BBS: OMIM 209900) هو اضطراب في النمو النادر أن يسلك كبير عدم التجانس السريرية والجينية. على الرغم من أن غرار البداية كصفة متنحية بحتة، وغير المقنعة البيانات الأخيرة لوضع قليل الجينات من انتقال المرض، الذي الطفرات في مختلف BBS مواضع يمكن أن تتفاعل وراثيا في بعض العائلات أن تسبب و / أو تعديل النمط الظاهري. هنا، وسوف استعراض ومناقشة التطورات الحديثة في توضيح الجوانب سواء الوراثية والخلوية من هذا النمط الظاهري والتطبيق المحتمل في فهم الأساس الجيني للالتباين المظهري والميراث قليل الجينات.
القسم السابق القسم التالي
تلقى 29 يناير 2004؛ المنقحة والمقبولة 9 فبراير 2004

مقدمة

وقد وفرت العقدين الماضيين أمثلة عديدة حيث تم عزا الأساس الجيني للمرض البشري بشكل مقنع إلى حدوث طفرات في مكان معين. هذا التقدم، ومع ذلك، فقد أثارت أيضا تحديات جديدة كبيرة. الأكثر إثارة للمشاعر هو إدراك أن للأغلبية الساحقة من الجينات المرتبطة الصفات المندلية، ومعرفة التركيب الوراثي في مكان واحد يمكن أن لا يتوقع ولا يفسر مرض مظاهر المظهرية في أي مريض معين أو عائلة (+1 - 3). وقد أدى ذلك إلى استكشاف الفرضيات والنماذج تعديل الموقع الثاني، الذي ينص على الأليلات في مواضع إضافية تؤثر على نتائج المظهرية لطفرات في مكان واحد، وأساسا إلغاء مندلة الصفات أحادية المنشأ (4).
على الرغم من بعض النجاح في قياس تعديل الموقع الثاني في البشر (2، 5) والكائنات نموذج (6، 7)، فهم التفاعلات الوراثية، والكيمياء الحيوية في نهاية المطاف، من اثنين من الجينات ومنتجاتها يبقى مهمة صعبة. بعض المشاكل الجذعية إما من قدرة محدودة لدينا لقياس مساهمة الأليلات محددة إلى النمط الظاهري (ينظر بشكل خاص أليل "ضعيفة"، مثل بعض الطفرات مغلطة) أو من محدودية المعلومات المجراة حول الخصائص الكيميائية الحيوية والخلوية للمنتج الجين قيد التحقيق.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو النمط الظاهري يمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في بعض هذه القضايا، لأن المرض يمكن أن تفصل في الأسر على حد سواء باعتبارها راثي متنحي الكلاسيكية وسمة digenic. وعلاوة على ذلك، المعلومات الفنية بدأت في الظهور حول الدور الخلوية من البروتينات BBS، وتقدم إمكانية نمذجة الأساس الخلوي للتفاعل الوراثي وتطبيق الدروس المستفادة لقليل الجينات والصفات المعقدة.

التحدي الجيني للBBS

BBS هو النمط الظاهري multisystemic تتميز في المقام الأول عن السمنة، تنكس الشبكية، polydactyly، الغدد التناسلية وتشوه الكلوي والمشاكل السلوكية والتنموية. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن المرضى الذين يعانون من BBS مع مجموعة من المظاهر السريرية شديدة التباين التي تتراوح من أمراض الشعب الهوائية رد الفعل إلى مرض نفسي (لمناقشة متعمقة من النمط الظاهري نرى +8 - +11). اضطراب غير شائع نسبيا في شعوب القوقاز، بمعدل انتشار يقدر ب 1: 140 000-160 000 ولادة حية في أمريكا الشمالية وأوروبا (12، 13)، على الرغم من أن أعلى معدل تم الإبلاغ في السكان المعزولين في نيوفاوندلاند [1: 13 000 (9)] والكويت [1: 17 000 (14)]. يمثل النمط الظاهري BBS لغز الجيني صعبة، منذ يقترح خسارة أو خلل في بروتين واحد أن تؤدي إلى وخصائص multisystemic المتميزة للمتلازمة، بما في ذلك التقدمية (مثل ضمور شبكية العين والسمنة) والهيكلية (مثل polydactyly والكلى الخراجات) العيوب. وعلاوة على ذلك، BBS يسلك التباين المشترك بين وداخل الأسرة الكبير، الذي هو أيضا من الصعب التوفيق مع احد الجينات جسمية نموذج المتنحية. وأخيرا، على الرغم من التوقعات الأولية إلى أن معظم الأسر BBS ستسند إلى نفس الموضع، والطفرات الإحصائي الأدلة الناشئة واقترح عدم التجانس الوراثي كبير، مع ما لا يقل عن تسعة مواضع في الجينوم.

IDENTIFICATION GENE في BBS

بعد توقف دام 7 سنوات بين التعيين من أول موضع BBS، BBS2 (15)، واستنساخ الجين الأول، BBS6 (16، 17)، وأحرز تقدما كبيرا في السنوات ال 3 الماضية في توضيح الأساس الجيني لل BBS. في الوقت الحاضر، هناك ستة جينات BBS المعروفة (الجدول 1). اثنين من أكثر مواضع، BBS3 (18) وBBS5 (19) تم تعيينها والبيانات طفرية / الوراثية في أفواج كبيرة تشير إلى وجود واحد على الأقل من موضع، وذلك لأن الأسر العديدة تؤوي أي طفرات في الجينات الستة المعروفة ويمكن استبعادها من جميع مواضع ثمانية من خلال تحليل النمط الفرداني (20 - +22). الأهم من ذلك، أكثر من مواضع معروفة تؤوي الطفرات المسببة للأمراض في نسبة صغيرة من الأسر BBS (الشكل 1). حتى BBS1، والذي يعتبر البداية ليكون موضع كبيرا للمتلازمة، مع المساهمة المتوقعة من 40-50٪ (+23 - 25)، وتحور فقط في 20-25٪ من القوقازيين ونادرا ما في البدو، واحدة من المجموعات العرقية الرئيسية مع حدوث BBS عالية (26). على هذا النحو، فمن المرجح إما أن يبقى موضع رئيسي آخر BBS ككل، أو أكثر تحديا، أن ما تبقى من> 50٪ من BBS يتم توزيعها بين عدد كبير من الجينات، كل منها يساهم نسبة متواضعة إلى تجمع طفرة BBS.

الشكل 1. مساهمة معروف BBS مواضع ثمانية إلى BBS. تم تعيين الأسر التي لديها ثلاثة الطفرات إلى موضع الأساسي (واحد مع اثنين من الطفرات). وقدرت مساهمة BBS3 وBBS5 من بيانات التركيب الوراثي فقط، لأنه لا الجين المعروف حتى الآن.


الجدول 1.
الجينات BBS معروفة ومنتجاتها

التعديل الثاني-SITE في BBS

كل من التجانس الوراثي كبير وتقلب السريرية في BBS تشير إلى أن الموقع الثاني-التعديل الوراثي هو المرجح للغاية، حيث طفرات في الجين الثاني قد تعدل انتفاذ و / أو التعبيرية من الطفرات المتنحية في موضع الابتدائي. ما هو أكثر إثارة للدهشة، ومع ذلك، هو أن الجينات BBS مختلفة تظهر الآن قادر على تحمل إما سببية أو دور المعدلة في عائلات مختلفة، قد يخلق نموذجا جديدا من انتقال المرض بين البشر. أول دليل غير مباشر لهذه الظاهرة نشأت بعد استنساخ أول جين BBS، BBS6 (16، 17). الطفرات مفصلة وتحليلات النمط الفرداني في كبيرة، فوج متعددة الأعراق كشف نوعين من الانحرافات المحتملة من محض نماذج الفصل الأمراض المندلية. أولا، في معظم الأسر التي لديها طفرات BBS6، لا يمكن التعرف على أليل متحولة الثاني، على الرغم المباشر التسلسل صبغ التمهيدي من كامل BBS6 كدنا] (27). هذا يزيد من احتمالات أن هناك إما تيرة عالية من نوع الطفرات لا يمكن الكشف عنها من قبل المنهجية (مثل الحذف كبيرة، والتحكم في الاضطرابات عنصر، الخ) أو أن BBS6 قد يشارك في الميراث معقدة. الثانية، وأكثر من الفضول، تم العثور على طفرة A242S متخالف واحد في الأسرة الأقارب واحدة من نيوفاوندلاند (27) الذي كان متوقعا في السابق عن طريق تحليل مفردات لتعيين BBS2 (28). من غير المرجح أن تكون حميدة، لأسباب ليس أقلها أنها ارتبطت في السابق في ولاية متماثل مع متلازمة ذات الصلة ظاهريا McKusick-كوفمان (MKS) (هذا البديل 29). الأهم من ذلك، كان كل من الأشقاء المتضررة وغير المتضررة النسخ المتنوعة متطابقة حول كل من الكروموسومات في منطقة 5 سم تتمحور حول BBS6، مشيرا إلى أنه إذا كانت الطفرة الثانية الحاضرة في هذا الموضع، سواء sibs سيكون له أنها قد ورثت ذلك، على الرغم من واحد منهم كان سواء ظاهريا وضعها الطبيعي وأبعد من متوسط ​​العمر من ظهور هذا الاضطراب. وكان التفسير أكثر شحيح جدا أن أليل A242S قد تتفاعل وراثيا مع الطفرات في موضع آخر BBS (المتوقع في هذه الحالة أن يكون BBS2). تم اختبار هذه الفرضية مباشرة على استنساخ الموضعية من BBS2 (30) عن طريق فحص الفوج نفسه بغض النظر عن الربط التأكد سابقا أو معلومات طفرة وراثية. وقد تم تحديد أربع سلالات ايواء التعديلات المسببة للأمراض المحتمل في كل BBS2 وBBS6، بما في ذلك الأسرة المذكورة أعلاه من نيو فاوند لاند، الذي يتأثر، ولكن ليس السيب تتأثر يضمرون طفرة متماثل Y24X هراء في BBS2 (31). في الثانية الأسرة القوقازية الأباعد، سواء المتضررين وكان أحد السيب تتأثر متخالف مركب لمدة الطفرات هراء BBS2. فقط السيب المتضررين، ومع ذلك، قامت طفرة هراء متخالف إضافية في BBS6. وبناء على هذه البيانات، واقترح نوعا جديدا من تعديل الموقع الثاني، وصف الميراث triallelic، حيث كانت ثلاث الأليلات الطافرة على اثنين من مواضع اللازمة لالإمراضية (31).

تقييم TRIALLELIC الميراث ACROSS GENES BBS المعروفة

وبعد اكتشاف الإرث triallelic، وفحص BBS6 في جماعة مستقلة كشفت عن وجود فائض ملحوظ من الأسر التي لديها طفرة واحدة يمكن تحديدها BBS6 (خمس أسر) في مقابل اثنين الطفرات المتنحية (عائلتين). ومع ذلك، لا النية الحسنة triallelic تم تحديد مجموعات، مما يشير إلى أن الطفرات BBS6 قد تتفاعل وراثيا مع مواضع أخرى (32). استنساخ الجين BBS الثالث، BBS4 (33)، وقدم بعض الأدلة على أن مشاركة triallelic الأليلات الطافرة لا يقتصر على BBS2 وBBS6 منذ واحد، متخالف، من المحتمل تم العثور على الطفرات المسببة للأمراض في ثلاث عائلات (34). يثير الاهتمام والفضول، في أسرة الأقارب الرابعة من أصل كردي، قام الفرد المصاب طفرات متماثل في كلا BBS2 (T558I) وBBS4 (A364E)، في حين أن كلا من الأم والأخ تتأثر قامت ثلاث الأليلات الطافرة (34).
الاستنساخ من BBS الجين الرابع، BBS1 وتحليل نص لالميراث تعقيدا، ومع ذلك، اقترح أن triallelism قد لا تكون ظاهرة في كل مكان في BBS. الأسر التي لديها طفرات BBS1 ورثت هذه الصفة بطريقة المتنحية، على الرغم من الطفرة المسببة الثانية لا يمكن العثور عليها في نسبة صغيرة من sibships (35، 36). في اتفاق مع هذه البيانات، ذكرت Fauser وزملاؤه الميراث معقدة في BBS2 وBBS4 ولكن ليس BBS1 في لفيف من 21 مريضا لا علاقة لها (22). ومع ذلك، فإن استنساخ BBS7 تتناقض هذه النتائج، منذ طفرة E237K متخالف في BBS1 فصلت مع المرض في عائلة من أصل اسباني ايضا ان يحمل طفرة T211I متماثل في BBS7 (21). قدم تحليل لفيف أكبر من 259 أسرة مستقلة من خلفيات عرقية متنوعة عدة أسطر من الأدلة على أن BBS1 تشارك في triallelism. وشملت هذه تحديد ست عائلات مع اثنين من الطفرات BBS1 وطفرة الثالثة في موضع آخر BBS وعائلتين فيه أحد الوالدين يتأثر هو متماثل لطفرة M390R (26)، والبديل BBS1 الأكثر شيوعا في القوقازيين (35).

AN VIEW المتطورة للأليل المساهمة في TRIALLELIC الميراث

مقارنة بين التردد النسبي للtriallelism موثقة (ثلاث طفرات) أو triallelism توقع (اثنين من الطفرات في الأقارب أعراض أو طفرة واحدة في أسرة المستثناة بموجب الربط) في كل البرامج الجينات BBS اختلافات ملحوظة بين مواضع (الشكل 2 A). من كل البيانات المتاحة حتى الآن، BBS2 وBBS6 المشاركة في أغلب الأحيان في مجموعات triallelic. في المقابل، والطفرات في BBS1 يبدو كافيا للتسبب المرض في أكثر من 80٪ من المرضى BBS1، الذي قد يفسر في جزء البيانات المتناقضة بشأن إشراك BBS1 في الميراث triallelic. في الوقت الحاضر، لم يتم بعد تورط فقط موضع BBS8 حددت مؤخرا في مثل هذه الظواهر الوراثية (20)، على الرغم من أن هذا قد يعكس عدد صغير (ثلاثة) من الأنساب المرتبطة موعد مع BBS8.

الشكل 2. تحليل الطفرات triallelic. (A) بار الرسم البياني تصور نسبة الأسر يظهر الميراث المتنحية أو قليل الجينات (المساهمة إما واحد أو اثنين من الطفرات) في موضع. يشارك أي من أسر ثلاثة مع الطفرات BBS8 في الميراث triallelic. (B) نوع الطفرة مجموعات في الميراث triallelic. تم تصنيف الطفرات على نطاق واسع بأنها هراء (N)، مغلطة (M)، وصلة (S) أو غير معروفة (U). يشير هذا الأخير الحالات التي يتأثر أحد الوالدين أو السيب تتأثر يحمل اثنين من الطفرات في مكان واحد، ولكن لم يتم بعد تحديد أليل الثالث.

أنواع الطفرات المرتبطة موعد مع triallelism بدأت أيضا لتقديم بعض المؤشرات الفنية. حتى وإن كانت هناك أمثلة قليلة نسبيا المتاحة، فقد أصبح من الواضح أن مجموعات من ثلاثة بحسن نية خسارة كاملة من الأليلات وظيفة نادرة، مع واحد فقط مثال موثقة من ثلاثة الأليلات هراء يجري اللازمة لالمرضية (التي تشمل BBS2 وBBS6). تتكون تركيبات triallelic المتبقية في المقام الأول من اثنين أو ثلاثة من الطفرات مغلطة (الشكل 2 B). وهذا يثير التحدي المتمثل في تحديد إمكانيات المسببة للأمراض من الأليلات مغلطة.
تاريخيا، وقد نظرت في فصل البديل المرشح مع اضطراب مؤشرا قويا على الإمراضية. كما تم استخدام هذا المعيار في تقييم الطفرات triallelic المحتملة، نهج صحيح وفقا لنموذج السببية، حيث يفترض أليل متحولة الثالث من الضروري لمظهر من مظاهر المرض. ومع ذلك، وفصل الطفرات triallelic في الأسر BBS، إلى جانب المظهرية في المختبر تحليلات لمنتجات البروتين متحولة وأشار إلى أن بعض الطفرات قد تؤثر على شدة النمط الظاهري المتنحية، وبالتالي توسيع نموذج من الميراث triallelic لتغليف تعديل كل من انتفاذ والتعبيرية (37).
في ثلاث عائلات BBS، بعض، ولكن ليس تم الإبلاغ عن جميع المرضى قد ورثت أليل الإمراض الثالث، والتي ترتبط في كل حالة على حدة مع زيادة شدة المرض. وقد تم توثيق المشترك بين وداخل الأسرة المظهرية التباين نطاق واسع لBBS (8، 9، 11)، أي تعقيد مثل هذه الارتباطات-النمط الظاهري النمط الجيني. ومع ذلك، واحدة من ثلاث عائلات، PB009، تؤوي طفرة M390R متماثل في BBS1، بالإضافة إلى تغيير L349W متخالف في BBS2 التي تفصل مع سن مبكرة من ظهور النمط الظاهري في شبكية العين (الشكل 3). ولذا كان من الممكن تحقيق التباين في سن بداية من اعتلال الشبكية، واحدة من الجوانب أكثر اتساقا من النمط الظاهري BBS، في الأسر المتنحية متعددة مع التركيب الوراثي BBS1 M390R وقارن الفرق مع أن الأسرة مع الطفرة BBS2 إضافية. والمثير للدهشة، كان فرق المتوسط ​​في عمر البدء في الأسر M390R المتنحية 3 سنوات فقط، مقارنة مع الفارق من 19 عاما لوحظ في sibship triallelic (37).

الشكل 3. ليس كل الأحداث تعديل الموقع الثاني في BBS هي السببية. في كل من العائلتين هو مبين، طفرة الثالثة في BBS6 وBBS2، على التوالي، يرتبط النمط الظاهري أكثر شدة، كما هو مبين تحت كل مريض. خ م = انزياح الإطار (1650 درجة مئوية)؛ MR = تخلف عقلي، RP = التهاب الشبكية الصباغي. البنك المركزي السويسري = العمى الليلي ثابتة.

وقد لوحظت ظاهرة مماثلة في غيرها من عائلتين، مع BBS1 وBBS6 كما المعدل الموقع الثاني. على سبيل المثال، في AR768 الأسرة، وطفرة BBS1، وتوقع طفرة لصق مفرق تؤدي إلى أليل باطل من قبل هراء التوسط الاضمحلال، والمترابطة مع تأخر في النمو في مرحلة الطفولة المبكرة، في حين أن طفرة مغلطة BBS6 T325P ارتباطا مع شدة زيادة من عدة جوانب من النمط الظاهري بما في ذلك السمنة، والتخلف العقلي وتأخر في النمو (الشكل 3). يثير الاهتمام والفضول، اقترحت الدراسات في المختبر في خلايا هيلا أن هذا البديل قد يكون له عواقب وخيمة على وظيفة البروتين، منذ الموسومة حاتمة overexpressed بنيات BBS6 تؤوي بقايا البرولين تشكلت رواسب هيولي غير قابلة للذوبان (37).
وبناء على هذه الأمثلة، تم اقتراح نموذج الانحدار لBBS، وتحويل النمط الظاهري من أحادية المنشأ لسمة الكمية، مع بداية وشدة المرض يتم عن طريق التضمين الأليلات إضافية، وعدد والمساهمة النسبية الذي هو غير واضح. هذا النموذج هو يتفق مع الأفكار الحالية للسببية المرض، حيث انتفاذ، التعبيرية وقشوة هي تمثيلات جزئية من سلسلة متصلة من التأثير الجيني (38، 39).

بعض الدروس وراثية جديدة

أن ميراث Triallelic وغيرها من أشكال تعديل الموقع الثاني-ربما يتطلب تعديل الطرق التقليدية لتقييم الجينات المرشحة. أولا، فإن الممارسة الشائعة المتمثلة في استبعاد عائلة من فحص إضافي مرة واحدة تم التعرف على "المسبب" طفرة ربما يؤدي إلى فقدان البيانات التفاعل الوراثية. هذا ينطبق بشكل خاص في الصفات غير المتجانسة وراثيا مثل BBS هذا. ولعله من الواضح بداهة أن الجينات المتعددة التي تؤدي إلى نفس النمط الظاهري هي مرشح قوي لتعديل الموقع الثاني، بعد كثير من الأحيان يتم تجاهل هذا الاحتمال.
التثبت من الطفرات قليل الجينات مرشح ويمكن أيضا أن يكون تحديا. أولا، ينبغي أن المعيار التقليدي الذي النية الحسنة الطفرات لا تكون موجودة في الكروموسومات السيطرة، وعدد من التي تمليها عادة من قبل حدوث السكان من المرض، لم يعد من الممكن تطبيقها. إلا بعض الأليلات تشارك في الميراث قليل الجينات لها تردد مرتفعة في عموم السكان، فإن فرصة للفرد وراثة ثلاثة أو أكثر من الطفرات في نفس الوقت أن تكون صغيرة، وهي ليست كذلك. على سبيل المثال، وانتشار الطفرة M390R المشتركة في BBS1 في القوقاز هو ~1: 325، مقارنة مع تردد المتوقع من 1: 1000-2000 بموجب نموذج المتنحية (26).
وأخيرا، فإن الفصل بين متغير يمكن أن يؤدي أيضا إلى underappreciation من تأثير أليل على النمط الظاهري. وفقا لنموذج أحادي الجين، قد تم تجاهل العديد من الطفرات في الجينات ينظر BBS كما حميدة (بما في ذلك طفرة لصق تقاطع في BBS1)، في حين قدمت فرضية روكبي تفسير أكثر شحيح جدا من هذه البيانات (37). يمكن نمذجة هذه التفاعلات الوراثية يمكن أن يكون تحديا، مع خطر حقيقي من التخمة وتحت تفسير البيانات طفرية. ومن المرجح أن يتيسر من خلال تطوير البيانات الخلوية والمقايسات البيوكيميائية التي يمكن اختبار مباشرة تأثير البديل على جين معين، والمنتج والمسار (ق) في تأدية وظائفه مثل هذه المساعي.

نحو فهم الخلوي والبيوكيميائية OF TRIALLELISM

وعلى الرغم من إحراز تقدم كبير في توضيح الأساس الجيني من اضطرابات قليل الجينات، وترجمة البيانات الوراثية لنماذج الخلوية لا تزال بعيدة المنال إلى حد كبير. ظهرت نماذج التفاعل المباشر من دراسة الخواص الكيميائية الحيوية من ROM1 وRDS، التي تتفاعل وراثيا لتسبب digenic التهاب الشبكية الصباغي (40) والتي تشكل tetramers (منتجات البروتين +41 - 43). وقد أثبتت أزواج أخرى من التفاعلات الجينية إلى أن أكده علاقات مماثلة، مثل أزواج مستقبلات يجند من JAG1 مع NOTCH2 في متلازمة Allagille (44) وRET-GDNF في مرض هيرشسبرونغ (45؛ انظر 2 لمناقشة المزيد من التفاصيل لهذه نماذج).
وقد أشارت الدراسات الخلوية الأولية أن البروتينات BBS قد تلعب دورا في وظيفة المنطقة محيط بالمريكز، لأن اثنين من البروتينات BBS، BBS4 وBBS8 عرضت، في توطين تحديدا إلى الهيئات القاعدية وcentrosomes من أنواع مختلفة من الخلايا (20). علاوة على ذلك، C. عرضت orthologs ايليجانس من BBS1، BBS2، BBS7 وBBS8 أيضا أن أعرب تحديدا في نهايات الجذعية مهدبة الخلايا العصبية الحسية، مما يزيد من احتمال أن الخلل في الجسم القاعدية في الخلايا المهدبة قد تكمن وراء عدة جوانب من النمط الظاهري (20). وبالنظر إلى أن لا توجد فروق ملحوظ بين النمط الظاهري التي تسببها طفرات في كل من الجينات BBS معروف، فإنه ليس من المستغرب أن البروتينات BBS تتقارب إلى مجموعة مشتركة من الوظائف الخلوية ويبدو أن تشارك في أعربت (على الأقل في أقل الكائنات الحية) في أنواع الخلايا نفسها. ومع ذلك، ما هو من أكبر أهمية الوراثية، هو أن كل من BBS4 وBBS8 يتفاعل مع نفس محيط بالمريكز البروتين، PCM1 (20)، على الرغم من أن الجزيئية للتفاعل لا يزال يتعين حلها. في الوقت الحاضر، لا يوجد أي دليل على التفاعل المباشر بين BBS4 وBBS8، أو في الحقيقة أي زوج البروتين BBS (بيانات غير منشورة لدينا)، مما يدل على أن نموذج معقد المباشر أقرب إلى ROM1-RDS، JAG1-NOTCH2 وغيرهم من غير المرجح. بدلا من ذلك، البروتينات BBS قد يشارك في مجمع multiprotein أن يصبح خطر تدريجيا من خلال وجود طفرات إضافية. بدلا من ذلك (أو إضافة) لأنها قد تتصرف بشكل متتالي أن تؤثر على عملية الخلوية نفسها، مثل النبات من المواد لمنطقة محيط بالمريكز أو الخيط المحوري للهدب.

الاستنتاجات

توضيح الآليات الوراثية والخلوية التي تكمن وراء الموقع الثاني المظهرية تعديل مهم لفهم المرض قليل الجينات، وأيضا قالب النمذجة مفيد لصفات معقدة، حيث كل من عدد الأليلات المشاركة ومساهمة العوامل العشوائية تشكل عقبات كبيرة. BBS بالتالي هو نظام الدراسة مفيدة للفك رموز هذه التفاعلات على حد سواء على المستوي الجيني وعلى المستوى الخلوي. منذ التقرير الأصلي من الميراث triallelic، تم الإبلاغ عن العديد من الظواهر غير ذات صلة في إظهار أوضاع مماثلة من انتقال الأمراض، بما في ذلك المتلازمة الكلوية (46)، ونقص اختزال الكورتيزون (47)، الاصطباغ الدموى (48) وhypercholanemia الأسرية (49)، مشيرا إلى أن هذا ولا تقتصر ظاهرة الوراثية لBBS. وتشير الناشئة نماذج حيوانية أن التفاعل الجيني لوحظت في بعض المرضى قد BBS تلخيصها (50، 51). هذه، جنبا إلى جنب مع الدراسات البيوكيميائية من النوع البري والبروتينات BBS متحولة سوف تكون أدوات هامة لتشريح الأساس الخلوي للtriallelism وتطبيق الدروس المستفادة نحو أحادية المنشأ والصفات المعقدة على حد سواء.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #4  
قديم 11-23-2015, 08:07 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بارديه-بيدل متلازمة: دراسة في الكلى والقلب والأوعية الدموية الظواهر في الفوج الفرنسي

 

الخلفية والأهداف بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو نادر وراثي جسمي مقهور ciliopathy مع طائفة واسعة من المظاهر السريرية بما في ذلك السمنة، التهاب الشبكية الصباغي، polydactyly، والتخلف العقلي، قصور الغدد التناسلية، والشذوذ الكلوي. ويجري حاليا التحقيق في الصورة الجينية الجزيئية من BBS بعد تحديد مؤخرا من 14 جينات BBS تشارك في أمراض مرتبطة أهداب الابتدائي. وتهدف هذه الدراسة إلى تحديد خصائص العروض الكلى والقلب والأوعية الدموية، وتحليل العلاقات الممكنة بين الأنماط الجينية والظواهر السريرية.

تصميم وإعداد والمشاركين وقياسات أجريت هذه الدراسة السريرية في لفيف وطنية من 33 مريضا BBS، 22 رجلا و 11 امرأة، وجميع الذين تتراوح أعمارهم> 16 سنة (متوسط ​​العمر 26.3 سنة).

النتائج تشوهات الكلى، بما في ذلك ضعف وظائف الكلى وعلامات اعتلال الكلية الخلالي المزمن الطبيعة خلل التنسج، تم توثيقها في 82٪ من المرضى. وأظهرت التقييمات القلب والأوعية الدموية أن هذه المجموعة من المرضى الصغار كانت عوامل الخطر القلبية الوعائية كبيرة. تم العثور على ارتفاع ضغط الدم في> 30٪ من المرضى والدهون في> 60٪، وكان ما يقرب من 50٪ حالات الشذوذ الأيضي الأخرى. كان مرض السكري الصريح الحالي في 6٪ فقط. وفيما يتعلق الوراثي، النمط الظاهري الارتباط، وكان المرضى الذين يعانون من طفرة في BBS6، BBS10، أو الجينات BBS12 (10 من 33 مريضا) أمراض الكلى أكثر شدة.

استنتاجات نتائج دراستنا تؤكد تكرار وقوع تأثر الكلى في المرضى الذين يعانون من BBS، تؤكد ارتفاع مخاطر أمراض القلب والشرايين في هؤلاء المرضى، وتوفر معلومات جديدة عن احتمال وجود علاقة الوراثي، النمط الظاهري.

مقدمة

بارديه-بيدل متلازمة (BBS، OMIM 209900) هي نادرة، وراثية، ciliopathy تتميز السمنة الأحداث، قصور الغدد التناسلية، polydactyly، ضمور شبكية العين، والتخلف العقلي، والشذوذ الكلوي. ارتفاع ضغط الدم و / أو مرض السكري عادة يحدث (1، 2).
حتى الآن، وقد تم تحديد 14 جينات BBS المسببة لل(BBS1 من خلال BBS14، لاستعراض رؤية BBS، OMIM 209900). سبعة من البروتينات BBS الأكثر الحفظ (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9) تشكيل مجمع مستقرة تسمى BBSome (3)، باستثناء ثلاثة بروتينات أخرى، BBS6، BBS10، وBBS12، التي هي vertebrate- البروتينات مثل chaperonin محددة (4). ويعتقد أن البروتينات BBS أن تشارك في نشوء حيوي والحفاظ على أهداب / مجمع الجسيم المركزي الابتدائي، وتكون مرتبطة مع مسارات الإشارات الأساسية (5). A طفرة جينية BBS يؤدي إلى اضطراب في عدة طرق يشير، على وجه الخصوص، مسار WNT noncanonical تشارك في الخلية القطبية مستو التي تلعب دورا في التسبب في مرض الكلى المتعدد الكيسات، التي وصفت (6، 7). وقد لوحظت معظم الصفات المظهرية لBBS في النماذج الحيوانية (8 - 11). النتائج الأخيرة في نموذج الفأر من Alström المكتسب (OMIM 203800) -also على ciliopathy ترتبط ارتباطا وثيقا BBS، وتتميز تشوهات الكلى، والسمنة، ومقاومة الأنسولين، توحي تشوهات داخل الجسيم المركزي كونها سبب هذا الاضطراب (12).
BBS هو من مصلحة لأمراض الكلى لعدة أسباب. تحديد الجينات المسؤولة عن BBS والآليات الجزيئية ذات الصلة يمكن أن تزيد فهمنا ليس فقط لتطور أمراض الكلى في BBS والأمراض المتداخلة والأمراض وciliopathies تكيس الكلى، ولكن أيضا من الصفات المظهرية أكثر شيوعا بما في ذلك السمنة وارتفاع ضغط الدم، و داء السكري. من جميع الميزات من BBS، وقد تم دراسة عيوب الكلى أكثر على نطاق واسع، وقد تم الإبلاغ عن التباين في التعبير السريري وشدة المرض (13، 14). في المقابل، فإن الملف الشخصي القلب والأوعية الدموية للمرضى BBS وعوامل الخطر القلبية الوعائية لم يتم تتميز أيضا (15، 16). وأخيرا، لا يزال هناك جدل حول علاقة الوراثي، النمط الظاهري في هذا المرض عديد المظاهر مع الميراث قليل الجينات ممكن (17، 18).
وكان الهدف من هذه الدراسة هو تحليل خصائص الكلى والقلب والأوعية الدموية من 33 مريضا تتأثر BBS واستكشاف العلاقات المتبادلة المحتملة بين النمط الجيني والنمط الظاهري.

المواد والأساليب

السكان الدراسة

تكونت مجموعة الدراسة من 33 شابا الفرنسي (الذين تتراوح أعمارهم> 16 سنة) بمتوسط ​​عمر (± SD) 26.3 (7.7) سنة ونسبة الذكور إلى الإناث من 2: 1. وتم متابعة المرضى في المركز (ق) في ستراسبورغ (ن = 19) ومرسيليا (ن = 8)، مونبلييه (ن = 4)، وليل (ن = 2). تم تشخيص BBS باستخدام معايير Beales (1) استنادا إلى جمعية من الأعراض الأساسية للمرض بما في ذلك التهاب الشبكية الصباغي، polydactyly، والسمنة، والتخلف العقلي، قصور الغدد التناسلية، والشذوذ الكلوي. تم قبول تشخيص BBS إذا كانت ثلاثة من الأعراض المذكورة أعلاه موجودة، أو اثنين من الأعراض الثلاثة الأولى المذكورة، أو إذا كان اثنان أعراض الحالية وتم الكشف عن طفرة جينية في واحدة من الجينات BBS (الجدول 1). وتضمنت معايير الاستبعاد العمر <16 سنة، والحمل، ومرض قبل الشفاء.

الجدول 1.
توزيع BBS معايير التشخيص لإدراجها

تم الحصول على البيانات من المرضى الذين يعانون من BBS يتبع ما بين مارس 2003 ومارس 2007. وتمت الموافقة على الدراسة من قبل لجان أخلاق المحلية وجميع المرضى أعطى موافقة مستنيرة.

تقييم

تقييم الكلى.

وشملت المعلمات البيولوجية مستويات بلازما الدم من الكرياتينين والبوتاسيوم والبيكربونات، تحليل البول على مدار 24 ساعة من الكرياتينين، والبروتين، ومستويات الزلال. وقد تم تعريف غير طبيعية البول التركيز القدرة عن عدم وجود زيادة في الأسمولية ل> 750 الميلي أسمول / كغ H 2 O بعد فترة 12 ساعة من تقييد الماء. أجريت الموجات فوق الصوتية الكلوي وبطني حوضي التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) في معظم المرضى. وقدرت GFR باستخدام القياس المباشر البولية تصفية الكرياتينين (UCcr) أو مع أربعة متغيرة تعديل النظام الغذائي في مرض الكلى (MDRD) صيغة (GFR يقدر [اريسا]) (19). وجاء انطلاق من مرض الكلى المزمن (CKD) توصيات KDIGO 2005 بما في ذلك علامات الفشل الكلوي، بروتينية، بيلة دموية، وتشوهات في اختبارات التصوير (20). تم تعريف البول الزلالي في البول غير طبيعي من قبل الزلال البولي إلى نسبة الكرياتينين (UACR)> 30 ملغ / غ (20).

تشوهات القلب والأوعية الدموية والتقييمات عوامل الخطر.

تم توثيق التواريخ الشخصية والعائلية من أعراض القلب، وكذلك علاج القلب والأوعية الدموية الحالية. وشملت التحقيقات السريرية الجلوكوز في الدم أثناء الصيام، الكوليسترول الكلي، HDL، LDL، الفيبرينوجين، وleptinemia. وقد تم تعريف الحساسية المفرطة تجاه الجلوكوز من مستوى الجلوكوز في بلازما الدم من> 140 ملغ / دل ولكن <200 ملغ / ديسيلتر في الساعات 2 بعد تحميل الجلوكوز عن طريق الفم وغير طبيعية من السكر في الدم أثناء الصيام قبل بلازما الجلوكوز اثناء الصوم (FPG)> 110 ملغ / ديسيلتر ( منظمة الصحة العالمية 1999). تم إجراء قياس BP الإسعافية خلال فترة 24 ساعة. أجريت الكهربائي وتخطيط صدى القلب عبر الصدر لقياس أبعاد البطين في وضع TM مع تقدير البطين الأيسر تطبيع الشامل للارتفاع 2.7 النحو الموصى به في السمنة. واستندت تفسير هذه الأبعاد وحسابات الكتلة على المعايير المتفق عليها من قبل الجمعيات الأمريكية والأوروبية لضربات القلب (21). معايير NCEP-ATP III تعديل لأوروبا من قبل EGIR (22 استخدمت) لتعريف محيط الخصر غير طبيعي، ونسبة الخصر إلى محيط الورك، وتشخيص متلازمة التمثيل الغذائي.

التحليلات الجزيئية.

أجريت التحاليل الوراثية في مختبر علم الوراثة الطبية، كلية الطب، في ستراسبورغ (HD) ويتكون من الكشف عن الطفرات داخل BBS1 من خلال BBS12 الجينات، كما هو موضح سابقا (23).

تحاليل احصائية

يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SD أو النسبة المئوية تحديد عدد من المرضى الذين يعانون علامة أو أعراض تلك درس للمتغير تحليلها. لدراسة الاختلافات بين المجموعات مع أو بدون أمراض الكلى، تم استخدام اختبار دقيق فيشر للمعطيات الفئوية. تم قبول دلالة إحصائية لP <0.05.

النتائج

الظواهر الكلى (الجدول 2)


الجدول 2.
خصائص شذوذ وظيفي كلوي

باستخدام الصيغة MDRD، حددنا أن 36٪ (12 من 33) من المرضى كان لاريسا <90 مل / دقيقة لكل 1.73 م 2، منهم 9٪ (3 من 33) الفشل الكلوي المعتدل (EGFR بين 30 و 60 مل / دقيقة لكل 1.73 م 2). القياس المباشر للUCcr في 31 مريضا كشفت أن 48٪ (15 من 31) منهم كان UCcr أقل من 90 مل / دقيقة و 19٪ (6 من 31) وكان الفشل الكلوي المعتدل (UCcr <60 مل / دقيقة).
وكانت تشوهات مما يدل على الآفات tubulointerstitial متكررة مع تشوهات في تركيز البول في 63٪ من المرضى. تم العثور بروتينية في 33٪، وكان UACR غير طبيعي (> 30 ملغ / غ) في 31٪ من المرضى. من تسعة مرضى UACR مرتفعة، وأربعة كانوا ارتفاع ضغط الدم وكان واحدا كل من ارتفاع ضغط الدم والسكري. تم العثور على بيلة دموية مجهرية في اثنين فقط من المرضى.
تم إجراء الموجات فوق الصوتية الكلوي في جميع المرضى وأجريت MRI في 24 من 33 مريضا. تسعة مرضى لا يمكن أن يخضع MRI بسبب السمنة. وأكد تنمية الكلى غير طبيعية في ما يقرب من 50٪ من المرضى (الجدول 2). ولوحظ عدم التماثل أو ضمور الكلى والجانب غير متمايزة في إحدى أو كلتا الكليتين في 12٪ من المرضى. وكان متوسط ​​حجم الكلى (± SD) في المجموعة لكن العادي في 115 (12) × 47 (9) ملم. وكانت الخراجات القشرية عموما، وأربعة مرضى كانوا الانفرادي. لم أساليب التصوير لا تكشف عن وجود خلل التنسج الكيسي corticomedullary أو أكثر أشكال حادة من النمو الشاذ، مثل الكلى حدوة حصان أو لاتكون. أخيرا، 36٪ من المرضى يعانون من علامات تشير إلى CKD المرحلة 2 (27٪) لمرحلة CKD 3 (9٪) وتشوهات الكلى الشاملة، بما في ذلك على الأقل الكلوي وظيفة ضعف و / أو علامات الآفات tubulointerstitial الطبيعة خلل التنسج و / أو ضعف القدرة تركيز البول تم توثيقها في 82٪.

الظواهر القلب والأوعية الدموية (الجدول 3)


الجدول 3.
خصائص النمط الظاهري القلب

كان هناك انتشار قوي من ارتفاع ضغط الدم النظامية (36٪) في هذه الفئة من السكان الشباب. وكان ثلاثة مرضى أظهر التاريخ السابق لعلاج الخافضة للضغط وقياس BP الإسعافية القيم المتوسطة> 130/80 مم زئبق على مدى 24 ساعة في سبعة مرضى. من عشرة مرضى ارتفاع ضغط الدم، ثمانية منهم يعانون من السمنة المفرطة وأظهرت أربع علامات CKD. كان جميع المرضى قيمت الكهربائي العادي.
في أولئك الذين خضعوا لتخطيط صدى القلب عبر الصدر، لم يلاحظ أي valvulopathy أو تشوهات هيكلية. وكان اثنين من المرضى لديهم تاريخ معروف من الاتصالات البطين. وقد تجلى البطين الأيسر تمدد في مريض واحد فقط وعثر تضخم البطين الأيسر (تضخم البطين الأيسر) في 5 من 29 من المرضى. من هؤلاء المرضى خمسة، ثلاثة منها ارتفاع ضغط الدم. تم العثور على جزء قذف غير طبيعي قليلا (54٪) في اثنين فقط من المرضى.

عوامل الخطر القلبية الوعائية (الجدول 4)


جدول (4).
القلب والأوعية الدموية توزيع عوامل الخطر

بالإضافة إلى ارتفاع معدل انتشار ارتفاع ضغط الدم، تم العثور دسليبيدميا في 53٪ من المرضى الذين يعانون من زيادة في الكولسترول LDL> 160 ملغ / ديسيلتر في 9٪ من المرضى وانخفاض في الكوليسترول الحميد <40 ملغ / ديسيلتر في 47٪ من المرضى. وكانت تفاصيل عن تاريخ التدخين غير متوفرة. أي من المرضى كان له التاريخ الماضي أو تاريخ عائلي من مرض القلب والأوعية الدموية.
قدمت إحدى عشرة من 33 مريضا (33٪) مع ايض الجلوكوز غير طبيعي. وعولج اثنان لنوع 2 داء السكري في حين FPG و 2 ساعة الجلوكوز في البلازما (2-ح PG) مرض السكري استبعاد في الآخرين. وقد تجلى الحساسية المفرطة تجاه الجلوكوز في ستة مرضى، وكان ثلاثة مرضى آخرين لFPG غير طبيعي. تم العثور على زيادة شحوم الدم (> 150 ملغ / دل) في 22٪ من المرضى. واقترح A الخلايا البطانية بفضل وجود hyperfibrigenemia (> 4 ز / L) في 27٪ من المرضى والبول الزلالي الدقيق في 31٪ من المرضى. السمنة، وهو ما يعد مؤشرا أساسيا في هذه المتلازمة، كان موجودا في 70٪ من المرضى (مؤشر كتلة الجسم، و> 30 كجم / م 2). وكان الروبوت هذه السمنة بشكل رئيسي في توزيع مثل السمنة في منطقة البطن، كما يقاس محيط الخصر، ورقي في 79٪ (22 من 28) من المرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة. كانت نسبة الخصر إلى محيط الورك غير طبيعية في 50٪ من المرضى (14 من 28). وأشار إلى hyperleptinemia المرتبطة بها (الدم leptinemia> 11 ميكروغرام / لتر) في 90٪ من المرضى. شذوذ المذكورة أعلاه تسمح استنتاج مفاده أن وجود متلازمة التمثيل الغذائي في 45٪ من المرضى (13 من 29) التي سيتم التوصل إليها (22).

راثى-النمط الظاهري إرتباطات

تم العثور على طفرة BBS1 الجيني في 37٪ من المرضى (12 من 33)، طفرة BBS10 في 15٪ (5 من 33)، وطفرة BBS12 في 12٪ (4 من 33) (جدول رقم 5). في 9٪ من المرضى (3 من 33)، لم يتم بعد تحديد تحور الجين ولكن يعتقد أن تتصل الجينات غير معروف حتى الآن. في هذه المجموعة، لم يتم العثور على طفرة في الجين BBS3، BBS7، أو BBS8. كان هناك حالة واحدة فقط من triallelism (BBS12 تحور متماثل، BBS3 تحور متخالف).

الجدول 5.
توزيع المورثات BBS من 33 مريضا المدرجة في هذه السلسلة حالة

الأرقام الصغيرة في كل مجموعة راثى لا تسمح استنتاجات قاطعة بشأن معينة الارتباط الوراثي، النمط الظاهري. ومن المثير للاهتمام، من بين المرضى الذين يعانون من طفرة BBS1، كانت 6٪ فقط (2 من 12) يعانون من السمنة المفرطة، وكان CKD. ومع ذلك، كان كل المرضى الذين يعانون من طفرة BBS12 (4 من 4) CKD ومعظمهم كانوا يعانون من السمنة المفرطة (3 من 4) وزيارتها حالات الشذوذ الأيضي (3 من 4). وهناك اتجاه مماثل يبدو أن تكون موجودة في المرضى الذين يعانون من طفرة BBS10. وكان 4 من 5 مرضى يعانون من السمنة المفرطة و1 من 5 لديه متلازمة التمثيل الغذائي. وهكذا، وبالنظر إلى الجينات الثلاثة الأكثر شيوعا، يبدو أن النمط الظاهري BBS1 كان أكثر موهنة من BBS10 وBBS12 الظواهر.
وهناك طريقة أخرى ذات الصلة لاستكشاف العلاقات المتبادلة الوراثي، النمط الظاهري في التحقيق الاختلافات المظهرية بين المرضى الذين يعانون من الطفرات على BBSome، وهذا هو، وBBS1 المحفوظة جيدا، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9 الجينات، والمرضى الذين يعانون من BBS الطفرات في الجينات BBS الأخرى (BBS6، BBS10، وBBS12) وجدت فقط في الفقاريات (الجدول 6). ويبدو أنه لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية واضحة في النمط الظاهري مخاطر القلب والأوعية الدموية بين هاتين الفئتين من الجينات. على العكس من ذلك، المرضى الذين يعانون من الطفرات في الجينات الفقاريات محددة قدمت BBS6، BBS10، وBBS12 مع النمط الظاهري الكلوي أسوأ بكثير لأن 70٪ (7 من 10) كان تشخيص CKD مقارنة مع 15٪ (3 من 20) من المرضى الذين يعانون من BBSome الجينات طفرات (P <0.005).

الجدول 6.
العلاقة الوراثي، النمط الظاهري الكلى والقلب والأوعية الدموية. الجينات BBSome مقارنة مع جينات أخرى

نقاش

هدفت هذه الدراسة إلى وصف الظواهر الكلى في عدد السكان من 33 شابا (متوسط ​​العمر 26.3 عاما) مع BBS، وهو أول من وصف الظواهر القلب والأوعية الدموية، وتقييم عوامل الخطر القلبية الوعائية لدى هؤلاء المرضى. دراستنا هي أيضا واحدة من عدد قليل من الدراسات التي قامت بالتحقيق العلاقات الممكنة بين النمط الجيني والنمط الظاهري في المرضى الذين يعانون BBS.
واحدة من النتائج الهامة من دراستنا هو تواتر حدوث المرض الكلوي، مهما كانت طبيعته، من 82٪، مما يؤكد أن إصابة الكلى هي واحدة من العلامات الأساسية للمتلازمة. وعلاوة على ذلك، ما يقرب من ثلث لدينا فوج من الشباب قدم مع وجود علامات متوافقة مع مراحل CKD 2 و 3. ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أنه في مجموعة من المرضى من كبار السن، أوديا وآخرون. وأشار إلى أن 100٪ من مرضاهم مع BBS كان تشوهات هيكلية الكلى وكان 25٪ انخفاض قيمة GFR في سن 48 عاما (24). في نفس الطريق، وذكرت ويب آخرون مؤخرا سلسلة نيوفاوندلاند من BBS مع انتشار مرحلة CKD 3 (EGFR <60 مل / دقيقة لكل 1.73 م 2) إلى 47٪ (20 من 43) في بداية العمر الوسيط للCKD من 58 سنة (25). المرحلة 4 CKD (EGFR <30 مل / دقيقة لكل 1.73 م 2) المعنية 20٪ من المرضى و 14٪ تقدما لالداء الكلوي بمراحله الأخيرة. وأكدت أطروحات الدراسات ارتفاع معدل انتشار CKD في المرضى الذين يعانون BBS بعد العقد الرابع وتعزيز ملاحظتنا أن أعراض الكلى قد تكون موجودة والكشف في المرضى الصغار الذين سوف تتطور الفشل الكلوي مع التقدم البطيء لالداء الكلوي بمراحله الأخيرة في وقت مبكر.
ترددات لوحظ من توسع الكأس وتفصص الجنين مستمر في سلسلة لدينا هي تدل على النضج الكلوي غير طبيعي كونه ميزة بارزة مرضية. تاريخيا، كانت حتى أكثر في كثير من الأحيان الكشف عن هذه التشوهات باستخدام تصوير الجهاز البولي عن طريق الوريد، والتي هي أكثر حساسية لتقييم ملامح كلاسيكية مثل diverticuli كأسي والتواصل الخراجات كأسي. في الواقع، ذكرت ترددات شذوذ الكيسي في المرضى الذين يعانون BBS تختلف اختلافا كبيرا، من 10٪ إلى 72٪ (14، 24). ويمكن أيضا أن تعزى هذه الاختلافات إلى عدم التجانس السريري في كل من العرض المرض والطبيعي حدوث الخراجات. في BBS، الخراجات توزيع يذكرنا nephronophthisies بدلا من مرض الكلى المتعدد الكيسات مع microcysts الناشئة عند تقاطع corticomedullary، أو ectasias من القنوات جمع والتي لا يمكن كشفها بسهولة عن طريق طرائق التصوير (14، 24).
والفشل الكلوي في BBS يشير نحو عملية tubulointerstitial مع بروتينية نادرا ما تتجاوز 1 غ لكل 24 ساعة وتشوهات في تركيز البول، مما يشير إلى خلل في النظام القناة جمع. وعدد قليل من الدراسات المرضية التي نشرت في الأدب يتفق مع هذه النتائج. ومع ذلك، كما تم الإبلاغ عن الآفات الكبيبي تتميز سماكة الغشاء القاعدي نشاهد في المجهر الإلكتروني (26، 27). وجود ACR غير طبيعية في 31٪ من المرضى تشير مرض الكبيبي المرتبطة بها، التي يمكن أيضا أن يكون من عواقب ارتفاع ضغط الدم على المدى الطويل أو مرض السكري. وفي هذا السياق، يمكن النظر أيضا بروتينية باعتباره علامة إضافية من مخاطر القلب والأوعية الدموية العالمي ارتفاع في هؤلاء المرضى.
المرضى الذين يعانون من آفات tubulointerstitial السائدة عموما لديهم بمعدل أبطأ من التقدم إلى الداء الكلوي بمراحله الأخيرة. ومع ذلك، في المرضى الذين يعانون BBS، يمكن تسارع هذا المعدل البطيء الكلاسيكي من قبل وقوع ما يصاحب ذلك من ارتفاع ضغط الدم أو مرض السكري والطولي متابعة فوج لدينا يمكن أن توفر، في المستقبل، وبيانات مثيرة للاهتمام على معدل معين من التقدم في المرضى الذين يعانون BBS مع مطلع تشخيص CKD.
هي البيانات المنشورة تقتصر على مخاطر القلب والأوعية الدموية للمرضى BBS المتاحة (16). على الرغم من صغر سنهم، ما يقرب من نصف مرضانا الصغار قدمت بالفعل معايير وضعها في المجموعة عالية الخطورة لتطوير أحداث القلب والأوعية الدموية. في سلسلة لدينا تظهر عوامل الخطر القلبية الوعائية الكلاسيكية لتكون أكثر تمثيلا بالمقارنة مع تلك الموجودة في فرنسا عموم السكان (28). تم العثور دسليبيدميا يرتبط مع انخفاض الكولسترول HDL في ما يقرب من نصف المرضى وأظهر ثلث المرضى بالفعل علامات ارتفاع ضغط الدم منها انتشار ينبغي أن تزيد أيضا مع تقدم العمر. انتشار مرض السكري أو الحساسية المفرطة تجاه الجلوكوز غير قابلة للمقارنة مع البيانات المنشورة (بين 6٪ و 48٪)، وربما يكون أيضا عرضة للزيادة مع تقدم العمر.
هذه الدراسة، وتقييم جوانب القلب والأوعية الدموية غالبا ما يتم تجاهلها من هذه المتلازمة، هي واحدة من أكبر الدراسات المنشورة. وقد اقترحت القلب الخلقية أو تضخم البطين الأيسر لتكون ذات قيمة محدودة في إرساء تشخيص BBS. Elbedour آخرون بعمل ضربات القلب منتظمة في 22 المرضى الذين يعانون من BBS وجدت سبعة مرضى (32٪) مع تشوهات قلبية (ثلاثة مع التشوهات الخلقية واثنين مع تضخم البطين الأيسر) (15). في هذه السلسلة، وكان اثنين فقط من المرضى (6٪) والتاريخ الماضي من الاتصالات البطين وعثر LVH في 17٪، معظمهم من ارتفاع ضغط الدم، مما يشير إلى أن تضخم البطين الأيسر يمكن أن تنتج عن الضرر نهاية الجهاز. المثير للاهتمام يعطى هذا التردد المنخفض نسبيا للتضخم البطين الأيسر تأثير مضافة المتوقع السمنة على وظيفة القلب.
ويعوق استكشاف الارتباطات المحتملة بين الأنماط الجينية والظواهر في فوج من المرضى BBS من عدم التجانس الوراثي للمرض. مور وآخرون لا يمكن أن تجد أي ارتباط بين النمط الجيني وتواتر حدوث الصفات المظهرية مثل العمى، والسمنة، وارتفاع ضغط الدم، أو مرض السكري (18). هم افترض أنه بسبب هذا عدم وجود علاقة، ويشارك جميع الجينات BBS في عملية الخلوية متطابقة. ومما يعزز هذه الفرضية من قبل عدة ملاحظات: (1) colocalization من البروتينات المختلفة BBS على مستوى أهداب الابتدائي والجسيم المركزي. (2) وصف الأخير ل-مجمع الأساسية للبروتينات BBS، وBBSome (3)؛ (3) التشابه من الظواهر التي لوحظت في نماذج الماوس BBS، أيا كان الجين تتم إزالة (5). ومع ذلك، في هذه السلسلة، الاختلافات المظهرية لاحظنا يبدو أن تحدث وفقا للتحولات التي تنطوي إما على الجينات امتلاك إلى BBSome أو الجينات الأخرى من مثل chaperonin-مجموعة البروتينات الفقاريات محددة (BBS6، BBS10، وBBS12). يبدو أن المرضى الذين يعانون من الطفرات في الجينات الأخيرة أن يكون النمط الظاهري الكلوي أكثر حدة مقارنة مع المرضى الذين يعانون من الطفرات في BBSome. ويؤيد هذه الفرضية من خلال دراسة حديثة فيها إزالة هذه الجينات في الصدارة الزرد إلى النمط الظاهري أكثر شدة بطريقة تعاونية (4). وتوضح النتائج المعروضة على أهمية إجراء المزيد من الدراسات لفهم أفضل BBS على المستوى الجزيئي، وكذلك علم الأوبئة الوراثية لها.
ومن الواضح أن هذه الدراسة لديها بعض القيود. كما ذكر سابقا، أجرينا دراسة مستعرضة في عدد السكان من المرضى الصغار مع BBS. وكان جميع المرضى في مرحلة مبكرة من المرض، وهناك حاجة إلى المسح الطولي للتأكيد على أهمية النذير عوامل خطر عالية القلب والأوعية الدموية والكلى. BBS1 من خلال الجينات BBS12 تم فحص شامل للطفرات ولكن يجري حاليا التحقيق BBS13 وBBS14.
وفي الختام، فإن هذه الدراسة تسلط الضوء على ارتفاع معدل انتشار المرض الكلوي في BBS وتؤكد على ضرورة التشخيص المبكر والعلاج. تحتاج عوامل الخطر القلبية الوعائية للنظر، وإذا كان موجودا، وتعامل في وقت مبكر لمنع المضاعفات اللاحقة. قد تكشف الدراسات التنميط الجيني في المستقبل واسعة الارتباط الوراثي، النمط الظاهري، مما يسمح التشخيص المبكر وتحسين فهم الفيزيولوجيا المرضية من تشوهات القلب والأوعية الدموية المرتبطة بها. سوف دراسة طولية من المرضى المقدمة في هذه الوثيقة توفر بيانات قيمة على المراضة والوفيات، والتطور الطبيعي للمشاركة أمراض القلب والكلى. على الرغم من BBS هو اضطراب نادر، فإنه من مصلحة كبرى لأمراض الكلى كتعيين الوراثي والجزيئي سيسهم في الفهم العام للciliopathies الكلى الموروثة، ومشاكل القلب والأوعية الدموية في الفشل الكلوي المزمن. وبالتالي، فإن دور أمراض الكلى هو محوري في إدارة هذه المتلازمة المتعددة لليؤثر على القلب والأوعية الدموية ونظم الكلى.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #5  
قديم 11-23-2015, 08:11 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي فقدان بارديه-بيدل البروتينات يسبب متلازمة خلل في تعصيب الحسي المحيطي وظيفة

 

http://www.pnas.org/content/104/44/17524.full

ستقبال وتفسير المحفزات البيئية هو أمر حاسم لبقاء جميع الكائنات الحية. هنا، وتبين لنا أن الاجتثاث من BBS1 وBBS4، اثنين من الجينات الطافرة في متلازمة بارديه-بيدل وأن البروتينات ترميز أن توطين بالقرب من centrioles من الخلايا العصبية الحسية، يؤدي إلى تغيرات في تعصيب الحسي SC والاتجار في TRPV1 قناة thermosensory وميكانيكية حسية قناة STOML3، مع ما يصاحب ذلك من العيوب في thermosensation الطرفية وmechanosensation. ولخص النمط الظاهري thermosensory في ايليجانس انواع معينة، لأن ردود thermosensory نقص المسوخ BBS اضح في كل من درجات الحرارة الفسيولوجية ومسبب للألم وخلل الاتجار OSM-9، وهو بروتين قناة الحسي polymodal وhomolog الوظيفي للTRPV1 أو TRPV4. وتشير النتائج التي توصلنا إليها وغير معترف بها حتى الآن، ولكن من الضروري، دور الثدييات بروتينات الجسم القاعدية في الحصول على المحفزات mechano- وthermosensory وتسليط الضوء على الميزات يحتمل السريرية للciliopathies في البشر.

كشفت دراسة الحواس في كل من الفقاريات واللافقاريات دور للأهداب في chemosensation، mechanosensation، وphotosensation. في ذبابة الفاكهة، chemosensation وmechanosensation تعتمد بشكل خاص على الخلايا العصبية التي مهدبة (1). وبالمثل، راسخة دور للأهداب في chemosensation في ايليجانس انواع معينة، حيث المسوخ مع وظيفة للخطر أو هيكل من العيوب عرض أهداب في الاستشعار عن عطر أو الاختلافات في الأسمولية (+2 - 4). في الثدييات، مستقبلات الرائحة توطين لأهداب الشم (5)، وأجهزة phototransduction الخلايا قضيب ومخروط في الفقاريات يموضع إلى الجزء الخارجي، وهدب المعدلة (6). وأخيرا، فإن الهدب المحرك شرط أساسي للتنمية القوقعة، وبالتالي السمع بسبب دورها في stereociliary التشكل حزمة (7).
نحن وغيرنا قد أظهرت أن الخسارة من وظيفة الطفرات في الجينات الكامنة وراء عديد المظاهر بارديه-بيدل النمط الظاهري (8) تسبب العجز الحسية التي تشمل فقدان الرؤية، الشم، السمع ومعيب (5، 7، 9، 10). جميع البروتينات BBS تتسم حتى الآن توطين بالقرب أو داخل الهيئات القاعدية وأهداب في كل خلايا الثدييات (11 - 13) وفي C. ايليجانس الخلايا العصبية الحسية (+14 - 16).
هنا، وتبين لنا أن الثدييات الخلايا العصبية الحسية المحيطية ومهدبة وأن المسوخ الماوس مع المستهدفة الخسارة من وظيفة الطفرات في أي Bbs1 أو Bbs4 المعرض thermosensory الظواهر التي تتميز زيادات كبيرة في الإختفاء استجابة سلوكية. من غير المرجح أن يكون سبب العليا القشرية أو اختلال وظيفي محرك هذه العيوب ولكن ترافقها تغيرات في تعصيب الحسي الجلدي وخلل توزيع الجزيئات المستجيب في سوما الخلايا العصبية الحسية. هذه الظواهر ليست فريدة من نوعها للثدييات، لأن BBS الخيطية المسوخ هي أيضا thermosensory معيب. وأخيرا، والبشر مع BBS أيضا البيان بعض أعراض مشابهة لتلك التي لوحظت في الفئران، مثل انخفاض درجة الحرارة والاهتزاز الإحساس. وتشير دراساتنا دورا حاسما من الجسم الهدبي والقاعدية البروتينات عن وظيفة الثدييات الخلايا العصبية الحسية الطرفية وتنبيغ كفاءة من المحفزات extraorganismal.
النتائج

الظهرية جذر العقد هي مهدبة.

في الثدييات، وقد لوحظ أهداب الابتدائي في معظم الخلايا تالية للتفتل. ومع ذلك، فإنها لم يتم الإبلاغ عنها في الخلايا العصبية الحسية الطرفية. وبالنظر إلى أن أهداب الابتدائية أداء المهام الحيوية في الخلايا العصبية الحسية اللافقارية، ونحن التحقيق ما إذا كانت هذه الخلايا يمكن أيضا المهدبة في الثدييات. تلطيخ العقد الجذرية الظهرية (DRG) المقاطع مع الأجسام المضادة ضد IFT88 البروتين axonemal (بولاريس) (17 اقترح) وجود أهداب (لا تظهر البيانات)، الذي كان مدعوما من جراء انتقال المجهر الإلكتروني (الشكل 1 A، F، وG). لتحقيق هذا الاحتمال أكثر شمولا، وخصوصا بسبب أقسام DRG تحتوي على السكان غير متجانسة من أنواع الخلايا، ونحن مثقف الخلايا العصبية DRG من الفئران البالغة WT وخلايا ملطخة أجسام مضادة ضد سلسلة من البروتينات axonemal المعروفة ومكافحة NeuN لتمييز الخلايا العصبية من أنواع الخلايا الأخرى . لاحظنا تلطيخ محددة على طول أهداب الخلايا العصبية لIFT88 (الشكل 1 B)، وكذلك IFT57 (لا تظهر البيانات). لنؤكد أيضا أن هذه ليست قطعة أثرية عبر التفاعل، ونحن transfected الثقافات DRG مع ترميز البلازميد و(V5) البروتين الموسومة حاتمة axonemal، IFT81 (18). Costaining مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للV5، وكذلك المرتبطة أنيبيب بروتين 2 (MAP2؛ الشكل 1 C)، علامة الجذعية العصبية، أيد كذلك وجود هدب على سوما الخلايا العصبية DRG.

تين. 1.
الخلايا العصبية DRG لها أهداب الابتدائي. (A، F، G و) الفئران DRGs الموافق قطني المناطق تم تشريح L3-L5 وتعرض لالمجهر الإلكتروني. التكبير، × 60000 (يسار)؛ × 8000 (مركز)؛ × 15000 (يمين). كانت تزرع (B و C) DRGs الفئران فصل، في الثقافة لمدة 3-7 أيام، تليها مناعية باستخدام علامة النقل intraflagellar بولاريس (IFT88) (B) جنبا إلى جنب مع علامة العصبية NeuN. كانت ملطخة A 72-ح ترنسفكأيشن من IFT81 الموسومة ب V5 أيضا مع الأجسام المضادة لمكافحة V5 وMAP2 (C)، علامة الجذعية. تشير الأسهم الصفراء للأهداب. عرض (أقحم) التكبير من هدب تلطيخ الخلايا العصبية. (D و E) سيتولوجية مناعية من الخلايا العصبية DRG مثقف مع الأجسام المضادة ضد BBS1 (D) وBBS4 (E)، costained مع علامة العصبية NeuN. السهام الخضراء تشير إلى إيجابي توطين الجسم القاعدية.
الفئران BBS المسخ وقد حراري وميكانيكية حسية المعيبة الظواهر.

وقد ارتبطت طفرات فارغة في البروتينات BBS مع عيوب وظيفية، ولكن ليس الهيكلية، من هدب سواء بصورة مباشرة، كما يتضح من تنكس الشبكية (9، 10) والشم (5)، وبشكل غير مباشر، من خلال نقل عيب محتمل للإشارة WNT (7). لذا تساءلنا عما إذا كان وجود أهداب في الخلايا العصبية الحسية التي يعصب الجلد قد تؤكد أخرى، تأخذ حقها حتى الآن، والعجز الحسي في المسوخ ciliopathy.
أولا، لإقامة وجود هدب في DRGs من BBS فئرانا معدلة وراثيا، أجرينا مناعية على DRGs فصلها نمت في الثقافة التي تم الحصول عليها من Bbs1 - / - وBbs4 - / - الفئران. Costaining مع أي أدينيليل محلقة 3 (AC3) أو أظهر IFT88 وNeuN أهداب العادي بشكل صارخ في كل من سلالات متحولة [المعلومات الداعمة (SI) الشكل. 6 A]، في حين أن توزيع γ تويولين كان تمييزه عن الضوابط WT، مما يشير إلى أن العمارة الإجمالية من الجسم القاعدية هي أيضا طبيعية (SI الشكل 6 B). ثم لإنشاء توزيع البروتينات في الخلايا العصبية DRG BBS، أجرينا مناعية على DRGs فصلها من فئران بالغة. والجدير بالذكر أن هذه الخلايا العصبية تبدي الهيئات القاعدية التي هي منفصلة مكانيا من centrosomes، وكما يتضح من تلطيخ مع MAP-2 و γ تويولين (19) (SI الشكل 6 B)، وهو نمط تذكرنا IMCD3 خلايا القناة جمع الكلوي (11) ربما كان هذا هو انعكاس للدولة تالية للتفتل الاستقطاب من هذه الخلايا. وكان توزيع البروتينات BBS في WT أيضا مطابقة للأنماط المحددة سابقا في هذه الخلايا (+11 - 13)، مع كل من BBS1 وBBS4 توطين بالقرب centrosomal منفصلة أزواج (محيط بالمريكز أو مريكزي) من النقاط في كل عصبون (الشكل 1 D وE).
ونظرا لهذه الملاحظات، أجرينا فحوصات السلوكية على Bbs1 - / - الفئران كوسيلة أولية لاستكشاف دور (ق) من هذه البروتينات في وظيفة الخلايا العصبية الحسية. وكان أول اختبار الغمر فحص الذيل، الذي قمنا بقياس الكمون الانسحاب ذيل عبر مجموعة من درجات الحرارة. في مجموعة من التجارب أجريت في ثلاث نسخ والطرف عن التركيب الوراثي، وجدنا أن Bbs1 - / - كان المسوخ يعد الإختفاء مقارنة مع تتزاحم WT، مما يشير إلى أن هذا المسخ كان له المعيبة، ولكن لا تضيع والاستجابة thermosensory (الشكل 2. أ) .

تين. 2.
Bbs1 - / - الفئران لها ردود ناقصة للمؤثرات الحرارية والميكانيكية وكذلك تقليل نقل الإشارة إلى الحبل الشوكي ردا على التحفيز الحراري. (A) نتائج من فحص ذيل الغمر التي المستمر التحفيز في 46 ° C، +48 ° C، 50 درجة مئوية، أو 52 ° C يطبق، ويتم تسجيل الوقت للرد. عموما، Bbs1 - / - فى الحيوانات الإختفاء أكبر من نظرائهم WT. (ب) فحص فون فراي على Bbs1 - / - أظهرت الفئران قدرا أكبر من القوة اللازمة للحث على الاستجابة الميكانيكية مقارنة مع WT. (C) أقسام التمثيلية للL3 / L4 / L5 الظهرية منطقة القرن Bbs1 + / + وBbs1 - / - الفئران ملطخة المضادة للج-FOS بعد التحفيز من واحد مخلب هند في 48 ° C أو 52 ° C حمام الماء . (D) قطعة أرض لعدد من ج-فو نوى -positive في القرن الظهري المماثل مقابل القرن الظهري المقابل بعد التحفيز من واحد مخلب هند في 48 ° C أو 52 ° C حمام الماء (ن = 4 الفئران في التركيب الوراثي). (التكبير، × 10).

تساءلنا المقبل ما إذا كانت هذه المسوخ قد يكون أيضا العيوب الحسية الأخرى. وبالتالي فإننا اختبار لنقص محتمل في mechanoception مع اختبار فون فراي، الذي وكميا الحواس من حيث استجابة لضغوط عبر مجموعة من القوى الميكانيكية التطبيقية. وجدنا أن Bbs1 - / - فى الحيوانات عتبة استجابة انخفضت إلى نقط المحفزات تطبيقها على قوات أقل مقارنة مع الفئران WT (الشكل 2 B). الأهم من ذلك، لم يكونوا على thermosensory ولا الظواهر ميكانيكية حسية فريدة من نوعها لBbs1 - / - الفئران، لأن التحاليل متطابقة من Bbs4 - / - كشفت المسوخ نفس العيوب (لا تظهر البيانات).
لتفسير هذه الظواهر، رأيناها ثلاثة احتمالات: أن الحيوانات كانت الاستجابات الحركية المعيبة، أن الحيوانات قد يثير الشبهة أعلى وظيفة القشرية وبالتالي فقد تحدت لتفسير الإشارات الحسية. أو أن العيب نشأ في تعصيب لها الطرفية. كما استبعدت الاحتمال الأول عن طريق اختبار التنسيق الحركي مع rotarod متسارع. على الرغم من أن بعض المسوخ BBS كانت أثقل من تتزاحم WT، وعدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين Bbs1 - / - الفئران وWT عبر أربع التجارب التي أجريت أعمى إلى التركيب الوراثي (P = 0.13؛ SI الشكل 7.).
المقبل، للتمييز بين العيوب الطرفية وتشوهات في أعلى وظيفة القشرية، درسنا قراءات thermosensory دون مستوى الدماغ، وهي الاستقراء أثار حرارة فوري الجيني المبكر ج-فو في الدرجة الثانية الخلايا العصبية الحسية من النخاع الشوكي القرن الظهري (20). A تخفيض يسببها حراريا ج-فو في القرن الظهري، كما تم قياسها عن طريق حساب عدد من نوى ج-فو-إيجابية، تشير إلى أن وجود خلل ما لا يقل يحدث في تعصيب الطرفية أو تفعيل الخلايا العصبية من الدرجة الثانية. إذا يبقى ج-فو الاستقراء العادي في القرن الظهري، ثم عيب يمكن أن تحدث في مراكز المعالجة CNS أعلى (20). نحن حفز مخلب واحد من ثلاثة المسوخ وثلاثة تتزاحم WT إما في 48 ° C أو 52 ° C وكميا النووي التعبير ج-فو في القرن الظهري المماثل عبر المقاطع المسلسل الى منطقة أسفل الظهر (L3-L5)، أعمى إلى التركيب الوراثي. وعلى النقيض من تفعيل قوي من الظهرية الخلايا العصبية قرن في الحيوانات WT تتعرض ل48 ° C التحفيز، لاحظنا تفعيل ضئيلة أو معدومة من ج-فو في الخلايا العصبية القرن الظهري المسوخ Bbs1 "في نفس درجة الحرارة (الشكل 2 C و D). ظلت استجابة من المسوخ والحيوانات WT مختلفة إلى حد كبير عند 52 ° C، على الرغم من درجة الحرارة هذه، المسوخ تظهر بعض الاستجابة، مما يشير إلى وجود الشذوذ الحسي المحيطي.
العيوب التشريحية في التعصيب الشوري في الفئران BBS المسخ.

لتحديد ما إذا كانت التغيرات في الغدد العرقية الطرفية قد تساهم في العجز الحسي المرصودة، قمنا بتحليل المشعر هند مخلب (GHP) أقسام الجلد immunolabeled لPGP 9.5، علامة panneuronal، وCGRP، علامة من تعصيب ببتيدي المفعول (الشكل 3، SI الجدول 2 ). وكشف التحليل النوعي تخفيضات في CGRP مناعية (IR) بين ألياف داخل الجلد الحلمية كل المسوخ BBS (الشكل 3 أ و ب). كريات ميسنر، التي تعبر عادة عن انخفاض مستويات CGRP-IR (21)، لم تتأثر بشكل ملحوظ. تم تغيير توزيع النهايات الحسية داخل البشرة وحجم الجلد الحلمية أيضا في كل من المسوخ BBS. في منصات WT، تعصيب لديه توزيع موحد نسبيا في جميع أنحاء البشرة بينما في المسوخ BBS، فهي تتركز بشكل غير متناسب في الجلد الحليمات (الشكل 3 C). الكمي التي أجريت على GHP الأنسجة المسمى لPGP 9.5 والفأر مكافحة Cy2 لترسيم الحدود بين الجلد ابيديرمي epidermal أكد أن كلا من المسوخ BBS زادت النهايات الحسية أعلاه وعلى الحدود بين الحليمات، والتي كانت أيضا أوسع من WT (الشكل 3 F وH). لم يتم تغيير كثافة البشرة إنهاء الشاملة عبر لوحة بالكامل انخفض بدرجة كبيرة في أي من المسوخ BBS.

تين. 3.
الاختلافات في بنية البشرة والغدد العرقية في BBS - / - الفئران. (A و B) صور منصات البعيدة من الكفوف الخلفيتين المشعر تظهر CGRP (الحمراء) مع PGP (الأخضر) (A) وCGRP (B) immunolabeling وحده BBS - / - قد الحيوانات خفضت مناعية CGRP في الألياف العصبية داخل الجلد الحليمات ( الأسهم الصفراء)، في حين لم تكن هناك اختلافات واضحة في نسبة-CGRP إيجابي النهايات البشرة (النجوم الصفراء). الأسهم الخضراء والنجوم تشير ألياف الجلد العصبي PGP الإيجابي والنهايات البشرة، على التوالي. يشار إلى الحدود البشرة الجلدية خط متقطع. (C) الصور من منصات البعيدة من WT وBBS - / - الفئران المسمى لPGP 9.5. ومتباعدة تعصيب بالتساوي في جميع أنحاء البشرة لوحة WT ولكنها تتركز في الحليمات الجلدية في المسوخ BBS. (D) عن قرب من منطقة لوحة البعيدة اختيارها يدل على تصنيف شخصي من النهايات الحسية على أساس موقفهم في البشرة قريبة الحليمات الجلدية (بين أعلاه، أو على الحدود بين حليمة). وصفت النهايات التي تغطي مناطق متعددة في كل منطقة مروا من خلال (على سبيل المثال، النهايات interpapilla الحدود). (E) صور منصات البعيدة المسمى مع مكافحة فأر Cy2 لترسيم الحدود بين الجلد ابيديرمي epidermal تبين أن المسوخ BBS لها كبير، شوه الحليمات الجلدية (السهام البيضاء). الحليمات (خطوط بيضاء صلبة) والأمثلة على المناطق تحديدها بشكل غير موضوعي أعلاه (تبددت خطوط بيضاء) وعلى الحدود بين حليمة (منقط خطوط بيضاء) وتتبع. (F-H) الكمي لتعصيب البشرة وهيكل حليمة الجلد أجريت على أقسام الأنسجة المسمى مع PGP 9.5 والفأر مكافحة Cy2. (F) كل BBS - / - المسوخ كان أكثر بكثير النهايات أعلاه وعلى الحدود بين الحليمات مقارنة مع WT، وBbs1 - / - الفئران كان أكثر بكثير مجموع النهايات الحليمات من Bbs4 - / - الفئران. وبلغ مجموع النهايات الحليمات مجموع كل النهايات التي مرت عبر المناطق المذكورة أعلاه أو على الحدود بين الحليمات. (G) Bbs1 - / - زيارتها الفئران كثافة أكبر بكثير من النهايات فوق الحلمية الخاصة بهم، وBbs4 - / - زيارتها الفئران أقل بكثير النهايات بين الحليمات بهم، مشيرا إلى أن عددا أكبر من النهايات المرتبطة الحليمات في هذه الحيوانات لم يكن بسبب مجرد التغيرات في حجم الحليمات. لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية لإنهاء الكثافة خارج المنطقة الحلمية (من بداية ونهاية لوحة لحليمة الأولى) أو على لوحة كاملة. حسبت البشرة الكثافة إنهاء بقسمة عدد من النهايات في المنطقة من خلال طوله. كان المسوخ (H) كل من BBS لفترة أطول كثيرا الحليمات الاعراض لكن ليس المرتفعات. وقد تم قياس ارتفاع حليمة من قاعدتها المقدرة على الارتفاع ذروته في البشرة، وحسبت عرض بتقسيم منطقة الحليمة التي كتبها ذروتها. موانئ دبي، حليمة الجلد، سان جرمان، الغدد العرقية. ه، البشرة. د، الأدمة.
C. ايليجانس BBS المسوخ هل Thermosensory المعيبة.

على الرغم من أن البيانات الثدييات دينا أنشأت الظواهر thermodefective عن المسوخ لدينا، تعصيب الثدييات معقدة بطبيعتها، ويمكن أن الظواهر الحسية تكون متغيرة. علاوة على ذلك، الخلايا العصبية الحسية الثدييات أيضا التفاعلات المعقدة مع أنواع الخلايا الأخرى التي مهدبة أيضا، مثل خلايا شوان والخلايا الكيراتينية (22، 23). لهذه الأسباب، لجأنا إلى كائن مهدبة بساطة، C. ايليجانس، حيث يمكننا أن التحقيق في عواقب القاعدية ضعف الجسم / الهدبية في thermosensory استجابة حصرا في الخلايا العصبية الحسية المهدبة.
لاختبار الدور المحتمل للC. البروتينات ايليجانس BBS في thermosensation، ونحن أول مقارنة سلوك اثنين وصفت سابقا BBS المسوخ (14)، (المعروف أيضا باسم OSM-12) BBS-7 و BBS-8، مع أن من نظرائهم WT في مقايسة تكيف حراري (24) . عند وضعه على التدرج الحراري الطولي الضحلة تتراوح ما بين 18.5 درجة مئوية إلى 21.5 درجة مئوية (في 8 سم)، انتقلت الحيوانات WT بشكل فعال في درجة الحرارة تربية الخاصة من 20 درجة مئوية خلال مدة 1 ساعة (الشكل 4 A). على النقيض من ذلك، BBS-7 و BBS-8 المسوخ عرض عيوب كبيرة إحصائيا (P <0.00001) في تكيف حراري لمنطقة C 20 ° (الشكل 4 A). وقد أجريت على عدد متساو من تكيف حراري فحوصات عن طريق وضع الحيوانات على الجانب الساخن أو البارد من بلاطة آغار، وضمنا النتائج التي المسوخ الهدبية كانت معيبة في thermosensation العام، تبين عدم وجود تفضيل لدرجات حرارة دافئة أو باردة. لا يمكن أن يعزى هذا النمط الظاهري لالحركي العيوب، لأن عرض حركة الحيوانات متحولة (أي الانحناءات في الدقيقة) لا يمكن تمييزها من WT (لا تظهر البيانات). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت BBS-7 و BBS-8 سلالات متحولة انقاذ مع الجينات WT كل منها استعادة تكيف حراري السلوكيات (الشكل 4. A؛ BBS-7 الإنقاذ = 0.5307 ± 0.073؛ BBS-8 الإنقاذ = 0.4925 ± 0.063). الأهم من ذلك، وهذه العيوب لا يقتصر على المسوخ BBS، لأن المسوخ الهدبية الأخرى، بما في ذلك OSM-5، والتي بترميز ortholog من IFT52 (25)، وOSM-3، الذي يشفر كينيسين homodimeric اللازمة لبناء الجزء الأعلى من C . ايليجانس أهداب (26)، عرض أيضا تكيف حراري العيوب (P <0.00001) التي كانت قابلة للمقارنة مع تلك التي BBS المسوخ (الشكل 4 A). أيضا من الفائدة، كان التشكل العام للتزيين زغيبات AFD thermosensory الخلايا العصبية هدب سليمة، مما يوحي بأن العيوب فقط في هدب الأساسي تسببت في النمط الظاهري (لا تظهر البيانات).

تين. 4.
C. ايليجانس تظهر طفرات الهدبية تكيف حراري والعيوب تجنب الحرارية وكذلك mislocalized OSM-9. (A) تكيف حراري وتجنب الحراري للWT (N2)، BBS المسوخ، وOSM-3 كينيسين المسوخ. تكيف حراري يتصل جيدا كيف تتحرك الديدان لمن منطقة درجة الحرارة تربية (20 ° C). (B) تجنب Nonthermal هي نسبة الديدان التي لا تجنب درجات الحرارة الضارة قدم بالقرب من رأس الحيوان. لA و B، *، P <0.00001. (C) GFP الموسومة OSM-9 mislocalizes في BBS-8 الحيوانات متحولة. TZ، منطقة انتقالية / الجسم القاعدية. *، تراكمات غير طبيعية لم تشهدها من النوع البري الحيوانات.

المقبل، لاختبار ما إذا كانت العيوب thermosensory تمتد إلى درجات الحرارة الضارة، أجرينا فحص تجنب الحراري، والتي تم قياس استجابة الديدان الفردية إلى درجة حرارة مسبب للألم (≈50 ° C) وضعها مباشرة في مسار حركتهم قرب رؤوسهم ( 27). الحيوانات WT (ن> 400) تتوقف حركتها إلى الأمام وبدء متميزة، عكس انعكاسية استنساخه في 94.9٪ من الحالات (الشكل 4. B؛ انظر أيضا المرجع 27). على النقيض من ذلك، BBS-7 و BBS-8 المسوخ (ن> 400) على حد سواء أظهر الظواهر تجنب الفقيرة (P <0.00001)، مع تجنب الاستجابات المناسبة لوحظ في فقط 73.1٪ و 73.3٪ من الحالات، على التوالي. وبالمثل، عرض على OSM-3 وOSM-5 المسوخ تجنب في 78.3٪ و 73.4٪ من الحالات (P <0.00001)، على التوالي (الشكل 4 A). للتأكد من أن الظواهر التي تعاني من نقص الحرارية على وجه التحديد بسبب طفرات في BBS، أكدنا أن BBS-7 و BBS-8 المسوخ التعبير عن الجينات المحورة WT كانوا قد الردود تجنب الحرارية مقارنة مع تلك الحيوانات WT (BBS-7 الإنقاذ = 95.0٪ ± 3.2 ٪، BBS-8 الإنقاذ = 94.5٪ ± 0.4٪، الشكل 4 B).
سعينا المقبل لمواصلة التحقيق الأساس الكيميائي الحيوي لهذا النمط الظاهري. وكان أحد الاحتمالات أن وظيفة الهدبية المعيبة قد التشويش على حركة الجزيئات المستجيب، منها مستقبلات TRP سيمثل المرشحين المثالي. ولذلك درسنا حركة OSM-9 في المسوخ لدينا. لأنه لا يوجد C. وحتى الآن تم ربط قناة ايليجانس TRP خصيصا لthermosensation، ركزنا على OSM-9، وهو بروتين axonemal يعرف ما هو مطلوب لالكيميائي ويمثل homolog الوظيفي المحتمل للTRPV1 الثدييات أو TRPV4 (28، 29). وجدنا أن إصدار GFP الموسومة من OSM-9، والذي يموضع بشكل صحيح إلى الخيط المحوري الهدبية في الحيوانات WT، يظهر mislocalization متغير ولكن ثابت في خلفية BBS متحولة. على وجه التحديد، عرض BBS-8 الحيوانات تراكمات / mislocalization لم أر في الحيوانات WT أو في BBS-8 الحيوانات الإنقاذ، على طول التغصنات، داخل أو على مقربة من الجسم القاعدية، وعلى طول الخيط المحوري الهدبية (الشكل 4 C). على الرغم من أن OSM-9 ليس C. ايليجانس thermosensory مستقبلات في حد ذاته، وتشير النتائج التي توصلنا إليها أن التفسير الجزيئي واحدة على الأقل في النمط الظاهري thermosensory هو أن جهاز thermosensory القائم على هدب (على سبيل المثال، TRP-نوع مستقبلات) mislocalizes أو غير فعال عندما تتعطل BBS ظيفة البروتين.
عيب توزيع مستقبلات الخلايا العصبية في الفئران DRG.

على الرغم من أن تشريح C. ايليجانس الخلايا العصبية الحسية تختلف بشكل ملحوظ عن تلك الخلايا العصبية الحسية الطرفية في الثدييات (لأسباب ليس أقلها الموقف من هدب النسبي لموقع المدخلات الحسية)، أثارت بيانات دينا إمكانية المتميزة التي mistrafficking أو misregulation من حراري والبروتينات قناة ميكانيكية حسية قد تسهم في الظواهر التي لوحظت في الماوس. لدراسة هذا الاحتمال، ركزنا على TRPV1 مستقبلات الثدييات، ينشط في نطاق حيث لوحظ أن النمط الظاهري في المقام الأول (30) وSTOML3، وهو بروتين مثل stomatin أن ثبت مؤخرا أنها ضرورية لmechanosensation (31)، والتي لقد وجدنا سابقا أن mislocalized في الظهارة الشمية من BBS المسوخ الماوس (5).
نحن تقييمها أولا توزيع TRPV1 في أقسام GHP من كل بلد من بلداننا المسوخ وتتزاحم WT. نحن لم نلاحظ أي اختلافات ملحوظة بين تلطيخ النهايات (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، عند اختبار مقصورة آخر من هذه الخلايا العصبية، ونحن لم نلاحظ تغير TRPV1 مناعية في سوما على النحو الذي يحدده التهديف أعمى من أقسام متتالية عبر DRG. أربعة من ستة Bbs1 - / - الحيوانات قد الاكتئاب إشارة TRPV1 كما تقرره متوسط ​​كثافة الخلايا العصبية الملون بشكل إيجابي، في حين أن Bbs4 - / - أظهرت الحيوانات زيادة في كثافة-TRPV1 إيجابي somata (SI الشكل 8 A و B.). كان هذا يذكرنا العيوب وحظ سابقا من الخلايا العصبية الشمية، حيث Bbs1 - / - وBbs4 - / - أظهرت الحيوانات الظواهر الخلوية متناقضة، وكلاهما توج في نفس الخلل الوظيفي (32). نحن لا نعرف ما إذا كان هذا الاكتشاف يعكس مواصفات العصبية غير الطبيعية (يحتمل أن تكون نتيجة لهدب عيب) أو ما إذا كان أقلقت الاتجار مستقبلات.
وجدنا اضطرابات مماثلة في توزيع STOML3. في حين تم الكشف عن كميات متواضعة في السيتوبلازم (وربما غشاء البلازما) من الخلايا في الفروع عبر DRG في الحيوانات WT، لاحظنا وضوحا تراكم STOML3 في نوى على حد سواء Bbs1 - / - وBbs4 - / - الحيوانات (الشكل 5 )، والتنبؤية توزيع عيب ميكانيكية حسية.

تين. 5.
توزيع STOML3 في الخلايا العصبية DRG. وعلى النقيض من الحيوانات WT، وزعزع STOML3 تلطيخ في المسوخ BBS، حيث يبدو أن mistrafficked إلى النواة. الصور هي في التكبير، × 40.
العيوب الحسية في BBS المرضى.

إنشاء thermosensory المعيبة / ردود مسبب للألم في الجسم الهدبي والقاعدية المسوخ في الماوس وC. أثار ايليجانس إمكانية واضحة أن المرضى BBS قد أيضا يحمل أوجه القصور الحسية غير معروف حتى الآن. لاختبار هذه الفرضية مباشرة، قمنا بتعيين تسعة مرضى BBS لا علاقة لها فوق سن ال 17، وبناء على موافقة مستنيرة، يعاير عليهم سبع لطرائق الحسية باستخدام اختبار عصبي القياسية. كان جميع المرضى تناقص ملحوظ في قدرتها على كشف الاهتزاز عندما تم تطبيق الشوكة إلى اللقم الإنسي والجانبية على ظهر المعصم وكل عرض الفقراء التمييز بفارق نقطتين على النخيل وظهر اليد. سبعة من التسعة (78٪) لديهم الحس العميق تضاءلت (الشعور موقف مشترك)، وأربعة من تسعة (44٪) قد تضاءلت حساسية درجة الحرارة، وسبعة من تسعة (78٪) لم يتمكنوا من تحديد دقيق لوزن أو شكل الجسم وضعها في كف (الجدول 1).

الجدول 1.
الظواهر الحسية في المرضى الذين لا علاقة BBS

نقاش

هنا، لقد أظهرنا أن somata من الخلايا العصبية الحسية الثدييات ومهدبة وأن الخسارة من وظيفة الطفرات في الهدبية والبروتينات الجسم القاعدية تؤثر على وظيفة هذه الخلايا، التي تترجم إلى عيوب في تصور thermosensation في الماوس، واسعة الظواهر الحسية لدى البشر. على حد علمنا، هذا الارتباط في الثدييات بين الجسم القاعدية / البروتينات الهدبية وthermosensation هي غير المبلغ عنها سابقا، ويحتمل أن تكون لها آثار كبيرة على فهمنا لتطور وظيفة الخلايا العصبية الحسية الطرفية.
على الرغم من أن الأساس الخلوي الدقيق لهذا النمط الظاهري سوف تحتاج إلى مزيد من التحقيق، وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن اضطراب الجسم القاعدية يمكن ربما يؤدي إلى mislocalization يصاحب ذلك من TRPV1 وSTOML3 في العقد الجذرية الظهرية، ملمحا إلى أن الاتجار معيب والتعبير، أو توطين الخلوية من هذه القناة البروتينات، أو في الواقع مواصفات العصبية، قد تساهم في الظواهر المرصودة. اكتشافنا أن C. ايليجانس OSM-9 جزئيا mislocalizes في BBS المسوخ تدعم هذه الفرضية. يتسق أيضا مع نموذج النقل، وأشارت بيانات حديثة أن PKD2 heterodimerizes مع واحد على الأقل من قنوات thermoTRP، TRPV4، ويبدو أن هناك حاجة لوظيفة الصحيحة لها (M. Köttgen وG. والز، اتصال شخصي)، وتقدم ميكانيكي الصلة بين البروتينات الهدبية والعجز thermosensory. ومع ذلك، العيوب التخلق إضافية قد تسهم أيضا، كما يتضح من تعصيب الجلدي الشاذة من كل من المسوخ ciliopathy فحصها. تم ترجمة مستقبلات مثل SSTR3 و 5 HT6 لأهداب الابتدائي الخلايا العصبية في الدماغ (33، 34)، وعلى الرغم من أنها لم أظهر في DRG أهداب، وأعربت SSTR3 مرنا في الخلايا DRG (35). ومن الملاحظ أيضا أن بعض الناقلات العصبية ونيوروببتيد ويعتقد أن يصدر من سوما DRG (36، 37). أخذت معا، هذه الملاحظات تؤدي بنا إلى التكهن قد يكون متورطا أن أهداب DRG في العوامل الإنمائية الرئيسية الاستشعار، التي يمكن بدورها تنظيم توطين وظيفة تعصيب الحسي المحيطي.
في الوقت نفسه، فمن الممكن أن اختلال وظيفي الهدبي على الخلايا nonneuronal في محيط يمكن أن تسهم في هذه التغيرات في الغدد العرقية. على سبيل المثال، ومن المعروف أن الخلايا الكيراتينية أن مهدبة (22)، وكذلك خلايا شوان (23). وبالتالي يمكن لمزيج من العيوب الهدبية في كل من هذين النوعين من الخلايا يساهم في موقعنا thermosensory وحظ والظواهر ميكانيكية حسية. وبالتالي تكون هناك حاجة الاجتثاث المشروط من البروتينات الهدبية في الخلايا العصبية الحسية، طبقات الخلايا الكيراتينية منفصلة والخلايا الدبقية فضلا عن المسوخ الكبار محددة لتشريح المساهمة النسبية الزمانية المكانية لكل الأنسجة.
وأخيرا، تشير البيانات المتوفرة لدينا مريض BBS أن اضطراب الخلايا العصبية الحسية المحيطية قد لا تقتصر على thermosensation لكن قد عقد ينطبق أيضا على طرائق أخرى. وسيكون من المهم لتحديد مدى وطبيعة هذه العيوب، وما إذا كانت تقتصر على الجلد. في موازاة ذلك، فإنه من الأهمية بمكان لتحديد ما إذا كانت هذه الظواهر موجودة في متلازمات الهدبية أخرى. وقد أبرز الأعمال الأخيرة للciliopathies كمجموعة من الاضطرابات مع تداخل، وإن كان، الخصائص السريرية متغير مثل تنكس الشبكية وأمراض الكلى الكيسي، والشم (38). فمن المعقول أن نفترض أن العجز الحسي المحيطي قد تمثل بعد آخر، مكون underrecognized هذه الاضطرابات السريرية.

إجراءات تجريبية

الماوس السلوكية طرق التجريبية.

ذيل غمر الفحص.

تم مغمورة الثلث الأعلى من ذيل فأر في حمام الماء الساخن الذي عقد في 46 ° C، +48 ° C، 50 درجة مئوية، و 52 درجة مئوية. وكان مقدار الوقت اللازم لذيل الماوس للنقر على استجابة المسجلة. وضعت قطع مرات في كل درجة حرارة (1 دقيقة 46 ° C و 48 ° C، و 10 ثانية لمدة 50 ° C و 52 ° C) لمنع الضرر للحيوان. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت ثلاث تجارب في درجة الحرارة.

فون فراي الفحص.

وقد تأقلم الفئران لمدة 30 دقيقة على الأقل في غرف زجاجي قمة سلكية. تم تطبيق القوة الميكانيكية منقط إلى مخلب هند الصحيح باستخدام الإلكترونية فون فراي anesthesiometer (IITC، وودلاند هيلز، كاليفورنيا). كانت القوات التي انسحبت الحيوان مخلب الذي اتخذته ثلاث مرات حيث بلغ متوسط ​​الاستجابة. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت ثلاث تجارب.

فحص Rotarod.

وبدأ العمل في فترة التدريب حيث وضعت الفئران على rotarod تسريع (كولومبوس الآلات، كولومبوس، OH) بسرعة ثابتة من 4 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق متتالية. إذا سقط الماوس، وضعت مرة أخرى على rotarod حتى 5 دقائق قد انقضت. ثم سمح الفئران للراحة في أقفاصها الفردية لا يقل عن 1 ساعة. تم الفئران ثم توضع مرة أخرى على rotarod في سرعة التعجيل من 4-40 دورة في الدقيقة مع التسارع التدريجي الذي يحدث كل 30 ثانية. وسجلت الوقت اللازم للماوس لتسقط على rotarod كرد. تم اختبار عشرة إلى 15 الفئران في التركيب الوراثي، وأجريت أربع تجارب.

الماوس تشريحية طرق التجريبية.

Immunolabeling من الماوس GHP أقسام الأنسجة باستخدام مكافحة PGP 9.5 (1: 800؛ Ultraclone) ومكافحة CGRP (1: 400؛ حدة طرفية مختبرات)، الأجسام المضادة الأولية مع المضادة للأرنب اليكسا فلور 488 (1: 500؛ المسابر الجزيئية)، ومكافحة -guinea pig Cy3 (1:500; Jackson ImmunoResearch) secondary antibodies was conducted as previously described ( 21 ).من أجل ترسيم واضح البشرة من الأدمة، ومكافحة فأر Cy2 (1: 250؛ جاكسون InnumoResearch) تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية لتسمية المناعية الذاتية التي تتركز بشكل تفضيلي في الأدمة. كان إعداد الأنسجة من القرن الظهري DRG وفقا لبروتوكولات موحدة، كما تلطيخ وتقدير من الظواهر. للحصول على طرق مفصلة، ​​انظر طرق SI.

C. ايليجانس التحليلات.

جيل من الحيوانات والإنقاذ المعدلة وراثيا وكما وصفها (14). أجريت فحوصات السلوكية كما هو مفصل سابقا؛ لمزيد من التفاصيل التجريبية، انظر طرق SI.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #6  
قديم 11-23-2015, 08:21 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي التفاعل الجيني بين بارديه-بيدل الجينات متلازمة والآثار المترتبة على أطرافهم الزخرفة

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/17/13/1956.full



متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو عديد المظاهر، واضطراب غير المتجانسة وراثيا تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly وضعف الإدراك، الكلى والتشوهات القلبية، فضلا عن ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري. ومن المعروف أن الجينات متعددة لتسبب بشكل مستقل BBS. لا تظهر هذه الجينات إلى رمز لنفس الفئة الوظيفية للبروتينات. بعد، تحور كل النتائج في النمط الظاهري مماثلة. الجينات ضربة قاضية للجينات BBS المختلفة في الزرد تبين الظواهر المتداخلة لافت للنظر بما في ذلك النقل جسيم ميلانيني خلل واضطراب في الحويصلة المهدبة كوبفر. هنا، علينا أن نبرهن على ضربة قاضية الفردية bbs1 وbbs3 النتائج في نفس الظواهر نموذجية كما ذكرت سابقا للجينات BBS أخرى. نحن الاستفادة من نظام الزرد لتحديد ما إذا كانت شاملة في وقت واحد الزوج الحكيم ضربة قاضية للجينات BBS تكشف التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS. باستخدام هذا النهج، علينا أن نظهر ثمانية التفاعلات الوراثية بين مجموعة فرعية من الجينات BBS. العلاقات التآزر بين مزيج متميز ليست بسبب التكرار وظيفية ولكن تشير تفاعلات معينة داخل مجمع BBS متعددة الوحيدات. بالإضافة إلى ذلك، نحن الاستفادة من النظام النموذجي الزرد للتحقيق في تنامي الأطراف. polydactyly البشري هو سمة أساسية من BBS لا يرد في نماذج BBS-الماوس. قمنا بتقييم الزرد زعنفة برعم الزخرفة و نظرن تغيير القنفذ الصوتي (SHH) التعبير وتغييرات لاحقة إلى fin عناصر الهيكل العظمي. تم استخدام برعم النمط الظاهري SHH زعنفة أيضا لتأكيد التفاعلات الجينية المحددة بين الجينات BBS. وتكشف هذه الدراسة شرط في الجسم الحي من أجل وظيفة BBS في برعم الطرف الزخرفة. نتائجنا توفر رؤى جديدة هامة في آلية والأهمية البيولوجية للBBS.
مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS، OMIM 209900) هي جسمية اضطراب المتنحية غير المتجانسة وراثيا تتميز السمنة، وتنكس الشبكية، polydactyly بعد المحوري، الادراكي، نقص الأعضاء التناسلية، وتشوهات الكلى والقلب والأوعية الدموية وارتفاع نسبة مرض السكري وارتفاع ضغط الدم (1 - 3). حتى الآن، تم تحديد 12 جينات BBS (4 - +15). وعلى الرغم من بعد إلى توضيح وظيفة محددة من البروتينات الفردية BBS، والأدوار دعم البيانات في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا.
من اجل الحصول على نظرة ثاقبة الفيزيولوجيا المرضية لBBS، وضعنا BBS نماذج الزرد وأثبتت أن ضربة قاضية لأي من سبعة orthologs الزرد BBS (bbs2، 4، 5، 6، 7، 8 و 11) النتائج في الظواهر المماثلة. وتشمل هذه الظواهر تعطل حويصلة المهدبة يسمى الحويصلة كوبفر (KV)، الاستعداد لعيوب تجانب الجهاز وتأخر نقل إلى الوراء بين الخلايا (16). تحور BBS1 في البشر يؤدي إلى الشكل الأكثر شيوعا من BBS. وظيفة BBS1 غير معروف. يحتوي هذا البروتين مجال بيتا المروحة، مشيرا إلى أنه يتفاعل مع البروتينات الأخرى. نحن في الآونة الأخيرة أنه BBS1، بالتزامن مع BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9، هو جزء من مجمع مستقرة متعددة البروتين المعروف باسم BBSome (17). BBS3، عاملا ADP-ribosylation (ARF) تشبه بروتين يعرف باسم ARL6 (18 تم التعرف)، عن طريق الاستنساخ الموضعية واستخدام علم الجينوم الحسابية (10). ويقترح البروتينات ARL أن يكون لها دور في حويصلة داخل الخلايا والاتجار الغشاء والتجمع أنيبيب (18، 19). باستخدام الزرد، ونحن اختبار ما إذا كان bbs1 وbbs3 الخسارة من وظيفة يلخص نموذجية BBS الظواهر ضربة قاضية بما في ذلك عيب KV وتأخير النقل داخل الخلايا. نحن أيضا تقييم التفاعل الوراثي الزوج الحكيم بين ثمانية جينات BBS الزرد (bbs1-bbs8). يسمح النظام النموذجي الزرد لفي وقت واحد الزوج الحكيم ضربة قاضية من مجموعات متعددة من الجينات BBS، بما في ذلك الجينات BBS هذا الرمز للبروتينات التي هي جزء من مجمع BBSome، وكذلك البروتينات التي ليست جزءا من المجمع. تركيبات الزوج الحكيم من أليغنوكليوتيد مكافحة الشعور تثبت ثمانية تفاعلات تعاونية هامة بين جينات معينة BBS. من المذكرة هو دور مركزي للbbs1 في خمس من هذه التفاعلات الوراثية. التفاعلات الوراثية في الجسم الحي المحددة في هذه الدراسة تكشف أن البروتينات BBS التي هي جزء من المجمع يمكن أن يؤدي إلى التفاعل الوراثي التآزر، والبروتينات يمكن أن ليست جزءا من مجمع BBSome.
polydactyly البشري هي واحدة من السمات الأساسية للBBS لا يرد في BBS نماذج الماوس خروج المغلوب (+20 - 23). وبالنظر إلى أن يتم التعبير عن العديد من الجينات BBS الزرد في مهدها زعنفة تطوير (16)، قمنا بتقييم زعنفة الزخرفة برعم في morphants BBS. ركزنا على منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) بسبب الدور الحاسم والحفظ تطويريا في الزخرفة في الطرف رباعي الأرجل / برعم الزعنفة. علينا أن نبرهن على ضربة قاضية الفردية الجينات BBS في الزرد، وكذلك الزوج الحكيم ضربة قاضية للجينات BBS، والنتائج في توسيع القنفذ الصوتي (SHH) التعبير، وهو مكون الجزيئي للZPA، وكذلك تغييرات على عناصر الهيكل العظمي لاحقة.

النتائج

عرض الزرد bbs1 وbbs3 knockdowns BBS الظواهر نموذجية

في السابق، أثبتنا أن ضربة قاضية الفردية bbs2، bbs4 - bbs8 وbbs11 (9، 16) يولد الظواهر نموذجية في الزرد. من أجل تحديد ما إذا كان knockdowns من bbs1 وbbs3 تؤدي إلى الظواهر المماثلة، كنا morpholinos العقاقير لاسقاط هذه الجينات. وقد صممت oligonucleitides العقاقير morpholino (موس) لاستهداف bbs1 تقع على الصبغي 21 وbbs3 تقع على الصبغي 1 في الجينوم الزرد (معهد ويلكوم ترست سانجر، http://www.ensembl.org). المنظمات الأعضاء الموسومة فلوريسئين استهداف ميثيونين البادئ (أغسطس-MO) أو لصق موقع من exon2 تم microinjected (exon2-MO) في الأجنة. وقد وزعت على المنظمات الأعضاء بشكل موحد في 12-14 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ولم الأجنة morphant لا تظهر أية تغييرات جسيمة في حجم الجسم العام ومورفولوجية مقارنة مع الضوابط. Bbs1 وقيمت morphants bbs3 المقبل لإجراء تعديلات نموذجية بما في ذلك الحد أو فقدان حويصلة مهدبة، والمعروفة باسم حويصلة كوبفر (KV)، الاستعداد لعيوب تجانب والتأخير في النقل جسيم ميلانيني الوراء (9، 16). الأسلاف KV تنشأ في خط الوسط الظهرية وتشكل حويصلة المهدبة في منطقة الذيل برعم خلال مراحل الجسيدة (+24 - +30). في البرية من نوع ومراقبة الأجنة المحقونة MO في مرحلة 10-13 الجسيدة، وKV على شكل دائرة يبلغ متوسط ​​حجم 50 ميكرون (الشكل 1 A و B). وقد لوحظت عيوب KV (خفض حجم ثلث أقل من المعتاد أو الكلي من غياب KV) بطريقة تعتمد على الجرعة في bbs1 MO وbbs3 حقن MO الأجنة (الشكل 1، الجدول 1). وتمشيا مع وظيفة المقترحة للKV في اليسار واليمين التماثل محور (+24 - +30)، وأظهرت ضربة قاضية الزرد من bbs3 العيوب تجانب الجهاز تظهر الأجنة Bbs3 MO حقن التعديلات الركض هامة في 22-24 HPF (عكس أو لا هرول) و. حلقات العيوب في 36 HPF (31)، في حين أن جرعة منخفضة من bbs3 MO أو مراقبة الأجنة المحقونة MO لا تظهر KV كبير أو التعديلات تجانب (الشكل 1 E، الجدول 1).

الشكل 1.
bbs3 ضربة قاضية الظواهر في الزرد. (A - C) صور الأجنة الزرد حية في مرحلة 10-13 الجسيدة. (A) KV (مربع متقطع) هو حويصلة مهدبة تقع في منطقة الذيل برعم في البرية من نوع الجنين. (B) التكبير العالي للسيطرة KV (رأس السهم). (C) bbs3 حقن MO الجنين مع انخفاض KV (رأس السهم). التكبير: (A) 5 ×؛ (B و C) 10 ×. (D) نسبة العيوب KV الزرد (انخفاض أو غائبة) ولدت في MO ومجموعات التحكم. (E) نسبة العيوب تجانب القلب لوحظ في morphants bbs3 والضوابط. (F - H) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء، نظرا الأمامي الظهري من اليرقات البالغة من العمر 5 أيام. (F) من النوع البري اليرقات قبل العلاج ادرينالين و (G) عند نقطة 1.5 دقيقة بعد العلاج الادرينالين. (H) bbs3 morphant اليرقات يبدون استجابة تأخير بعد 3.0 دقيقة من العلاج الادرينالين. (I) التمثيل البياني للجسيم ميلانيني إلى الوراء مرة النقل التي يسببها الأدرينالين مما يدل على تأخير تعتمد على الجرعة في bbs3 ضربة قاضية بالمقارنة مع من النوع البري والأجنة حقن السيطرة. وأشارت العلاج وحجم العينة على X -axis وأشارت نسبة في الجزء العلوي من العارضة. * P <0.001.


الجدول 1.
وتشمل bbs1 وbbs3 ضربة قاضية الظواهر تعطيل تشكيل KV، عيوب تجانب القلب (الركض وحلقات) وتأخير كبير في جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء

أثبتنا سابقا تورط ظيفة BBS في مجال النقل داخل الخلايا العام. وأسفرت - (bbs8 وbbs11 bbs2، bbs4) في تأخير ذات دلالة إحصائية في النقل إلى الوراء (ضربة قاضية للجينات BBS الزرد 9، 16). مكوك الزرد الأجسام الصباغية داخل melanophores ردا على الإشارات البصرية والمحفزات الهرمونية (32 - 35). في الزرد تكييفها الظلام، وفرقوا الأجسام الصباغية (الشكل 1 F). جسيم ميلانيني التجميع (إلى الوراء النقل) يتم تحفيز على العلاج مع ادرينالين (الشكل 1 G) (16، 36). من النوع البري والأجنة حقن السيطرة تتراجع بسرعة الأجسام الصباغية (الشكل 1 الأول؛ الجدول 1). في المقابل، وجرعة عالية من bbs3 الأجنة المحقونة MO تأخر كثيرا جسيم ميلانيني التراجع (الشكل 1 H) (P <0.001)، في حين تظهر جرعة منخفضة من bbs3 الأجنة المحقونة MO معدل مماثل لأجنة التحكم (P> 0.05) ( الجدول 1). لوحظ نتائج مماثلة مع الأجنة المحقونة MO bbs1. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الزرد bbs1 وbbs3 knockdowns تؤدي إلى الظواهر نموذجية مماثلة لغيرها من knockdowns BBS الجينات، بما في ذلك العيوب KV، الاستعداد لعيوب تجانب وإلى الوراء تأخير النقل داخل الخلايا.

التفاعل الجيني بين orthologs BBS الزرد

تحور أي من تحديد 12 جينات BBS الإنسان تسبب الظواهر المماثلة، بعد تحليل التنبؤ مجال البروتين تشير إلى أن البروتينات BBS لا تنتمي إلى أي فئة وظيفية واحدة (المواد التكميلية، الشكل S1). وقد اقترح أن التباين المظهري بين المرضى BBS ربما يعود إلى التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS (37). لذا نحن اختبار الزوج الحكيم ضربة قاضية من bbs1-bbs8 في الزرد لتقييم التآزر بين هذه الجينات في الجسم الحي. حددنا أول جرعة subphenotypic لكل الثمانية BBS المنظمات الأعضاء. تم تحديد جرعة subphenotypic بوصفها أعلى جرعة MO الذي لا ينتج النمط الظاهري كبير عندما تم حقنها بشكل فردي في الأجنة الزرد (المشار إليها باسم '-'، الشكل 2 A؛ الجدول 2). نحن المقبل شارك حقن 28 مجموعات الزوج الحكيم المحتملة لجرعة subphenotypic-bbs1 bbs8 المنظمات الأعضاء. واعتبرت تفاعلات كبيرة (المشار إليها باسم '+'، الشكل 2 أ) إذا لوحظت في تغيير دلالة إحصائية في العيوب KV وزيادة جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء بالمقارنة مع العلاج مع انخفاض جرعة واحدة MO. ثمانية من 28 حقن الزوج الحكيم الممكنة أدى إلى تفاعلات تعاونية. كل هذه التفاعلات المعنية إما bbs1 أو bbs2 كأحد مكونات التفاعل. حددنا خمسة bbs1 التفاعل المتآزرة (مع bbs2، bbs3، bbs4، bbs6 وbbs7 موس) وأربعة bbs2 التفاعل المتآزرة (مع bbs1، bbs3، bbs4 وbbs6 موس). Bbs3، bbs4 وbbs6 تفاعلت مع كل bbs1 وbbs2. تفاعلت Bbs7 فقط مع bbs1. أظهر Bbs5 وbbs8 لا التفاعلات الجينية مع أي الجينات BBS الآخرين. تركيبات التآزر ثمانية، وbbs1 مع مزيج bbs7 الزوج الحكيم أظهر الخلل KV أشد (الشكل 2 B) وتأخير النقل إلى الوراء (الشكل 2 C؛ الجدول 2). سبع مجموعات تعاونية أخرى، من أجل زيادة شدة،are bbs2 with bbs4 , bbs2 with bbs3 , bbs1 with bbs2 , bbs1 with bbs4 , bbs1 with bbs6 , bbs1 with bbs3 and bbs2 with bbs6 (Table 2 ). لتأكيد التفاعل المتآزرة، ونحن أجنة مع مجموعات الزوج الحكيم من جرعة عالية من bbs1 MO مع bbs7 MO شارك حقن. نحن أيضا تقييم جرعة عالية من مزيج من bbs3 MO مع bbs7 MO، وزوج غير متناغم. وجنبا إلى جنب جرعة عالية من bbs1 MO مع bbs7 MO إنشاء عيوب مثيرة، في حين أن جرعة عالية من الزوج الحكيم مزيج من bbs3 MO مع bbs7 MO أسفرت عن الظواهر مماثلة لتلك التي تم إنشاؤها بواسطة bbs3 MO جرعة عالية من حقن وحده، وbbs7 حقن جرعة عالية وحده (الشكل 3 أ و ب). توفر البيانات التآزر في أدلة الجسم الحي للتفاعل بين الجينات الوراثية المحددة BBS. هذه التفاعلات الوراثية يمكن أن تشير إلى التكرار وظيفية بين التفاعل الجينات و / أو رياضيات الكيمياء المطلوبة ضمن مجمع مهمة لوظيفة المناسبة من المجمع.

الرقم 2.
التفاعل الجيني بين ثمانية جينات BBS (bbs1 - bbs8). (A) ثمانية وعشرون تركيبات الزوج الحكيم subphenotypic من BBS MO أظهرت ثمانية فقط تفاعلات تعاونية، كما لاحظ علامة "+". التفاعلات الوراثية تؤدي إلى (B) اضطراب KV و (C) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني تأخير النقل إلى الوراء بالمقارنة مع الرقابة والأجنة جرعة منخفضة من BBS MO حقن. RNA محددة يمكن انقاذ تعطيل KV وجسيم ميلانيني تأخير النقل إلى الوراء. أضيفت مراقبة المنظمات الأعضاء عند الضرورة للحفاظ على التركيز النهائي موحد للMO في مزيج الحقن. * P <0.001؛ تابع والسيطرة.


الرقم 3.
جرعة متوسطة ضربة قاضية للوراثيا التفاعل BBS الجينات النتائج في زيادة شدة وانتفاذ من BBS الظواهر ضربة قاضية، بما في ذلك (A) اضطراب KV و (B) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء بالمقارنة مع من النوع البري، ضخت السيطرة والأجنة حقن مع مجموعات MO من BBS الجينات التي لا تتفاعل وراثيا. وأشارت العلاج وعدد الأجنة على المحور س والقيم على الجزء العلوي من القضبان. * P <0.001؛ تابع والسيطرة.


الجدول 2.
ملخص التفاعل الوراثي تقييمها من قبل BBS ضربة قاضية الجينات

خصوصية BBS ضربة قاضية

تم إجراء الانقاذ من الظواهر الناتجة MO-لتأكيد خصوصية ضربة قاضية الجينات. ركزنا هذا الجزء من الدراسة على bbs1 وbbs7 لسببين. أولا، لوحظ والجمع الأكثر أهمية التفاعل الجيني مع bbs1 وbbs7. ثانيا، تظهر bbs1 وbbs7 البروتينات تناظر كبير مع بعضها البعض. شارك في حقن في المختبر -transcribed bbs1 RNA مع جرعة عالية من bbs1 MO، وكذلك شارك في حقن bbs7 RNA مع جرعة عالية من bbs7 MO، النتائج في إنقاذ كل من KV والظواهر النقل إلى الوراء (الشكل 2 B و C ؛ الجدول 3). وهكذا، والإنقاذ RNA يدعم خصوصية bbs1 وbbs7 الظواهر التي يسببها MO. للتحقيق في ما إذا كان هو التفاعل بين الجينات الوراثية BBS يرجع إلى التكرار وظيفية، شاركنا في حقن جرعة عالية من bbs7 MO مع bbs1 RNA. لا يمكن انقاذ النمط الظاهري جرعة عالية من bbs7 يسببها MO مع bbs1 RNA. وبالمثل، جرعة عالية من bbs1 MO وجرعة عالية من الظواهر bbs3 MO لا يمكن انقاذ مع bbs7 RNA (الشكل 3 أ و ب). وتوفر هذه البيانات الإنقاذ RNA والجمع بين الزوج الحكيم في دليل فيفو للتفاعلات جينية محددة بين الجينات BBS وتشير إلى أن هذه التفاعلات الوراثية ليست بسبب التكرار وظيفية. في المقابل، إلى جرعة عالية من حقن MO التي تؤدي إلى الظواهر، وجرعة منخفضة من الحقن MO الفردية BBS المنظمات الأعضاء لا تولد الظواهر، ما لم يكن جنبا إلى جنب مع ثاني جرعة منخفضة محددة BBS MO. وعلاوة على ذلك، تم تقييم الإنقاذ RNA التفاعلات التآزر. وتم انقاذ الظواهر الناتجة عن الجمع بين حقن جرعة منخفضة من bbs1 MO مع bbs7 MO مع RNA bbs7 وحدها، وكذلك مع bbs1 RNA وحدها (الجدول 3). قدرة RNA bbs1 أو bbs7 RNA لانقاذ جرعة منخفضة جنبا إلى جنب ضربة قاضية إلى أن ضربة قاضية الجزئية إما bbs1 أو bbs7 وحده لا يؤدي إلى فقدان كامل للوظيفة مجمع BBSome.

الجدول 3.
BBS الجينات ضربة قاضية الإنقاذ واختبار وظيفة زائدة

الزخرفة تغيير في مهدها الزعنفة الصدرية الزرد

منذ polydactyly هي واحدة من السمات الأساسية للBBS البشري، وبحثنا إمكانية العيوب الزخرفة برعم الزعنفة في morphants BBS. في الواقع، يتم التعبير عن الجينات BBS على نطاق واسع، ولكن بنسبة 36 HPF bbs7 يظهر تخصيب الأمامي، مع التعبير ملحوظ في برعم الزعنفة النامية (16). في morphants BBS، كان حجم الزعانف عموما يمكن تمييزه من النوع البري، مما يشير إلى نمو زعانف عادية نسبيا وقدرتها على البقاء. وقد تطورت الزعانف الصدرية الزرد والأمامية رباعي الأرجل من أطرافهم الأجداد المشترك وتبادل التشكل مماثلة والآليات الجزيئية الكامنة مماثلة (+38 - 43)، بما في ذلك ZPA (44، 45) والتي يتم ترجمتها في اللحمة المتوسطة الخلفي من برعم الزعنفة / أطرافهم ( الشكل 4 A). ويشير ZPA المعلومات الموضعية هامة للمواصفات وأرقام. في الفرخ برعم الطرف، تطعيم لZPA الأمامي إضافي للZPA الأصلي أسفرت عن تشكيل ارقام اضافية تشبه polydactyly البشري (44). وأعرب عن القنفذ الصوتي (Shh على) في الخلفية الفقارية برعم الطرف اللحمة المتوسطة ويتوسط وظائف ZPA، بطريقة تعتمد على التركيز في كل براعم الزعنفة الزرد وبراعم الأطراف رباعي الأرجل (46). منذ زيادة ZPA وظيفة أو SHH النشاط قد يؤدي إلى polydactyly، قمنا بتقييم SHH التعبير. في البرية من نوع الأجنة، وأعرب عن الصورة صاحب السمو في مجال على شكل هلال في المنطقة الخلفية لبرعم الزعنفة الصدرية (الشكل 4 B). هذا مجال التعبير دون تغيير في السيطرة وجرعة منخفضة من الأجنة MO حقن (bbs1، bbs3 وbbs7). والزعنفة الصدرية SHH مجال التعبير في جرعة عالية من bbs1 أو bbs7 morphants يدل على التوسع الأمامي، في حين أن التعبير SHH في خط الوسط ظهري لم يتغير (الشكل 4 C). وتمشيا مع التفاعلات الوراثية التي سبق تحديدها، الزوج الحكيم مزيج من جرعة منخفضة من MO من bbs1 مع bbs7 أيضا أثبتت موسعة التعبير SHH (الشكل 4 D)، في حين أن الزوج الحكيم مزيج من جرعة منخفضة من MO من bbs3 مع bbs7 يظهر نفسه كما البرية من نوع (لا تظهر البيانات). تم قياس متوسط ​​مساحة التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية باستخدام برنامج يماغيج (47)، وأكد ذات دلالة إحصائية (P <0.001) يزيد في جرعة عالية من bbs1 MO، جرعة عالية من bbs7 MO وbbs1 مع bbs7 مزيج جرعة منخفضة في مقارنة مع البرية من نوع الأجنة (الشكل 4 E). وهكذا، في برعم الزعنفة النامية، نلاحظ زيادة نطاق ZPA / SHH دون تكدير أطرافهم / نمو زعانف العام.

الرقم 4.
منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) من برعم الزعنفة الصدرية والقنفذ الصوتي (SHH). (A) تمثيل تخطيطي من برعم الزعنفة الزرد قبل 48 HPF ZPA المترجمة الخلف، ويمكن أن يكون المسمى مع التعبير SHH. جبل بأكمله التهجين الموضعي باستخدام SHH باعتباره التحقيق في مهدها الزعنفة الصدرية من 42 HPF (B) من النوع البري، (C) morphant bbs7 و (D) جرعة منخفضة من bbs1 MO مع مزيج bbs7 MO. رأس السهم يدل SHH التعبير في برعم الطرف على جانب واحد، ويرد مجال التعبير على الجانب الآخر. (E) التمثيل البياني للمنطقة قياس (ميكرون 2) المجال التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية من morphants BBS والنوع البري. * P <0.001.

منذ طفرات وراثية لSHH تظهر خسارة أو الحد من عناصر الهيكل العظمي من الزعانف الصدرية (46)، ونحن مصممون المقبل ما إذا كان -signaling SHH توسعت في مهدها زعنفة من morphants BBS يدفع توسيع الصدرية الهياكل الزعانف. في الزعنفة الصدرية من اليرقات البالغة من العمر 6-7 يوما، العنصر الهيكل العظمي أكثر الداني هو cleithrum (الكلور)، الذي يمتد dorsoventrally (الشكل 5 A). المرافقة الكلورين هو كتفي غرابي (SC)، الذي يمتد على طول قاعدة الزعنفة، والعنصر الأكثر القاصي هي الزعنفة. تلطيخ الأزرق الألسيان في البرية من نوع يحدد مثل قضيب الكلورين (الشكل 5 B، السهم) والشوري المجاور (الشكل 5 B، رأس السهم). BBS الأجنة morphant إثبات وجود الشوري الموسع (الشكل 5 C، رأس السهم)، حيث تظهر نهاية الخلفي البعيدة للالشوري لطبقات الخلايا غير منظمة و / أو إضافية مقارنة مع من النوع البري (الشكل 5 B). بما يتفق مع البيانات الجينية التفاعل، bbs1 مع bbs3 وbbs1 مع مجموعات جرعة bbs7 subphenotypic تظهر أيضا سميكة الشوري (الشكل 5 D، رأس السهم)، في حين bbs3 مع bbs7، التي لا يوجد لها تأثير متناغم على KV أو النقل إلى الوراء، يوضح هيكل برأسية مماثلة إلى البرية من نوع (لا تظهر البيانات). وهكذا، خطر ظيفة BBS التي كتبها النتائج حقن MO في توسيع التعبير SHH والزخرفة في وقت لاحق تغييرات في عناصر الهيكل العظمي للزعنفة الصدرية. وعلى الرغم من الزرد لا تشكل الأرقام، فإن هذه النتائج تشير إلى أن العيوب أطرافهم الزخرفة لوحظت في مرضى BBS ناتجة عن تشوهات SHH التعبير.

الرقم 5.
الصدرية الزرد زعنفة الغضروف تلطيخ. (A) التمثيل التخطيطي للهياكل زعنفة: الكلورين كخط ظهري بطني (السهم). الشوري البعيدة لالكلورين والأقرب إلى زعنفة. (B - D) الألسيان الأزرق تلطيخ الزعنفة الصدرية يوضح هيكل نموذج أولي للغضروف في العمر 6 ايام (B) من النوع البري اليرقات، في حين أن (C) يرقات bbs7 morphant و (D) جرعة منخفضة من الجمع بين bbs1 MO مع bbs7 MO تظهر بنية الشوري الموسع مع 2-3 خطوط الخلايا في المنطقة الخلفية القريبة من الشوري (رأس السهم).

نقاش

وقد ثبت اثني عشر الجينات تسبب بشكل مستقل BBS في البشر. عرض المرضى BBS البشري ميزات مشابهة مستقلة عن تحور الجين الأساسي. لقد أظهرنا في وقت سابق ان ضربة قاضية الفردية من عدة جينات BBS الزرد (bbs2، bbs4-bbs8 وbbs11) النتائج في الظواهر الزرد المشتركة بما في ذلك تشكيل KV غير طبيعي، تشوهات أهداب وجسيم ميلانيني عيوب النقل (9، 16). في هذه الدراسة، علينا أن نظهر أن الخسارة من وظيفة الفردية bbs1 أو bbs3 في النتائج الزرد في نفس الظواهر كما ضربة قاضية أخرى الجينات BBS الزرد. بالإضافة إلى ذلك، فقد استخدمنا الآن في النظام النموذجي الزرد لتحديد التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS عن طريق ضرب في وقت واحد أسفل تركيبات الزوج الحكيم من الجينات. لهذا التحليل في الجسم الحي من التفاعلات الوراثية، تم اختبار 28 مجموعات الزوج الحكيم الممكنة من الجينات BBS (bbs1-bbs8) في الجرعات التي لا تنتج النمط الظاهري عندما يتم استخدام morpholino الفردية (جرعة subphenotypic). في جرعات subphenotypic المستخدمة في هذه الدراسة، تم تحديد ثمانية الزوج الحكيم تفاعلات تعاونية. قبل هذه الدراسة، تم إنشاء أي نموذج حيواني لBBS polydactyly. باستخدام نظام نموذجي الزرد، حددنا الزخرفة غيرت من المهد الزعانف وتغييرات لاحقة لعناصر الهيكل العظمي الزعانف. منذ برعم الزعنفة الزرد هو orthologous لبرعم الطرف البشري، وتشير هذه الدراسة وجود صلة بين polydactyly بعد المحوري لوحظت في مرضى BBS وغيرت التعبير SHH في تطوير أطرافهم / برعم الزعنفة.
وظيفة BBS3 المطلوبة من أجل وظيفة الأهداب والنقل حويصلي داخل الخلايا

BBS3 (ARL6) هو ARF مثل البروتين (10). تدعم البيانات الأدوار الوظيفية المختلفة للبروتينات ARL، بما في ذلك تنظيم حويصلة داخل الخلايا والاتجار الغشاء والتجمع أنيبيب (18، 19). يوضح لنا فقدان البيانات من وظيفة أن النتائج bbs3 في نفس الظواهر الزرد كما knockdowns BBS الأخرى، بما في ذلك العيوب KV والخلايا تأخير النقل إلى الوراء. العثور على أهداب في KV يبدو أن تشكلت في البداية في bbs3 ضربة قاضية الزرد، ولكن يتم فقدان أهداب قبل الأوان، ولا تعمل في تشكيل KV العادي. وقد تم مؤخرا تبين أن سبعة البروتينات BBS (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) شكل مجمع المعروفة باسم BBSome (17). وBBSome يبدو أن تلعب دورا في تكون الأهداب، على الأقل جزئيا، من خلال التفاعل مع / الناتج المحلي الإجمالي عامل الصرف Rab8 GTP (Rabin8). Rab8GTP يدخل أهداب الابتدائي ويعزز تمديد الغشاء الهدبي. منع Rab8GTP إنتاج كتل ciliation وعوائد الظواهر BBS مميزة في الزرد (17). وإن لم يكن جزءا من BBSome، والبيانات المقدمة هنا مما يدل على أن bbs3 ضربة قاضية النتائج في عيوب في KV وأهداب العقدي، وكذلك في جسيم ميلانيني (يحلول عضيات ذات الصلة) النقل، ودعم دور للBBS3 والبروتينات BBS أخرى في مجال النقل الحويصلي ل وهدب (9، 16).

التفاعل بين الجينات الوراثية BBS

تظهر المرضى BBS الإنسان مجموعة واسعة من التباين المظهري. ويعتبر الاختلاف بين المرضى حتى ضمن العائلة الواحدة (وبالتالي مع نفس الطفرات BBS الأولية)، مشيرا إلى المعدلات الوراثية و / أو البيئة من النمط الظاهري. التباين المظهري والتباين الوراثي واسعة من BBS يرفع احتمال وجود تفاعلات معقدة بين الجينات BBS (37). في هذه الدراسة، حددنا ثمانية التفاعلات الوراثية من مجموع 28 التفاعلات الوراثية الزوج الحكيم الممكنة اختبارها. وتجدر الإشارة، كل واحد من ثمانية التفاعل المتآزرة أسفرت عن عيوب KV وتأخر نقل جسيم ميلانيني. لم يلاحظ أي تفاعلات تعاونية التي أثرت فقط مجموعة فرعية من الظواهر. في كل حالة، وزيادة الجرعة كل من morpholinos فوق جرعة subphenotypic أدى إلى زيادة شدة الظواهر ضربة قاضية BBS أبعد من ذلك لوحظ لالفردية ضربة قاضية جرعة عالية، ودعم الفرضية القائلة بأن الجينات BBS يمكن تعديل الظواهر بعضها البعض.
BBS التفاعلات المعقدة يمكن أن يعزى إلى أدوار زائدة عن الحاجة، وظيفة مسار مواز أو شرط stoichometric داخل مجمع البروتين مثل BBSome، على سبيل المثال عدد قليل من الاحتمالات. في هذه الدراسة، أثبتنا أن جرعة عالية من العيوب التي يسببها MO الفردية يمكن انقاذ من قبل المشارك حقن شكل من النوع البري من مرنا الجينات المحددة (أي bbs7 مرنا ينقذ جرعة عالية من bbs7 MO النمط الظاهري)، ولكن ليس عن طريق زيادة مستويات البروتينات BBS أخرى. على سبيل المثال، bbs1 مرنا لا إنقاذ جرعة عالية من العيوب التي يسببها MO-bbs7 والعكس بالعكس، يجادل ضد التكرار وظيفية. في المقابل، مرنا الفردية كافية لانقاذ subphenotypic المنظمات الأعضاء ضربة قاضية مجتمعة (أي bbs7 مرنا يمكن إنقاذ جرعة منخفضة من bbs7 جنبا إلى جنب مع bbs1 العيوب التي يسببها MO)، مما يشير إلى رياضيات الكيمياء المطلوبة داخل المجمع. دراسة حديثة أجرتها Nachury وآخرون. (17) وقد حددت BBS معقدة (وBBSome) وذكرت أن عناصر من مجمع موجودة بكميات متكافئة.
التعرف على مجمع BBSome تتألف من سبعة من 12 البروتينات المعروفة BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9) (17) يمكن استخدامها لتصنيف البروتينات BBS تعرف إلى تلك التي هي جزء من BBSome وتلك التي ليست جزءا من هذا المجمع (BBS3، BBS6، BBS10، BBS11 وBBS12). هذه المعلومات، جنبا إلى جنب مع البيانات التفاعل الوراثي من الدراسة الحالية، يسمح تحديد ما إذا كان BBS الزوج الحكيم التفاعلات الوراثية تنتج عن انخفاض قيمة اثنين من البروتينات BBSome، وضعف مكون من BBSome وعنصر عدم BBSome و / أو في وقت واحد انخفاض قيمة اثنين من البروتينات غير BBSome. وقد لوحظت أنواع الأولين من التفاعلات. على سبيل المثال، كان ينظر إلى أقوى التفاعل بين عنصرين BBSome (BBS1 وBBS7). بالإضافة إلى ذلك، اثنين من البروتينات غير BBSome التي درست (BBS3 وBBS6) عرضت كل من التفاعل وراثيا مع مكونات محددة من BBSome (BBS3 مع BBS1 وBBS2؛ BBS6 مع BBS1 وBBS2)، ولكن ليس مع مكونات BBSome الأخرى وليس مع بعضها البعض. وعلاوة على ذلك، والتفاعلات المادية المباشرة داخل المجمع BBSome لا يتوقع التفاعلات الوراثية. على سبيل المثال، BBS7 يتفاعل جسديا مباشرة مع BBS2 وليس مع BBS1 (17). ومع ذلك، BBS7 يتفاعل وراثيا مع BBS1، ولكن ليس مع BBS2.
على أساس من العثور على البديل متخالف في MGC1203 في عدد قليل من المرضى BBS، Badano وآخرون. (48) تستخدم الزرد لتقييم تأثير روكبي من mgc1203 على الجينات BBS وذكرت أن قمع متواضع من mgc1203 يمارس تأثير روكبي على النمط الظاهري التنموي للmorphants BBS. وبالمثل، knockdowns subphenotypic لدينا جينات معينة BBS الزرد إلى أن بعض الجينات BBS لها تأثير روكبي على النمط الظاهري من الجينات BBS أخرى. ومن الجدير بالذكر أن اثنين من الدراسات المستقلة استخدمت نهج subphenotypic مماثل في الزرد لتقييم التفاعلات الوراثية للbbs10 وbbs12 الجينات (12، 15). وتجدر الإشارة إلى أن واضعي ذكرت العيوب تكون المعيدة باعتباره النمط الظاهري BBS MO التي يسببها (12، 15، 48) وتستخدم هذه النمط الظاهري لتحديد التفاعلات المحتملة بين الجينات BBS. الأجنة morphant في دراستنا لا تظهر أية تغييرات جسيمة في حجم الجسم العام والتشكل. الظواهر عيب أهداب وتأخير النقل لوحظ في الدراسة الحالية هي ذات الصلة بيولوجيا إلى اضطراب البشري.
ذات أهمية سريرية، وتوفير البيانات لدينا نظرة ثاقبة وسائط غير المندلية من BBS الميراث. تم الإبلاغ عن الميراث Triallelic في مجموعة فرعية صغيرة من الحالات BBS (49 - 54). وتشير البيانات المتوفرة لدينا الزرد أن جرعة عالية من ضربة قاضية الفردية BBS الجينات النتائج في أهداب KV والظواهر النقل حويصلة (9، 16). هذه البيانات بيانات دعم الماوس خروج المغلوب أن خسارة كاملة للوظيفة البروتين BBS واحدة كافية للحث على الظواهر BBS (20 - +22). البيانات التفاعل الوراثية المقدمة هنا تشير إلى أن الأليلات hypomorphic وظيفيا من اثنين من البروتينات المحددة BBS يمكن أن تتضافر لتؤدي في الميراث digenic من BBS. على أساس البيانات الزرد يدل الظواهر ذات الصلة الناجمة عن ضربة قاضية في وقت واحد من اثنين من الجينات BBS، فمن المغري أن نفترض أن تغاير في اثنين من الجينات BBS (تغاير مزدوج) يمكن أن تكون كافية لإظهار بعض الظواهر BBS. لم يتم الإبلاغ عن حدوث ذلك. سوف توفر عدة نماذج الماوس BBS تسهيل اختبار هذه الفرضية.

ارتباط بين SSH والعيوب أطرافهم BBS

وقد تم ربط BBS الفيزيولوجيا المرضية لعيوب في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا. ومع ذلك، فإن لم يبلغ عنها polydactyly باستمرار في الأمراض الهدبية (+55 - 58). لذلك، وصلات الآلية بين وظيفة الأهداب وpolydactyly لا تزال غير واضحة. منذ الزرد الاقتران الزعانف والأطراف رباعي الأرجل ترتبط phylogenetically، شكليا مماثلة (42، 43، 59) وعرض مماثلة أنماط التعبير الجيني في تطوير أطرافهم / براعم الزعانف، يمكننا استخدام هذا النظام لتحليل الآليات الجزيئية التي تكمن وراء تطورها المبكرة (+38 - 43). BBS الخسارة من وظيفة يدل على توسيع SHH التعبير في مهدها الزعنفة الصدرية دون أن يؤثر ذلك SHH العصبي أنبوب التعبير. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة SHH للتنمية داخل الهيكل زعنفة / أطرافه (43)، وأظهر متحولة الزرد SHH (سيو) فقدان الصدرية حزام عناصر الهيكل العظمي (46، 60)، في حين أن التعبير خارج الرحم من Shh على الدجاج في الثقافة برعم الطرف MICROMASS يسببها الغضاريف رواية عقيدات (61). تحليل للعناصر الهيكلية في BBS اليرقات ضربة قاضية كشف كتفي غرابي سميكة من الزعنفة الصدرية بما يتفق مع زيادة التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية. على الرغم من أن تم الإبلاغ عن وظيفة الأهداب وIFT للعب دور في SHH الإشارات (56، 62، 63)، وتستخدم الدراسة الحالية لدينا SHH كعلامات لZPA. بالإضافة إلى ذلك، SHH التعبير في خط الوسط هو رابط الجأش. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لمعالجة مباشرة لدور أهداب أو نقل الخلايا في تنظيم SHH في morhpants BBS.ومع ذلك، توفر البيانات المتوفرة لدينا في الجسم الحي دليلا على وجود دور وظيفة BBS في أطرافهم / زعنفة برعم الزخرفة مما أدى إلى زيادة SHH الإشارات.

المواد والأساليب

MO العقاقير

وقد صممت المنظمات الأعضاء العقاقير والتي تم شراؤها من أدوات الجينات، LLC. تم microinjected المنظمات الأعضاء في ما يقرب من 3 مجلدات نانولتر في 07:59 الأجنة الخلية بتركيزات تتراوح بين 125-500 م م. تسلسل MO الزرد هي bbs1 _aug (GGGAACAGATGACATGGTTGTTTTG)؛ bbs1 _ exon2 (TGAAACTCACCAATGCATGAGGAGA)؛ السيطرة MO bbs1 _5mis (TAAGaGTGAtGATGGcCACTtGCAT)؛ bbs3 _aug (AGCTTGTCAAAAAGCCCCA TTTGCT)؛ bbs3 _exon2 (TACATCTTTTATTTTCACCTTGAGG) والسيطرة MO bbs3 _5mis (AGgTTcTCAAAAAaCCCgATTTcCT).

الزوج الحكيم مزيج من BBS morpholinos

اثنين من المنظمات الأعضاء BBS مختلفة تستهدف bbs1-bbs8 كانت مجتمعة في الجرعات المنخفضة subphenotypic (125 μ M لكل منهما) وmicroinjected في 07:59 الأجنة الخلية. وكانت الضوابط لهذه التجارب مجموعات من جرعة منخفضة من كل BBS MO والتحكم MO (125 μ M لكل منهما). التركيز النهائي من المنظمات الأعضاء حقنه في أي الجنين في هذه التجربة كانت دائما ثابتة (250 μ م).

تحليل KV

والحويصلات في الأجنة التي يبلغ قطرها أقل من ثلث أن من النوع البري يعتبر انخفاض وتم سجل الأجنة التي الحويصلات لا يمكن تحديد شكليا كما تغيب. تم تصوير الأجنة الحية مع زايس Axiocam على المجسام.

فحص النقل جسيم ميلانيني

تعرض يوم 5 اليرقات إلى ادرينالين (50 ملغ / مل، سيجما، E4375) تضاف إلى الجنين المتوسطة (64) لتركيز النهائي من 500 ميكروغرام / مل. تم رصد جسيم ميلانيني تراجع باستمرار تحت المجهر وسجل نقطة النهاية عندما كانت جميع الأجسام الصباغية في الرأس والجذع محيط بالنواة.

إنقاذ النمط الظاهري ضربة قاضية

وsubcloned مقاومة للMorpholino BBS RNA إلى pCS2 + ناقلات التعبير (65). وقدم RNA الاصطناعية مع mMessage mMachine (AMBION). مرنا (50 نانوغرام / ميكرولتر bbs1 و 100 نانوغرام / ميكرولتر bbs7 كان) شارك في حقن MO المناسب.

جبل بأكمله، في الموقع التهجين من SHH في براعم الزعانف الصدرية

الأجنة، وتعامل مع الصباغ المانع في 12 HPF، كان المثقف إلى 42 HPF وثابتة مع بارافورمالدهيد 4٪ / الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). SHH تم توليفها تحقيقات RNA (روش) من القوالب خطي، العقاقير (digoxigenin-UTP جمعية مهندسي البترول I ، T7 RNA البلمرة) والمعنى (ليس أنا، البلمرة SP6 RNA). جبل بأكمله، في الموقع التهجين أنجز كما وصفها الين وآخرون. (16). مجال SHH تم قياس التعبير عن الرأي 1.37v يماغيج (47). الطالب ر استخدمت -test افتراض عدم المساواة التباين لتقييم فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط ​​مساحة SHH التعبير (P <0.001). تم تصوير الأجنة في 50 × التكبير.

الغضروف تلطيخ

تم إجراء الغضروف تلطيخ كما هو موضح في تايلور وفان دايك (66). لفترة وجيزة، اليرقات في 6 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) كانت ثابتة بين عشية وضحاها مع بارافورمالدهيد 4٪ / برنامج تلفزيوني، المجففة تدريجيا مع الايثانول المطلق وملطخة بين عشية وضحاها مع الألسيان الأزرق (30 ملغ في 8: 2 الايثانول: حامض الخليك الجليدي). واليرقات ثم ابيض مع 1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم (1 M) / 3٪ بيروكسيد الهيدروجين، مسح مع 0.5٪ trypsine / المشبعة tetraborate الصوديوم، ودرجة الحموضة 9.1، لمدة 2 ساعة والمخزنة في 7: 3 الجلسرين: (1X) PBS. تم تصويرها يتصاعد الغضروف في 50 × التكبير.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #7  
قديم 11-23-2015, 09:05 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي المتناقضة آثار الأوعية الدموية الناجمة عن فقدان بارديه-بيدل الجينات متلازمة

 

http://ajpheart.physiology.org/content/299/6/H1902.full



متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي، اضطراب وراثي جسمي مقهور غير المتجانسة وراثيا يرتبط مع العديد من المظاهر السريرية بما في ذلك السمنة وارتفاع ضغط الدم، والتشوهات القلبية الوعائية. البروتينات BBS تلعب دورا مهما في وظيفة الأهداب، وعضية ميكانيكية حسية في الخلايا البطانية، ولكن إذا كانت هذه البروتينات يشاركون مباشرة في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية غير واضحة. هنا، وتبين لنا أن الجينات BBS (12/01) ويعبر عنه في خطوط البطانية وسلس الخلايا العضلية والأنسجة المخصب في البطانية (الرئة) والعضلات الملساء (المعدة) خلايا فضلا عن الشريان الأبهر. وبعد ذلك، كنا حلقات الأبهري لدراسة وظيفة الأوعية الدموية من نموذجين الماوس BBS أن ألخص النمط الظاهري البشري، وهي Bbs2 - / - (السمنة وسوي ضغط الدم) وBbs6 - / - (السمنة وارتفاع ضغط الدم) الفئران. ومن المثير للاهتمام، تم تعزيز الاسترخاء التي تعتمد على البطانة (الناجم عن ACH) بشكل كبير في Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران. في المقابل، كان الاسترخاء-البطانة المستقلة (الناجم عن نتروبروسيد الصوديوم) دون تغيير في كلا النموذجين الماوس BBS. وبالإضافة إلى ذلك، تم الموهن الردود مقلص إلى السيروتونين وendothelin-1 في Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران. من المذكرة، وupregulated الانزيمات NO-إنتاج (أنوش وiNOS) في الشريان الأورطي من Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران. من ناحية أخرى، انخفض مستوى التعبير عن مفارز غشاء أوكسيديز NADPH (P22 P47 phox وphox) في الشريان الأورطي في Bbs2 - / - الفئران ولكنه زاد في Bbs6 - / - الفئران. في الختام، وهذه البيانات تورط الجينات BBS في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية وتبين أن تعطيل Bbs2 وBbs6 الجينات تؤثر بشكل مختلف على وظيفة الأوعية الدموية.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو اضطراب غير المتجانسة وراثيا تتميز السمنة، والإعاقة، polydactyly، تشوهات الكلى، قصور الغدد التناسلية، واعتلال الشبكية (تعلم 34). ارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب والشرايين هي أيضا مشتركة في المرضى الذين يعانون BBS (20). نتائج BBS من الطفرات في جينات عديدة، 12 صفها حتى الآن، أن البروتينات ترميز التي تعتبر بالغة الأهمية لبنية ووظيفة أهداب (33). وتمشيا مع هذا، الحفظ جدا تم العثور على homologs من البروتينات BBS في الكائنات مهدبة ولكن ليس في الأنواع nonciliated (19، 22). بالإضافة إلى ذلك، عرضت منتجات الجين BBS لتوطين للأقمار الصناعية مريكزي من centrosomes والهيئات القاعدية للأهداب الابتدائي حيث تتفاعل مع مكونات الآلات النقل داينين ​​النقل intraflagellar (17، 30).
توفر الدراسات الحديثة خيوط مهمة حول كيفية تشارك البروتينات BBS في وظيفة الهدبية ولماذا الطفرات في الجينات أي تقدم BBS على نفس النمط الظاهري. في الواقع، تم العثور على 7 BBS البروتينات (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9) لتشكيل مجمع الأساسية، والمعروفة باسم BBSome، الذي يعمل كوحدة التي تتوسط الاتجار البروتين / الحويصلة إلى أهداب (23) . من ناحية أخرى، 3 مثل chaperonin البروتينات BBS (BBS6، BBS10، وBBS12) تشكيل مجمع في تركيبة مع البروتينات chaperonin أخرى من CCT / TRIC الأسرة والتوسط جمعية BBSome (28).
وقد سمح تطوير نماذج حيوانية من BBS تقدما ملحوظا في فهم الدور المحدد للبروتينات BBS في الأنسجة المختلفة واكتساب المعرفة الآلية في الفيزيولوجيا المرضية لهذه المتلازمة. من المذكرة، ونماذج الماوس BBS يحمل المكونات الرئيسية من النمط الظاهري البشري بما في ذلك السمنة، تنكس الشبكية، وعجز عصبي (10، 13، 22، 24). نحن (10، 26) أثبتت أيضا أن Bbs4 - وBbs6 الفئران -null وارتفاع ضغط الدم، في حين Bbs1 M390R knockin وBbs2 الفئران خروج المغلوب لا.
تعطيل الجينات BBS في الخلايا العصبية يبدو أن تؤثر على غشاء توطين العديد من مستقبلات بما في ذلك مستقبلات هرمون الليبتين (4، 29). ونتيجة لذلك، وفقدان البروتينات BBS في الخلايا العصبية طائي يشوش الآليات التي تتحكم في توازن الطاقة مما يؤدي إلى السمنة (26، 29). من ناحية أخرى، تثبيط جينات BBS في أنسجة الشبكية يؤدي إلى mislocalization من رودوبسين، والتي تسبق الموت أفكارك من المستقبلات الضوئية في شبكية العين والضمور (24). وعلى الرغم من هذا التقدم، وهناك عدد كبير من أنواع الأنسجة والخلايا التي لا تزال تقوض دور البروتينات BBS.
الدور الرئيسي للجينات BBS في وظيفة الهدبية أدت بنا إلى افتراض أن البروتينات BBS يشاركون بشكل حاسم في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية. تم فحص الجينات BBS في خلايا العضلات الملساء البطانية وكذلك الأوعية الدموية. بالإضافة إلى ذلك، لتوضيح دور الجينات BBS في السيطرة على وظائف الأوعية الدموية، قمنا بتقييم آثار الأوعية الدموية حذف Bbs2 أو Bbs6 الجينات في الفئران.
المواد والأساليب

الأدوية والكواشف.

أدن تشافيز، نتروبروسيد الصوديوم (SNP)، تم الحصول عليها-23187 A بوكل، و5-HT من سيغما الدريخ ويذوب في محلول ملحي الفسيولوجية. تم توفيره من قبل جامعة ولاية ايوا الصيدلة البروستاغلاندين F 2α (فايزر صحة الحيوان PGF 2α ؛؛ Lutalyse). تم شراؤها Endothelin-1 (ET-1) من مختبرات شبه الجزيرة الكورية والذائبة في المياه المالحة الفسيولوجية. تدرج جميع التركيزات حيث أن التركيزات النهائية في غرفة الجهاز. كنا الأجسام المضادة ضد مفسفر البطانية سينسيز أكسيد النيتريك (الفوسفات-أنوش؛ Ser1177) ومحرض أكسيد النيتريك سينسيز (iNOS) كلا من خلية اشارة التكنولوجيا، مجموع أنوش (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية)، وβ-الأكتين (Abcam). تم شراؤها الأجسام المضادة أرنب الثانوي من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية. تم شراؤها تعزيز التوهج (ECL) مجموعة الكشف عن شكل أمرشام جنرال إلكتريك للرعاية الصحية. كان السلس الخلايا العضلية المتوسطة القاعدية والخلايا البطانية المتوسطة القاعدية من ونزا.

الحيوانات.

جيل من Bbs2 - / - وBbs6 - وصفت الفئران والتنميط الجيني سابقا (- / 13، 24). واستخدمت Littermate الفئران من النوع البري والضوابط. تم تغذية كل الفئران تشاو الماوس القياسية (LM-485؛ رئيس الوزراء Teklad مختبر الحمية) والمياه الإعلانية libitum. اجتمع الرعاية من الفئران المستخدمة في التجارب المعايير المنصوص عليها من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في مبادئها التوجيهية لرعاية واستخدام حيوانات التجارب. وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

الاستعدادات حلقة الأبهر.

تم إعداد حلقات الأبهري لقياس التقلص والاسترخاء كما هو موضح سابقا (5، 6). وباختصار، 4- لمن العمر 7-مو-Bbs2 - / - وBbs6 - / - أعطيت الفئران والضوابط littermate جرعة قاتلة من بنتوباربيتال (50-100 ملغ / الماوس الملكية الفكرية)، وتمت إزالة الشريان الأورطي الصدري بسرعة وتوضع في كريبس العازلة التي تحتوي على ما يلي: (في ملمول / لتر): 118.3 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل، 2.5 CaCl 2، 1.2 MgSO 4، 1.2 KH 2 PO 4، 25 NaHCO 3، 11 الجلوكوز. تم إزالة النسيج الضام والدهون المتبقية في البرانية، وقطع السفينة إلى أربعة متساوية، وقطع على التوالي من 4-5 ملم في الطول. علقت حلقات الأوعية الدموية في غرفة مخطاط العضل (موضوع سلك مخطاط العضل النظام النموذجي 610M؛ الدنماركي ميو التكنولوجيا) التي تحتوي على 5 مل من الاوكسيجين حل كريبس الحفاظ على 37 درجة مئوية. تم ربط الحلقات إلى محول القوة عن طريق اثنين من السنانير المدمج في الفولاذ لقياس التوتر متساوي القياس (التقلص والاسترخاء). وزاد التوتر يستريح تدريجي للوصول إلى التوتر النهائي من 0.5 غرام، وسمح للعصابات لكي تتوازن لمدة 45 دقيقة. هذه الكمية من الراحة التوتر هو الأمثل لتقلص في هذه الشرايين ونحن (5، 6) أظهروا سابقا. بعد precontraction الأولية (submaximally، 40-50٪ من الحد الأقصى) مع PGF 2α (10-50 ميكرومول / لتر) والاسترخاء مع أدن تشافيز (10 -4 M) وSNP (10 -4 M) لإنشاء النزاهة وظيفة كانت متشكلة السفينة، منحنيات الاستجابة للجرعة. تم التعاقد مع السفن submaximally مع PGF 2α كما هو موضح أعلاه. بعد أن تم التوصل إلى هضبة انكماش مستقرة، وقد تم الحصول على منحنيات الاستجابة للجرعة لأدن تشافيز وSNP (10 نانومتر إلى 0.3 ميكرومتر). تم فحص استجابة مقلص في الشريان الأورطي إلى ET-1 (0.1 نانومتر إلى 0.3 ميكرومتر)، بوكل (4-160 ملم)، و 5-HT (10 نانومتر إلى 0.3 ميكرومتر) بطريقة جرعة استجابة. أجريت كحد أقصى من خمسة منحنيات الاستجابة للجرعة لكل قطعة.

فحوصات الجينات التعبير.

تم فحص الجينات BBS في الماوس مثقف الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البطانية (BMVEC) والعضلات الملساء (BMSMC) الخلايا وكذلك في الشريان الأورطي والرئة والمعدة والبرية من نوع الفئران باستخدام معيار RT-PCR الفحص. كانت تزرع BMVEC وBMSMC (تم الحصول عليها من الدكتور ستيفن مور، جامعة أيوا) في بطانة الخلايا القاعدية والمتوسطة الخلايا العضلية الملساء المتوسطة القاعدية، على التوالي، كما هو موضح سابقا (9). تم الفئران الذين قتلتهم CO 2 اختناق، وتم تشريح الأنسجة، وتجميد فرضت، وتخزينها في -80 ° C. تم تنقية الحمض النووي الريبي مجموع من طريقة TRIzol من الأطباق 100 ملم من BMVEC وBMSMC أو من أنسجة 50 ملغ. تم تضخيم [كدنا التي كتبها الناسخ العكسي II (إينفيتروجن). واستخدمت الظروف PCR التالية: الخطوة 1، 95 ° C، 5 دقائق، الخطوة 2، 95 ° C، 30 ثانية، 55 ° C، 30 ثانية، 72 ° C، 1 دقيقة، 30 دورات، الخطوة 3، 72 ° C و 10 دقيقة. وقد أجريت في الوقت الحقيقي RT-PCR خارجا مع SYBR الخضراء (بيو راد) باستخدام بادئات هو مبين في الجدول 1. وتم تحليل العينات في 2٪ الاغاروز المواد الهلامية.

الجدول 1.
الاشعال PCR تستخدم للدراسات التعبير الجيني

النشاف الغربي.

Bbs2 - / - وBbs6 - / - والفئران والضوابط littermate (4-7 مو القديمة) قتل مع CO 2 الاختناق، وتمت إزالة الشريان الأورطي الصدري بسرعة. تم استخراج البروتينات التي المجانسة الشريان الأورطي في الأنسجة العازلة المحللة (50 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم MgCl 2، 1 ملم CaCl 2، 10 ملم ناف، 5 ملي EDTA، 1٪ تريتون X-100، 2 مم orthovanadate الصوديوم، وروش كوكتيل البروتيني قرص المانع). تعرض عينات البروتين ميكروجرام والعشرين لSDS-PAGE، electrotransferred على غشاء البولي فينيل الفلورايد، ثم بحث مع الأجسام المضادة الأولية في التخصصات التالية: الفوسفات-أنوش (Ser1177، 1: 1000)، أنوش (1: 1000)، iNOS ( 1: 1000)، وβ-الأكتين (1: 10000)، تليها الأضداد المضادة للأرنب الثانوي (1: 10000). وتصور التعبير البروتين مع ECL عدة الكشف.

تحليل البيانات.

وأعرب عن البيانات كما يعني ± SE. وتم قياس كمية البيانات لطخة غربية باستخدام NIH يماغيج. وقد استخدم SigmaStat (SYSTAT البرمجيات) لتحليل البيانات. لمنحنيات التركيز على الاستجابة، وإجراء المقارنات مع اتجاهين المتكررة تدابير ANOVA تليها اختبار توكي أو تي -test عند الاقتضاء. وتمت مقارنة البيانات المتبقية في اتجاه واحد يتبع ANOVA بواسطة توكي اللاحق الاختبار. P <0.05 اعتبر كبيرة.

النتائج

يتم التعبير عن الجينات BBS في الأوعية الدموية.

لمعالجة الدور المحتمل للجينات BBS في وظيفة الأوعية الدموية، ونحن أول اختبار ما إذا كان يتم التعبير عن الجينات BBS في الخلايا التي تشكل الأوعية الدموية (العضلات الملساء والخلايا البطانية). كما هو مبين في الشكل. 1، يتم التعبير عن الجينات 12 BBS مع شدة مختلفة في البطانية مثقف (BMVEC)، وكذلك العضلات الملساء (BMSMC) الخلايا. وأعرب عن هذه الجينات BBS أيضا بدرجات مختلفة في الأنسجة المخصب في البطانية (الرئة) والعضلات الملساء (المعدة) الخلايا وكذلك في الأوعية الدموية، والشريان الأبهر (الشكل 1).

تين. 1.
يتم التعبير عن الجينات BBS في الأوعية الدموية. تحليل التعبير عن الجينات 12 BBS أنشئت في البطانية الماوس الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ (BMVEC) والعضلات الملساء (BMSMC) الخلايا والبرية من نوع أنسجة الفئران بما في ذلك الرئة والمعدة، والشريان الأورطي عن طريق RT-PCR. M، العلامة.

التي تعتمد على البطانية الاسترخاء هو تغير تفاضلي في الفئران BBS.

لتوصيف دور الجينات BBS في السيطرة على وظيفة الأوعية الدموية، أجرينا دراسات الأوعية الدموية في الشريان الأورطي من Bbs2 - الفئران، والتحكم من النوع البري - / -، Bbs6 - /. من النوع البري تتزاحم من Bbs2 - / - وBbs6 - / - لم الفئران لا يحمل أي اختلاف، وبالتالي، تم الجمع بين واستخدامها كأداة الضوابط من خلال الدراسات وصفها هنا Bbs2 - / - وBbs6 - / - كانت الفئران السمينة كما هو مبين بسبب زيادة وزن الجسم وكتلة الدهون (التكميلي الشكل S1، وهي متاحة في ملحق البيانات على الانترنت في AJP-القلب والدورة الدموية موقع على شبكة الإنترنت علم وظائف الأعضاء). نحن (26) قد أظهرت في وقت سابق أنه في حين أن Bbs6 يعانون من السمنة المفرطة - / - هي ارتفاع ضغط الدم، والسمنة Bbs2 - / - هي سوي ضغط الدم.
/ - - أظهرت الفئران الاسترخاء تعزز إلى حد كبير إلى أدن تشافيز، ولكن كانت الارخاء القصوى لا يختلف مقارنة مع الضوابط البرية من نوع (حلقات الأبهري من السمنة سوي ضغط الدم Bbs2 الشكل 2 A.). زيارتها الفئران استجابة طبيعية لأدن تشافيز (- يعانون من السمنة ارتفاع ضغط الدم Bbs6 - / الشكل 2 A.). لاختبار إمكانية أن التعديلات في المستقبلات المسكارينية يمكن أن تسهم في استجابة توسيع الاوعيه الدمويه المعززة لأدن تشافيز، كنا الكمي RT-PCR لمقارنة مستوى التعبير، إلى النمط الفرعي مستقبلات المسكارينية (M 3 R) التي تتوسط آثار الأوعية الدموية من أدن تشافيز (2 ، 18) في الشريان الأورطي من BBS والسيطرة على الفئران. وتمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها، وزادت مستويات التعبير عن M 3 R بشكل كبير في Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران (التكميلي الشكل S2).

تين. 2.
مقارنة استرخاء الأوعية الدموية بين Bbs2 - / -، Bbs6 - / -، والفئران البرية من نوع التحكم (WT). توسع الأوعية إلى البطانية محددة الموسع أدن تشافيز (A)، حامل الأيون endothelial- وNO-محدد A-23187 (B)، والبطانية مستقلة NO نتروبروسيد الصوديوم المانحة؛ واختبار (SNP C) في حلقات الأبهري من Bbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران والبرية من نوع الضوابط littermate. * P <0.05 مقابل الفئران البرية من نوع (ن ≥ 8).

وعلى النقيض من ردود أدن تشافيز، والارخاء التي تعتمد على البطانة الناجمة عن حامل الأيون الكالسيوم A-23187 وتنخفض قيمته بشكل كبير في Bbs6 - / -، ولكن ليس Bbs2 - / - الفئران (الشكل 2 B). من ناحية أخرى، كانت الاستجابة الأبهر إلى التحفيز البطانة المستقلة (SNP) دون تغيير في كلا النموذجين الماوس BBS (الشكل 2 C) مما يدل على أن التغييرات في الارخاء التي تعتمد على البطانة ليست بسبب ضعف العضلات على نحو سلس.

وانخفض ردود مقلص بشكل ملحوظ في الفئران BBS.

لاختبار ما إذا كان يتم تبديل قدرة السفينة على العقد أيضا في الفئران BBS، قارنا تأثير العديد من المواد فعال في الأوعية على الشريان الأورطي من Bbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران والضوابط littermate. لافت للنظر، وحلقات الأبهري من Bbs2 - / - أظهرت الفئران استجابة مقلص الموهنة إلى حد كبير ET-1، السيروتونين (5-HT)، وبوكل (الشكل 3، A - C). وvasoconstrictions الناجمة عن بوكل تم أيضا مخففة بشكل كبير في Bbs6 - / - الفئران نسبة إلى البرية من نوع الضوابط ولكن أقل مقارنة مع Bbs2 - / - الفئران (الشكل 3 C). في المقابل، لم يكن هناك اختلاف في ردود الناجمة عن PGF 2α (الشكل 3 D) تشير إلى أن التغييرات في الردود مقلص انتقائية.

تين. 3.
توصيف مقلص الردود الأوعية الدموية في Bbs2 - / -، Bbs6 - الفئران، والتحكم من النوع البري - /. وقد يتسبب تقلصات في حلقات الأبهري من Bbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران والبرية من نوع الضوابط littermate استخدام منبهات التي تعتمد على مستقبلات بما في ذلك السيروتونين (5-HT؛ A)، endothelin-1 (ET-1؛ B)، و البروستاجلاندين F 2α (PGF 2α؛ D) أو كلوريد مستقبلات مستقلة المضيقة البوتاسيوم (بوكل، C). * P <0.05 مقابل البرية من نوع الفئران، † P <0.05 مقابل من النوع البري وBbs2 - / - الفئران (ن ≥ 8).

غياب تغييرات هيكلية في الأوعية الدموية للفئران BBS.

درسنا إمكانية أن التغيرات الهيكلية قد تساهم في إحداث تغييرات في تفاعل الأوعية الدموية في الفئران BBS. لهذا، قمنا بتحليل المقطع العرضي الأوعية الدموية المنطقة، القطر الداخلي والخارجي، وسمك الجدار من BBS السباتية الفئران. ومع ذلك، لم يكن هناك اختلاف كبير في كل من هذه المعايير بين Bbs2 - / -، Bbs6 - / -، والضوابط البرية من نوع (التكميلي الشكل S3).

المتناقضة التغيرات الجزيئية في الأوعية الدموية للفئران BBS.

للحصول على نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية التي تمثل تغيرات الأوعية الدموية في الفئران BBS، درسنا التعديلات المحتملة في مستويات NO-إنتاج الإنزيمات في الأوعية الدموية للفئران BBS. وبالنظر إلى أن أنوش تعتبر مصدرا رئيسيا للNO في جدار الأوعية الدموية، قمنا بقياس مستوى النشاط (الفسفرة Ser1177) من هذا الانزيم في الشريان الأورطي. كما هو مبين في الشكل. 4 A، مقارنة مع من النوع البري تتزاحم السيطرة، aortas من Bbs2 - / - أظهرت الحيوانات زيادة ملحوظة في مستويات الفوسفات-أنوش (تطبيع إلى إجمالي أنوش)، في حين Bbs6 - / - أظهرت الفئران فقط متواضعة (غير ذات دلالة إحصائية) زيادة. من المذكرة، وتطبيع الفوسفات-أنوش إلى بيتا الأكتين، بدلا من إجمالي أنوش، أسفرت عن نتائج مماثلة (الفئران البرية من نوع السيطرة، 100 ± 9٪، Bbs2 - / - الفئران و 162 ± 9٪، وBbs6 - / - الفئران و 117 ± 13٪). بعد ذلك، قارنا التعبير (مستوى البروتين) من إنزيم آخر لإنتاج NO، iNOS، بين BBS والسيطرة على الفئران. كان مستوى iNOS أكبر بكثير (~4 أضعاف) في aortas من Bbs2 - / - ولكن ليس Bbs6 - / - الفئران (الشكل 4 B.). هذا upregulation في الأنزيمات المنتجة للNO في Bbs2 - / - يتسق مع ارتخاء وعائي مبالغ فيه أدن تشافيز التي يسببها في هذا النموذج الماوس.

تين. 4.
مستوى التعبير عن NO-إنتاج الإنزيمات في الشريان الأورطي من Bbs2 - الفئران، والنوع البري السيطرة littermate - / -، Bbs6 - /. تم قياس مستويات مفسفر البطانية سينسيز أكسيد النيتريك (ف أنوش) وأنوش (A) ومحرض أكسيد النيتريك سينسيز (iNOS) وβ-الأكتين (B) من خلال لطخة غربية. وأظهرت لطخة غربية تمثيلية على القمة، ونتائج القياس الكمي في القاع. * P <0.05 مقابل الفئران البرية من نوع (ن ≥ 6). الاتحاد الافريقي، وحدات التعسفي.

الاكسدة هو العامل المسبب هاما من الخلايا البطانية ويعتقد أن تلعب دورا رئيسيا في حدوث ومضاعفات متلازمة الأيض (1، 12، 27). لذلك، قمنا بتقييم التعبير (مستوى البروتين) مفارز غشاء أوكسيديز NADPH (P22 P47 phox وphox) في الشريان الأورطي من الفئران BBS. وتجدر الإشارة، في حين أن انخفاض التعبير عن phox P22 P47 وphox في Bbs2 - / - الفئران، وازداد التعبير عن هذه البروتينات بشكل كبير في Bbs6 - / - الفئران (الشكل 5.).

تين. 5.
مستوى التعبير عن مفارز غشاء NADPH أوكسيديز في الشريان الأورطي من Bbs2 - الفئران، والنوع البري السيطرة littermate - / -، Bbs6 - /. تم قياس مستويات البروتين من phox P22 P47 وphox في aortas لطخة غربية، وكان يستخدم بيتا الأكتين كما تحكم التحميل. وتظهر البقع الغربية ممثلة في الجزء العلوي، ونتائج القياس الكمي في القاع. * P <0.05 مقابل الفئران البرية من نوع (ن ≥ 6).

نقاش

وصفنا العديد من النتائج الجديدة في هذه الدراسة. لأول مرة، وتبين لنا أن يتم التعبير عن الجينات BBS في الخلايا العضلية البطانية وسلس، والأنسجة المخصب في هذه الخلايا، والشريان الأورطي. ثانيا، وجدنا أنه على الرغم من السمنة، ونماذج الماوس اثنين من BBS لا تظهر أي خلل في توسع الأوعية. في الواقع، فإن Bbs6 ارتفاع ضغط الدم - / - أظهرت ظيفة بطانة الأوعية الدموية العادية، في حين أن Bbs2 سوي ضغط الدم - / - نموذج أظهرت زيادة تعتمد على البطانية استرخاء الأوعية الدموية. الثالثة، حلقات الأبهري من كلا Bbs2 - / - وBbs6 - / - أظهرت الفئران انخفاضا كبيرا في الردود مقلص الناجمة عن مختلف المحفزات. وبشكل أكثر تحديدا، Bbs2 - / - أظهرت انخفاض استجابة مقلص إلى السيروتونين، ET-1، وبوكل، في حين Bbs6 - / - أظهرت انخفاضا كبيرا في الانكماش الناجم عن بوكل لكن أي تغييرات في الرد على ET-1. وأخيرا، وجدنا تغيرات متباينة في التعبير عن المسارات الجزيئية الرئيسية المشاركة في تنظيم الأوعية الدموية في الشريان الأورطي من Bbs2 - / - وBbs6 - / - الفئران. وتبين هذه النتائج أن Bbs2 وBbs6 الجينات تغير بشكل مختلف لهجة الأوعية الدموية في الفئران.
على الرغم من وجود السمنة في كلا النموذجين الماوس درس، Bbs2 - / - وBbs6 - / - أظهرت الفئران المتناقضة التغييرات الأوعية الدموية. ومع ذلك، فإن وظيفة بطانة الأوعية الدموية محسن (كما يتضح من تأثير ACH) وانخفاض ردود مقلص في Bbs2 - / - الفئران تتفق مع عدم وجود ارتفاع ضغط الدم في هذا النموذج الماوس (26). من ناحية أخرى، فإن التغيرات الوعائية وصفنا في Bbs6 - / - الفئران تتماشى مع وجود ارتفاع ضغط الدم في هذا النموذج. هذه التغيرات في تفاعل الأوعية الدموية يمكن أن تسهم في الفرق في الضغط الشرياني في هذه نماذج الماوس اثنين.
على غرار النتائج التي توصلنا إليها في الفئران، في البشر تم العثور على العديد من المورثات BBS بما في ذلك BBS6 أن تكون مصحوبة بارتفاع ضغط الدم إلا للمرضى الذين يعانون BBS2 الذين ما زالوا سوي ضغط الدم (20). بالإضافة إلى ذلك، المتغيرات من Bbs6، ولكن تم الإبلاغ عن لا Bbs2، الجينات لزيادة خطر ارتفاع ضغط الدم عند الأشخاص البدناء المشترك (3). وبالتالي توضيح الآليات التي تحمي بعض المرضى يعانون من السمنة المفرطة من تطوير الخلايا البطانية وارتفاع ضغط الدم كما هو الحال في BBS2 سيساعد فهم الفيزيولوجيا المرضية من تشوهات الأوعية الدموية المرتبطة بالسمنة وارتفاع ضغط الدم.
حددنا العديد من التغييرات الجزيئية التي قد تكون مسؤولة عن التغييرات الأوعية الدموية المتناقضة في الفئران BBS. وتبين لنا أن الشريان الأبهر من Bbs2 - / - الفئران تبدي مستويات التعبير العليا للسلالة مستقبلات المسكارينية (M 3) التي تتوسط استرخاء تعتمد على البطانة التي تسببها أدن تشافيز (2، 18). وتتوافق هذه النتيجة مع تعزيز توسع الأوعية أدن تشافيز التي يسببها في هذا نموذج الفأر. نحن أيضا تظهر زيادة مستويات أنوش الفسفرة في موقف Ser1177 في الشريان الأورطي من Bbs2 - / - الفئران. على الرغم من أن تنظيم النشاط أنوش معقد، ومن المعروف الفسفرة Ser1177 أنوش لتعزيز نشاط الإنزيم مما يؤدي إلى ارتفاع NO إنتاج (11، 15) Bbs2 - / - أظهرت الفئران أيضا كبير (~4 أضعاف) زيادة في التعبير iNOS في الشريان الأورطي. وذكر مرتفعة التعبير iNOS سابقا في الشريان الأورطي من الفئران التي يسببها النظام الغذائي يعانون من السمنة المفرطة (25). ملف تعبير عن NO-إنتاج الإنزيمات في Bbs2 - / - الفئران يمكن أن تسهم في تحسين وظيفة بطانة الأوعية الدموية وانخفاض ردود مقلص بوساطة مستقبلات في هذا النموذج الماوس. NO أمر بالغ الأهمية للاسترخاء الأوعية الدموية واعتبار كبير الاسترخاء عامل المستمدة من البطانة في الأوعية قناة مثل الشريان الأورطي (14، 32). الافراج عن NO من قبل البطانة الوعائية يتسبب في العضلات الملساء الوعائية للاسترخاء من خلال تفعيل ذوبان guanylate محلقة، وزيادة تركيز المركب، وتفعيل بروتين كيناز المركب التي تعتمد G، مما أدى إلى توسع الأوعية (21، 32). ومع ذلك، زيادة في iNOS مثل تلك التي لوحظت في الشريان الأورطي من Bbs2 - / - الفئران قد تعزز الالتهابات (7، 8). هذه حالة التهابات قد تعوض الآثار المفيدة من أعلى أنوش مما يؤدي إلى ضغط الدم الطبيعي في هذا النموذج الماوس.
مستوى التعبير من أوكسيديز NADPH، وهو الانزيم الأكسجين التفاعلية الأنواع المنتجة الرئيسية، هو عامل حاسم في وظيفة الأوعية الدموية (14، 16). من المذكرة، والأوعية الدموية NADPH أوكسيديز يبدو أن مصدرا رئيسيا لزيادة الاكسدة في السمنة (31). وجدنا أن مستوى التعبير عن مفارز غشاء أوكسيديز NADPH (P22 P47 phox وphox) في الشريان الأورطي وانخفض في Bbs2 سوي ضغط الدم - / - الفئران ولكنه زاد في Bbs6 ارتفاع ضغط الدم - / - الحيوانات.
ونحن ندرك العديد من القيود على دراسات الحالية التي تحتاج إلى معالجة. أولا، تم فحص وظائف الأوعية الدموية خارج الجسم الحي. ما إذا كانت التغييرات وجدنا باستخدام حلقات الأبهري المحافظة في الجسم الحي لا يزال يتعين تحديدها. وهناك حاجة إلى مزيد من الدراسات أيضا إلى تقييم أهمية تفاعل الأوعية الدموية للسيطرة على ضغط الدم في الفئران BBS. ثانيا، أجرينا فحوصات الجزيئية باستخدام RNA والبروتينات التي تم الحصول عليها من السفينة بأكملها. تتطلب مساهمات مختلف أنواع الخلايا التي تشكل السفينة إلى تغييرات نفيدكم مزيد من التحقيقات. ومع ذلك، أثبتنا أن يتم التعبير عن الجينات BBS في الخلايا التي تعتبر حاسمة للسيطرة على لهجة الأوعية الدموية (العضلات الملساء والخلايا البطانية). ثالثا، على الرغم من أن بعض التعديلات الجزيئية وجدنا يبدو متسقا مع اختلافات في تفاعل الأوعية الدموية وضغط الدم في اثنين من BBS نماذج الماوس، هناك حاجة لدراسات إضافية لربط وظيفيا التعديلات في التعبير عن أنوش، iNOS، ومفارز من NADPH أوكسيديز للتغيرات في تفاعل الأوعية الدموية وضغط الدم. وأخيرا، هناك حاجة لدراسات إضافية أيضا لتحديد الآليات التي فقدان Bbs2 وBbs6 الجينات تؤدي إلى المتناقضة التغيرات الجزيئية في الأوعية الدموية.
في الختام، البيانات المتوفرة لدينا توريط الجينات BBS في تنظيم نغمة الأوعية الدموية وتبين أن تعطيل Bbs2 وBbs6 الجينات تغير تفاضلي وظيفة الأوعية الدموية في الفئران. التغييرات الأوعية الدموية يمكن أن تسهم في المتناقضة آثار ضغط الدم الناجم عن الطفرات في هذه الجينات BBS.

GRANTS

وأيد هذا العمل من قبل القومي للقلب والرئة والدم المعهد منحة HL-084207. وأيد AM باير لجائزة NIH القومي للبحوث الخدمة (NRSA) زمالة أبحاث HL-07121. VC شيفيلد هو محقق من معهد هوارد هيوز الطبي.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #8  
قديم 11-23-2015, 09:09 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي العلاج الجيني يمنع الموت مبصرة ويحافظ على وظيفة الشبكية في متلازمة نموذج الفأر بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/108/15/6276.full


ملخص

المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) تجربة تنكس الشبكية الشديد نتيجة لعمليات النقل مبصرة ضعاف التي لا تزال غير مفهومة تماما. حتى الآن، لا يوجد علاج فعال لBBS المرتبطة تنكس الشبكية والعمى وشيك من قبل العقد الثاني من العمر. نحن هنا تقرير وضع الغدة المرتبطة الفيروسي (AAV) المتجه أن ينقذ رودوبسين mislocalization، ويحافظ على قضيب قطاعات الخارجي العادية، التي تظهر تقريبا، ويمنع موت مستقبلة للضوء في Bbs4 نموذج الفأر -null. تحليل مخطط كهربية على الموجة يشير إلى أن الخلايا قضيب انقاذ لا يمكن تمييزها وظيفيا من النوع البري قضبان. وتبين هذه النتائج أن العلاج الجيني يمكن أن تمنع تنكس الشبكية في النموذج BBS الثدييات.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) يتم تشخيص سريريا من خلال وجود أربعة على الأقل من العلامات التالية: ضمور شبكية العين، polydactyly، والسمنة، وصعوبات التعلم، قصور الغدد التناسلية الذكور، والشذوذ الكلوي (1). من هذه، والنمط الظاهري البصرية مدمر على وجه الخصوص: فإن متوسط ​​BBS المريض التقدم إلى العمى القانوني قبل له أو عيد ميلادها ال16. يوجد حاليا 15 المواضع الجينية (أون لاين الوراثة مندلية في مان # 209900) التي هي معروفة لتترافق مع BBS، وعلى الرغم من وراثة هذا المرض كان يعتقد مرة واحدة لمتابعة جسمية نمط المتنحية الكلاسيكية، وتشير الأدلة مؤخرا أن نمطا أكثر تعقيدا، ووصف "الميراث triallelic"، ويشارك في بعض مواضع BBS (2). وقد ظهرت أدلة فقط خلال العقد الماضي أن البروتينات BBS تلعب دورا في وظيفة الهدبية (3). وبشكل أكثر تحديدا، Bbs4 ومكونات BBSome أخرى يبدو أن تشارك في كل من تجنيد البضائع نحو الجسم الهدبي القاعدية (4، 5) والنقل intraflagellar على طول هدب (5 - +7). وتوضيح عدة تقارير الآليات التي تعطل بروتينات BBS تؤدي إلى الظواهر الفردية ينظر في هذه المتلازمة عديد المظاهر غاية (8 - 11).
تنكس الشبكية هو سمة أساسية من جميع النماذج BBS الماوس ولدت حتى الآن (8، +12 - 16). في قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية، وربط هدب هو بنية الهدبية درجة عالية من التخصص الذي يخدم كقناة الوحيدة من قطاع الداخلي إلى الجزء الخارجي. لأن تخليق البروتين يحدث الأقرب إلى الجزء الخارجي، رودوبسين والبروتينات البصرية الأخرى يجب أن يتم الاتجار بهن من خلال هدب ربط للوصول إلى موقع عملها في الجزء الخارجي. عبد البر وآخرون. (11) أظهر أنه عندما تم حذف Bbs4 في الفئران، رودوبسين ومخروط opsins أصبح mislocalized بشكل صارخ في قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية، على التوالي. وأعقب ذلك أفكارك الموت مبصرة وتدهور مخطط كهربية (أرج) موجات ب أ- و(14). وكشف تحليل التركيبية قضبان من الحيوانات الصغيرة التي تربط أهداب والهياكل القاعدية التي تظهر الجسم الطبيعي. هذا الاستنتاج الأخير له انعكاسات هامة على العلاج الجيني: لأن جهاز النقل الهيكلي يبدو أن تتطور بشكل طبيعي في خلايا مستقبلة للضوء Bbs4 -null، ونحن افترضنا أن مكملات ما بعد الولادة من الجين Bbs4 في قضبان شأنه انقاذ رودوبسين mislocalization ومنع قضيب الموت مبصرة.
لاختبار الفرضية لدينا، اخترنا فيروس الغدة المرتبطة-pseudotyped (AAV) كناقل التسليم. AAV المرغوب فيه ميزات كثيرة باعتباره الشبكية العلاج الجيني ناقلات، بما في ذلك المناعية منخفضة (17)، الكفاءة تنبيغ عالية (18)، والتعبير التحوير على المدى الطويل (19)، وtropisms محددة تعتمد على المصلي الخلوية (20). وعلاوة على ذلك، بيانات من ثلاث مراحل التاريخية الأولى من التجارب السريرية تشير إلى أن AAV ديه صورة ممتازة سلامة في البشر (+21 - 23). هنا، نحن تصف نتائج بوساطة AAV تسليم Bbs4 إلى قضبان من الفئران Bbs4 -null. وتوضح النتائج التي توصلنا إليها أن العلاج الجيني يمكن انقاذ رودوبسين mislocalization في هذا النموذج الماوس BBS والحفاظ العادي تقريبا قضيب التشكل الجزء الخارجي. وعلاوة على ذلك، معالجتنا يمنع الموت مبصرة، ويحسن وظيفة الكهربية من شبكية العين، ويحافظ على الاستجابات السلوكية أثار بصريا. وتشير هذه البيانات من نموذج الثدييات التي BBS المرتبطة تنكس الشبكية يمكن علاجها.
النتائج

تنكس الشبكية في Bbs4 -Null ماوس.

أجرينا دراسات تشريحية وظيفية في Bbs4 الفئران -null والنوع البري تتزاحم للحصول على القيم الأساسية قبل التجارب نجدتنا. في البرية من نوع شبكية العين، المناعى تلطيخ رودوبسين (الأحمر) مترجمة إلى منطقة الجزء الخارجي من المستقبلات الضوئية قضيب وكان غائبا تماما عن الطبقة النووية الخارجي (ONL) (الشكل 1 A، 8 أسبوع من العمر). تم العثور على رودوبسين أيضا في منطقة الجزء الخارجي من العمر المتطابقة Bbs4 -null (- / -) شبكية العين، ولكن هذا كان يرافقه mislocalized جزيئات رودوبسين التي تميل إلى تشكيل أنماط حلقية (الشكل 1 B. حول نواة مبصرة الفردي (، النصال) الأزرق). الشكل. 1 C يوضح الفقدان التدريجي للنوى مستقبلة للضوء في شبكية العين BBS، والبعض الآخر الذي قد أظهرت أن تحدث من خلال موت الخلايا المبرمج (11، 12). في 2 أسبوع من عمر - / - شبكية العين أظهر بالفعل دليل على فقدان مبصرة (سبعة إلى ثمانية نوى في العمود ONL) مقارنة مع + / + ضبط نفس العمر الذي كان 10-11 نوى سميكة فقط. الموت مستقبلة للضوء في - / - شبكية العين تقدما مطردا على مر الزمن، وظلت 1-2 فقط نوى في العمود ...... قل في 16 أسبوع. وكانت الشبكية أقصر وأكثر غير متجانسة من + / + شرائح الخارجي في أقرب نقطة زمنية بحثت وكانت لا يمكن التعرف عليها تماما من قبل 16 أسبوع - شرائح الخارجي في - /.

تين. 1.
رودوبسين mislocalization وتنكس الشبكية في الفئران Bbs4 -null. Immunolocalization من رودوبسين (الأحمر) في القديم 8-أسبوع-من النوع البري (A) وBbs4 - / - (B) شبكية العين. Topro-3 (الأزرق) يمثل نواة، والسلطة الوطنية الفلسطينية (الأخضر) يحدد الأغماد مخروط. النصال في B تشير مبصرات قضيب الذي يحمل رودوبسين mislocalized. وتوضح (C) Photomicrographs الفقدان التدريجي للخلايا مستقبلة للضوء في ONL من Bbs4 - / - شبكية العين، مع أقسام من النوع البري على طرفي للمقارنة. (D-F) التوهين من أرج يصاحب فقدان مبصرة. في 8 أسبوع، Bbs4 - / - (الأحمر) الاستجابات هي أصغر بكثير من النوع البري تتزاحم (الأسود) في شدة فلاش انتزاع إما قضيب فقط (D) أو مختلطة قضيب مخروط (E) ردود F هو تضخم عالية. نظرا لوجود موجة حواف الرائدة في اثنين من كثافات مختلفة، مع نموذج photoresponse تركيبها على البيانات (آثار المنقطة). شدة فلاش في سجل الاسكتلندي مؤتمر نزع السلاح * ق / م 2 هي -3.65، -2.93، -2.08، -0.89 و لD؛ 3.45 لE؛ 2.10 و3.45 لF. (أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر في A و B، و 10 ميكرون في C).

أجرينا ERGs لقياس وظيفة الشبكية في Bbs4 الفئران -null مع مرور الوقت. في جميع الأعمار وشدة فلاش فحصها، وسعة A و B موجة الموهن بشدة في - / - الفئران (آثار حمراء اللون) مقارنة مع + / + الضوابط (آثار سوداء). وأظهرت البيانات القديمة 8-أسبوع-تمثيلية للقضيب فقط (الشكل 1 D) والمختلط قضيب مخروط (الشكل 1 E) الاستجابات. لبالحدود وphotoresponses قضيب، أجرينا نوبة الفرقة من طراز photocurrent Cideciyan-جاكوبسون (24) ضد أرج البيانات على بعد موجة من اثنين من شدة فلاش مختلفة. الشكل. 1 F يظهر على الموجة الحواف الأمامية من ممثل - / - العين (يمين) الذي هو أقل في كل من السعة وحساسية مقارنة مع عنصر تحكم من النوع البري العين يقابل عمر (يسار) استجابة قضيب.

التعبير عن AAV الجينات المحورة.

وقد أظهرت التوصيف السابق من هذا نموذج الفأر أن مخروط أوبسين mislocalization شديد من قبل 2 أسبوع من العمر (11)، والموهن مخروط ERGs بنسبة 88٪ في 4 أسبوع (14). لهذه الأسباب، اخترنا لتوجيه جهودنا العلاج الجيني نحو إنقاذ مبصرات قضيب، والتي لها بالطبع أبطأ من انحطاط. كنا على بعد التكميلي النفس الغدة المرتبطة بفيروس pseudotyped (scAAV5) التي تحتوي على المروج الماوس أوبسين (MOP) لدفع تعبير قوي في قضبان (25). واستخدمت اثنين من بنيات الفيروسية في هذه الدراسة: فيروس تحكم يحتوي GFP (المشار إليه فيما scAAV5-MOP-GFP) وفيروس العلاجية التي تحتوي على الماوس Bbs4 الجينات مع علامة HA N-الطرفية (scAAV5-MOP-BBS4). في أيدينا، أدى حقن تحت الشبكية من 1.1 ميكرولتر من scAAV5-MOP-GFP إلى البرية من نوع الماوس العين في منطقة المترجمة من التعبير GFP (الشكل 2 A) التي تغطي 4.8٪ ± 1.1٪ من شبكية العين (يعني ± SEM ، ن = 6). كان تنبيغ من الخلايا قضيب داخل تلك المناطق فعالة للغاية، مع ما يقرب من 100٪ من الخلايا قضيب معربا عن GFP على مقربة من موقع الحقن (الشكل 2 B ط). في المقابل، مبصرات مخروط (النصال في الشكل 2 B ط، إشارة حمراء في الشكل 2 B كانت ب) معربا عن GFP الحالية ولكنها نادرة. وقد تم تحديد الأقماع عن طريق فحص المقاطع البصرية مسلسل من شبكية العين مسطحة شنت ملطخة-رودامين مترافق الفول السوداني راصة (PNA) (فيلم S1).

تين. 2.
التعبير التحوير بعد الحقن تحت الشبكية من AAV. (A) flatmount الشبكية 4 مو بعد الحقن scAAV5-MOP-GFP كشفت مترجمة التعبير الجيني فقط بالقرب من موقع الحقن. (شريط مقياس، 1 ملم.) (بي) متحد البؤر صورة من الجزء العلوي من ONL تظهر قضبان (الأخضر من GFP) والمخاريط (زنازين مظلمة تميزت السهام). وقد تم تحديد الأقماع التي تلطيخ رودامين-السلطة الوطنية الفلسطينية في المقاطع البصرية التسلسلية. (شريط مقياس، 10 ميكرون.) (BII) شرائح الداخلية ينتمون إلى ثلاثة مخاريط (PNA) هي الوحيدة التي لا تعبر عن GFP. (شريط مقياس، 5 ميكرون.) (C) تحليل لطخة غربية لعينة الشبكية حقن AAV تحمل بناء HA-Bbs4 يظهر الفرقة HA-مناعيا قرب 59 كيلو دالتون الذي هو غائب في العينة الضابطة uninjected. (D) بوساطة AAV Bbs4 التعبير يموضع في المقام الأول إلى قطاعات الداخلية والقطاعات الخارجية القريبة (النجمة)، في حين ينظر لا يوجد مثل هذا في تلطيخ الضوابط uninjected. (مقياس شريط 20 ميكرون) الحق: ويرد إشارة رودوبسين لتحديد نظام التشغيل / IS الحدود. أجريت جميع التجارب في ظاهريا الضوابط العادية (Bbs4 + / + أو Bbs4 +/-). Topro-3، وصمة عار النووية؛ السلطة الوطنية الفلسطينية، مخروط غمد علامة. OS، الجزء الخارجي؛ هو، الجزء الداخلي. اوبل، طبقة ضفيري الخارجي.

حقن لدينا scAAV5-MOP-BBS4 بناء إلى نجم الفضاء تحت الشبكية في واحدة الفرقة HA-مناعيا لطخة غربية (الشكل 2 C). وتقع هذه الفرقة، التي كانت غائبة في العينة الضابطة uninjected، في ≈59 كيلو دالتون، الكتلة الجزيئية المتوقع لBbs4 (UniProt # Q8C1Z7) مع علامة HA. لتحديد توطين التحت خلوية من البروتين الفيروسي Bbs4، أجرينا المناعية على المقاطع vibratome 40 ميكرون. تظاهر شبكية العين حقن scAAV5-MOP-BBS4 الفرقة واضحة لتلطيخ منقط HA-الإيجابي (النجمة) التي لم يكن ينظر في شبكية العين السيطرة uninjected (الشكل 2 D). وكانت هذه الفرقة من تلطيخ الأكثر كثافة في المنطقة الواقعة بين الجزء الداخلية نوى مبصرة (ONL) و-رودوبسين الغنية قطاعات الخارجي (الشكل 2D.، يمين). ولكن لوحظت بعض punctae على هامش القريبة من طبقة الجزء الخارجي. هذه البيانات متوافقة مع التعريب الأنسجة من البروتين الذاتية (4، 11)، وكذلك الملاحظات من تجارب زراعة الخلية التي BBS4 يمكن العثور عليها على حد سواء داخل هدب (5) وعلى الأقمار الصناعية مريكزي (4، 5).

إنقاذ رهودوبسن Mislocalization.

بعد إنشاء توطين التحت خلوية من الفيروسية Bbs4، نحن مصممون المقبل ما إذا كان لدينا الجين العلاج العلاج يمكن أن يمنع رودوبسين mislocalization. عولجت فئران Bbs4 القديمة اسبوعين -null عن طريق الحقن تحت الشبكية من scAAV5-MOP-BBS4 في hemiretina الزماني للعين واحدة. في 12 أسبوع من العمر، وقطعت أقسام ناظم البرد الأفقية التي تحتوي على المنطقة المعالجة الفيروس في النصف الصدغي من هذا الباب، والمنطقة ضابطة في النصف الأنف. وأشار المناعية أن نسبة خلايا مستقبلة للضوء مع الحلقي mislocalized رودوبسين تلطيخ (السهام) كانت أقل في المناطق المعالجة (الشكل 3 A) مقارنة مع المناطق غير المعالجة (الشكل 3 B). النسب المئوية في معاملة مقابل المناطق غير المعالجة لشبكية العين ثلاثة فحص (الشكل 3 C كانت) 0.30٪ مقابل 4.19٪ (P <0.0001)، 0.23٪ مقابل 1.58٪ (P <0.01)، وبنسبة 0.09٪ مقابل 2.30 ٪ (P <0.0001). تم إحصاء ما لا يقل عن 600 خلايا ...... قل في كل منطقة، وكان يحسب أهمية باستخدام اختبار χ 2 لجدول طوارئ 2 × 2.

تين. 3.
scAAV5-MOP-BBS4 ينقذ رودوبسين mislocalization ويعيد التشكل الجزء الخارجي. المعالجة (A) وغير المعالجة (B) مناطق نفس الشبكية تظهر اختلافات واضحة في نسبة خلايا مستقبلة للضوء مع رودوبسين mislocalized (السهام). إشارة حمراء مباشرة أسفل ONL تمثل سمة غير محددة تلطيخ هذه الأجسام المضادة (الشكل 1 A). نلاحظ أيضا أن ONL هو أكثر سمكا كبيرا في الشبكية المعالجة (A). الأحمر، رودوبسين؛ الأزرق، وصمة عار النووية Topro-3. (. أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر) (C) في كل شبكية العين ثلاثة درست في هذا العصر، وكانت النسبة المئوية للخلايا مستقبلة للضوء واظهار رودوبسين mislocalization أقل من ذلك بكثير في معاملة مقابل المناطق غير المعالجة (* P <0.01 **؛ P <0.0001؛ أهمية محسوبة بواسطة χ 2 الاختبار لجدول طوارئ 2 × 2). (D) الأقاليم من Bbs4 - / - شبكية العين تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 الواردة قطاعات الخارجية التي كانت مشابهة لافت للنظر في WT قطاعات الخارجي. في غير المعالجة السيطرة Bbs4 - / - شبكية العين، وقطاعات الخارجي لا يمكن التعرف عليها في 16 أسبوع من العمر. (شريط مقياس، 10 ميكرون). OS، الجزء الخارجي؛ هو، الجزء الداخلي. INL، طبقة النووية الداخلية.

كما أظهرت قطاعات الخارجي في Bbs4 شبكية العين -null التحسن بعد العلاج مع scAAV5-MOP-BBS4. تعامل - / - الفئران قتل في 16 أسبوع أظهرت بقع كثيفة، شرائح الخارجي متجانسة في hemiretina الزمانية قياس 20.7 ± 0.52 ميكرومتر في الطول (يعني ± SEM، ن = 12) (الشكل 3 D.، يمين). وكانت هذه مشابهة لمن النوع البري قطاعات الخارجي (الشكل 3D، يسار) في كل من المظهر وطول (22.6 ± 0.21 ميكرون، ن = 12). قطاعات الخارجي من دون علاج - / - شبكية العين، في المقابل، كانت متفرق، غير متجانسة، وقصيرة (13.1 ± 0.44 ميكرون، ن = 12) في 4 أسبوع والتعرف عليها في 16 أسبوع (الشكل 3 D.، مركز لليسار ويمين مركز).

مبصرة الإنقاذ.

لتحديد ما إذا كان العلاج الجيني يمكن أن يمنع موت الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية العين -null Bbs4، أحصينا عدد الأنوية المتبقية في الأعمدة الخلوية من ONL. الشكل. 4 يظهر كلتا العينين من - / - الماوس العلاج في 2 أسبوع وقتل في 16 أسبوع. تلقت العين اليسرى لحقن scAAV5-MOP-BBS4 الزمني، في حين أن العين اليمنى تلقت حقن scAAV5-MOP-GFP الزمني، وترك أجزاء الأنف كل من شبكية العين غير مصورة على أي فيروس. خرائط الحرارة من سمك فقط. t (الشكل 4 أ) تدل بوضوح على المنطقة المحلية في النصف الصدغي للعين اليسرى، حيث كان ONL أربع إلى ست نوى مستقبلة للضوء في السمك. هذه المنطقة تقابل بالضبط إلى جزء من شبكية العين تتعرض لفيروس Bbs4 العلاجي. مناطق لا يتلقى الفيروس العلاجي (أي النصف الأنف للعين اليسرى وكل شطر من العين اليمنى) قد شهد انحطاط لا هوادة فيه أن ترك طبقة مبصرة 1-2 فقط نوى سميكة. Photomicrographs (الشكل 4 B) من المواقع الخمسة المشار إليها في خرائط الحرارة توضح تناقض صارخ بين - / - شبكية العين مع وبدون العلاج العلاج الجيني. المناطق المعالجة (الأول والثاني) لديها ONL سمكا بكثير جنبا إلى جنب مع ما يقرب من المعتاد الظهور-شرائح الخارجي، في حين أن المناطق غير المعالجة (الثالث إلى الخامس) لديها ONL رقيقة متجانس وليس قطاعات الخارجي.

تين. 4.
العلاج مع scAAV5-MOP-BBS4 يمنع الموت مبصرة. (A) في 16 أسبوع، مبصرة البقاء على قيد الحياة وتقييمها من قبل طبقة النووية الخارجي (ONL) سمك في أقسام أفقية تحتوي على العصب البصري. خرائط الحرارة تشير إلى طبقة سميكة الخارجي النووية (الأحمر) في موقع الحقن scAAV5-MOP-BBS4، والطبقة النووية الخارجي رقيقة (الأزرق) في جميع المناطق الأخرى. (B) Photomicrographs من المعالجة (الأول والثاني) وغير المعالجة (من الثالث الى الخامس) مواقع مبين في A. (شريط مقياس، 10 ميكرون). وأصبحت قطاعات الخارجي في BII عازمة أثناء التثبيت وتظهر في المقطع العرضي. هو، الجزء الداخلي. OS، الجزء الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية.

كان نمط المترجمة سمك فقط. t في المنطقة تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 متناسقة عبر جميع شبكية العين فحصها. تضمين هذا حيوانين قتل في 12 أسبوع (التين. S1 و S2)، واثنين من الحيوانات قتل في 16 أسبوع (الشكل 4 والشكل S3)، واحد حيوان قتل في 45 أسبوع (الشكل. S4). كان هذا أقدم الحيوانات ذات أهمية خاصة لأن العين غير المعالجة الواردة على الإطلاق أي خلايا مستقبلة للضوء، في حين أن المنطقة الزمنية للعين المعالجة كان ستة إلى سبعة صفوف من خلايا مستقبلة للضوء في أنحف نقطة فيه.

تحسين وظيفي من الرؤية.

لتقييم وظيفة قضيب في شبكية العين -null Bbs4 بعد العلاج الجيني، أجرينا ERGs ومعلمات الردود على الموجة باستخدام المربعات الصغرى يصلح للphotocurrent نموذج Cideciyan-جاكوبسون (المعادلة 1). أنتج هذا التحليل اتساع (R كحد أقصى) والحساسية (σ) قيمة لوصف استجابة قضيب من كل عين. الشكل. 5 A يدل على البيانات الفعلية على الموجة (آثار الصلبة) في اثنين من كثافات مختلفة ومنحنيات المجهزة (آثار متقطع) لمدة 12 فالتر كالين من العمر - / - الفأر مع عين واحدة تعامل (يسار) ودون علاج البعض (يمين).

تين. 5.
تحليل ERG موجة بعد العلاج scAAV5-MOP-BBS4. (A) التمثيلية 12 أسبوع من موجة الحواف الأمامية وآثار نموذج المجهزة (الخطوط المنقطة) للتعامل (يسار) والتحكم (يمين) عيون Bbs4 - / - الماوس. (B) وعاد إجراءات تركيب نموذج السعة (R كحد أقصى) والحساسية (σ) معلمات للعيون اختبارها في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوع. وتظهر عيون الفردية رموز المفتوحة (الأزرق وscAAV5-MOP-BBS4، الأحمر وscAAV5-MOP-GFP أو أي حقن)، وتمثل الرموز شغل المتوسطات (أشرطة الخطأ = SEM). المتوسطات مجموعة مختلفة إحصائيا في 8 و 12 و 16 أسبوع (الجدول 1). وتظهر (C) متوسط ​​R ماكس واستخدمت القيم سيجما من B كمدخلات لنموذج photocurrent، وآثار الإخراج لكل نقطة من النقاط الزمنية الأربعة التي تم فحصها.

بعد العلاج في 2 أسبوع من العمر، وقد تم تحليل ERG على موجات في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوع. يتم عرض البيانات في الشكل. 5 B، مع كل من الفردية عيون (رموز فتح) ومتوسط ​​القيم (رموز شغل) هو مبين. في جميع نقاط الوقت الأربعة، وكان يعامل عيون (scAAV5-MOP-BBS4) في المتوسط ​​على حد سواء أعلى سعة وحساسية أعلى من عيون التحكم (scAAV5-MOP-GFP أو uninjected). كان الفرق بين عيون المعالجة والسيطرة صغير في 4 أسبوع لكن نما أوسع وصلت دلالة إحصائية عند كل نقطة زمنية لاحقة الثلاث (الجدول 1). أهمية خاصة هو حقيقة أن متوسط ​​حساسية العينين تعامل زاد فعلا من 12 إلى 16 أسبوع، لتصل إلى قيمة 3.80 ± 0.077 سجل الاسكتلندي مؤتمر نزع السلاح -1 م 2 ق -3 (يعني ± SEM، ن = 15). وكانت هذه القيمة يمكن تمييزها تقريبا من قيمة من النوع البري العمر المتطابقة من 3.83 ± 0.064 (ن = 6). قيم متوسط ​​R ماكس وσ من الشكل. 5 B تم استبداله في المعادلة 1 لإنتاج متوسط ​​حواف الموجة الرائدة لكلا الفريقين (الشكل 5 C) في جميع نقاط الوقت الأربعة (4 أسبوع يسار، 16 أسبوع اليمين). لاحظ أسرع الارتفاع الوقت وزيادة سعة المعالجة (الأزرق) يتتبع في جميع الأوقات. ومن المثير للاهتمام، وظل الفرق السعة بين المعالجة ومراقبة ثابتة نسبيا على مر الزمن، على الرغم من العمليتين انخفضت في السعة المطلقة (مناقشة).

الجدول 1.
مخطط كهربية على الموجة تحليل

أجرينا أيضا حركة العين استجابة (OKR) اختبار لتحديد ما إذا كانت المنطقة محدودة من شبكية العين الحفاظ كافية للحصول على رد السلوكية أثار بصريا. تم اختبار ما مجموعه تسعة الفئران (تتراوح أعمارهم بين 9-11 شهر)، بعد أن تلقى كل حيوان لحقن scAAV5-MOP-BBS4 أحادي في 2 أسبوع من العمر. كشفت التجارب الأولية في ظل ظروف ظلامية أن أربعة من تسعة عيون المعالجة يمكن أن انتزاع OKR إيجابي، في حين كان ينظر توجد مثل هذه الاستجابة لأي من أعين غير المعالجة المقابل. مزيد من الاختبارات السلوكية ويجري حاليا.

نقاش

نحن هنا تقديم دليل على أن العلاج الجيني يمكن أن تمنع بصمات مرضية الرئيسية التي توجد في شبكية العين -null Bbs4 (11، 13، 14). على وجه التحديد، والتعبير Bbs4 الفيروسي في المستقبلات الضوئية قضيب ينقذ رودوبسين mislocalization ويحافظ على قضيب قطاعات الخارجية التي تظهر صحية. يتم منع الموت مستقبلة للضوء في المناطق تلقي العلاج الجيني العلاج، في حين أن المناطق غير المعالجة تتحول بسرعة. نحن تأكدت هذه النتائج التشريحية التي كتبها تخطيط كهربية الشبكية والسلوك. أظهرت ردود قضيب أرج أكبر سعة وارتفاع حساسية في العينين تعامل مقابل الضوابط غير المعالجة، وكانت أثارت OKRs إيجابية من بعض العيون المعالجة ولكن لا علاج الضوابط. بشكل جماعي، وتشير هذه النتائج إلى أن العلاج الجيني هو نهج ممكنا لعلاج العمى في المرضى الذين يعانون BBS البشري. على أساس نجاحنا في استكمال هذا الجين Bbs4، يبدو من المرجح جدا أن أشكالا أخرى من BBS، وخصوصا تلك التي ترتبط جزيئيا إلى BBSome (5)، وسوف تكون أيضا أهدافا مناسبة للعلاج بالجينات. والشيء نفسه يمكن أن ينطبق على ciliopathies الشبكية الأخرى، بما في ذلك متلازمة حاجب، متلازمة جوبير، متلازمة العليا-لوكن، وبعض أشكال يبر كمنة خلقية (26). وعلاوة على ذلك، لأنه يعتقد السمنة في BBS أيضا أن يحدث بواسطة آلية البروتين mislocalization مماثلة تنطوي على مستقبلات هرمون الليبتين في الخلايا العصبية المهاد (9)، فمن الممكن أن بعض أشكال السمنة المتلازمات قد تكون أيضا المرشحين للعلاج بالجينات.
في أيدينا، أدى حقن تحت الشبكية من scAAV5-MOP-GFP في GFP التعبير بمتوسط ​​تغطية شبكية العين من 4.8٪ فقط. على الرغم من أن هذا هو أقل مساحة من وقدر الآخرين، حققنا مرتفعة للغاية قضيب تنبيغ داخل منطقة التغطية (تقترب من 100٪ قرب موقع الحقن) والأحداث السلبية التقليل الناتجة عن الإصابات الميكانيكية للأنسجة. كان نمط تغطية الفيروسي من المفيد لدراستنا: أنها قدمت الرقابة الداخلية مريحة عند دراسة المعالجة (الزمانية) وغير المعالجة (الأنف) مناطق أقسام الشبكية عرضية. وعلاوة على ذلك، لأن تنبيغ من الخلايا قضيب كان ما يقرب من 100٪ محليا وغائبة في المناطق البعيدة، وكانت آثار نسيجية للفيروس جلية واضحة. لأسباب سبق ذكرها، اخترنا الماوس أوبسين المروج أن نركز جهودنا على إنقاذ مبصرات قضيب. ونتيجة لذلك، أدى لدينا بناء الفيروسي العلاجية إلى تحسن واضح في نظام قضيب ولكن تحسين مخروط قليلا. ومع ذلك، ونظرا لأوسع نافذة الوقت العلاجية والمروج المناسب (+27 - +29)، وليس هناك سبب واضح لماذا لا يمكن أيضا أن أنقذ المخاريط. على عكس الفأر المستخدمة في هذه الدراسة، وBbs1 M390R ديه knockin عادية نسبيا مخروط أرج وظيفة في 11 أسبوع من العمر (16)، وبالتالي قد يكون نموذجا مناسبا للتقييم المستقبلي لإنقاذ مخروط.
على الرغم من أن دور الجزيئي الدقيق للBbs4 والبروتينات BBS أخرى في المستقبلات الضوئية ليست مفهومة تماما [انظر زغلول وKatsanis (30) لمراجعة]، والكثير من النقاط الأدب دورا في الاتجار داخل الخلايا البروتين والتعريب في المنطقة المجاورة لل الجسم الهدبي القاعدية. ملاحظتنا التعبير Bbs4 الفيروسي في الجزء الداخلي والجزء الخارجي القريب يتسق تماما مع هذه الفكرة. كان قادرا على عكس النمط الظاهري تنميط رودوبسين mislocalization ينظر في عدة نماذج BBS الماوس (ScAAV5-MOP-BBS4 11، 12، 15)، وكذلك نماذج الأخرى التي تم حذفها البروتينات الهدبية (31، 32). وليس من الواضح تماما ما إذا mislocalization رودوبسين في هذا النموذج هو نتيجة مباشرة لBbs4 حذف أو بالأحرى إهانة الثانوية الناجمة عن انحطاط مبصرة. هذا التمييز، ومع ذلك، لا تحدث أثرا يذكر لهذه الدراسة. تم العثور رودوبسين mislocalization أن تسبق الموت مبصرة أفكارك في Bbs2 - وBbs4 نماذج الماوس -null (11، 12)، وذلك على أساس لدينا وجدت أن عمليات الإنقاذ العلاج الجيني رودوبسين mislocalization، وكنا نتوقع تماما أن العلاج الجيني من شأنه أيضا أن يمنع الموت مبصرة . والواقع أن هذه القضية: أدى الحقن الموضعي للscAAV5-MOP-BBS4 في 2 أسبوع من العمر في المترجمة الإنقاذ مبصرة التي لا تزال قائمة حتى حتى بحثت نقطة زمنية مشاركة (45 أسبوع). على العكس، المناطق غير المعالجة تدهورت بشكل مطرد حتى بلغت خسائر مبصرة كاملة. ولذلك أنشأنا التي نافذة علاجية موجود في الماوس -null Bbs4 خلالها عملية مرض شبكية العين هو عكسها.
تحليل كامل الحقل أرج على الموجة باستخدام نموذج Cideciyan-جاكوبسون (24) أثبتت أن لديها حساسية بشكل ملحوظ في هذه الدراسة. دون الحاجة إلى استخدام تقنية أرج متعددة البؤر كنا قادرين على ملاحظة هامة للغاية (P <0.0001) تحسن في وظيفة قضيب الرغم من الحقن تحت الشبكية لدينا تغطي سوى 5٪ من شبكية العين. إمكانية أرج القرنية هي محصلة جميع التيارات خارج الخلية الشعاعية في العين، لذلك لدينا في فوج من العيون تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 افترضنا أن أرج يمثل تركيبة خطية من 5٪ الصحية (المعالجة) شبكية العين و 95٪ المنحطة (غير المعالجة) شبكية العين. السعة القصوى لالموجة، R كحد أقصى، ويرتبط إلى مجموع الظلام الحالي المتداول في قطاعات الخارجي في وقت ظهور ضوء (33)، وبالتالي من المتوقع أن ينخفض ​​في هذا النموذج الماوس كما تفقد قطاعات الخارجي بسبب وفاة مبصرة . لدينا بيانات على الموجة (الشكل 5 C) تبين أن R كحد أقصى في التعامل مع عيون انخفاض 4-16 أسبوع ولكن أكبر من R الحد الأقصى من أعين الرقابة غير المعالجة في كل نقطة زمنية. الأهم من ذلك، والفرق السعة بين المجموعتين التجريبية هو ثابت تقريبا. الفرق ثابت يشير إلى أن عيون المعالجة لديها عدد قليل من السكان انقاذ قطاعات الخارجية التي تبقى في صحة جيدة على مر الزمن (الشكل 4 B i و B II) والإسهام بشكل مطرد إلى والموجة. هذا، ومع ذلك، يتم فرضه على إشارة الخلفية الكبيرة القادمة من شرائح الخارجي غير الصحية التي تتدهور مع مرور الوقت.
معتمد لدينا الخطية الجمع الفرضية أيضا بالتغيرات في حساسية على الموجة (σ) على مر الزمن. شادي وآخرون. (34) خلصت من مرضى التهاب الشبكية الصباغي البشري الذي قضيب انحطاط أدى إلى تخفيض تدريجي من التضخيم تنبيغ، وهي كمية ترتبط ارتباطا وثيقا المعلمة حساسية عنها في هذه الدراسة. وتبين لنا أن حساسية قضيب في غير المعالجة Bbs4 عيون -null تنخفض مفردة النغمة 4-16 أسبوع. في عيون المعالجة، إلا أن انخفاض حساسية 4-12 أسبوع، تليها زيادة ملحوظة من 12 إلى 16 أسبوع. ومن المثير للاهتمام خاصة أن حساسية العين العلاج في 16 أسبوع هي مشابهة جدا لحساسية النوع البري عيون العمر المتطابقة. في سياق نموذجنا الجمع الخطي، وتشير هذه البيانات إلى أن القفزة في حساسية بين 12 و 16 أسبوع يمثل الاختفاء التدريجي لل95٪ قضيب صحي إشارة وهيمنة الناشئة من 5٪ الصحية (المعالجة) قضبان مع قضيب عادية نسبيا المعلمات phototransduction. ويؤكد الحفاظ على الاستجابات السلوكية أثار بصريا من أربعة من تسعة عيون يعامل كذلك إلى أن عدد سكان قضبان الوظيفية نجا نتيجة العلاج لدينا. والحقيقة أن أي الفئران التي عولجت عرضت هذه الاستجابات السلوكية مفاجئا، بالنظر إلى مساحة محدودة من المستقبلات الضوئية انقاذهم. مزيد من الدراسات جارية حاليا لربط تشريحية، الكهربية، والإنقاذ السلوكي على مستوى الفرد العينين.
من منظور تجريبي لدينا عامل التغطية المتوسط ​​من 5٪ في حقن الفيروس كان أكثر من كافية لمراقبة مصلحة التشريحية والوظيفية، وبالتالي التحقق من فعالية لدينا بناء الفيروسي. في النماذج الحيوانية الكبيرة، والتغطية الشبكية من 20-30٪ يمكن تحقيقه بسهولة عن طريق الحقن تحت الشبكية (35، 36). إذا ترجم إلى موضوع الإنسان، أن 30٪ تحتوي على تغطية منطقة البقعة الصفراء لديها القدرة على الحفاظ على حدة البصر العادي تقريبا. شرط هام للعلاج بالجينات، ومع ذلك، هو التشخيص الوراثي في ​​الوقت المناسب قبل حدوث الموت مبصرة واسعة النطاق. وتشير الدراسات السريرية أن من بين المرضى BBS1، نصف فقط سيكون حدة البصر من 20/60 أو أفضل في وقت التشخيص. يبدو أن الوضع يكون أسوأ بالنسبة لأولئك مع BBS10 (37، 38). وهذا يؤكد على أهمية الوعي BBS في طب العيون والمجتمعات طبية واسعة النطاق. نتائجنا هي خطوة مشجعة أولى نحو الحفاظ على الرؤية في المرضى الذين يعانون BBS، ولكن النجاح النهائي لمثل هذا العلاج يتطلب جهد تعاوني بين الباحثين والأطباء متعدية يقظة.

المواد والأساليب

التركيبات الفيروسية.

كامل طول كدنا] للماوس Bbs4 الجين (الانضمام لا. BC145771 تم الحصول عليها) من النظم البيولوجية فتح. تمت إضافة حاتمة العلامة HA (YPYDVPDYA) إلى N محطة من Bbs4، تليها ربط من HA- Bbs4 إلى البلازميد SC-MOPS500-hGFP في مكان hGFP. طريقة البلازميد ترنسفكأيشن باستخدام خلايا HEK293 كما هو موضح سابقا (39) تم استخدامه لإنتاج وتنقية scAAV2 / 5 ناقلات تحمل إما Bbs4 أو GFP. تم تحديد التتر الفيروسية التي كتبها في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح سابقا (40) وكانت 6.82 × 10 12 VG / مل لscAAV5-MOP-BBS4 و 3.64 × 10 12 VG / مل لscAAV5-MOP-GFP.

الحيوانات وتحت الشبكية الحقن.

تم إنشاؤها الفئران Bbs4 -null كما (هو موضح سابقا 8). وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في كلية بايلور للطب. وترد تفاصيل تقنية الحقن تحت الشبكية بطريق الصلبة في مواد SI وطرق.

الأنسجة وImmunoblotting.

تم تنفيذ طرق كما هو موضح سابقا (11) مع تعديلات طفيفة. كانت ملطخة أقسام المجمدة عشرة ميكرومتر مع 1: 1000 لمكافحة رودوبسين (استنساخ RET-P1؛ Neomarkers) ماب ودابي. لتحديد HA-BBS4، 1: تم استخدام 1000 التخفيف من مكافحة HA ماب (16B12 استنساخ؛ كوفانس). لالمجهر الضوئي، كانت ملطخة أقسام الإي بي 1 ميكرومتر مع الميثيلين الأزرق الفوكسين والأساسي. لخلق تمثيل خريطة الحرارة، تم تقسيم الصور الرقمية بشكل متساو إلى 32 مناطق في hemiretina. تم تحديد قيمة سمك لكل منطقة عن طريق حساب متوسط ​​ثلاث تهم من النوى الموجودة في عمود فقط.

اختبار الرؤية وظيفية.

تم تخدير الفئران عن طريق الحقن الملكية الفكرية من 51 ملغم / كغم من الكيتامين، 10 ملغ / كغ زيلازين، و 0.86 ملغم / كغم آسيبرومازين، وسجلت ERGs كما هو موضح سابقا (11). وعلى غرار A-موجة الرائدة الحواف باستخدام طريقة وصفها Cideciyan وجاكوبسون (24). لفترة وجيزة، تم تسجيل ERGs الظلام تكييفها استجابة لاثنين من ومضات مشرقة (2.10 و 3.45 سجل الاسكتلندي * CD * ق / م 2)، والمعادلة التالية كان يصلح لكلا منحنيات وقت واحد باستخدام المربعات الصغرى التقليل: حيث I هي شدة فلاش، R كحد أقصى، وأقصى اتساع الاستجابة؛ σ، والحساسية؛ ور، مرة بعد بداية التحفيز. مزيد من المعلومات حول المعادلة. 1، منحنى البرنامج المناسب، واختبار OKR يمكن العثور عليها في مواد SI وطرق.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #9  
قديم 11-23-2015, 09:14 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي بوساطة التفاعل جوهري البروتين البروتين وChaperonin بمساعدة الجمعية متسلسل من مستقر بارديه-بيدل متلازمة مجمع البروتين، وBBSome *

 

http://www.jbc.org/content/287/24/20625.full



الميزات عديد المظاهر من السمنة، وتنكس الشبكية، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الإدراك، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري وجدت في متلازمة بارديه-بيدل (BBS) تجعل هذا الاضطراب اضطراب نموذجا هاما لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في الأمراض الإنسانية المشتركة. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 16 جينات BBS، سبعة منها (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) رمز للبروتينات التي تشكل مجمع المعروفة باسم BBSome. وظيفة BBSome ينطوي على نشوء حيوي الغشاء الهدبي. ثلاثة جينات BBS إضافية (BBS6، BBS10، وBBS12) لديها تناظر لكتابة II chaperonins والتفاعل مع CCT / البروتينات TRIC وBBS7 لتشكيل مجمع يطلق عليه مجمع BBS-chaperonin. مطلوب هذا المجمع لBBSome التجمع. ولا يعرف الكثير عن هذه العملية وتنظيم تشكيل BBSome. استخدمنا الطفرات نقطة والأليلات فارغة من البروتينات BBS لتعطيل تجميع BBSome مما يؤدي إلى تراكم BBSome سيطة التجمع. التي تميز BBSome سيطة التجمع، وتبين لنا أن المجمع BBS-chaperonin يلعب دورا في الاستقرار BBS7. يتفاعل مع BBS7 BBS2 ويصبح جزءا من التجمع BBS7-BBS2-BBS9 المتوسطة ويشار إلى أن مجمع الأساسية BBSome لأنها تشكل جوهر BBSome. وأضاف BBS1، BBS5، BBS8، وأخيرا BBS4 حتى النخاع BBSome لتشكيل BBSome كاملة.
مقدمة

المجمعات الجزيئات، بما في ذلك الريبوسوم، و26 S proteasome و، مجمع المسام النووي، ومجمعات النقل intraflagellar، هي المسؤولة عن وظائف أساسية، مما أدى إلى اهتمام واسع في توصيف والعملية التي يتم تجميعها (1، -، 6 ). تنص على تجميع البروتين المعقد والمهم، إذا تقدير كما ينبغي وفي الوسائل التي يمكن أن خلايا تنظيم وظيفة. وعلاوة على ذلك، يمكن فهم أفضل التجمع بروتين معقد توفير نظرة ثاقبة الأمراض غير المتجانسة وراثيا وmultigenic ويحتمل أن توفر وسيلة جديدة للتعديل الدوائي من وظيفة، مما يؤدي إلى تصاميم دواء جديد.
الميزات عديد المظاهر من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) 4 بما في ذلك السمنة، تنكس الشبكية، polydactyly، تشوهات الكلى وضعف الإدراك، ارتفاع ضغط الدم، ومرض السكري جعل BBS باعتبارها نموذجا جذابا لتحديد الآليات الجزيئية المشاركة في الأمراض المشتركة (7، 8). حتى الآن، وقد تم تحديد 16 جينات BBS المسببة لل(9). سبعة من البروتينات BBS (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) وقد ثبت أن تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome (10). وظيفة BBSome ينطوي على نشوء حيوي الغشاء الهدبي من خلال Rab8 GTPase الصغيرة والبروتين التفاعل لها، Rabin8. وBBSome أيضا يتفاعل وراثيا مع مسار النقل intraflagellar لتنظيم نقل الإشارة الصوتية القنفذ (11). BBSome مفارز تحتوي على مجالات معروفة للتوسط تفاعلات البروتين البروتين. على وجه التحديد، BBS1، BBS2، BBS7، وBBS9 احتواء المجالات المروحة بيتا. BBS4 وBBS8 يحتوي على عدة tetratricopeptide تكرار المجالات. وBBS5 يحتوي على اثنين من المجالات تناظر pleckstrin. BBS3 / ARL6 (ADP-ribosylation مثل عامل 6) هو عضو في الفصيلة رأس من البروتينات ملزم GTP صغيرة ومطلوب من أجل توطين الهدبية من BBSome (12، -، 15). BBS6، BBS10، وBBS12 دينا نوع II تناظر chaperonin (16، -، 19). وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS6، BBS12، وBBS7 التفاعل مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل المجمع الذي سنشير فيما بعد باسم مجمع BBS-chaperonin. مجمع BBS-chaperonin يسهل BBSome التجمع (20). ولا يعرف سوى القليل عن عملية متسلسلة من تشكيل BBSome، وتنظيم هذه العملية، أو الانتقال من BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى BBSome. في الجسم الحي، وتوجد البروتينات BBSome بوفرة في مجمع BBSome بدلا من كونها في شكل فردي أو ضمن المجمعات الحرة أصغر (10)، مما يوحي بأن BBSome سيطة التجمع عابرة وقصيرة الأجل.
فهم عملية BBSome التجمع قد تساعد في تحديد المكونات الجزيئية الجديدة، والطفرات التي تسبب إما أو تعديل الظواهر BBS. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فهم عملية تشكيل BBSome قد توفر معلومات عن وظيفة فرعية فردية، وبالتالي توفير رؤى جديدة بشأن BBSome وظيفة. وعلاوة على ذلك، فإن توصيف BBSome التجمع توفر المقايسات خلية مقرها فعالة لتقييم الطفرات نقطة المحددة في المرضى. وأخيرا، فإن فهم عملية BBSome التجمع قد يؤدي إلى علاجات جديدة للالظواهر ذات الصلة BBS BBS و.
كنا مناهج متعددة لتحديد BBSome سيطة التجمع بما في ذلك إدخال طفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS إلى الفردية البروتينات BBS، والاستفادة من الفئران خروج المغلوب، واستخدام رني ضد الجينات BBS لعرقلة تشكيل BBSome. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن overexpressed مفارز BBSome المحددة التي أسفرت عن تجميع وتراكم سيطة BBSome متميزة. التي تميز هذه الوسيطة، علينا أن نبرهن على BBSome التجمع هو عملية أمر ينطوي على البروتينات مثل chaperonin BBS (BBS6، BBS10، وBBS12) والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين.

إجراءات تجريبية

للحصول على وصف مفصل لمواد وأساليب، انظر "المواد والأساليب". التكميلية
السكروز التدرج تجزئة

تعطلت الأنسجة التي كتبها TISSUEMISER (فيشر) في المخزن تحلل (1- PBS، 0.5٪ تريتون X-100 مع مثبطات الأنزيم البروتيني). تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 20 دقيقة. تم تحميل supernatants على التدرج السكروز 20-60٪. تم طرد التدرج في 100،000 × ز لمدة 14 ساعة باستخدام الدوار TH-660 الحرارية العلمية (أشفيل، NC). أخذت اثنين من كسور مائة ميكروليتر من أعلى وعجلت عن طريق الأسيتون البارد. وقد نسج عينات المترسبة في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة. حلت الكريات في SDS-PAGE عينة العازلة.

البروتيني حساسية الفحص

وهي lysed الخلايا العازلة في الفحص (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 50 م م بوكل، 10 م م CaCl 2، 10٪ الجلسرين). كمية متساوية من البروتينات كانت مختلطة مع 200 ميكروغرام / مل thermolysin في 4 درجة مئوية لمدة الأوقات المحددة، وردود الفعل أوقفهم إضافة EDTA لتحقيق تركيز النهائي من 10 م م.

النتائج

BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج ترناري الجمعية المتوسطة

وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBS7، التي هي جزء لا يتجزأ من BBSome، يتفاعل مع مجمع BBS-chaperonin (20). حقيقة أن جميع مكونات المجمع BBS-chaperonin هي بروتينات نوع chaperonin باستثناء BBS7 تشير إلى أن BBS7 قد تكون بمثابة ركيزة للمجمع BBS-chaperonin وأن يستقر من قبل المجمع. كيف يجعل BBS7 الانتقال من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع BBSome غير معروف حاليا. لمعالجة هذه المسألة، ونحن استخدام العديد من الطرق التي تؤدي إلى تراكم متميزة BBSome سيطة التجمع. وتتلخص الطفرات نقطة المستخدمة في هذه الدراسة في تكميلية الشكل. S1. عندما كنا بإفراط BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة T211I في الخلايا 293T، متحولة BBS7 T211I لديه قدرة انخفضت إلى التفاعل مع مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع WT BBS7 على النحو الذي يحدده المشترك مناعي باستخدام FLAG الأجسام المضادة. ومع ذلك، مناعي من BBS7 T211I يسحب إلى أسفل أكثر نسبيا BBS2 من البروتينات الأخرى BBSome (على سبيل المثال، BBS1 أو BBS4) (الشكل 1 أ)، مشيرا إلى أن هناك تفاعل ثنائي بين BBS7 T211I وBBS2 التي المحاصرين (لا تشرع في الخطوة التالية في التجمع).

الشكل 1.
BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية BBSome. A، و transfected BBS7 الموسومة FLAG تحتوي على طفرة نقطة (T211I) وWT BBS7 إلى خلايا 293T. وتم سحب كلا WT وBBS7 متحولة بنسبة الخرز FLAG. تم الكشف عن وجود غيرها من مفارز BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. B، غياب BBS2 يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS1، في حين أن فقدان BBS1 لا يؤثر على تفاعل BBS7 مع BBS2. C، الموسومة FLAG BBS5، BBS8 ، و transfected BBS9، وBBIP10 إلى خلايا 293T. تم immunoprecipitated البروتينات الموسومة (IP) من خلال حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز أخرى BBSome الذاتية عن طريق ويسترن صمة عار. D، كان يستخدم BBS9 رني لاسقاط الذاتية التعبير BBS9 في خط الخلية مستقرة التعبير عن FLAG-BBS2. وimmunoprecipitated وBBSome التي كتبها حبات FLAG، والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية.

لقد أوقفنا بجوار أسفل BBS2 لتحديد تأثير ذلك على BBSome التجمع. ضربة قاضية من BBS2 يقلل من جمعية BBS7 مع BBS1، في حين أن ضربة قاضية من BBS1 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2 (الشكل 1 B). هذا يدل على أن BBS2 وBBS7 قادرين على التواصل مع كل أخرى مستقلة من BBS1. ويتم الحصول على نتائج مماثلة تظهر التفاعل مستقر من BBS2 مع BBS7 مع الأنسجة من الفئران الطافرة التي تعبر عن شكل متحولة من BBS1 مع أرجينين لطفرة في الحمض الأميني ميثيونين 390 (Bbs1 M390) (الشكل 2 C). هذه النتيجة مزيد من يدعم فكرة أن BBS7 بربط BBS2 مستقل ملزمة لBBS1 والبروتينات BBSome أخرى. وانسجاما مع هذه النتيجة، BBS7 يتفاعل بقوة مع BBS2 وضعيفة مع BBS1 في المقايسات التفاعل البشرى (التكميلي الشكل S2 A).

الشكل 2.
أدرج BBS1 في BBSome قبل BBS4. A، البقع الغربية من لست] البروتين من WT وBbs1 M390R / M390R الفئران تبين أن غياب BBS1 لا يؤثر على الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين، في حين أن انخفاض مستويات البروتين BBS1 إلى حد كبير في عينات من Bbs1 الفئران M390R / M390R كما هو مبين بالسهم. ويعترف هذا الضد أيضا عدة فرق إضافية لا تغيير في كثافة بالمقارنة بين WT وBbs1 M390R / M390R الفئران، مشيرا إلى أن هذه العصابات هي غير محددة. B، تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs1 M390R الخصيتين يوضح أن معظم BBS4 يتم فصلها عن وsubcomplex تتكون من BBS2، BBS5، BBS7، BBS8، وBBS9. C، مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2 من البروتين لست] الخصيتين يدل على أن BBS4 يتم فصلها من subcomplex في غياب BBS1. هذه النتائج مشابهة لتلك التي تظهر من خلال تحليل الانحدار السكروز. D، مناعي المتبادل من الخلايا 293T transfected يوضح أن BBS4 التفكك من BBS1 M390R يرجع إلى انخفاض التفاعل بين BBS1 M390R وBBS4 مقارنة مع WT BBS1. E، رسم بياني للترتيب تسلسلي لل BBS1 وBBS4 إدماجها في BBSome.

المقبل، ونحن overexpressed BBS9 الموسومة FLAG في الخلايا 293T وتستخدم BBS9 لهدم مفارز BBSome الذاتية. مناعي من خارجيا أعرب النتائج BBS9 في مناعي كميات كبيرة من BBS2 وBBS7، في حين يتم سحب كميات صغيرة فقط من BBS1 وBBS4 أسفل في ظل هذه الظروف (الشكل 1 C). هذه النتيجة تشير إلى أن BBS9 يشكل مجمع الثلاثي مع BBS2 وBBS7. لمزيد من الدعم وجود مجمع الثلاثي BBS2-BBS7-BBS9، فإننا نهدم BBS9 التعبير باستخدام رني. ضربة قاضية من BBS9 لا يؤثر على جمعية BBS7 مع BBS2، مشيرا إلى أن التفاعل BBS7 / BBS2 لا يتوقف على BBS9. ومع ذلك، ضربة قاضية لBBS9 يقلل إلى حد كبير من جمعية BBS1، BBS4، وBBS8 مع BBS2 (الشكل 1 D).
وانسجاما مع هذه النتيجة، تشير الدراسات إلى التفاعل البشرى أن BBS2 يتفاعل مباشرة مع BBS7 وBBS9، في حين BBS7 وBBS9 لا تتفاعل مباشرة، بل تتفاعل إلا في وجود من BBS2 (التكميلي الشكل S2 B). نشير إلى مجمع الثلاثي يتكون من BBS2-BBS7-BBS9 كما المجمع الأساسية BBSome لأن هذا المجمع يبدو أن العنصر المركزي اللازمة لتشكيل BBSome كاملة.

BBS1 وBBS4 هل الوحدات الصغرى الطرفية من BBSome

وأظهرت دراساتنا التفاعل البشرى أن BBS9 يتفاعل مباشرة مع عدة وحدات فرعية BBSome بما في ذلك BBS2، BBS1، BBS5، وBBS8، وإنشاء BBS9 كما سقالة المركزية للBBSome (10). لتحديد الترابط الذي يتم إدراج مفارز BBSome أخرى في BBSome، ونحن استخدام الأنسجة من BBS فئرانا معدلة وراثيا ولدت في المختبر لدينا (21، -، 24). أظهر النشاف الغربي من أنسجة الخصية (الذي يعبر عن كميات كبيرة من البروتينات BBS) أن الفئران Bbs1 M390R / M390R انخفضت مستويات البروتين BBS1، ولكن الآخرين BBSome مفارز مستويات البروتين مماثلة لمستويات WT (الشكل 2 A). ويكشف تحليل الانحدار السكروز أن BBS1 M390R طفرة الزميلة عادة مع جميع البروتينات BBSome، باستثناء BBS4 (الشكل 2 B). ونأت معظم BBS4 من BBSome في Bbs1 M390R / M390R الأنسجة الماوس متحولة. لتأكيد هذه النتيجة، ونحن immunoprecipitated وBBSome الذاتية من Bbs1 M390R / M390R فئرانا معدلة وراثيا باستخدام الأجسام المضادة ضد BBS2. كما هو متوقع، BBS1 مفقود من مجمع جنبا إلى جنب مع BBS4 (الشكل 2 C).
للتأكد من أن BBS1 M390R البروتين الطافر يؤثر BBS4 إدماجها في BBSome، شاركنا transfected. Myc على الموسومة BBS1 مع الموسومة FLAG مفارز BBSome إلى خلايا 293T. BBS1 M390R البروتين الطافر قد تقلص إلى حد كبير التفاعل مع BBS4 (الشكل 2 D)، ولكن التفاعلات الطبيعية مع BBS9 وBBS2. معا، وهذه البيانات تشير إلى أن يتم تضمينها BBS1 في BBSome قبل BBS4 (الشكل 2 E). باستخدام نهج مماثل، علينا أن نظهر أن فقدان BBS4 لا يؤثر على إدماج مفارز BBSome الأخرى (بما في ذلك BBS1) في BBSome (الشكل 3، A و B)، مشيرا إلى أن BBS4 هو الوحيدات الماضية لتضاف إلى BBSome (الشكل 3 C).

الشكل 3.
ومن المرجح BBS4 الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome A، تحليل الانحدار السكروز من تشكيل BBSome في Bbs4 - / - الخصيتين لست] يدل على أن جميع مفارز BBSome أخرى لا تزال تشكل تعقيدا في غياب BBS4 B، مناعي باستخدام المضادة. BBS2 الضد من البروتين لست] الخصيتين إلى أن BBS4 هو الوحيدات الأخيرة لتدرج في BBSome. C، رسم بياني يبين ترتيب تسلسلي للBBS مكونات إدماجها في BBSome.

لتحديد ما إذا كان غياب البروتينات BBS أخرى يسمح جزئي BBSome التجمع، ونحن ترسيتها التعبير عن BBS5 وBBS8 باستخدام رني في الخلايا RPE1. بينت النتائج أن مفارز BBSome أخرى لا تزال تتضمن في BBSome في غياب BBS5، وكذلك في غياب BBS8 (25)، مشيرا إلى أن مثل BBS1، BBS5 وBBS8 تدرج بشكل مستقل في BBSome. وتتفق هذه النتائج مع البيانات التفاعل البشرى تبين أن BBS1، BBS5، BBS8، وBBS2 التفاعل مباشرة مع BBS9 (10).

BBS4 بربط PCM1 ويموضع لالجسيم المركزي / محيط بالمريكز الأقمار الصناعية المستقلة للBBSome الوحدات الصغرى أخرى

حقيقة أن BBS4 من بين مفارز الأخيرة لإدراجها في BBSome يضعه في موقف طيب للتفاعل مع البروتينات غير BBSome بما في ذلك الشحنات BBSome. وقد أثبتت دراسات سابقة أن BBSome تنتقل من السيتوبلازم إلى محيط بالمريكز الأقمار الصناعية ثم إلى أهداب. BBS4 يموضع لالجسيم المركزي / الأقمار الصناعية محيط بالمريكز ويتفاعل مع محطة C من PCM1 (10، 26). أهمية وظيفية لهذا التفاعل ليست واضحة. لتحديد ما إذا كان يتعين على التفاعل BBS4-PCM1 لتوطين الجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز من BBS4، تم WT-الموسومة GFP وشكلين متحولة من BBS4 (BBS4 G277E وBBS4 R295P) بشكل مستقل شارك transfected مع جزء C-محطة HA الموسومة من PCM1. كل من الطفرات نقطتين تعطلت تفاعل BBS4 مع PCM1 (الشكل 4 A). عندما transfected في الخلايا RPE1 الإنسان، سواء BBS4 G277E وBBS4 R295P تفقد القدرة على توطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز (الشكل 4 B). وتشير هذه البيانات إلى أن التفاعل BBS4 PCM1 مطلوب للBBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية.

الشكل (4).
مطلوب تدخل BBS4-PCM1 لBBSome لتوطين لالجسيم المركزي / قنوات فضائية محيط بالمريكز. A، BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل التفاعل بين BBS4 ومحطة C من PCM1. BBS4 (WT أو المسوخ) وHA الموسومة PCM1 C محطة و transfected المشارك في الخلايا 293T، وأجريت شارك في مناعي (IP) باستخدام الأجسام المضادة ضد HA وGFP الموسومة GFP. B، BBS4 الطفرات نقطة (G277E وR295P) تعطيل جسيم مركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية BBS4. أظهرت هو تلطيخ مناعي من GFP-BBS4 (WT والمسوخ) في الخلايا RPE1 transfected. γ-تويولين يستخدم (الأحمر) كعلامة centrosomal. C، و transfected الخلايا الأولية الكلى مع GFP-BBS4، وكانت الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل شارك في ملطخة γ تويولين. يمثل شريط 10 ميكرون.

لتحديد ما إذا كان يلزم BBSome سليمة لBBS4 لتوطين للأقمار الجسيم المركزي / محيط بالمريكز، ونحن transfected خلايا الكلى مثقف من BBS خروج المغلوب الفئران مع GFP-BBS4. غياب BBS2، BBS6، أو BBS7 لا يؤثر BBS4 الجسيم المركزي / محيط بالمريكز توطين الأقمار الصناعية (الشكل 4 C)، مشيرا إلى أن هذا التعريب هو سمة أصيلة من BBS4 مجانا (يحدث مستقلة عن BBSome). لمزيد من تميز التفاعلات BBS4، رسمناها المجال BBS4 التي تتفاعل مع PCM1 إلى N-380 محطة الأحماض الأمينية (التكميلي الشكل S3 A). الأحماض الأمينية N-المحطة 380 من BBS4 لا تحتوي على المجال الذي يربط مع BBIP10، وهو بروتين BBSome لا يتجزأ يربط المجمع من خلال BBS4 (27). وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن PCM1 يمكن أن تتفاعل مع BBIP10 فقط عندما BBS4 موجود (التكميلي الشكل S3 B).

BBS10 ينظم تفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / TRIC البروتينات لتشكيل مجمع BBS-Chaperonin

كما ذكر سابقا، وأظهرت الدراسات أن BBS7 تشكيل مجمع مع BBS6، BBS12، وCCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin (20). حقيقة أن BBS7 هو العنصر غير chaperonin الوحيد في مجمع BBS-chaperoinin تشير إلى أن BBS7 قد يكون الركيزة لBBS-chaperonin. وظيفة واحدة ممكنة من مجمع BBS-chaperonin هو استقرار BBS7. ويرتبط BBS10 مع هذا المجمع عند مستويات substoichiometric (أقل من نسبة 1: 1). وتشير هذه النتيجة إلى أن BBS10 ليس العنصر الهيكلي للمجمع BBS-chaperonin بل يلعب دورا في تنظيم تشكيل تعقيدا. للتحقيق في دور BBS10 في تشكيل معقد BBS-chaperonin، ونحن استخدام رني لاسقاط BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والتي هي بمثابة أداة ملائمة لمناعي للمجمع BBS-chaperonin. غياب BBS10 يقلل من تفاعل BBS6 مع TCPα وTCPβ، وهما CCT / البروتينات TRIC (الشكل 5 A). وعلاوة على ذلك، overexpression من BBS10 يعزز التفاعل بين BBS6 مع TCPα وTCPβ (الشكل 5 B). وتبين هذه النتائج أن BBS10 ينظم تشكيل مجمع BBS-chaperonin.

الشكل 5.
مطلوب BBS10 للتفاعل BBS6-BBS12-BBS7 مع CCT / البروتينات TRIC لتشكيل مجمع BBS-chaperonin. A، يستخدم BBS10 رني لاسقاط التعبير عن BBS10 في الخلايا 293T معربا عن FLAG-BBS6، والذي تم استخدامه لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7 وCCT / البروتينات TRIC للكشف عن وجود هذه البروتينات في المجمع. B، overexpression من BBS10 يسهل جمعية BBS6 مع CCT / البروتينات TRIC. وقد شارك في transfected-FLAG-BBS10 مع ناقلات فارغة أو Myc على-BBS6، وكان يستخدم Myc على الأجسام المضادة لهدم مجمع BBS-chaperonin. تم استخدام الأجسام المضادة ضد BBS7، TCPα، وTCPβ (وحدتين فرعيتين من البروتينات CCT / TRIC) للكشف عن هذه البروتينات في المجمع. IP، مناعي.

الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-Chaperonin يتم التنسيق مع BBSome كور تشكيل مجمع

لا يحتوي على شكل ناضج من BBSome BBS6، BBS12، أو CCT / البروتينات TRIC، مما يوحي يجب فصل هذه المكونات chaperonin من سيطة التجمع عند نقطة معينة. لتحديد متى يتم الافراج عن هذه المكونات من وسيطة التجمع، ونحن overexpressed FLAG الموسومة BBS6 في الخلايا 293T وimmunoprecipitated مع FLAG الأجسام المضادة. كما هو متوقع، مكونات معقدة BBS-chaperonin أخرى، فضلا عن BBS7 الذاتية وشارك immunoprecipitated جنبا إلى جنب مع BBS6 (الشكل 6 A). بالإضافة إلى ذلك، سحبت BBS6 أسفل بعض BBS2. ومع ذلك، فإن كمية BBS2 انزلوا كانت بالنسبة إلى BBS7 أقل من مبالغ BBS2 وجدت في BBSome (كما هو موضح من قبل إنزال BBSome مع BBS5). هذا يدل على أن التفاعل بين BBS2 مع BBS7 يقترن مع الافراج عن BBS6 وBBS12 من مجمع BBS-chaperonin (التكميلي الشكل. S4).

الشكل 6.
ويتم تنسيق الإفراج عن BBS7 من مجمع BBS-chaperonin مع تشكيل معقد BBSome الأساسية. وقد overexpressed A، FLAG-BBS6 في الخلايا 239T إلى سيطة فخ BBSome. نحن انزلوا BBS6 باستخدام الخرز FLAG والكشف عن مفارز BBSome الذاتية لطخة غربية. وقد استخدم FLAG-BBS5 كعنصر تحكم إيجابية، وكان يستخدم FLAG-GFP كما سلبي السيطرة. B، وoverexpressed مفارز BBSome الفردية في الخلايا 293T، وكانت تستخدم لتحديد جمعيات معينة مع CCT / البروتينات TRIC. BBS7 وBBS2 فقط قادرين على التواصل مع CCT البروتينات / TRIC. وقد استخدم FLAG-VHL كعنصر تحكم إيجابية. استخدمت FLAG-GFP وFLAG-BBS3 والضوابط السلبية. IP، مناعي.

التالي درسنا الافراج عن البروتينات CCT / TRIC من وسيطة التجمع. نحن overexpressed كل الوحيدات BBSome في الخلايا 293T وتحديد ما إذا كان أي الوحيدات BBSome يمكن immunoprecipitate أن التحويلات النقدية المشروطة / البروتينات TRIC. أظهر BBS2 وBBS7 المنسدلة قوية من CCT / البروتينات TRIC. أظهر BBS9 المنسدلة أقل نسبيا من البروتينات TRIC CCT / مقارنة مع BBS2 وBBS7 (الشكل 6 B). هذه النتيجة تشير إلى أن إدماج BBS9 لتشكيل يقترن مجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن BBS2 / BBS7 من CCT البروتينات / TRIC.

استقرار BBS2 يعتمد على تفاعله مع البروتينات الأخرى

لقد أثبتنا أن BBS2، BBS7، وBBS9 تشكيل مجمع الأساسية (الشكل 1). لتحديد أهمية هذا المجمع، درسنا مستوى البروتين من BBS2 في غياب BBS7 وBBS9، وكذلك في حالة عدم وجود مجمع BBS-chaperonin. غياب BBS7 يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين في أنسجة الخصيتين BBS2 من Bbs7 - / - الفئران. وعلاوة على ذلك، فإن غياب BBS6 (أحد مكونات المجمع BBS-chaperonin) في Bbs6 - / - نتائج الفئران أيضا إلى انخفاض كميات BBS2 (الشكل 7. A). لأننا لم يكن لديك Bbs10 الفئران خروج المغلوب، نحن نستخدم الخلايا الليفية الجلد من مريض البشري الذي هو متماثل لطفرة BBS10 المشتركة، c91fs95. ومن المتوقع أن تؤدي هذه الطفرة في الغياب التام للبروتين BBS10. في دراستنا، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الإنسان، وغياب BBS10 لا يؤثر على تشكيل أهداب (التكميلي الشكل S5)، على النقيض من التقرير السابق (28). ومع ذلك، فإن غياب BBS10 يخفض مستويات بروتين BBS2 (الشكل 7 أ) ويمنع تشكيل BBSome (التكميلي الشكل. S6).

الشكل 7.
وubiquitinated BBS2 والمتدهورة التي proteasome و. A، استقرار BBS2 يعتمد على مجمع الأساسية BBSome، فضلا عن مجمع BBS-chaperonin. البروتينات من BBS خروج المغلوب الأنسجة الماوس (الخصية) أو من تم فصل لست] الخلية SDS-PAGE رني المعالجة. كان يستخدم لمكافحة BBS2 الأجسام المضادة للكشف عن مستويات البروتين BBS2. B، BBS2 حساس لالبروتيني العلاج. أصيب الكلى مع اتش معربا عن FLAG-BBS2 - الخلايا الأولية من WT وBbs6 - /. كانت مختلطة كميات متساوية من البروتين الكلي مع البروتيني thermolysin في 4 درجات مئوية للمرة المشار إليه. مقارنة مع خلايا WT، BBS2 يحط أسرع في Bbs6 - / - الخلايا، مما يشير إلى أن BBS2 غير مستقر في ظل غياب BBS6 C، خلايا 293T وعولج FLAG-BBS2 الخلايا معربا عن مستقرة، مع MG132 proteasome والمانع. وimmunoprecipitated BBS2 (IP) من خلال حبات FLAG أو مكافحة BBS2 الأجسام المضادة، وتم الكشف عن BBS2 ubiquitinated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. D، HA-بتحول وكان transfected في الخلايا 293T، وimmunoprecipitated BBS2 الذاتية من قبل مكافحة BBS2 الأجسام المضادة. تم الكشف عن BBS2 Ubiquitinated من قبل مكافحة HA الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة لمكافحة بتحول. E، تم علاج الخلايا 293T مع 50 ميكروغرام / مل من سيكلوهيكسيميد (فروج) مع أو بدون 20 μ م proteasome والمانع MG132 أو MG115 لمدة 8 ساعات. تم الكشف عن BBS2 الذاتية في الخلية لست] بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS2.

وبعد ذلك، كنا رني في الخلايا RPE1 للحد بشكل فردي التعبير عن BBS9 (BBSome عنصر معقد الأساسية)، BBS12 وTCPβ (مكونات معقدة BBS-chaperonin). تخفيض كل من هذه البروتينات يقلل إلى حد كبير مستويات البروتين BBS2. في المقابل، فإن عدم وجود البروتينات BBSome العادي BBS4 أو BBS1 (باستخدام أنسجة من Bbs4 - / - وBbs1 M390R فئرانا معدلة وراثيا، على التوالي) لا تؤثر على مستويات البروتين BBS2 (الشكل 7. A). وتشير هذه البيانات إلى أن استقرار BBS2، وهو مكون من مجمع الأساسية BBSome، يتطلب مجمع BBS-chaperonin، فضلا عن العنصرين الآخرين من مجمع الأساسية BBSome (BBS7 وBBS9). وبالمثل، فإن استقرار BBS7 يتطلب مجمع BBS-chaperonin، وكذلك المكونات الأخرى اثنين من مجمع الأساسية BBSome (BBS2 وBBS9) (التكميلي الشكل S7).
لتحديد كيفية BBS-chaperonin الاستقرار التأثيرات المعقدة البروتين BBS2، ونحن المصابة Bbs6 - / - خلايا الكلى وخلايا الكلى WT مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. تم استخدام نفس تعدد العدوى لتصيب WT وBbs6 - / - خلايا الكلى، وكميات متساوية من البروتينات استخدمت في التحليل. مستوى البروتين BBS2 أقل في Bbs6 - / - الخلايا من الخلايا في WT (الشكل 7. B، 0 ')، بما يتفق مع الاستنتاج أن المجمع BBS-chaperonin مطلوب للBBS2 الاستقرار البروتين. البروتين BBS2 المتبقية في Bbs6 - / - الخلايا أكثر حساسية لالبروتيني thermolysin العلاج. عمر النصف من BBS2 في Bbs6 - / - الخلايا يتم تقليل ~3 أضعاف (4 دقيقة في خلايا WT مقابل 12 دقيقة في Bbs6 - / - الخلايا) (الشكل 7. B). ويتم الحصول على نتائج مشابهة عندما وإعادة تقديم FLAG-BBS2 إلى Bbs7 - / - خلايا الكلى (التكميلي الشكل S7.). وتشير هذه البيانات إلى أن مجمع BBS-chaperonin وBBS7 تلعب دورا في استقرار BBS2.

واليوبيكويتين-proteasome والمسار تشارك في BBS2 تدهور

للتحقيق في الآلية التي تتحلل BBS2 في الخلايا، درسنا ما إذا كان ينطوي على مسار بتحول-proteasome وفي هذه العملية. وubiquitinated كلا BBS2 أعرب خارجيا وأعرب عن التطور الطبيعي عند تحول دون proteasome والتي MG132 (الشكل 7 C). علينا أن نبرهن أيضا أن BBS2 الذاتية وubiquitinated حتى من دون تثبيط proteasome وعندما كنا overexpressed HA-بتحول في الخلايا 293T (الشكل 7 D). أسفرت علاج الخلايا 293T مع تخليق البروتين المانع سيكلوهيكسيميد في انخفاض مستويات البروتين BBS2. وزاد انخفاض مستويات البروتين BBS2 في الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد عندما يتم التعامل مع الخلايا المعالجة سيكلوهيكسيميد أيضا مع مثبطات proteasome وMG132 أو MG115 (الشكل 7 E). وتبين هذه النتائج أن BBS2 الحرة وubiquitinated وتدهورت قبل proteasome و.

BBSome الجمعية نموذج

واستنادا إلى البيانات الواردة أعلاه، نقترح نموذجا فيه أشكال BBSome في عملية متسلسلة أمر يساعده على حد سواء الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات BBSome، فضلا عن عدم BBSome-تشبه chaperonin البروتينات BBS (BBS6، BBS10 وBBS12) (الشكل 8). يتفاعل مجمع BBS-chaperonin مع BBS7 لتحقيق الاستقرار فيه. التحولات BBS7 من مجمع BBS-chaperonin إلى مجمع الأساسية BBSome، وهو مجمع يتألف من BBS7-BBS2-BBS9. ويرافق تشكيل مجمع الأساسية BBSome عن طريق إزالة مجمع BBS-chaperonin. الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين تعزيز إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يضاف BBS4 لاستكمال BBSome، وهي خطوة تتطلب وجود BBS1. مطلوب مجمع BBS-chaperonin لاستقرار الفرد من BBS2 وBBS7 البروتينات قبل هذه البروتينات المشاركة مع BBS9 لتشكيل مجمع الأساسية BBSome.

الشكل 8.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وchaperonin بوساطة التجمع متتابعة من BBSome. المعروضة هي المخططات من النموذج الحالي من أجل BBSome التجمع. واستقرت BBS7 من قبل BBS-chaperonin معقدة (BBS6-BBS12-BBS7-CCT) ويجعل الانتقال إلى مجمع الأساسية BBSome (BBS7-BBS2-BBS9). يتطلب هذا التحول BBS10. والجوهرية تفاعلات البروتين البروتين توجه إدماج BBS1، BBS5، وBBS8. يتطلب BBS4 BBS1 على أن تدرج في المجمع وغير الوحيدات مشاركة تضاف إلى المجمع.

نقاش

ارتفاع معدل انتشار السمنة، ومرض السكري، وتنكس الشبكية في عموم السكان يجعل دراسة BBS ذات الصلة سريريا تتجاوز تلك مع هذه المتلازمة نادرة نسبيا. في الواقع، وقد ارتبطت متغيرات جينية BBS مع كل من الطفولة وتعليم الكبار السمنة مشتركة في عدد السكان واحد على الأقل (29). وعلاوة على ذلك فهم الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية من BBS سوف توفر معلومات مفيدة تتعلق هذه الاضطرابات شيوعا. على الأقل مجموعة فرعية من وظائف فردية البروتينات BBS تعتمد على تشكيل BBSome، وهو مجمع متعدد فرعية مستقرة تتكون من BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8، BBS9، وBBIP10، وهو بروتين الذي الطفرات لم يتم بعد المتورطين في المرض. وقد تركزت الدراسات السابقة وظيفة BBSome على تحديد البروتينات أو الشحنات التي تتفاعل مع BBSome (14، 15، 26، 30، -، 32). هنا، نحن نقترب من الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية من BBS من وجهة نظر الجمعية BBSome. دراستنا يربط مباشرة مجمع BBS-chaperonin (تتألف من BBS6، BBS12، BBS7، وCCT / البروتينات TRIC) إلى BBSome، مجمعين تم تحديدها من خلال تحليل الكيمياء الحيوية.
الجوهرية تفاعلات البروتين البروتين وChaperonin مثل دليل BBS البروتينات أمر الجمعية BBSome

بشكل عام، والتجمع بروتين كبير المعقد هو عملية أمرت، عادة ما تتطلب خطوات وسيطة متعددة (1، 3، 5).غالبا ما يكون من الصعب تحديد طبيعة وسيطة التجمع بسبب طبيعتها العابرة ونصف الحياة قصيرة. يمكن ترتيب تجميع محدد من مجمعات البروتين يحتمل أن تلعب دورا هاما في تحديد طبيعة الظواهر الناتجة عن الطفرات في مكونات المجمع. في بعض الحالات، يمكن أن تحور في بروتين واحد من مجمع يؤدي إلى تراكم من تجميع وسيطة أن يحافظ على وظيفة متبقية أو مكسب من وظيفة، في حين أن النظام المختلفة التكوين يمكن أن يؤدي إلى انعدام تام التجمع وخسارة كاملة وظيفة.
في هذه الدراسة، طبقنا النهج وموارد متعددة لتوصيف BBSome سيطة التجمع. الطفرات نقطة في بروتينات معينة BBS، والطفرات فارغة تفتقر تماما بعض البروتينات BBS، والتدخل RNA للحد من مستويات البروتين BBS، وكذلك overexpression من مفارز BBSome محددة تؤدي إلى تراكم الخلايا من التجمع سيطة متميزة. وأملت الجمعية من BBSome من قبل الجوهرية البروتين البروتين التفاعلات بين البروتينات وBBSome ويسترشد أيضا من البروتينات BBS مثل chaperonin-BBS6، BBS10، وBBS12. التحليل البنيوي يكشف أن BBS1، BBS2، BBS7، وBBS9 احتواء المجالات المروحة بيتا، BBS4 وBBS8 يحتوي على عدة tetratricopeptide تكرار المجالات، وBBS5 اثنين من المجالات تناظر pleckstrin. هذه المجالات التوسط عادة تفاعلات البروتين البروتين. وأظهرت البشرى المقايسات المشترك مناعي أن BBS7 يتفاعل مع BBS2 وأن BBS9 يتفاعل مع BBS1، BBS2، BBS5، وBBS8. وقد تبين BBS1 للتفاعل مع BBS2 وBBS4. عملية التجميع BBSome تعكس هذه التفاعلات البروتين البروتين. البروتينات BBS مثل chaperonin (BBS6، BBS10، وBBS12) ضرورية في بدء الخطوة الأولى لتشكيل BBSome من خلال تشكيل مجمع BBS-chaperonin لتحقيق الاستقرار BBS7.

BBS2، BBS7، وBBS9 نموذج BBSome الأساسية مجمع

لدينا حددت الدراسة BBS2-BBS7-BBS9 بمثابة مجمع المتوسطة هاما في تجميع BBSome ناضجة. ويتم تنسيق تشكيل هذا المجمع الأساسية BBSome مع الافراج عن مجمع BBS-chaperonin من BBS7. تظهر وظيفة واحدة من هذا المجمع BBS-chaperonin أن يكون لتحقيق الاستقرار BBS7 قبل ارتباطه BBS2 وBBS9. غياب BBS2، BBS7، BBS9، أو أي من مكونات معقدة BBS-chaperonin يقلل من مستويات BBS2 وBBS7، في حين أن غياب أو تحور BBS1 أو BBS4 له تأثير ضئيل على BBS2 وBBS7 الاستقرار البروتين. تتحلل BBS2 المجاني من مسار بتحول-proteasome و. يغاز بتحول لBBS2 غير معروف حاليا.
BBS11 / TRIM32 هو يغاز E3 لعدة بروتينات بما في ذلك الأكتين وdysbindin (33، 34). طفرة معينة من P130S في عائلة واحدة تسبب الظواهر BBS (35). ومن المثير للاهتمام أن يتكهن بأن يغاز E3 المفترض لBBS2 قد يكون BBS11 / TRIM32.

تنظيم BBSome وظيفة

هناك العديد من الآليات المحتملة التي يمكن أن تحدث في تنظيم وظيفة BBSome. أحد الاحتمالات هو أن يحدث التنظيم بعد تجميعها BBSome تماما، وحركة BBSome في المقصورة، وظيفية الخلوية (أي ينظم، أهداب). سواء كانت إيجابية (RAB8) والسلبية interactors (LZTFL1) BBSome وقد تم تحديد (10، 25). ومع ذلك، وتنظيم التجمع هو أيضا احتمال وارد. وبناء على دراستنا، فإن تنظيم التجمع الأرجح أن يحدث على مستوى تشكيل مجمع BBS-chaperonin، على مستوى تشكيل مجمع الأساسية BBSome، و / أو على مستوى الإفراج BBS6، BBS12، والبروتينات CCT / TRIC من BBS7. ومن المرجح BBS10 عنصر تنظيمي رئيسي للمجمع BBS-chaperonin.

أهمية الفسيولوجية والسريرية BBSome الوسطيات: دور للBBSome الوسطيات الجمعية في BBS النمط الظاهري التغير

في ظل ظروف طبيعية، يبدو أن هناك بركة مجانية محدودة من مفارز BBSome الفردية مع الغالبية العظمى من مفارز يجري في BBSome الأشكال المعقدة. ومع ذلك، BBSome سيطة التجمع مثل مجمع الأساسية BBSome قد تشكل في ظروف مثل تلك التي تحدث عند وجود خالية أو نقطة طفرات معينة في المرضى الذين يعانون BBS. الظواهر من BBS تتفاوت تفاوتا كبيرا بين العائلات المختلفة وحتى داخل أفراد من نفس العائلة (الأفراد بنفس طفرة معينة) (36، -، 38). وتشير هذه الملاحظات إمكانية المعدلات الوراثية. يمكن أن يحدث تعديل النمط الظاهري عندما متغير متخالف في جين واحد يؤثر على مظهر المظهري من الجين المسبب للمرض آخر. لأن بعض الطفرات قد يؤدي إلى تراكم التجمع مستقر وسيطة، وجود وسيطة قد يفسر بعض الاختلافات المظهرية لوحظ بين مختلف طفرات الجينات BBS. مثال واحد للاهتمام هو النمط الظاهري ارتفاع ضغط الدم الذي يتجلى في Bbs4 - / - الفئران، في حين Bbs2 - / - الفئران ليس لديها ارتفاع ضغط الدم (39، 40). وعلاوة على ذلك، كما تم الإبلاغ عن الاختلافات الفسيولوجية بين المرضى BBS البشرية التي تسببها طفرات في الجينات BBS متميزة (37). والآلية التي قد تحدث هذا يتطلب مزيدا من التحقيق.
توضيح من الطريقة التدريجية التي يتم تشكيل BBSome يوحي بإمكانية نوع معين أشكال خلية من BBSome. وبعبارة أخرى، فإن حقيقة أن بعض البروتينات BBSome (على سبيل المثال، BBS1، BBS5، وBBS8) تضاف بشكل مستقل لمجمع المتوسطة مستقر يسمح لاحتمال أن BBSome التجانس موجود وأن أشكال غير متجانسة من BBSome قد يكون الأدوار الوظيفية في أنسجة معينة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
  #10  
قديم 11-23-2015, 09:18 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
  
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome وغيابها في الفئران النتائج في بارديه-بيدل الظواهر متلازمة وتشوهات انتقائية في غشاء الاتجار البروتين

 

http://jcs.biologists.org/content/126/11/2372.full



بارديه-بيدل متلازمة (BBS) هو اضطراب عديد المظاهر ومتخالف وراثيا تسبب بشكل مستقل من قبل العديد من الجينات (BBS1-BBS17). سبعة البروتينات BBS الحفظ جدا (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكيل مجمع المعروفة باسم BBSome، التي تعمل في نشوء حيوي الغشاء الهدبي. BBS7 على حد سواء وحدة فرعية فريدة من BBSome ويعرض التفاعل المادي المباشر مع BBS الثاني معقد، مجمع chaperonin BBS. لفحص وظيفة في الجسم الحي من BBS7، ولدت لنا Bbs7 الفئران خروج المغلوب Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لغيرها من الجينات BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، والسمنة، ventriculomegaly والعقم عند الذكور تتميز الشاذ axonemes الحيوانات المنوية سوطي. باستخدام أنسجة من Bbs7 - / - الفئران، وتبين لنا أن BBS7 مطلوب لتشكيل BBSome، وأن BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. على الرغم من أن BBSome بمثابة مجمع معطف للبروتينات الغشاء الهدبي، غير مطلوب BBS7 لتوطين بروتينات الغشاء الهدبي polycystin-1، مستقبلات polycystin-2، أو الطعم المر، ولكن غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات إلى الغشاء الهدبي، مشيرا إلى أن BBS7 تشارك في توطين محددة بروتين الغشاء لأهداب.
مقدمة

أهداب هي الهياكل القائمة على أنيبيب التي تمتد من سطح الخلية لمعظم خلايا حقيقية النواة. أنها تحتوي على مكونات فريدة غشاء الخلية منفصلة عن الغشاء البلازمي، وتصنف على أنها إما أهداب متحركة أو الأساسي (immotile). أهداب تلعب دورا مهما أثناء التطور وعلم وظائف الأعضاء في أنسجة البالغين. عيوب أهداب تؤدي إلى مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان ciliopathies يطلق التي تشمل dyskinesis الأساسي الهدبي، مرض الكلى المتعدد الكيسات، سحاف الكلية، جوبير syndome، متلازمة العليا-لوكن، متلازمة ميكل-جروبر، ORO-الوجه الرقمية متلازمة، متلازمة Alstrom، وBardet- متلازمة بيدل (BBS).
BBS هو اضطراب وراثي جسمي مقهور تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly، والتشوهات الكلى، والإعاقة ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك العيوب الثانوية بما في ذلك مرض السكري وارتفاع ضغط الدم التعلم. حتى الآن، تم الإبلاغ عن 17 جينات BBS أن يسبب اضطراب مستقل (عبد الستار وجليسون، 2011). على الرغم من أن الوظائف الخلوية من البروتينات BBS لا تزال غير مفهومة تماما، وقد كشفت الدراسات الوظيفية في الكائنات نموذج التي تشارك البروتينات BBS في وظائف الهدبية والنقل داخل الخلايا. في ايليجانس انواع معينة، يتم التعبير عن BBS الجينات في الخلايا العصبية المهدبة وتوطين للقاعدة الهدبية / المنطقة الانتقالية والمشاركة في IFT على طول الهدبية الخيط المحوري. bbs7 وbbs8 متحولة C. ايليجانس خطوط لها صبغة ملء العيوب، أهداب أقصر، وعيوب في النقل intraflagellar (IFT) (Blacque وآخرون، 2004). ضربة قاضية للتعبير عن BBS الجينات في نتائج الزرد في العيوب الحويصلة كوبفر، وفقدان أهداب سابقة لأوانها، وجسيم ميلانيني الوراء تأخير النقل (الين وآخرون، 2006). BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص انحطاط والسمنة الظواهر الشبكية ينظر في المرضى الذين يعانون BBS. وبالإضافة إلى ذلك، ذكر BBS فئرانا معدلة وراثيا تفتقر سياط الحيوانات المنوية (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛ Mykytyn وآخرون، 2004.؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). وتشير الدراسات البيوكيميائية أن سبعة من البروتينات BBS المعروفة (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8، و 9) تشكيل مجمع مستقرة المعروفة باسم BBSome (Nachury وآخرون، 2007). البروتينات BBS الأخرى بما في ذلك BBS6، BBS10، وBBS12 تشكل المجمع الذي ينظم BBSome التجمع (سيو وآخرون، 2010). واحدة من وظائف BBSome هو تعزيز أهداب نشوء حيوي الغشاء من خلال Rab8 GTPase الصغيرة وبمثابة مجمع معطف للاتجار الهدبية بروتين الغشاء (جين وآخرون، 2010.؛ Nachury وآخرون، 2007.).
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا ألخص معظم الظواهر BBS، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. على سبيل المثال، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران هي ارتفاع ضغط الدم، في حين Bbs2 - / - الفئران هي سوي ضغط الدم (رحموني وآخرون، 2008. Bbs3) - / - الفئران لها hydocephalus أكثر حدة وأقل بدينة من غيرها من الفئران BBS (تشانغ وآخرون، 2011). بما يتفق مع الدراسات الماوس، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر على حد سواء. وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011.؛. Kulaga وآخرون، 2004)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، الجينات BBS المختلفة قد تمتلك ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هي فريدة من نوعها من حيث أنه هو وحدة فرعية من BBSome ويتفاعل مباشرة مع جسديا مجمع chaperonin BBS. من أجل دراسة دور BBS7 في الجسم الحي، وتحديد ما إذا كان فقدان Bbs7 لديه أي الظواهر الفريدة المرتبطة بها، ولدت لنا Bbs7 بالضربة القاضية الفئران Bbs7 - / - أظهرت الفئران الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في آخر BBS فئرانا معدلة وراثيا بما في ذلك تنكس الشبكية، وعدم من سياط الحيوانات المنوية، والسمنة، وventriculomegaly. علينا أن نبرهن على BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين وما هو مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. والجدير بالذكر، وتبين لنا أن BBSome غير مطلوب للعالمي توطين الهدبية بروتين الغشاء. ومع ذلك، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

النتائج

جيل من الفئران Bbs7 باطل

BBS7 هي فريدة من نوعها بين البروتينات BBS لأنه جزء لا يتجزأ من BBSome ومكون من مجمع chaperonin BBS. للتحقيق في وظيفة في الجسم الحي من الجين Bbs7، ولدت لنا Bbs7 الفئران بالضربة القاضية جين عن طريق استبدال اكسون 5 مع كاسيت بالنيوميسين. هذا يؤدي إلى انزياح الإطار مما أدى إلى Bbs7 أليل فارغة (المواد التكميلية الشكل S1A). تم التحقق من عدم وجود Bbs7 مرنا من خلال تحليل RT-PCR RNA باستخدام معزولة عن Bbs7 - / - الخصيتين الماوس مع الاشعال داخل اكسون 5 (المواد التكميلية الشكل S1B.). وأكد عدم وجود بروتين BBS7 قبل الغرب النشاف (المواد التكميلية الشكل S1C).
أدى التزاوج من الزيجوت Bbs7 +/- 26٪ في Bbs7 + / + الفئران، و 55٪ الفئران Bbs7 +/-، و 19٪ Bbs7 - / - الفئران (ن = 387؛ P <0.05). تردد انخفضت من Bbs7 - / - وقد لوحظ في ذرية أخرى فئرانا معدلة وراثيا BBS وتشير إلى أن بعض Bbs7 - / - الفئران توفي قبل الولادة أو فترة ما حول الولادة.

Bbs7 - / - الفئران تصبح بدينة، تفتقر الخراجات الكلى ولا تتطور polydactyly

Bbs7 - / - الفئران هي الضعفاء عند الولادة، تزن أقل من تتزاحم بهم في 3 أسابيع من العمر، وسمنة على مر الزمن. بعد الفطام، Bbs7 - / - الفئران تبدأ في كسب المزيد من الوزن من النوع البري الفئران بسبب زيادة الاستهلاك الغذائي. قبل 12 أسبوعا من العمر، Bbs7 - / - الفئران (ذكورا وإناثا) تزن أكثر بكثير من تتزاحم سيطرتها، والخلافات أصبحت أكبر في الحيوانات الأكبر سنا. قبل 7 أشهر، من النوع البري الفئران هي 28.7 ± 2.8 جم مقابل Bbs7 - / - 41.1 ± 3.25 غ (P <0.05).
على الرغم من شذوذ الكلوي وpolydactyly هي السمات الأساسية للالظواهر BBS في البشر، ونحن لم نلاحظ الكيسات الكلوية أو polydactyly من الأطراف الأمامية أو hindlimbs في فئرانا معدلة وراثيا Bbs7، مما يشير إلى اختلاف الأنواع أو الاختلافات عتبة بين الماوس والبشرية.

Bbs7 - / - الفئران تبدي تنكس الشبكية وventriculomegaly

التحليل النسيجي للBbs7 العمر 4-8 شهرا - / - تظاهر عيون انحطاط كبير من القطاعات الداخلية والخارجية للخلايا مستقبلة للضوء وطبقة النووية الخارجي (الشكل 1A، B.). وقد لوحظ Ventriculomegaly في البطينات الجانبية والثالث من الدماغ كما رأينا في أقسام الاكليلية من Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - الفئران (الشكل 1C-F.). نحن أيضا لوحظ تخفيف من القشرة المخية وانخفاض في حجم الحصين والجسم المخطط. لم يلاحظ أي تشوهات جسيمة في المخيخ في Bbs7 فئرانا معدلة وراثيا أو غيرها من فئرانا معدلة وراثيا BBS (المواد التكميلية الشكل S2).

تين. 1.
Bbs7 - / -. ملطخة E-عرض الفئران مبصرة فقدان الخلية وventriculomegaly (A، B) H & القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - (B) عيون تظهر فقدان مبصرة الداخلي وشرائح الخارجي فضلا عن انحطاط الطبقة النووية الخارجي. PC، خلايا مستقبلة للضوء. (C-F) محايد الحمراء الملطخة 60-100 ميكرون سميكة أقسام الدماغ الاكليلية من النوع البري (C، E) وBbs7 - / - الفئران (D، F) تظهر البطينات الجانبية الموسع (*)، والظهرية الموسع البطين الثالث (رأس السهم العلوي والسفلي)، وانخفاض المخطط الإحضار (S) وقرن آمون (H)، وترقق القشرة المخية (CC). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 1 مم (C-F).

Bbs7 - / - الفئران لديها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ

منذ BBS هو مرض له علاقة أهداب، درسنا أهداب متحركة وأهداب الابتدائي في Bbs7 - / - الفئران. درسنا أهداب متحركة من طبقة الخلايا البطانة العصبية المبطنة للالبطينين عن طريق تلطيخ أقسام الاكليلية من العمر 3 اشهر من النوع البري وBbs7 - / - أدمغة فئران مع-α تويولين الضد ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة لمكافحة الأسيتيل كعلامات أهداب . مقارنة مع الضوابط، Bbs7 - / - أظهرت الفئران عددا كبيرا من أهداب انخفاض خلية بطانية عصبية وأهداب المتبقية هي أقصر (الشكل 2A، B).

تين. 2.
Bbs7 - / - الفئران لها أهداب متحركة غير طبيعي في طبقة البطانة العصبية في الدماغ (A، B) كشفت تلطيخ مناعي من البطين الدماغ خلايا البطانة العصبية باستخدام المضادة للالأسيتيل α تويولين (الخضراء) ومضادة للIFT88 الأجسام المضادة (أحمر) عدم وجود أهداب وأهداب قصيرة (السهم) في طبقة البطانة العصبية من Bbs7 - / - الفئران (A) مقارنة مع من النوع البري الضوابط (B). (C، D) تحليل TEM من المقطع الطولي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر القصير وانتفخ أهداب مع حويصلات في Bbs7 من العمر 3 اسابيع - / - الفئران (D) مقارنة مع عمرها 3 أسابيع تحكم من النوع البري (C). (E-G) تحليل TEM من المقطع العرضي للأهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ يظهر هيكل axonemal غير طبيعي في Bbs7 - / - الفئران (F، G) مقارنة مع السيطرة البرية من نوع (E). أشرطة النطاق: 50 ميكرون (A، B)؛ 0.2 ميكرون (C-G).

لمزيد من التحليل أهداب متحركة في طبقة البطانة العصبية في الدماغ، أجرينا تحليل TEM من العمر 3 اسابيع من النوع البري وBbs7 - أدمغة الفئران - /. أهداب متحركة من Bbs7 - / - الدماغ طبقة البطانة العصبية لديها القصير، انتفخ أهداب مع حويصلات (الشكل 2C، D.) وتلك أهداب متحركة أيضا هياكل axonemal المعيبة (الشكل 2F، G.) بالمقارنة مع النوع البري الضوابط (الشكل. 2E). وتشير هذه الدراسات إلى أن غياب البروتين BBS7 يؤثر هياكل أهداب متحركة.
لدراسة أهداب الأساسي في الجسم الحي، ونحن ملطخة أقسام الأنسجة من الكلى والبنكرياس مع الأسيتيل α تويولين. لم نجد اختلافات في أرقام أهداب الأولية أو طول أهداب بين النوع البري وBbs7 - / - الفئران (المواد التكميلية الشكل S3.). كما شكلت أهداب الابتدائي وتظهر طبيعي في الخلايا المستزرعة الظهارية الكلى والخلايا الليفية الجنينية مثقف (MEF) المستمدة من Bbs7 - / - الفئران (. المواد التكميلية الشكل S3 والبيانات لا تظهر)، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية أن يكونوا قد يكون خفية العيوب الهيكلية، مثل التغييرات بعد التعديل في الأنابيب الدقيقة.

Bbs7 - / - الفئران يكون غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية

أثبتنا سابقا لعدم وجود الحيوانات المنوية الأسواط في Bbs1 M390R / M390R knockin، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs6 - / - الفئران (ديفيس وآخرون، 2007.؛. الفتح وآخرون، 2005؛. Mykytyn وآخرون، 2004؛. نيشيمورا وآخرون، 2004). الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ Bbs7 العمر 4-8 شهرا - / - كشفت الخصيتين ندرة الحيوانات المنوية سياط (الشكل 3A، B.). نحن صقلها على هذه الملاحظة عن طريق تلوين المناعي من أنسجة الخصيتين. في حين أن معظم الحيوانات المنوية من Bbs7 - / - الفئران تفتقر إلى ذيل سوطي، وبعض من الحيوانات المنوية لديهم سياط تالف. هذه الأسواط غير طبيعي في كثير من الأحيان تشكيل هيكل حلقة نوع (الشكل 3C-F). لدراسة هذه الآفة تالف في مزيد من التفاصيل، أجزاء من النوع البري وBbs7 - / - تم تحليل الخصيتين بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). الهياكل microtubular والألياف الكثيفة الخارجية المحيطة هيكل microtubular في قطعة الرئيسي غير منظمة إلى حد كبير في المسوخ (الشكل الجيل الثالث 3G، H). في بعض الأحيان لاحظنا العادية 9 + 2 الهياكل axonemal في Bbs7 - / - الفئران (8،8٪ مقابل 100٪ في البرية من نوع، P <0.01). في المقابل، فإن الهياكل axonemal من أهداب متحركة في القصبة الهوائية من Bbs7 - / - الفئران طبيعية إلى حد كبير عن طريق تحليل TEM (المواد التكميلية الشكل S4.).

تين. 3.
Bbs7 - / - الفئران لها غير طبيعي سياط الحيوانات المنوية (A، B) H & E الملون القديم 4-8 شهرا البرية من نوع (A) وBbs7 - / - أظهرت (B) الأنابيب المنوية عدم وجود الحيوانات المنوية سياط. أظهر (C-F) مناعي تلطيخ الخصيتين سياط باستخدام المضادة للالأسيتيل-α تويولين تلطيخ عيوب في Bbs7 - / - الفئران. في كثير من الأحيان ولوحظ وجود نوع من عصابة هيكل أنيبيب في Bbs7 - / - الفئران. C و D الصور وانخفاض القوة، E و F هي صور عالية الطاقة. (G، H) تحليل TEM من المقطع العرضي البرية من نوع (G) وBbs7 - / - (H) الحيوانات المنوية سياط يكشف أن Bbs7 - / - سياط الحيوانات المنوية لا يكون نموذجي 9 + 2 axonemes، ولكن تظهر الهياكل أنيبيب غير منظمة (السهم) والألياف الكثيفة الخارجي (رأس السهم) المحيطة الهياكل microtubular. أشرطة النطاق: 100 ميكرون (A، B)؛ 50 ميكرون (C، D)؛ 20 </ emph> ميكرون (E، F)؛ 0.1 ميكرون (G، H).

مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome

منذ Bbs7 - / - الفئران لها الظواهر مماثلة لغيرها من BBSome الفئران فرعية خروج المغلوب وBBS7 هو وحدة فرعية من BBSome، ونحن التحقيق آثار خسارتها على تشكيل BBSome. والمثير للدهشة، وكانت مستويات البروتين BBS2 بشكل ملحوظ انخفضت في Bbs7 - / - الخصيتين لست] البروتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين. وبالمثل، فقد انخفضت مستويات البروتين BBS7 في Bbs2 - / - الخصيتين، ولكن ليس في Bbs4 - / - الخصيتين (الشكل 4A.). لتحديد ما إذا كان هذا يرجع إلى تدهور البروتين أو انخفضت النسخ، كنا نصف الكمية RT-PCR لتقييم Bbs2 وBbs7 مرنا مستويات التعبير. نحن لم تراع الفوارق التعبير عن Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الخصيتين أو الاختلافات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الخصيتين مقارنة مع الضوابط (الشكل 4B.). معا هذه النتائج تشير إلى أن BBS2 وBBS7 الخلافات مستوى البروتين تنتج عن الاختلافات في استقرار البروتين، والتي BBS2 وBBS7 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار.

تين. 4.
مطلوب BBS7 لتشكيل BBSome. (A) BBS7 وBBS2 تعتمد على بعضها البعض لتحقيق الاستقرار البروتين. أظهرت هي البقع الغربية من إجمالي لست] البروتين من النوع البري (WT)، Bbs2 - / -، Bbs4 - / - وBbs7 - / - الخصيتين. ويظهر تحليل (B) RT-PCR أي تغييرات واضحة في مستويات Bbs2 مرنا في Bbs7 - / - الفئران ولا تغييرات في مستويات Bbs7 مرنا في Bbs2 - / - الفئران. (C) وBBSome لا تشكل في BBS الخصيتين الماوس خروج المغلوب. أظهرت هي البقع الغربية من البروتينات الخصيتين immunoprecipitated بواسطة الأجسام المضادة لمكافحة BBS1. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome أخرى مع الأجسام المضادة ضد مفارز BBSome الفردية. واستخدمت كميات متساوية من البروتين الأولي من الخصيتين lystaes للمناعي. (D) تحليل الانحدار السكروز من البروتين لست] الخصيتين تثبت أنه لا يوجد أشكال BBSome في غياب BBS7. (E) فقدان تشكيل BBSome في خلايا الكلى مثقف من BBS الفئران خروج المغلوب وBBS2 انقاذ BBSome تشكيل في Bbs2 - خلايا الكلى - /. أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من مختلف الفئران خروج المغلوب BBS المصابين اتش معربا عن FLAG-BBS2. وهي lysed الخلايا المصابة وتم سحب البروتينات أعرب بنسبة مكافحة FLAG الأجسام المضادة. تم الكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية لطخة الغربية. (F) FLAG-BBS7 (WT والمسوخ) كانت المشترك مع transfected BBS2 الموسومة MYC إلى خلايا 293T والتفاعل بين BBS7 وBBS2 كان يعاير من قبل المشارك مناعي وكميا بواسطة يماغيج. و transfected (G) FLAG-BBS7 (WT وH323R طفرة) في الخلايا 293T وتم سحب البروتينات transfected أسفل عن طريق الأجسام المضادة لمكافحة FLAG. تم تحديد وجود مفارز BBSome الذاتية من قبل، BBS2، BBS4 وBBS7 الأجسام المضادة BBS1 المضادة. وتم قياس كمية مبالغ BBS1، BBS2، BBS4 وBBS7 التي كتبها يماغيج.

ترابط BBS2 وBBS7 للاستقرار البروتين يتسق مع النتائج تبين أن BBS2 يتفاعل جسديا مع BBS7 ويشكل subcomplex (Nachury وآخرون، 2007). ومن المثير للاهتمام، BBS7 وBBS2 مشاركة ملفوف لفائف تناظر تسلسل المجال في المناطق الوسطى من (المواد التكميلية الشكل S5). لم يكن مطلوبا من BBS7 ملفوف لفائف مجال للربط إلى BBS2. بدلا من ذلك، يطلب من الأحماض الأمينية 200-C النهائي للBBS7 للربط إلى BBS2 (المواد التكميلية الشكل S5A). وبالمثل، المجال ملفوف لفائف من BBS2 غير مطلوب على الاطلاق للتفاعل مع BBS7، ولكن فقدان هذا المجال يقلل من التفاعل مع BBS7 (المواد التكميلية الشكل S5B). وعلاوة على ذلك، فإن حذف المنطقة ملفوف لفائف في BBS7 لا يعطل تفاعلها مع غيرها من الوحدات الفرعية BBSome الذاتية. البروتين BBS2 مع حذف المنطقة ملفوف لفائف يعطل التفاعل مع بعض مفارز BBSome الذاتية (BBS7) مع الحفاظ على القدرة على التفاعل مع مفارز BBSome أخرى (BBS1 وBBS9) (المواد التكميلية الشكل S5C).
لدراسة تشكيل BBSome في غياب BBS7، أجرينا مناعي مع الأجسام المضادة ضد BBS1، واحدة من مفارز من BBSome. وقد انخفض وجود مفارز BBSome أخرى في BBS1 سحب هبوطا أو غير قابلة للكشف في غياب BBS7 أو BBS2 كما يتبين من لطخة غربية. هذا يدل على أن BBSome سليمة غير مشكلة في غياب BBS7 (الشكل 4C). أكدنا أيضا هذه النتائج عن طريق تحليل الانحدار السكروز من إجمالي لست] البروتين من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين (الشكل 4D).
للتحقيق في ما إذا كان شرط من BBS7 لتشكيل BBSome هي فريدة من نوعها لأنسجة الخصيتين، ونحن عزل الكلى الخلايا الظهارية الأولية من كلا من النوع البري وBbs7 - / - الفئران وإصابة الخلايا المستزرعة مع اتش معربا عن FLAG-BBS2. نحن انزلوا العلم BBS2 والكشف عن وجود مفارز BBSome الذاتية باستخدام أجسام مضادة لمكافحة BBS (الشكل 4E). وجدنا أن في غياب البروتين BBS7، ويتم تشكيل أي BBSome كامل (ناقص BBS7)، على الرغم من أن بعض المكونات BBSome لا تزال تشكل subcomplex. إذا كانت هذه subcomplexes تزال تحتفظ ببعض المهام المتبقية هي مسألة الفائدة.
لتقييم تأثير على تشكيل BBSome من متماثل الطفرات BBS7 مغلطة (T211I وH323R) وجدت في المرضى الذين يعانون BBS، نحن اختبار ما إذا كان BBS7 تحتوي على هذه الطفرات يمكن إدراجها في BBSome. ويظهر تحليل النشوء والتطور أن هذه الطفرات تقع في مناطق محمية من البروتين. ونحن إنشاء بنيات BBS7 تحور بواسطة الطفرات موقع الموجه والموسومة لهم FLAG في N-محطة من البروتينات. انخفضت البروتينات BBS7 تحور القدرة على التفاعل مع BBS2 كما يتبين من شارك في مناعي عندما transfected المشارك في الخلايا 293T (الشكل 4F). طفرة مغلطة BBS7 H323R قد تراجع في القدرة على هدم مفارز BBSome الذاتية مقارنة مع من النوع البري BBS7 البروتين (الشكل 4G). تم الحصول على نتيجة مماثلة مع متحولة بروتين T211I (تشانغ وآخرون، 2012b). وتشير هذه النتائج إلى أن الطفرات BBS7 مغلطة تؤثر BBSome تشكيل. وهذا يوفر تفسيرا لماذا هذه الطفرات نقطة متماثل تسبب BBS. في المقابل، لم غياب BBS7 لا تؤثر على مستويات البروتين من مكونات معقدة IFT أو IFT تشكيل معقد (المواد التكميلية الشكل S6A، B). لم فقدان BBS7 لن يؤثر IFT البروتين الهدبية توطين (المواد التكميلية الشكل S6C)، بما يتفق مع الحقائق التي فقدان الجينات BBS ديها الظواهر أكثر اعتدالا من ذلك من فقدان الجينات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف إذا كان معدل حركة IFT هو تغييرها.

غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين مستقبلات الذوق، polycystin-1 أو polycystin-2

ومن المعروف أن BBSome تشارك في نشوء حيوي غشاء أهداب من خلال Rab8. بالإضافة إلى ذلك، نهدم من BBS الجينات في النتائج الزرد في عيوب في الحويصلة Kuffer وإلى الوراء تأخير النقل جسيم ميلانيني. وعلاوة على ذلك، فقد BBS البروتينات النتائج في تراكم عنصر الصوتية مسار القنفذ مملس (SMO) داخل أهداب دون تفعيل المسار (تشانغ وآخرون، 2012A). هذه الدراسات تدل على أن البروتينات BBS تعمل في الاتجار محدد الحويصلة. وقد تبين أن البروتينات أهداب الأخرى ذات الصلة مثل AHI1 وتشارك FUZZY في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لأهداب الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛ هسياو وآخرون، 2009.). لاختبار ما إذا تشارك BBS7 في الغشاء العام الاتجار البروتين، درسنا مسارات الإلتقام-بالكلاذرين مستقلة وتعتمد على بالكلاذرين في مثقف من النوع البري وBbs7 - / - الخلايا الأولية الكلى باستخدام fluorophore المسمى السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة كعلامات على التوالي. تم الكشف عن عدم وجود اختلافات من السم الكوليرا أو ترانسفيرين مستقبلات الإلتقام بين النوع البري وBbs7 - / - الخلايا (المواد التكميلية التين S7، S8). ويتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام خلايا MEF من النوع البري وBbs7 - / - الفئران. وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs7 ليست متورطة في الاتجار حويصلي العام، ولكن بدلا تشارك في أنواع معينة من الاتجار حويصلي مثل جسيم ميلانيني النقل في الزرد و / أو الاتجار إلى وجهات التحت خلوية محددة مثل الأغشية الهدبية.
بعد ذلك، درسنا الهدبية غشاء الاتجار البروتين في الخلايا فارغة Bbs7. وقد تم مؤخرا أظهرت مستقبلات الطعم المر للتوطين لغشاء الهدبية في أهداب متحركة من ظهارة الهوائية والذوق مستقبلات الأشكال ترتبط عدوى الجهاز التنفسي (لي وآخرون، 2012.؛ شاه وآخرون، 2009.). رغم عدم وجود النمط الظاهري واضح في الكلى، وقد تبين وجود ارتباط طعم مستقبلات مرير مع نوع معين من اعتلال الكلية، البلقان المتوطنة إعتلال الكلى، (التغطية بالخشب وآخرون، 2012). لاختبار إذا يتم ترجمة مستقبلات الطعم المر أيضا إلى غشاء أهداب الابتدائي، ونحن ملطخة خلايا الكلى مثقف مع الأجسام المضادة ضد مستقبلات الطعم المر T2R4 وT2R43 جنبا إلى جنب مع أهداب علامة الأسيتيل α تويولين. وأظهرت النتائج أن مستقبلات الطعم المر توطين لغشاء أهداب الكلى الابتدائي (المواد التكميلية الشكل S9A-C). مستقبلات الذوق وظيفية كما يتضح من العلاج مع ديناتونيوم مجمع المر للحصول على 2+ استجابة الكالسيوم (المواد التكميلية الشكل S9I). من المذكرة، لم فقدان Bbs7 لن يؤثر على توطين أهداب من هذه المستقبلات (المواد التكميلية الشكل S9D-F)، ولا يؤثر على الكالسيوم 2+ تعبئة عندما حفز مع مجمع المر ديناتونيوم (المواد التكميلية الشكل S9J)، مشيرا إلى أن BBS7 و غير مطلوب BBSome لتوطين الغشاء الهدبي أو وظيفة مستقبلات الطعم المر.
طفرة من عدة بروتينات الغشاء الهدبية بما في ذلك polycystin-1، polycystin-2، وMecklin (MKS3)، يسبب الأمراض التي تصيب الإنسان مع الظواهر التي تتداخل تلك BBS. ولذلك، فإننا التحقيق في توطين كلا polycystin-1 وpolycystin-2 في تربيتها Bbs7 - / - خلايا الكلى الأولية باستخدام الأجسام المضادة ضد polycystin-1 وpolycystin-2. غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin 2 (الشكل 5). حقيقة أن Bbs7 - / - الفئران لا تتطور الكيسات الكلوية إلى أن polycystin-1 وpolycystin-2 لا تزال وظيفية، على الرغم من أننا لا نستطيع أن نستبعد إمكانية عيوب وظيفية خفية في غياب BBS7.

تين. 5.
غير مطلوب BBS7 لالهدبية توطين polycystin-1 وpolycystin-2. (A-L) أظهرت هي خلايا الكلى مثقف من النوع البري (A-C، G-I) وBbs7 - / - (D-F، J -L) الفئران ملطخة مكافحة الأسيتيل α تويولين (الخضراء) كعلامة أهداب ومضادة للpolycystin-1 (A-F؛ أحمر) ومضادة للpolycystin 2 (G-L، أحمر) الأجسام المضادة. أشرطة النطاق: 10 ميكرون.

غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للالدوبامين D1 مستقبلات الغشاء الهدبي

وقد أظهرت الدراسات الجينية في الكائنات النموذج الذي فقدان البروتينات BBS تؤدي إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل في الزرد، IFT عيوب تحول في الطرف الهدبية في C. ايليجانس، وتراكم يشير البروتينات داخل الأسواط في كلاميدوموناس، وتراكم مملس داخل أهداب في الفئران (Lechtreck وآخرون، 2009.؛ وي وآخرون، 2012.؛. الين وآخرون، 2006؛ تشانغ وآخرون، 2012A). ولذلك، فإننا التحقيق مستقبلات الذاتية التي قد تتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - الفئران. وقد تبين أن مستقبلات الدوبامين D1 (D1R) تتراكم في أهداب في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). لتحديد ما إذا D1R يتراكم في أهداب في Bbs7 - / - الفئران، ونحن ملطخة أقسام الدماغ من النوع البري وBbs7 - / - الفئران مع العصبية ACIII أهداب علامة والأجسام المضادة ضد D1R. لا يمكننا العثور على أي تلطيخ الهدبية من D1R في البرية من نوع الدماغ (الشكل 6A-C). في المقابل، وجدنا مناطق متعددة بما في ذلك المخطط واللوزة حيث يموضع D1R لأهداب في Bbs7 - / - (الدماغ الشكل 6D-F). وتشير هذه البيانات إلى أن BBSome يمكن أن تنظم النقل إلى الوراء من D1R داخل أهداب الخلايا العصبية وفقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للD1R إلى الغشاء الهدبي.

تين. 6.
فقدان BBS7 يؤدي إلى تراكم غير طبيعي للمستقبلات الدوبامين D1 داخل الأهداب. (A-F) أقسام الدماغ من النوع البري (A-C) وBbs7 - / - كانت ملطخة (D-F) الفئران مع مكافحة ACIII الأجسام المضادة ( الأحمر) كعلامة أهداب الخلايا العصبية ومكافحة D1R الأجسام المضادة (الخضراء). D1R يتراكم داخل أهداب في Bbs7 - / - مخ الفأر مقارنة البرية من نوع السيطرة. شريط النطاق: 20 ميكرون.

نقاش

وهدب هو عضية الهامة التي تلعب أدوارا متعددة خلال التنمية وفي التوازن من أنسجة البالغين. أهداب متحركة مهمة لوظائف مثل إزالة المخاط من الرئتين والدورة الدموية من السائل الشوكي الدماغي من خلال البطينين الدماغي، في حين أهداب الأساسي والمهم لchemo- والميكانيكية والإحساس، وكذلك القنفذ وWNT نقل الإشارة. وسلط الضوء على أهمية أهداب التي كتبها النتائج أن أهداب عطل يساهم في مجموعة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان المعروفة باسم ciliopathies التي تشمل متلازمة بارديه-بيدل.
BBS هو اضطراب عديد المظاهر التي تنطوي على العديد من أجهزة الجسم. بعض الظواهر BBS مثل السمنة، وتنكس الشبكية، والسكري، وارتفاع ضغط الدم لديها معدلات انتشار عالية في عموم السكان. ولذلك، فإن دراسة BBS يوفر فرصة فريدة من نوعها للكشف عن بعض مسارات الكامنة أو التأثير على هذه الأمراض الشائعة. BBS خروج المغلوب الفئران تحاكي النمط الظاهري البشري، وبالتالي توفير أداة مفيدة لاكتشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا المرض فضلا عن اختبار علاجات جديدة.
على الرغم من BBS فئرانا معدلة وراثيا تشترك الظواهر BBS مشتركة، ويلاحظ الاختلافات المظهرية بين مختلف طفرات الجينات BBS. الأهم من ذلك، عرض المرضى BBS التباين المظهري بين وداخل الأسر (كرمي وآخرون، 1995). وقد تم توثيق الفروق الفسيولوجية بين المرضى BBS التي تسببها طفرات في الجينات متميزة (Feuillan وآخرون، 2011)، مما يشير إلى أنه على الرغم من تقاسم الظواهر BBS المشتركة، قد يكون الجينات BBS مختلفة ظائف فريدة من نوعها. BBS7 هو جزء لا يتجزأ من BBSome ويتفاعل مع مجمع BBS chaperonin، وهي نتيجة فريدة من نوعها لBBS7 بين BBSome البروتينات جسديا. غياب BBS7 يؤثر على استقرار البروتين من BBS2 ويمنع تشكيل BBSome سليمة. ومع ذلك، لا تزال تشكل أهداب الابتدائية في غياب BBS7. على عكس بالضربة القاضية جين IFT، التي أهداب لا تشكل ويؤدي إلى الفتك الجنينية في الفئران، Bbs7 - / - الفئران يمكن البقاء على قيد الحياة إلى سن الرشد وأهداب الابتدائي لا تزال تشكل في الأنسجة بما فيها الكلى والجزر من البنكرياس، والقناة البنكرياسية، في الظهارية الكلوي مثقف الخلايا والخلايا الليفية. وعلى النقيض من أهداب الابتدائي، أهداب متحركة من خلايا البطانة العصبية بطانة البطينات الدماغية والحيوانات المنوية لديهم سياط عيوب خطيرة في Bbs7 - / - الفئران. أهداب متحركة المعيبة ليست بسبب وventriculomegaly المتقدمة في غياب BBS7 منذ أهداب عيب متحركة تطوير في وقت مبكر من 3 أسابيع في ependyma الدماغ. لا تفعل تظهر أهداب متحركة المعيبة أن يكون السبب الرئيسي للventriculomegaly. تطوير غير طبيعي للخلايا العصبية السلف قد تكمن وراء تطوير ventriculomegaly في هذا النموذج الماوس كما هو موضح لنماذج أخرى الماوس BBS لأن كلا BBS7 وBBS1 تعتبر ضرورية لسلامة BBSome (كارتر وآخرون، 2012). غياب BBS7 لا يؤثر على تشكيل المجمعات IFT، على الرغم من أننا لا نعرف ما اذا تأثر الحركة من الجسيمات IFT التي كتبها غياب BBSome. ويبدو أن الجينات BBS والجينات IFT أن تؤثر على جوانب مختلفة من وظيفة الهدبية. نتائجنا في الفئران تتسق مع نتائج كلاميدوموناس، وتسليط الضوء على التفاعل بين BBSome ومجمع IFT (Lechtreck وآخرون، 2009).
أثبتنا أن BBS7 البروتين إيواء الطفرات نقطة وجدت في المرضى الذين يعانون BBS7 (T211I وH323R) لديه قدرة انخفضت إلى تشكيل BBSome مقارنة مع البروتين BBS7 العادي. الأساليب المستخدمة هنا يمكن أن توفر نظام فحص خلية القاعدة فعال لتقييم طبيعة الطفرات مغلطة BBS الإنسان في المختبر.
في الآونة الأخيرة أظهرت الدراسات أن الجينات ذات الصلة أهداب، مثل AHI1 وغامض، وتشارك في الغشاء العام الاتجار البروتين وليس فقط لالهدبية الاتجار بروتين الغشاء (رمادي وآخرون، 2009.؛. هسياو وآخرون، 2009). في المقابل، غياب BBS7 لا يؤثر على مسارات إما مستقلة بالكلاذرين وأو بالكلاذرين الإلتقام يتوقف. وبالمثل، وغياب أو طفرة من البروتينات BBS لا تؤثر على مسار إفرازية العام للبروتينات الغشاء بما في ذلك SST3R وترانسفيرين مستقبلات غشاء البلازما (جين وآخرون، 2010) (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن الاتجار حويصلة العامة لا يبدو أن يتطلب BBS7 أو BBSome والاتجار بروتينات معينة أو من غشاء البلازما يمكن أن يثير الشبهة في غياب BBSome. ومن الأمثلة على الاتجار مستقبلات اللبتين، وهو ما ثبت للتفاعل مباشرة مع BBSome (سيو وآخرون، 2009). ومن المثير للاهتمام، في C. ايليجانس، وفقدان BBS الجينات يؤدي إلى زيادة إطلاق سراح الحويصلات كثيفة الأساسية والأنشطة المعززة للأنسولين، نيوروبيبتيدي، وأمين مسارات إشارات الاحيائية (لي وآخرون، 2011). نستنتج أن BBS7 وبالتالي BBSome لا تشارك في الهدبي الاتجار العام بروتين الغشاء بل في محدد الغشاء الهدبي الاتجار البروتين. ويستند هذا الاستنتاج على ملاحظة أن الهدبية بروتينات غشاء مثل polycystin-1، polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر لا تزال المترجمة إلى غشاء الهدبية في الغياب التام للبروتين BBS7، وهو مطلوب لBBSome التجمع. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدلائل إلى أن polycystin-1، لا تزال polycystin-2، ومستقبلات الطعم المر وظيفية في غياب BBS7. في المقابل، غياب BBS7 يؤدي إلى تراكم SMO داخل أهداب دون تحفيز SMO يجند (تشانغ وآخرون، 2012A). وقد ثبت الأخرى بروتينات الغشاء الهدبي بما في ذلك SST3R وMCHR1 لتوطين لأهداب الخلايا العصبية في ظل ظروف طبيعية، ولكن ليس في غياب BBS2 أو BBS4 (Berbari آخرون، 2008A.؛ Berbari وآخرون، 2008b.). ومع ذلك، فإن غياب BBS7 لا يؤثر توطين الهدبي إما SST3R أو MCHR1 في الخلايا العصبية في الدماغ أو في الخلايا المستنبتة من Bbs7 - / - الفئران (لا تظهر البيانات). في المقابل، تراكمت D1R داخل أهداب في غياب BBS7، على غرار النتائج في Bbs2 - / - وBbs4 - / - الفئران (Domire وآخرون، 2011.). تراكم D1R داخل أهداب قد يرجع ذلك إلى النقل إلى الوراء تغير من D1R داخل أهداب في غياب BBS7. ودعما لهذا الاحتمال، وأظهرت الدراسات الجينية في الزرد إلى الوراء جسيم ميلانيني تأخير النقل عند التعبير عن BBS يتم منع الجينات (الين وآخرون، 2006). وعلاوة على ذلك، SMO يتراكم داخل أهداب دون التحفيز يجند في غياب BBSome (تشانغ وآخرون، 2012A). تأخر نقل إلى الوراء يمكن أن تنجم عن النشاط تغير المحرك، خلل في مجمع IFT أو تتغير بنية أهداب axonemal، أو تغيير معين في قدرة بعض الشحنات للخروج من هدب. دراسات في C. ايليجانس تشير إلى أن البروتينات BBS بمثابة linkers بين مجمع IFT B ومجمع IFT A (Blacque وآخرون، 2004). وفقدان البروتينات BBS يؤدي إلى وظيفة غير لائقة المجمعات IFT. ودعما لهذا الاحتمال، المسوخ مضاعفة من Bbs7 وTg737orpk تفتقر تماما أهداب، تشبه مجمع IFT B بالضربة القاضية الحقيقية (تشانغ وآخرون، 2012A). بدلا من ذلك، أهداب الأساسي من المسوخ Bbs7 قد يكون لها أيضا خفية خلل في بنية axonemal التي قد تسهم في تراكم D1R داخل الأهداب. أهمية وظيفية من تراكم D1R داخل أهداب غير معروفة حاليا. وقد تبين أن المرضى BBS وBBS الفئران خروج المغلوب زادت القلق والاكتئاب (بارنيت وآخرون، 2002.؛ Eichers وآخرون، 2006.). ومن المثير للاهتمام، انسداد D1R السرقة مع الأدوية الموهن مكيفة التجمد (اختبار الخوف مشروط) أثناء الاختبار الاستبقاء (Guarraci وآخرون، 1999a... Guarraci وآخرون، 1999b). توطين D1R في مناطق الجسم المخطط واللوزة تشير إلى أن الدوبامين إشارات قد تلعب دورا لعيوب السلوك التي لوحظت في نماذج الماوس BBS والمرضى BBS.

المواد والأساليب

الكواشف والأجسام المضادة

وقد تم الحصول على الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS2 الببتيد DKTARYWRIK والأرنب بولكلونل الأجسام المضادة ضد الماوس BBS7 الببتيد VLQERENYQQ من توسيع النظم البيولوجية (هانتسفيل، AL). وكانت هذه الأجسام المضادة النقاء تقارب والتحقق منها في الفئران خروج المغلوب. وحيدة النسيلة المضادة للبيتا تويولين، بولكلونل مكافحة β-الأكتين، وحيدة النسيلة المضادة للالأسيتيل تويولين، وحيدة النسيلة المضادة للγ تويولين، بولكلونل الأرنب تم شراؤها مكافحة BBS8 وBBS9 من سيغما (سانت لويس، MO). تم شراء الماعز المضادة للBBS1 (N-20)، الماعز المضادة للBBS2 (C-16) الأجسام المضادة، والفأر مكافحة D1R الضد من سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية، CA). تم شراؤها لمكافحة T2R4 الضد الأرنب بولكلونل والأرنب المضادة للT2R43 الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة من العلم الحرارية (بيتسبرغ، PA). تم شراؤها اليكسا 488 مترافق السم الكوليرا واليكسا 568 البشرية مترافق نقل مستقبلات من إينفيتروجن (كارلسباد، كاليفورنيا). وكان الأرنب بولكلونل المضادة للpolycystin-1 هدية من الدكتور أوكسانا Ibraghimov-Beskrovnaya (شركة جنزايم). كان الأرنب بولكلونل مكافحة polycystin-2 الأجسام المضادة هدية من الدكتور ستيفان Somlo (جامعة ييل)، والدكتور غريغوري Pazour (مدرسة الطب بجامعة ماساتشوستس).

جيل من Bbs7 الفئران خروج المغلوب

تم استخدام PCR لتضخيم 5 'و 3' مناطق Bbs7 الجينات من 129 / SVJ الحمض النووي الجيني والمستنسخة في استهداف pOSDUPDEL ناقلات (هدية من O. سميثيز، جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل، NC). تم خطي ناقلات و electroporated إلى R1 الجذعية الجنينية (ES) خلايا (129 × 1 / SvJ3 129S1 / سيفرت). كما تم عرض G418 واستنساخ مقاومة للganciclovir التي كتبها بعيد المدى PCR لتحديد خطوط الخلايا ES المستهدفة بشكل صحيح. واستخدمت اثنين من خطوط الخلايا ES مستقلة لإنتاج الوهم. استخدمت حيوانات خيالية لتوليد Bbs7 الفئران متخالف على خلفية وراثية مختلطة من قبل التزاوج مع C57BL / 6J الفئران. تم intercrossed الفئران متخالف، وكان التنميط الجيني لسلالة بواسطة PCR. جميع الدراسات انضمت إلى المبادئ التوجيهية الموضوعة لرعاية واستخدام حيوانات التجارب وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة ولاية ايوا.

عزل الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR

تم عزل الحمض النووي الريبي من العمر 2.5 شهرا من النوع البري وBbs7 - / - الخصيتين الماوس باستخدام TRIzol كاشف (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). وقد أعد كدنا] من 1 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مرتفع الثالث الناسخ العكسي (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا).

تحليل لطخة غربية

من النوع البري وBbs7 تعطلت الخصيتين متحولة من قبل TISSUEMISER (فيشر العلمية، بيتسبرغ، PA) في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100 و مثبط البروتياز من روش، انديانابوليس، IN). تم تجميد الأنسجة تعطلت في النيتروجين السائل وإذابة في حمام الماء درجة حرارة الغرفة. وتكررت هذه الدورة تجميد أذاب ثلاث مرات. ثم تم طرد ولست] في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة وتم قياس تركيز supernatants باستخدام بيو راد العاصمة فحص البروتين (هرقل، CA).
تم فصل البروتينات عن طريق الكهربائي باستخدام 4-12٪ المواد الهلامية NuPAGE مكرر تريس (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا)، يليه نقل إلى الأغشية النيتروسليلوز وتم الكشف عنها من قبل SuperSignal دورا مددت الركيزة (بيرس، روكفورد، IL).

التحليل النسيجي للBbs7 - / - الفئران

الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ العينين والخصيتين من العمر 4-8 شهرا Bbs7 أجريت متحولة والعمر كعينة ضابطة من حد وصفه. أقسام الدماغ الاكليلية من 60-100 ميكرون من العمر 4-8 شهرا Bbs7 - - / كانت ملطخة الحيوانات والعمر كعينة ضابطة مع محايد الأحمر وصورت مع stereomicroscope أوليمبوس SZX12 كما هو موضح (ديفيس وآخرون، 2007.).

دراسات الوزن

تناول الطعام في قفص فردي Bbs7 - - / تم مقارنتها مع الحيوانات Bbs7 +/- والحيوانات البرية من نوع السيطرة تتراوح أعمارهم 4-28 أسابيع باستخدام متوسط ​​ستة حيوانات في كل مجموعة. تم تسجيل الوزن بداية الأسبوعية عند الفطام.

نقل الإلكترون المجهري

تم perfused الفئران مع نصف القوة تثبيتي Karnovsky وتم تشريح الأنسجة وإصلاحها في نصف القوة تثبيتي Karnovsky لعدة ساعات قبل الأوسيميوم بعد التثبيت، والجفاف، وتضمينها في الإي بي 812. نقل الميكروسكوب الإلكتروني اتخذت كما هو موضح سابقا (سويديرسكي وآخرون آل.، 2007).

جيل من BBS2 البشري وBBS7 متحولة بنيات الحذف والطفرات نقطة

تم إنشاء BBS7 المسوخ الحذف عن طريق PCR والمستنسخة في التعبير الثدييات ناقلات pCS2 +. وتم التحقق من كل المسوخ الحذف عن طريق التسلسل المباشر. تم إنشاؤها الطفرات نقطة BBS7 بواسطة الطفرات موقع الموجه (Stratagene، لا جولا، كاليفورنيا) باستخدام N-محطة الموسومة FLAG من النوع البري BBS7 كقالب والتحقق من التسلسل.

مناعي

تفاضلي الموسومة الجينات BBS الإنسان و transfected المشارك في الخلايا 293T. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت هي lysed الخلايا في تحلل العازلة (1 × PBS، 1٪ تريتون X-100، ومثبط البروتياز، روش، انديانابوليس، IN) ونسج في 20000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تم مسح supernatants من قبل الحضانة مع حبات بروتين G (بيرس، روكفورد، IL). وحضنت لست] مسح مع الأجسام المضادة ضد علامات المقابلة لمدة 4 ساعات. وبعد ذلك يضاف بروتين G الخرز والمحتضنة لمدة 4 ساعات أخرى. تم غسلها حبات أربع مرات مع العازلة تحلل وتم الكشف عن التفاعلات التي النشاف الغربي.

المناعي المجهري

تم إصلاح الخلايا في 4٪ paraformaldhyde في برنامج تلفزيوني أو ثابتة مع الميثانول البارد لمدة 5 دقائق (ل-γ تويولين صمة عار) وpermeabilized مع 0.2٪ تريتون X-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. تم غسلها الخلايا 3 × PBS وسدوا مع عازلة تمنع (1٪ BSA في PBS). وكانت مخففة الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تم غسلها الخلايا 3 × PBS، سدت مع عازلة تمنع، ثم حضنت مع فلور اليكسا 488 أو فلور اليكسا 568 المسمى الأجسام المضادة الثانوية (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). كانت ملطخة النوى مع دابي (سيغما، سانت لويس، MO).

كلية زراعة الخلايا الأولية

الكلى من النوع البري وBbs7 - / - تم تشريح الفئران وتعقيمها قبل التنسيب إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 ثوان، ثم مفروم مع مقص. تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 دون المصل. 20 مل من pronase (1 ملغ / مل، روش، انديانابوليس، IN) وأضيف إلى الأنسجة والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم تم غسلها الأنسجة مرة واحدة مع DMEM الباردة / F-12 وحضنت مع 20 مل 1-× التربسين EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. تم مكعبات الأنسجة في 500 غ لمدة 5 دقائق وإعادة علقت في 30 مل DMEM / F-12 مع 10٪ مصل. كانت مطلية الأنسجة إعادة علقت في ثلاثة أطباق 10 سم مغلفة بولي-L-ليسين (سيغما، سانت لويس، MO).

السم الكوليرا وترانسفيرين مستقبلات الإلتقام

أجريت السم الكوليرا وترانسفيرين المستقبلة المقايسات الإلتقام كما وصفها هسياو وآخرون. (هسياو وآخرون 2009).

التصوير الكالسيوم

تم إجراء التصوير الكالسيوم كما هو موضح سابقا (شاه وآخرون، 2009). خلايا الكلى مثقف من النوع البري وBbs7 - / - تم تحميل الفئران مع 1 ميكرومتر Fura2 صباحا، تم تقييم التغييرات تركيز الكالسيوم في ظهائر باستخدام مجهر مقلوب (نيكون الكسوف TE200، نيكون انسترومنتس، ميلفيل، NY)، والبيانات تم تحليلها باستخدام برنامج شيكل، عناصر (نيكون). تم تطبيق ديناتونيوم apically في تركيزات المشار إليها. تم استخدام برنامج تلفزيوني عن السيطرة.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس
إضافة رد
صفحة 1 من 2 1 2

« الموضوع السابق | الموضوع التالي »
أدوات الموضوع
طريقة عرض الموضوع
العرض المتطور العرض المتطور

تعليمات المشاركة
لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
لا تستطيع الرد على المواضيع
لا تستطيع إرفاق ملفات
لا تستطيع تعديل مشاركاتك
BB code is متاحة
كود [IMG] متاحة
كود HTML معطلة
الانتقال السريع

 المكتبة العلمية | المنتدى | دليل المواقع |  المقالات | ندوات ومؤتمرات | المجلات | دليل الخدمات | الصلب المشقوق وعيوب العمود الفقري | التوحد وطيف التوحد  | متلازمة داون | العوق الفكري | الشلل الدماغي | الصرع والتشنج | السمع والتخاطب | الاستشارات | صحة الوليد | صحة الطفل | أمراض الأطفال | سلوكيات الطفل | مشاكل النوم | الـربـو | الحساسية | أمراض الدم | التدخل المبكر | الشفة الارنبية وشق الحنك | السكري لدى الأطفال | فرط الحركة وقلة النشاط | التبول الليلي اللاإرادي | صعوبات التعلم | العوق الحركي | العوق البصري | الدمج التربوي | المتلازمات | الإرشاد الأسري | امراض الروماتيزم | الصلب المشقوق | القدم السكرية


الساعة الآن 04:05 AM.

الاتصال بنا - موقع أطفال الخليج ذوي الاحتياجات الخاصة - الأرشيف - الأعلى

Powered by vBulletin® Version 3.8.2
Copyright ©2000 - 2024, Jelsoft Enterprises Ltd

a.d - i.s.s.w