عرض مشاركة واحدة
  #28  
قديم 11-23-2015, 10:23 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي IFT27، ترميز مكون GTPase صغيرة من جزيئات IFT، وتحور في عائلة الأقارب الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/23/12/3307.full



IFT27، ترميز مكون GTPase صغيرة من جزيئات IFT، وتحور في عائلة الأقارب الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل

+ الكاتب الانتماءات
  • 1 قسم الوراثة و
  • 2 قسم طب وجراحة العيون في مستشفى الملك فيصل التخصصي ومركز الأبحاث، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 3 قسم علم الوراثة و
  • قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية 4 من والكيمياء الحيوية، جامعة ييل، نيو هافن، CT، الولايات المتحدة الأمريكية
  • 5 السريرية في طب الأطفال، الأمير سلطان المدينة الطبية العسكرية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • قسم 6 لطب العيون، كلية الطب، جامعة الإمام محمد بن سعود الإسلامية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 7 قسم طب الأطفال، مستشفى الملك فهد المركزي بجازان، المملكة العربية السعودية
  • 8 السريرية لطب العيون، كلية الطب، جامعة الملك سعود، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • قسم 9 من التشريح وبيولوجيا الخلية، كلية الطب، جامعة الفيصل، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • 10 قسم العيون، كلية الطب، جامعة الفيصل، الرياض، المملكة العربية السعودية،
  • قسم 11 من الوراثة الطبية، مستشفى الملك فهد العام، جدة، المملكة العربية السعودية و
  • 12 قسم أمراض كلى الأطفال، الأمير سلطان المدينة الطبية العسكرية، الرياض، المملكة العربية السعودية
  • * لمن ينبغي أن تعالج المراسلات على العنوان التالي: قسم العيون في مستشفى الملك فيصل التخصصي ومركز الأبحاث، الرياض، المملكة العربية السعودية. البريد الإلكتروني: falkuraya {في} kfshrc.edu.sa (FSA)؛ البريد الإلكتروني: zhaoxia.sun {في} yale.edu (ZS)
  • تلقى 26 نوفمبر 2013.
  • تلقى مراجعة 16 يناير 2014.
  • قبلت 27 يناير 2014.

ملخص

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي ciliopathy مقهورة مع إصابات أجهزة متعددة. حتى الآن، تم تحديد 18 جينات BBS والغالبية منهم من الضروري لوظيفة BBSome، وهو بروتين معقد تشارك في نقل البروتينات الغشاء من وإلى أهداب. بعد العيوب في الجينات المحددة ليست بقادرة على جميع الحالات BBS. تباين وراثي لهذا المرض يشكل تحديا كبيرا في تحديد الجينات BBS إضافية. في هذه الدراسة، ونحن إلى جانب علم الوراثة البشرية مع التحقق من صحة وظيفية في الزرد وIFT27 تحديدها على أنها رواية BBS الجين (BBS19). وهذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تورط لنقل intraflagellar (IFT) الجينات في التسبب في BBS، وتسليط الضوء على التعقيد الجيني لهذا المرض.

مقدمة

وهدب هو، عضية بغشاء القائم على أنيبيب أن يبرز من معظم الخلايا حقيقية النواة بعد الإنقسامية. في العقد الماضي، وتراكم أدلة تدعم الدور الحاسم من هذه العضية مصغرة بمثابة الهوائي إشارة للخلية حيوان فقاري، وقد تم ربط عيوب الهدبية إلى قائمة متزايدة من الأمراض التي تصيب الإنسان يشار إليها مجتمعة ب ciliopathies (1، 2).
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هي واحدة من أفضل ciliopathies درس (3، 4). بل هو نادر وراثي جسمي اضطراب المتنحية التي تتميز إصابات أجهزة متعددة، بما في ذلك العين (نمط معين من تنكس الشبكية المعروفة باسم التهاب الشبكية الصباغي)، الطرف (polydactyly) والكلى (الكلى المتعدد الكيسات)، والتي يمكن تفسيرها عن عيوب الهدبية (2، 5). وتشمل المظاهر الرئيسية الأخرى السمنة، والإعاقة الذهنية ونقص الأعضاء التناسلية، على الرغم من ارتباطها ضعاف هدب أقل وضوحا (5). BBS غير المتجانسة وراثيا. حتى الآن، تم تحديد 18 جينات (3، +6 - +23).
وعلى الرغم من تحديد 18 جينات BBS، دليل يدعم وجود جينات BBS مجهولة (24). بحثنا السابق عن رواية جينات المرض BBS في 29 عائلة ولكن وجدت أنهم جميعا تؤوي الطفرات الجينية المعروفة (25، 26). في هذه الدراسة، ونحن نعرب تحليلنا لتسع عائلات جديدة. في واحدة من هذه الأسر، تم استبعاد جميع الجينات BBS المعروفة. أجرينا كذلك تسلسل كامل exome (WES) إلى جانب التحقق من صحة وظيفية في الزرد للبحث عن رواية BBS الجينات في هذه العائلة. بشكل غير متوقع، حددنا لنقل intraflagellar (IFT) الجينات، IFT27، ورواية BBS الجين (BBS19). IFT الجين يشفر مكونات الجزيئات IFT التي هي ضرورية لنشوء حيوي أهداب وصيانة (27 - 29). على الرغم من أن الجينات IFT ترتبط ارتباطا وثيقا مع وظائف الهدبية، عملنا هو أول من ربط الجين IFT إلى BBS.

النتائج

يحدد تحليل الطفرات الموجهة Autozygome الطفرات BBS سببية

اجتمع تسع عائلات متعددة غير موصوف سابقا التعريف السريري للBBS وكانوا مسجلين في هذه الدراسة. فإن الطبيعة الأقارب من جميع الأسر تسعة من الممكن استخدام autozygosity باعتباره معلما من الجين المرض المحتمل لأنه من المحتمل جدا أن الطفرات المسببة سوف يقيم في أليل الأجداد التي تم تقديمها ذاتي الأمشاج جنبا إلى جنب مع توضيح النمط الفرداني أجداده (30) . لذلك، استخدمنا autozygome المشتركة لكل عائلة لتوجيه تحليل تحور الجينات BBS كما هو موضح سابقا (25، 26). يسمح هذا النهج لنا للتعرف على طفرة السببية في ثمانية من أسر تسعة و، بما يتفق مع عملنا السابق، كان التباين الوراثي واضح. الجدول 1 يلخص النتائج السريرية والجزيئية في هذه الحالات.

الجدول 1.
ملخص النتائج السريرية والجزيئية في مجموعة الدراسة

التعرف على عائلة BBS مع رواية BBS الجينات

الأسرة BBS DG_7 هي عائلة سعودية الأقارب التي تتكون من الأصحاء الآباء ابن عم الأول وطفلين مع BBS فضلا عن ثلاثة أطفال أصحاء (الشكل 1). أقدم اثنين من الأشقاء المتضررة هو صبي يبلغ من العمر 15 عاما مع السمنة المرضية، إعاقة ذهنية خفيفة، polydactyly من جميع الأطراف، والفشل الكلوي الشريط الحدودي والتهاب الشبكية الصباغي. وبالإضافة إلى ذلك، لديه سحنة نموذجية، الكبد الدهني، نقص الشم، تأتب ونقص الأعضاء التناسلية. أخته البالغة من العمر 14 عاما هي مشابهة جدا في أن لديها السمنة المرضية (ق / ع تكميم المعدة)، polydactyly من ثلاثة أطراف، والفشل الكلوي في نهاية المرحلة تتطلب غسيل الكلى والتهاب الشبكية الصباغي (الشكل 1). لديها أيضا سحنة نموذجية، الكبد الدهني، نقص الشم وتأتب الشديد. وبالتالي، يتم تأكيد التشخيص من BBS الكلاسيكية على أسس سريرية. ويشارك autozygome من الأشقاء اثنين تتداخل مع اثنين من المعروف BBS مواضع: BBS7 وBBS12. ومع ذلك، تتابع على المستوى الجيني وRNA كشف أي المتغيرات، مما يدل على أن الرواية BBS الجينات قد تكون لهم علاقة في التسبب في المرض. التكميلية المواد، الجدول S1 يسرد الاشعال كدنا] تستخدم لاستبعاد الطفرات الربط في BBS7 وBBS12 التي قد يكون لها ضاعت على المستوى الجيني.

الشكل 1.
التعرف على عائلة BBS أن يعين موضعا الرواية. نسب الأسرة تبين طبيعة الأقارب وجود اثنين من الأطفال المتضررين (اللوحة العليا). وأظهرت الطرز الوراثية للطفرة IFT27 لكل عضو. صور الممثل polydactyly (اللوحة السفلى اليسرى) والتغيرات قاع (اللوحة السفلى اليمنى) (صورة قاع العين اليمنى تظهر الأوعية الشبكية الموهنة، شاحب القرص البصري، ضمور البقعي والتغيرات RPE منتشر) ترد. العائلة لم يوافق على عرض الصور في الوجه.

ويحدد كامل exome التسلسل طفرة جديدة في IFT27

من أجل التعرف على الطفرات المسببة في الأسرة BBS DG_7، وقد تابعت WES في المؤشر. فحص دقيق لجميع الجينات المعروفة BBS تحديد أي تغييرات المسببة للأمراض. نحن ثم يصفى مجموع 71 670 المتغيرات لتحديد الترميز متماثل / المتغيرات الربط (باستثناء التغييرات مرادفة) التي تكون موجودة داخل المشتركة autozygome من الأشقاء اثنين، ولكن تغيب في خادم Exome البديل و+357 السعودية في منزل exomes كما هو موضح سابقا (31، 32). هذا النهج القضاء على جميع ولكن متغير واحد في IFT27 [NM_006860.4. c.296G> A: ص (Cys99Tyr)] (الشكل 2). تم الحفظ جدا بقايا المتضررة، وتوقعت أن يكون البديل الإمراض التي كتبها في سيليكون وتحليل (PolyPhen 1.0، فرزت 0.0) (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، نفذنا النمذجة التماثل للهيكل IFT27 البشري باستخدام التركيب البلوري للمثلي كلاميدوموناس reinhardtii IFT27 كقالب (33). وأظهرت النتيجة أن الأحماض الأمينية C99 من IFT27 الإنسان يبدو أن تقع في قلب جزيء ويحتمل أن تشارك في استقرار التفاعلات إلى بقايا لوي الحفظ جدا قريب (الشكل 3 A). ان الطفرة C99Y يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير سلسلة جانبية (السيستئين إلى صور) الذي قد يؤدي إلى اشتباكات الفراغية مع سلاسل الجانب يسين الحفظ (الشكل 3 B)، يحتمل أن تسبب زعزعة الاستقرار في بنية البروتين.

الرقم 2.
WES يحدد IFT27 كما رواية BBS مكان. وتظهر اللوحة العليا سير العمل لتصفية متكررة من المتغيرات WES. لاحظ أن المتغير الوحيد الذي يبقى بعد التصفية هو البديل في IFT27، ويتم عرض اللوني تسلسله جنبا إلى جنب مع الضابطة للمقارنة. تظهر لوحة المتوسطة كرتون من بنية البروتين. وتظهر اللوحة السفلى محاذاة متعددة الأنواع لتسليط الضوء على الحفظ قوي من بقايا المتضررة.


الرقم 3.
3D تقديم تناظر غرار IFT27 هيكل. يقع C99 في قلب جزيء ويحتمل أن تشارك في استقرار التفاعلات إلى الحفظ جدا المخلفات لوي قريب (A). ان الطفرة C99Y يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير سلسلة جانبية (السيستئين إلى صور) الذي قد يؤدي إلى اشتباكات الفراغية مع سلاسل الجانب يسين الحفظ (B)، يحتمل أن تسبب زعزعة الاستقرار في بنية البروتين.

IFT27 C99Y هو الأليل الخسارة من وظيفة

تقديم أدلة قاطعة على أن C99Y هو أليل الإمراض، ونحن استغلال نموذجا الزرد أن نشرنا سابقا (34). يتم حفظها عاليا البروتين Ift27 الزرد مع نظيرتها الإنسان مع 54٪ مخلفات متطابقة. الأهم من ذلك، هو يحفظ بقايا C99 في الإنسان (C100 في الزرد) أيضا (الشكل 2). وبالتالي فإننا شيدت متجه التعبير عن ift27 C100Y الزرد. الأجنة الزرد شارك حقن مع morpholino بنسبة ضئيلة المنشأة ضد ift27 والسيطرة EGFP مرنا عرض الظواهر ciliopathy نموذجية. على وجه التحديد، أظهر 58.3٪ morphants (الحيوان ضربة قاضية الناتجة عن morpholino حقن) وجود عيوب تجانب، 52.3٪ مع بطني انحناء الجسم و 36.1٪ مع الكلى الكيسي (الشكل 4). وتمشيا مع السابق الدراسة، وشارك في حقن ift27-EGFP مرنا انقاذ morphants بشكل ملحوظ، مع 18.9٪ من الأجنة المحقونة تظهر العيوب تجانب، 15.5٪ مع انحناء و 13.3٪ مع الكلى الكيسي (الشكل 5). في المقابل، فشل شارك في حقن ift27C100Y-EGFP مرنا لإنقاذ أي من الظواهر. تظهر جنبا إلى جنب، وهذه النتائج أن هذا الأليل مع انخفاض شديد النشاط، إن لم يكن الخسارة من وظيفة أليل كاملة.

الرقم 4.
الظواهر من ift27 morphants. (A - C) تجانب كما يتضح من موقف القلب في 1 DPF. وتظهر الأجنة في وجهات النظر بطني. L: اليسار جانب. M: المتوسط؛ R: الجانبين الأيمن. (D) الجنين حقن مع morpholino السيطرة على ift27 مع قواعد متطابقة (C MO) في 3 DPF. (E) وهو morphant ift27 (ift27 MO) في 3 DPF. (F و G) نظرا الموسع من المناطق محاصر في D و E، على التوالي. الحمراء نقاط السهم إلى الكيس الكلى.


الرقم 5.
C100Y هو الأليل الخسارة من وظيفة. (A - C) الصور مجموعة من 4 DPF الأجنة شارك حقن مع ift27 MO وGFP مرنا (A، GFP)، ift27 MO وift27 GFP مرنا (B، ift27 GFP) وift27 MO وift27 C100Y GFP مرنا (C، C100Y GFP)؛ (D - F) الرسوم البيانية التي تبين مدى فعالية ift27 GFP أو ift27 C100Y GFP في إنقاذ العيوب تجانب (D، نسبة مشتركة من القلب المتوسطة والجانب الأيمن)، انحناء الجسم (E) والخراجات الكلى (F) لوحظ في ift27 morphants من ثلاث تجارب مستقلة. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. * P <0.05؛ ** P <0.01.

راقبنا التعبير عن النوع البري وC100Y Ift27 عن طريق التفتيش إشارات EGFP في الأجنة المحقونة، ولاحظت أن الأجنة المحقونة مع ift27C100Y-EGFP مرنا تظهر تخفيض إشارة GFP (الشكل 6 A). للتحقق من صحة هذه النتيجة، نحن حقن دفعتين مستقلة مرنا ترميز من النوع البري ومتحولة Ift27 إلى البرية من نوع الأجنة، استخراج البروتين وإجراء التحليل الغربي. وأظهرت النتائج أن مستوى البروتين الطافر وانخفاض كبير مقارنة مع النوع البري (الشكل 6 B)، مما يشير إلى أن البديل C100Y يقلل من استقرار Ift27، بما يتفق مع التنبؤ من 3D النمذجة.

الرقم 6.
يؤثر استبدال C100Y استقرار Ift27. (A) إشارة GFP في 7.5 ساعة الأجنة بعد الإخصاب حقنوا ift27 GFP (WT) أو ift27 C100Y GFP (C100Y) مرنا. (B) لطخة غربية تظهر مستوى Ift27-GFP (WT) أو Ift27 C100Y GFP (C100Y) في الجنين لست] كاملة. تم حقن الأجنة مع دفعتين مستقلة من mRNAs. واستخدمت تويولين كعنصر تحكم التحميل.

وقد تبين في وقت سابق ان في عدة نماذج BBS الزرد، والتشكل من حويصلة في كوبفر (KV)، وهي ضرورية الجهاز مهدبة لإقامة التماثل بين اليسار واليمين، ونقل إلى الوراء الأجسام الصباغية معيب (35، 36). للتحقيق في ما إذا كانت تشارك ift27 في هذه العمليات، ونحن التفتيش أولا KV التشكل في ift27 morphants وجدت لا يوجد فرق كبير (الشكل 7 A و B). درسنا كذلك النقل إلى الوراء الأجسام الصباغية بإخضاع morphants للعلاج الادرينالين. ومن المثير للاهتمام، تأخر الاستجابة جسيم ميلانيني التجميع بشكل كبير في ift27 morphants (الشكل 7 C و D)، مما يوحي بأن Ift27 قد تلعب دورا في نقل الحويصلة خارج أهداب.

الرقم 7.
ift27 هو الاستغناء عن KV التشكل ولكنه يشترك في النقل إلى الوراء الأجسام الصباغية استجابة لالادرينالين. (A) مورفولوجية KV. (B). التحليل الإحصائي لقطر KV في morphants التحكم (ن = 10) وift27 morphants = 12). (C). الأجنة مع وبدون علاج ادرينالين تبين مورفولوجيا الخلايا الصباغية. (D) التحليل الإحصائي للزمن الاستجابة في ثواني للعلاج الادرينالين في السيطرة = 10) وift27 morphants = 13). شريط النطاق في A: 20 ميكرون. CMO: حقن الأجنة مع morpholino السيطرة مع قواعد متطابقة. MO، ift27 morphant. برنامج التحصين الموسع والعلاج الادرينالين. ** P = 0.0014.

نقاش

كشفت توصيف الكيمياء الحيوية المنوي من البروتينات المشفرة بواسطة الجينات BBS أن سبعة البروتينات BBS (المشفرة بواسطة BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) تشكل نواة لمجمع بروتين، يدعى BBSome، أساسي للبروتينات غشاء الاتجار، مثل كما مستقبلات البروتين يقترن G-Somastatin مستقبلات 3، من وإلى أهداب (4، +37 - +39). بالإضافة إلى ذلك، Arl6، المشفرة بواسطة BBS3، مطلوب لاستهداف BBSomes إلى هدب (37)، وBBIP1، المشفرة بواسطة BBS18، هو مكون من BBSome ومطلوب لBBSome التجمع (20، 40). جنبا إلى جنب، وتشير هذه النتائج إلى أن عيب BBSome يمكن أن تكون الآلية الكامنة وتوحيد لBBS.
بشكل غير متوقع، في هذه الدراسة، حددنا IFT27 كما رواية BBS الجينات. IFT27 يشفر المكون من المجمع IFT-B اللازم لنقل تقدمي البروتينات الهدبية. على الرغم من البروتينات IFT هي من بين المجموعات الأولى وأفضل درس البروتينات التي تؤثر في وظائف الهدبية، والطفرات ذلك الإنسان حتى في الجينات IFT اقتصرت في عواقب المظهري لciliopathies الهيكل العظمي (41 - 48). هناك تفاعلات موثقة بين المجمعات IFT وBBSomes. في ايليجانس انواع معينة، والبروتينات BBS الجسور IFT-A والمجمعات B (49، 50). ربما الأكثر أهمية، في كلاميدوموناس، وBBSome هو شحنة من IFT (39). ومن المثير للاهتمام، ويظهر IFT27 البروتين العديد من المزايا الفريدة مقارنة مع البروتينات IFT أخرى. وهو GTPase الصغيرة التي تحمل شبها قويا لRab8 وRab11 (33)، وتشكل subcomplex مع IFT25 (51). وخلافا لمعظم البروتينات IFT، لا يتم الحفاظ على حد سواء IFT25 وIFT27 في C. ايليجانس والدروسوفيلاميلانوجاستر (52، 53)، مما يشير إلى دور أكثر تخصصا في IFT. وعلاوة على ذلك، IFT25، الشريك ملزم من IFT27، في حين يمكن الاستغناء عنها لتكون الأهداب، لتغطية تكاليف القنفذ الإشارات المناسبة (52)، تشبه بروتينات BBS متعددة (54). جنبا إلى جنب مع هذه النتائج، النتيجة في أن IFT27 تشارك في BBS يثير احتمال إثارة للاهتمام أن هذا GTPase صغير قد ربط البضائع BBSome إلى آلية IFT.
على الرغم من عدم التجانس الوراثي للBBS لم يقدر تماما، وتشير الأعمال السابقة أن أي رواية BBS الجين المرجح أن يفسر سوى نسبة صغيرة من المرضى (25). ويؤيد ذلك من قبل القليلة الماضية الجينات BBS وصف (BBS15 و ​​17 و 18) التي كانت تستند جميع على الأسر واحدة أو المرضى واحد في بعض الأحيان (10، 14، 20). وبالمثل، وتبين لنا أن واحدا فقط من تسع عائلات في هذه الدراسة يمكن تفسير الطفرات في IFT27. إذا جمعنا هذه المجموعة مع شركائنا سابقا فوج من 29 عائلة (25)، مساهمة IFT27 هو <3٪ في الأسر BBS السعودية. على الرغم من أن مساهمة IFT27 الطفرات إلى تجمع طفرة BBS في السكان الأباعد غير معروف، نشك في أنها سوف تكون صغيرة بالمثل، وتمشيا مع بعض الجينات BBS وصف مؤخرا أنه حتى الآن لم يتم تحديدها خارج الأسر الأصلية / الحالات التي كانوا تحديدها. ومع ذلك، وتحديد رواية نادرة الجينات BBS مهم حيث أنه يوفر معلومات مفيدة في أهداب البيولوجيا وciliopathies بشكل عام، والتسبب الجزيئي للBBS على وجه الخصوص.
وخلاصة القول، أن نحدد IFT27 كما رواية BBS جين المرض باستخدام الخرائط الموضعية، WES وتأكيد وظيفية في نموذج الزرد. وهذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تورط بروتين IFT في التسبب في BBS.

المواد والأساليب

بالكائن البشري

تم تشخيص المرضى الذين يعانون من BBS وفقا للمعايير المحددة التي تأخذ بعين الاعتبار عدد من المظاهر السريرية الكبرى والصغرى (5). تم تجنيد جميع المرضى وأفراد العائلة ذات الصلة باستخدام بروتوكول المعتمد IRB مع الموافقة المسبقة. تم جمع الدم الوريدي في أنابيب EDTA، وعند الاقتضاء، في PAXGene لاستخراج DNA و RNA، على التوالي.

Autozygome تحليل تقرير والجينات مرشح

وكان تقرير لمجموعة كاملة من فترات ذاتي الأمشاج للفرد (autozygome) أساسا كما هو موضح سابقا (30). لفترة وجيزة، تم إجراء التنميط الجيني الجينوم على نطاق على منصة اكسيوم باتباع إرشادات الشركة المصنعة. وأعقب ذلك تحديد أشواط من زيجوت متماثلة الألائل كبديل للautozygosity باستخدام برنامج autoSNPa (55). تم فحص قائمة 18 تعرف جينات المرض BBS عبر إحداثيات autozygome المشتركة الأفراد المتضررين لتحديد أي الجينات لتضخيم والتسلسل (56). متوفرة عند الطلب الاشعال PCR والظروف.

كامل exome التسلسل

تم تنفيذ القياسي تسلسل كامل exome باستخدام TruSeq Exome إثراء مجموعة (البورشيد) تليها إعداد مكتبة التسلسل البورشيد، مع إثراء للهدف المطلوب باستخدام بروتوكول إثراء البورشيد Exome. والتسلسل المكتبات استولت باستخدام IlluminaHiSeq 2000 التسلسل. ويقرأ تم تعيينها ضد UCSC hg19 من قبل التحالف. تم الكشف عن تعدد الأشكال وIndels التي كتبها SAMTOOLS.

في النمذجة سيليكون

وأجري النمذجة تناظر من IFT27 الإنسان من استخدام كل من المنمذج برنامج وخادم النمذجة الآلية I-TASSER، التي صنفت كأفضل الخادم في تقييم نقدي الأخير من تقنيات لبنية البروتين المسابقات النمذجة التنبؤ (+57 - 59). يتم النمذجة عن طريق المنمذج في الخطوات التالية. قبل النمذجة، ومحاذاة تسلسل IFT27 الإنسان مع أن من كلاميدوموناس reinhardtii IFT27، الذين الكريستال هيكل وقد تم تحديد (PDBID: 2YC2) (33). وفي وقت لاحق، وكانت متواليات الانحياز مدخلات المنمذج للنمذجة تناظر باستخدام البنية البلورية كلاميدوموناس IFT27 كقالب باستخدام وظيفة المدمج في لالمنمذج. هو ممنوح الثقة في النمذجة تناظر بنسبة (ط) درجة عالية من التماثل تسلسل بين الجزيئات الإنسان وكلاميدوموناس IFT27 (الهوية ~37٪ و~54٪ تشابه)، و (ثانيا) تشابه النماذج الناتجة تنتجها المنمذج وI -TASSER. النموذج الناتج هو موثوق بها وخاصة بالنسبة للمنطقة حول بقايا C99، التي تحيط بها بقايا لوي الحفظ جدا في IFT27 البروتينات.

تربية الزرد

واستمر الزرد وفقا لبروتوكولات القياسية (60). وقد تم الحصول على البيض من خلال التفريخ الطبيعي.

ضربة قاضية، وتحليل النمط الظاهري والإنقاذ التجارب في الزرد

A morpholino بنسبة ضئيلة المنشورة سابقا (5 'GGAGGTAATAGTGTGTGTCTACGTG 3') ضد الموقع الشروع متعدية ift27 (34 تم استخدام) لضربة قاضية للتعبير عن ift27. تم استخدام morpholino مع خمس قواعد mispaired (5 'GGA ج GTAATA ج TGT ج ز TGT TAC ج TG 3'، وحالات انخفاض ومسطرة) باعتباره morpholino السيطرة. تم الحصول على GFP بناء ift27 C100Y بواسطة الطفرات موقع الموجه بناء على البلازميد ift27 GFP (34). ift27 GFP أو تم تصنيعه ift27 C100Y GFP مرنا في المختبر باستخدام عدة mMESSAGE mMACHINE (AMBION، AM1340).
للمقايسة الإنقاذ، كان 150 خريج من ift27 GFP مرنا أو ift27 C100Y GFP مرنا شارك في حقن 2 نانوغرام من ift27 morpholino إلى الأجنة خلايا مرحلة واحدة. وقد لوحظت الأجنة لعيوب تجانب على أساس موقف القلب في 1 DPF (يوم بعد الإخصاب)، للانحناء الجسم على 2 إدارة الشرطة الاتحادية، والخراجات سليفة الكلوة في 3-4 DPF.
لتفقد مورفولوجية KV، وقد شنت الأجنة الحية في جميع أنحاء مرحلة 14 الجسيدة في 3٪ ميتيل، تصوير باستخدام تدخل الفرق النقيض المجهري، وتم قياس قطر في برنامج فوتوشوب. تم تأكيد فعالية morpholino عن طريق التفتيش نفس دفعة من الأجنة المحقونة للجسم انحناء النمط الظاهري في 1 DPF.
تم إجراء فحص النقل جسيم ميلانيني باستخدام بروتوكول نشرت سابقا (35) مع تعديلات طفيفة. على وجه التحديد، تعرضوا 2 DPF الأجنة إلى 3.75 م م الادرينالين في المتوسط ​​الجنين وتفتيشها تحت نطاق تشريح. تم تسجيلها في وقت والاستجابة لكل جنين.

استخراج البروتين والنشاف الغربي

تم deyolked الأجنة في برنامج تلفزيوني يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز (روش، REF11836170001) والمتجانس في تريس العازلة تحلل (50 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 150 م م كلوريد الصوديوم، 0.5٪ NP40، 0.1 م م DTT) يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز . تم التشويه والتحريف البروتينات في SDS عينة العازلة عند 100 درجة مئوية لمدة 7 دقائق وتطهيرها عن طريق الطرد المركزي في 12 000 ز لمدة 3 دقائق. لالنشاف الغربي، كانت تستخدم الماوس مكافحة GFP مفتش (روش) والفأر مكافحة تويولين (المسابر الجزيئية، A11126) في 1: 1000 كما الأجسام المضادة الأولية. تم استخدام الأجسام المضادة البيروكسيديز مترافق الفجل الثانوية (جاكسون المناعية للبحوث) في 1: 2000. تعرض الأغشية لتعزيز الكشف عن معان كيميائي باستخدام الإضاءة الغربية بالإضافة إلى ECL مجموعة (بيركن، إلمر علوم الحياة).

التحليل الاحصائي

وقد تم الحصول على -values ​​P من خلال ر الطالب -test باستخدام Microsoft Excel.

المواد التكميلية


التمويل

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة دبي هارفارد للأبحاث الطبية التعاونية منحة بحثية (لFSA)، R01 DK092808 من المعهد الوطني للصحة ومنحة بحثية RSG-10-247-01-DDC من الجمعية الأمريكية للسرطان (لZS) و الأساسية الحيوان لمركز البحوث تكيس أمراض الكلى في جامعة ييل (DK090744).

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس