عرض مشاركة واحدة
  #3  
قديم 10-19-2015, 11:58 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي وAngelman متلازمة بتحول يغاز يموضع إلى المشبك والنواة، والنتائج نقص الأمهات في غير طبيعي التشكل العمود الفقري شجيري

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/17/1/111.full

https://translate.googleusercontent....UmiiO2XTMmzlUA



فقدان وظيفة أليل الموروثة للأمهات لجين UBE3A بتحول يغاز يسبب متلازمة أنجلمان (AS)، الذي يتميز باعتلال عصبي شديد وضعف المحرك. بالإضافة إلى ذلك، UBE3A تقع ضمن المنطقة كروموسوم 15q11-Q13، حيث الأم، ولكن ليس الأب، الازدواجية تسبب مرض التوحد. منتج الجين UBE3A، E6-AP، وقد تبين أن تعمل على حد سواء باعتبارها يغاز E3 في مسار بتحول proteasome وونتيجة لcoactivator النسخي. ومع ذلك، فإن الدور المحدد للE6-AP في الدماغ، أو كيفية فقدان وظائف النتائج E6-AP في AS، غير واضح. هنا، وتبين لنا، وذلك باستخدام الماوس المعدلة وراثيا المؤتلف تعبر عن Ube3a YFP الانصهار الجين، أن الأمهات Ube3a YFP أليل هو upregulated وأعرب تفضيلي في الخلايا العصبية، وهذا البروتين الانصهار، E6-AP: YFP، وأثرى في النواة والتشعبات في الجسم الحي. وتبين لنا أيضا أن E6-AP: YFP يموضع إلى النواة والمقصورات قبل المشبكي وبعد المشبكي في الخلايا العصبية الحصين مثقف. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن عدد الخلايا العصبية للدماغ والمتفرعة شجيري لا تتأثر في Ube3a الفئران الأم التي تعاني من نقص، ولكن هذا التطور العمود الفقري شجيري، بما في ذلك التشكل العمود الفقري، وعدد وطول، وأثرت على الخلايا العصبية للدماغ وعلى الخلايا العصبية الهرمية في قرن آمون و القشرة. بشكل جماعي، وتشير هذه البيانات إلى أن العجز العصبية التي لوحظت في AS المرضى وAS الفئران قد تنجم عن تشوهات معينة في التنمية متشابك و / أو اللدونة.
مقدمة

وتتميز متلازمة أنجلمان (AS) التي تخلف عقلي شديد، وغياب خطاب، وترنح والتصرف سعيد (1، 2). وAS الجينات، UBE3A، بترميز بتحول يغاز E6-AP ويخضع ليطبع الجينومية، مع التعبير الأمهات محددة تفضيلية في الدماغ، وبشكل أكثر تحديدا، في الخلايا العصبية ولكن ليس في الدبقية (3، 4). الازدواجية الخلالي الأب الأم ولكن ليس من كروموسوم 15q11-Q13 سبب مرض التوحد (5). وتشمل هذه الازدواجية جينات متعددة، ولكن UBE3A هي مرشح قوي للمساهمة في النمط الظاهري التوحد في حالات الازدواجية 15q11-Q13 على أساس وضعها مطبوع ودور المسبب للمرض المعروف في AS (6). وتعتبر اضطرابات طيف التوحد يعانون من متلازمة برادر ويلي وAS، والظواهر اثنين المرتبطة الحذف الأب والأم من 15q11-Q13، على التوالي (7، 8).
الفئران مع طفرة اغية الأمهات في Ube3a (AS الفئران) لديها عيوب في التقوية على المدى الطويل (LTP) والحركية واضح والانحرافات السلوكية التي النتائج موازية في AS على الرغم من العمارة الخلوية العادية في الدماغ (9). وقد عجز العصبية في الفئران AS مرتبطة مباشرة بعد المشبكي الكالسيوم / كالمودولين نوع كيناز 2 (كمكي) إشارات الطريق، وAS الفئران ازدادت الفسفرة المثبطة للαCaMKII في الدماغ (10). وعلاوة على ذلك، والتعلم والعجز السلوكية تقدم في AS يمكن انقاذ الفئران من خلال طفرة في كمكي يمنع الفسفرة المثبطة لها (11). وربطت تقارير أخرى E6-AP لمختلف البروتينات ذات الصلة عصبيا بما في ذلك تسلسل تحويل الخلايا الظهارية 2 الجين الورمي (Ect2) (12)، العصبية البروتين التفاعل على وجه التحديد مع TC10 (nPIST) (13) وملزم MYC البروتين 2 (MYCBP2) ( ortholog من ذبابة الفاكهة موقع HighWire) (14)، على الرغم من أهميتها الوظيفية من هذه التفاعلات غير واضحة.
وAS البروتين، E6-AP، ثلاثة إيسفورمس التي تختلف في N-محطة (15)، هو متعدد الوظائف E3 بتحول يغاز ولها نشاط coactivator النسخي (16)؛ ومن المعروف أن بعض أهداف ubiquitination (مثل البروتين p53 oncoprotein)، ولكن لا شيء تسليط الضوء على AS النمط الظاهري أو وظيفة E6-AP في الدماغ. على الرغم من Ube3a يتم التعبير بشكل كبير في الخلايا العصبية على أساس دراسات في الموقع التهجين، وتوطين التحت خلوية من E6-AP يزال غير واضح، ولا سيما ما يتعلق بالأنشطة يغاز coactivator النسخي وبتحول مزدوجة، وكيف يسبب نقصه في AS النمط الظاهري.
هنا، وتبين لنا، وذلك باستخدام الضربة القاضية في Ube3a YFP مراسل الانصهار الماوس، وهذا ما يعبر عنه Ube3a YFP تفضيلي من أليل الأمهات في الخلايا العصبية المركزية وإنما يعبر biallelicly في الخلايا الدبقية، وأن E6-AP: انصهار بروتين YFP يموضع على حد سواء ل نواة والمشبك. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن الفئران يعانون من نقص الأمهات لUbe3a لها الشاذ شجيري التشكل العمود الفقري والكثافة.

النتائج

جيل من Ube3a YFP الفئران مراسل

من أجل دراسة الخلية من نوع أليلية الوالدين تعبير عن Ube3a واستجلاء توطين الخلوية من الجين المنتج Ube3a، E6-AP، أنتجنا الفئران مع الضربة القاضية في الطفرات التفجير YFP إلى C-محطة من E6-AP ( الشكل 1 A-C؛ المستهدفة أليل، Ube3a YFP؛ البروتين الانصهار، E6-AP: YFP). تم تزاوج الفئران Ube3a YFP مع البرية من نوع (WT) الفئران للحصول على ذرية التي ورثت أليل Ube3a YFP إما عن طريق الخط الجرثومي الأم أو الأب. على أساس زيادة الوزن الجزيئي للE6-AP: YFP (E6-AP، 100 كيلو دالتون، E6-AP: YFP، 130 كيلو دالتون)، كنا النشاف الغربي للتمييز التعبير عن أليل Ube3a YFP وفقا لالأصل المنشأ . لست] المخيخ من الفئران وراثة أليل Ube3a YFP أمومي، ولكن ليس أبويا، كشفت زيادة في الوزن الجزيئي للE6-AP، مشيرا إلى التعبير الأمهات تفضيلية للأليل Ube3a YFP (الشكل 1 D). وأكد التعبير الأمهات محددة من Ube3a YFP في المخيخ أيضا مع مضاد-YFP الأضداد (الشكل 1 D). وعلاوة على ذلك، فإن كمية E6-AP: كان YFP انصهار بروتين الكشف عنها من قبل لطخة غربية بما يتفق مع مستويات الذاتية البروتين E6-AP، مشيرا إلى أن التعبير عن Ube3a YFP لم تتغير بشكل فاضح من قبل جيل من البروتين الانصهار (الشكل 1 D ). بالإضافة إلى ذلك، كانت الدراسات مع الأجسام المضادة متعددة لE6-AP في الفئران WT تتفق مع أنماط التوزيع رؤيتها انصهار بروتين (لا تظهر البيانات).

الشكل 1.
جيل من Ube3a YFP الفئران المراسل. (A). توضيح تخطيطي لموضع الجيني Ube3a (أعلى)، Ube3a YFP -targeting بناء (TC، وسط) وUbe3a YFP -targeted أليل (القاع). تم استخدام موقع تقييد SPH I يقع المنبع من وقف كودون متعدية لإزالة كودون وقف وصهر مراسل الجين YFP إلى C-محطة من E6-AP. (B) تحليل لطخة الجنوبي من النوع البري (+ / +) وUbe3a YFP [E6-AP: YFP (EY) EY / +] خلايا ES إيجابية. تم هضمها DNA مع منظمة التعاون الاقتصادي RV وتهجين مع الذراع الأيسر (LA) التحقيق هو مبين في (A). أحجام جزء لنوع البرية (+ / +) وEY (EY / +) الأليلات هي 9.0 و 12.0 كيلوبايت، على التوالي. تم هضمها DNA مع تجربة الاقتراب من الموت أنا وتهجين مع الذراع اليمنى (RA) التحقيق. أحجام جزء لنوع البرية (+ / +) وEY (EY / +) الأليلات هي 7.9 و 10.9 كيلوبايت، على التوالي. (C) تحليل لطخة الجنوبي من النوع البري (+ / +)، Ube3a YFP متخالف (EY / +) وUbe3a YFP DNA الذيل متماثل يتفاعل مع منظمة التعاون الاقتصادي RV وبحث مع لجنة التحقيق LA. تم تنفيذ (D) البقع الغربية مع النوع البري (+ / +)، Ube3a YFP الأم (EY / +) وUbe3a YFP الأب (+ / EY) عصائر وبحث مع المضادة للE6AP (اللوحة اليسرى) أو مكافحة YFP (يمين لوحة) مما يدل التعبير الأمهات من Ube3a YFP في المخيخ. ايكو RV؛ N، تجربة الاقتراب من الموت الأول؛ S، SPH I.

تحليل Ube3a YFP التعبير أليلية وتوطين الخلوية في الجسم الحي

بعد ذلك، درسنا نوع من الخلايا في التعبير عن Ube3a YFP وفقا لالوالدين وللأصل، وتوطين التحت خلوية من E6-AP: YFP في الدماغ باستخدام التصوير متحد البؤر. و immunostained أقسام المجمدة من الكبار Ube3a YFP الأم وUbe3a YFP العقول الأب مع مكافحة YFP ومكافحة GFAP، وهي علامة الخلية الدبقية، أو مكافحة YFP ومكافحة calbindin، والمخيخ العصبية خلية علامة. Ube3a YFP الفئران الأمهات أظهرت مستويات عالية التعبير في الخلايا العصبية الهرمية القشرية وقرن آمون (الشكل 2 A و D)، في حين تم الكشف عن التعبير بصوت ضعيف فقط في المناطق المقابلة في Ube3a YFP الفئران الأب (الشكل 2 A). في المخيخ، وأعرب عن Ube3a YFP في الخلايا العصبية والخلايا العصبية في في طبقات الحبيبية والجزيئية، وإن كان بمستويات منخفضة (الشكل 2 B). تم الكشف عن التعبير Biallelic من Ube3a YFP في الخلايا GFAP إيجابية بطانة البطينات الجانبية، على الرغم من وأعرب كل أليل عند مستويات أقل مما ظهر مع التعبير عن أليل الأمهات في الخلايا العصبية في المنطقة CA3 للقرن آمون (الشكل 2 C). تم التعبير Biallelic يقتصر على الخلايا GFAP إيجابي بطانة البطينين، بما في ذلك البطين الثالث (لا تظهر البيانات)، وكان لا يمكن كشفها بسهولة في الخلايا النجمية GFAP إيجابية في مناطق أخرى من الدماغ. تم الكشف عن التعبير عن Ube3a الأمهات المستمدة YFP في معظم مناطق الدماغ بما في ذلك الحصين، القشرة، المهاد، البصلة الشمية والمخيخ. تم الكشف عن Ube3a YFP الأب التعبير بصوت ضعيف فقط في هذه ومناطق أخرى من الدماغ، وبصرف النظر عن التعبير في الكشف عن الخلايا GFAP إيجابية بطانة البطينين. لكل سكان الخلية العصبية، E6-AP: YFP المترجمة في المقام الأول إلى النواة، ولكن بالإضافة إلى ذلك موجود في سوما والتشعبات كما ينظر بشكل واضح في هرمية، العصبية والخلايا العصبية البصلة الشمية (الشكل 2 D، E و F). وتشير هذه البيانات إلى أن Ube3a YFP يخضع التعبير وفيرة تفضيلية للأليل الأمهات حصرا في الخلايا العصبية، والتي E6-AP: YFP يموضع إلى النواة، سيتوبلازم خلايا الجسم والعمليات في هذه الخلايا.

الرقم 2.
Ube3a YFP يخضع التعبير الأمهات محددة تفضيلي في الخلايا العصبية والتعبير biallelic في الخلايا المبطنة GFAP البطينين. تم الكشف عن (A) Ube3a YFP التعبير في الهرمية (السنة التحضيرية) الخلايا العصبية في القشرة (CTX) والمنطقة CA1 من الحصين عندما ورثت من خلال الأمهات (يسار)، ولكن ليس الأب (اليمين)، خط الجرثومية. تم الكشف عن (B) Ube3a YFP التعبير أيضا في طبقة الخلايا العصبية للدماغ (PL) وفي الخلايا العصبية في الطبقة الحبيبية (GR) وطبقة الجزيئية (ML) عندما أمومي، ولكن ليس من الأب، ورثت. تم الكشف عن (C) Biallelic التعبير عن Ube3a YFP في الخلايا GFAP إيجابي يقع بالقرب من البطينات الجانبية (خلايا كبسولة الخارجية). كان التعبير عن أليل الأمهات Ube3a YFP العالي في الخلايا العصبية CA3 (السهم الأبيض) مقارنة مع الخلايا GFAP إيجابية بالقرب من البطين الجانبي. أظهرت أعلى صورة التكبير من المنطقة CA1 في قرن آمون (D) والمخيخ (E) أن الأمهات المستمدة Ube3a YFP وأعرب غاية في الخلايا العصبية. كان YFP تلطيخ على أشده في نوى لكن يمكن كشفها بسهولة في سيتوبلازم خلايا الجسم والتشعبات: E6-AP. في المخيخ، وتلطيخ على أشده في نوى الخلايا العصبية ولكن يمكن كشفها بسهولة في نوى الخلايا العصبية في طبقة الجزيئية (ML)، والطبقة الحبيبية (GL). تم الكشف عن ضعف في تلطيخ العصبية السيتوبلازم الخلية والعمليات. (F) التعبير عن الأمهات Ube3a EYFP تم اكتشاف بالإضافة إلى ذلك في الخلايا العصبية الشمية. المفوضية الأوروبية، كبسولة الخارجية؛ MC، خلية التاجية. YFP، ومكافحة YFP. GFAP، ومكافحة GFAP. CB، ومكافحة calbindin. شريط النطاق: (A) و (B) 100 ميكرون. (C)، (D)، (E) و (F) 20 ميكرون.

E6-AP: YFP يموضع إلى كل من المقصورات قبل المشبكي وبعد المشبكي في الخلايا العصبية الحصين فصلها في الثقافة

منذ E6-AP: أثريت YFP في نوى الخلايا العصبية، وكان حاضرا بالإضافة إلى ذلك في خلايا الجسم والتشعبات، كما رأينا في قرن آمون الخلايا العصبية CA1 الهرمية (الشكل قمنا بتحليل بجانب توطين التحت خلوية من E6-AP D): YFP في الخلايا العصبية الحصين فصلها النامية في الثقافة المستمدة من الفئران مع رثت أمومي Ube3a YFP أليل. الخلايا العصبية قرن آمون في 1-4 أيام في المختبر (DIV) أظهرت مستويات عالية من E6-AP: YFP في المخاريط نمو neurites التي النامية ونواة (الشكل 3 A). في 4 DIV، وكان يستخدم لمكافحة MAP2 وصمة عار التشعبات، ومستويات عالية من E6-AP: تم الكشف عن YFP في المخاريط نمو كل من المحاور والتشعبات (الشكل 3 B). من أجل دراسة ما إذا كانت E6-AP: كان YFP حاضرا في المشبك، قمنا بتحليل الخلايا العصبية Ube3a YFP تربيتها لمدة 25 DIV ومزدوجة ملطخة مكافحة synaptophysin، حويصلة علامة قبل المشبكي، ومكافحة YFP. أثريت YFP غاية في النواة وكانت موجودة على طول المحاور والتشعبات: E6-AP. وأشارت صور من المحاور التي E6-AP: YFP colocalized مع synaptophysin نقاط واضحة على طول المحاور (الشكل 3 C). في التشعبات، لوحظ وجود نمط مختلف من تلطيخ، مع E6-AP: YFP يجري توزيعها منتشرة والتي لا تشكل نقاط واضحة. ومع ذلك، E6-AP: تم الكشف عن YFP في نتوءات تشبه العمود الفقري على طول مهاوي الجذعية، واظهار بعض تلطيخ الإيجابية والسلبية لsynaptophysin (الشكل 3 D). بشكل جماعي، وهذه النتائج تشير إلى أن E6-AP: YFP يموضع بشكل مختلف إلى النواة، مخروط النمو والمشبك، بما في ذلك المقصورات قبل المشبكي وبعد المشبكي في الخلايا العصبية قرن آمون في الثقافة، مما يوحي بأن E6-AP يمكن أن تنظم تطوير و / أو وظيفة نقاط الاشتباك العصبي مباشرة.

الرقم 3.
توزيع داخل الخلايا E6-AP: YFP إلى النواة والمشبك في الخلايا العصبية الحصين فصلها. E6-AP: YFP يخضع الاتجار الفرق بين الخلايا لمخروط النمو، المشبك (قبل المشبكي وبعد المشبكي) ونواة الخلايا العصبية في قرن آمون فصلها. (A) صور متحد البؤر التي اتخذت من Ube3a YFP الخلايا العصبية المشتقة من الأمهات في 1 و 2 و 3 و 4 DIV أثبتت أن E6-AP: YFP أثريت في النواة (السهام البيضاء) والمخاريط نمو neurites التي التطويل الأولية. تم تضخيم نهايات neurites التي الأولية لإظهار إثراء E6-AP: (يتم توسيع متقطع صناديق لوحات أدناه) YFP. (B) الصور الملتقطة من الخلايا العصبية Ube3a YFP 4 DIV ملطخة مكافحة MAP2 ومكافحة YFP أشارت توطين E6-AP: YFP على كل المحاور والتشعبات في الخلايا العصبية النامية. (C) عالية التكبير صور مبائر المتخذة من 25 DIV الخلايا العصبية ملطخة مكافحة synaptophysin (SYP) ومكافحة YFP أظهرت التكتل واضح من E6-AP: YFP مع synaptophysin على طول المحاور. (D) جنبا إلى جنب مهاوي الجذعية، E6-AP: EYFP تم توزيع منتشرة وكان حاضرا في العمود الفقري شجيري (السهام البيضاء). شريط النطاق: 10 ميكرون في (C) و (D).

لا تتأثر المخيخ عدد الخلايا العصبية والمتفرعة شجيري عن فقدان الأم E6-AP

قمنا بتقييم المقبل المخيخ عدد العصبية الخلية وشجيري المتفرعة في Ube3a الفئران الأم التي تعاني من نقص (AS الفئران) (9، 17). قمنا بتحليل سلامة الخلايا العصبية للدماغ في WT وAS الفئران من خلال دراسة منظمة، وعدد الخلايا الجذعية المتفرعة من خلال تلطيخ calbindin، التي immunolabels سوما الخلية العصبية والتشعبات. تم توزيع وتنظيم الخلايا العصبية في الفئران AS مماثلة لWT، مع عدم وجود اختلافات واضحة كونها واضحة على مستوى المجهر الضوئي. وعلاوة على ذلك، ونحن لم يكشف عن أي اختلافات في عدد الخلايا العصبية بين WT وAS الفئران (WT، 11.98 ± 0.83 / 250 طبقة ميكرون PC، AS، 11.64 ± 0.19 / 250 ميكرون؛ P = 0.7)، ولم نكتشف أي اختلافات في calbindin تلطيخ الأشجار الجذعية، وهو مؤشر غير مباشر من الخلايا العصبية الكثافة الشجرية والمتفرعة (الشكل 4 أ) (18). هذه الملاحظات تتفق مع التقارير السابقة (9، 19). في مناطق أخرى في الدماغ، لم يكن هناك أي تشوهات واضحة لوحظ من خلال تحليل المناعى. لذلك، وهذه البيانات تشير إلى أن العجز العصبية التي لوحظت في AS الفئران لا تنشأ من تشوهات التي تنطوي على عدد الخلايا العصبية أو المتفرعة شجيري.

الرقم 4.
فقدان الأم E6-AP لا يؤثر على المخيخ تنظيم الخلايا العصبية أو المتفرعة شجيري. (A) صور الممثل تظهر متحد البؤر تلطيخ calbindin في WT وAS (خالية الأمهات) الفئران. الخلايا العصبية في الفئران AS تشير منظمة مماثلة والمتفرعة مقارنة مع WT. (B) التحليل الكمي للمتحد البؤر تلطيخ calbindin في التشعبات الخلية العصبية كمؤشر غير مباشر من المتفرعة. وكان متوسط ​​calbindin مضان عبر العصبية سوما الخلية والتشعبات لا يعتد به إحصائيا بين WT وAS الفئران، مشيرا العادي شجيري الخلايا العصبية المتفرعة في AS الفئران. موانئ دبي، ونقاط البيانات.

AS الفئران لها العمود الفقري شجيري غير طبيعية في الخلايا العصبية للدماغ والحصين والخلايا العصبية الهرمية القشرية

ونظرا لوجود E6-AP: YFP في التشعبات في الجسم الحي وعند نقاط الاشتباك العصبي في الخلايا العصبية مثقف، أجرينا جولجي تلطيخ في WT وAS الفئران من أجل دراسة مورفولوجية شجيري العمود الفقري والكثافة. تم استخراج العقول من الكبار WT وAS تتزاحم والمشرب جولجي. تم فحص المقابلة مقاطع من WT وAS الفئران بواسطة المجهر الضوئي. وكشفت الصور التي العمود الفقري شجيري على طول الخلايا العصبية، هرمي الحصين والخلايا العصبية الهرمية القشرية في WT الفئران ظهرت "مثل فطر" مع رؤوس كبيرة ورقيقة، وأعناق قصيرة مرصع على طول التشعبات. في المقابل، العمود الفقري في AS الفئران عرضها على التشكل متناسقة، بما في ذلك التباين الشديد في العمود الفقري طول العنق وحجم الرأس. يبدو أن كثافة العمود الفقري أيضا أقل في AS الفئران مقارنة مع الفئران WT (الشكل 5 A). لأن جعلت كثافة عالية والازدحام في العمود الفقري في الخلايا العصبية تحليل مفصل صعبة، ونحن كميا العمود الفقري شجيري في قرن آمون والخلايا العصبية الهرمية القشرية (الشكل 5 A). وقد تم تحليل التشعبات قمية الثانوية قريبة من سوما الخلية وتمتد أفقيا من الخلايا العصبية الهرمية في المنطقة CA1 لكثافة العمود الفقري شجيري وطول في WT وAS الفئران. كشف الكمي التي AS أظهرت الفئران انخفاضا كبيرا في كثافة العمود الفقري مقارنة مع الفئران WT (WT، 1.614 ± 0.076 العمود الفقري / ميكرون، AS، 1.228 ± 0.055 العمود الفقري / ميكرون؛ P = 0.0003؛ الشكل 5 B). ولوحظ وجود انخفاض في العمود الفقري على طول التشعبات قمية القشرية أيضا في AS الفئران (WT، 1.172 ± 0.044 العمود الفقري / ميكرون، AS، 0.882 ± 0.057 العمود الفقري / ميكرون؛ P = 0.0009؛ الشكل 5 C). نحن كميا بجوار أطوال العمود الفقري في التشعبات الحصين، وAS الفئران أظهرت انخفاض كبير في متوسط ​​طول العام العمود الفقري مقارنة مع WT (WT، 1.16 ± 0.0038 ميكرون، AS، 1.017 ± 0.0454 ميكرون؛ P = 0.03؛ الشكل 5 D). التشعبات الهرمية في AS الفئران أظهرت أيضا دوالي على طول رمح شجيري الثانوي (الشكل 5 A). وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من التشعبات بدا أرق في AS الفئران النسبية على الفئران WT. بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن فقدان النتائج E6-AP الأمهات في غير طبيعية تنمية العمود الفقري شجيري وربما تكمن وراء العجز في اللدونة متشابك وظيفية لوحظ في AS الفئران.

الرقم 5.
غير طبيعي التشكل العمود الفقري شجيري في الفئران يعانون من نقص الأمهات لE6-AP. AS الفئران أظهرت العمود الفقري شجيري غير طبيعية في المخيخ، العصبونات القشرية وقرن آمون، على الرغم من العمارة الخلوية العادية والمتفرعة شجيري. (A) وصور مجهرية ضوئية من جولجي مشربة-العصبية الخلية (PC)، قرن آمون (HP) الخلايا العصبية الهرمية والقشرية الخلايا العصبية (CT) هرمي أظهرت AS الفئران قد خفض كثافة العمود الفقري شجيري والتشكل غير طبيعي في AS الفئران مقارنة مع الفئران WT. وبالإضافة إلى ذلك، كان AS الفئران تورمات (السهام السوداء) على طول التشعبات قمية الثانوية. (B) و (C) كثافة العمود الفقري شجيرى انخفض بشكل كبير على طول التشعبات قمية الثانوية في CA1 الخلايا العصبية الهرمية وعلى طبقة 3-5 الخلايا العصبية الهرمية القشرية في AS الفئران. (D) ويبلغ متوسط ​​طول العمود الفقري شجيري طول التشعبات قمية في CA1 الهرمي تم تخفيض في AS الفئران. شريط النطاق: 10 ميكرون. أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط. * P = 0.03، P = 0.0003 ** ***، P = 0.0009.

مناقشة

في هذه الدراسة، درسنا التعبير الخلية من نوع وتوطين التحت خلوية من E6-AP في الدماغ من خلال Ube3a YFP الضربة القاضية في الانصهار مراسل الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، درسنا أدمغة الفئران لAS الظواهر المورفولوجية حتى الآن لم يتم كشفها المرتبطة العجز العصبية الموجودة في هذه الفئران. نتائجنا تشير الى ان Ube3a ويعبر عن درجة عالية من أليل الأمهات تحديدا في الخلايا العصبية، والتي E6-AP يموضع بشكل مختلف إلى النواة والمشبك، حيث أنها قد تعمل محليا لتنظيم وضع متشابك واللدونة.
وقد أشارت دراسات سابقة إلى أن الجينات الماوس Ube3a يخضع يطبع الجينومية مع التعبير التفضيلي للأليل الأمهات في الخلايا العصبية المركزية في الدماغ (3، 17). نتائجنا تتفق مع هذه الملاحظات السابقة وتبين من خلال التحاليل المجراة أن يتم التعبير عن أليل الأب عند مستويات منخفضة إلى غير قابلة للكشف جدا في الخلايا العصبية، في حين يتم التعبير عن كل من الأليلات بالتساوي تقريبا في الخلايا الدبقية بطانة البطينين. والجدير بالذكر أن لاحظنا upregulation من أليل الأمهات في الخلايا العصبية النسبية للأليل الأمهات أعرب في الخلايا الدبقية مع التعبير biallelic. لاحظنا أيضا أن E6-AP: YFP والمترجمة تفاضلي بين النواة وخلايا الجسم سوما، وتمتد إلى مخروط النمو والمقصورات قبل المشبكي وبعد المشبكي في الخلايا العصبية قرن آمون في الثقافة. هذه النتائج تدعم الدور متنوعة لE6-AP باعتباره يغاز بتحول وcoactivator النسخي.
ملاحظاتنا أن AS الفئران لديها بنية الخلوية العادية في الدماغ ولكن تمتلك العمود الفقري شجيري التي هي على شكل غير طبيعي وانخفاض في حجم وكثافة تشير إلى أن E6-AP لا ينظم تكوين الخلايا العصبية في حد ذاتها، ولكنها قد تعمل محليا لتنظيم وضع العمود الفقري أو اللدونة متشابك . يدعم وجود E6-AP في المشبك المزيد من هذه الفكرة (20)، على الرغم من أننا لا يمكن استبعاد إمكانية مساهمة دورا النووي لE6-AP في تنظيم هيكل و / أو وظيفة المشبك. وقد ثبت بما يتفق مع نماذج الماوس الأخرى للتخلف العقلي، مثل X الهش ومتلازمة ريت، AS الفئران بشكل واضح من امكانات تغيير الأشكال التضاريسية العمود الفقري. Fmr1 الفئران فارغة والمرضى X الهش لامتلاك العمود الفقري شجيري طويلة بشكل غير طبيعي، وكذلك زيادة كثافة العمود الفقري شجيري في مختلف السكان العصبية (+21 - +27). في المقابل، وقد ثبت MeCP2 الفئران -deficient والمرضى ريت لعرض انخفاض كثافة العمود الفقري شجيري (+28 - +30). وتمشيا مع ملاحظاتنا في AS الفئران، Fmr1 وMeCP2 الفئران الخالية تمتلك نضوج الخلايا العصبية على ما يبدو العادي وتشجر لكن اضح التنمية المشبك غير طبيعية.
وإن كانت هناك أهداف محددة من E6-AP ubiquitination تحديدها حتى الآن من شأنها أن تسهم في فهمنا لE6-AP وظيفة متشابك، لا يوجد دليل على تأثيرات على مسار كمكي. وقد أظهرت الدراسات التي أجريت في AS الفئران أن نقص النتائج Ube3a في زيادة الفسفرة المثبطة وخفضت بعد المشبكي كمكي المرتبطة الكثافة (10). وقد أظهرت دراسات أخرى الإنقاذ من الظواهر السلوكية AS في المسوخ كمكي عن طريق إدخال طفرة إضافية في موقع الفسفرة المثبطة للαCaMKII. لذلك، مما يدل على ديسريغولاتيون من كمكي من المرجح الأساس الجزيئي الكامن وراء العجز LTP (11). وتمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها في العمود الفقري شجيري غير طبيعية في AS الفئران، وقد تبين كمكي للعب دورا هاما في كل من الوظيفية والهيكلية اللدونة متشابك. تحريض النتائج كمكي تفعيلها في نمو أرجل كاذبة خيطية جديد وتشكيل العمود الفقري، في حين أن تثبيط نتائج النشاط كمكي في أرجل كاذبة خيطية وفقدان العمود الفقري (31). ولذلك، فقد E6-AP والتقلبات لاحق من كمكي المرجح أن يؤدي إلى ضعف في كل من الوظيفية والهيكلية اللدونة متشابك.
هناك أدلة أخرى تتسق مع دور هام للE6-AP في المشبك. وقد تبين E6-AP للتفاعل مع MYCBP2، وortholog البشري من ذبابة الفاكهة موقع HighWire والذي يعرف لتنظيم وضع متشابك وظيفة (14، 32، 33). ونظرا لعدم وجود أي عيوب تنظيمية أو الخلوية واضحة في AS الفئران وجود E6-AP في المشبك، نتوقع أن فقدان متشابك E6-AP والتشكل الشاذ الناتج من العمود الفقري شجيري في AS الفئران تساهم جزئيا، إن لم يكن تماما، إلى عجز العصبية التي لوحظت في هذه الفئران، وربما في AS الأفراد.

المواد والأساليب

جيل من Ube3a YFP الفئران

تم استخدام الحمض النووي الجيني من سلالة 129 / SvEv الماوس كقالب لPCR-تضخيم شظية 8.88 كيلو بايت من 3 'نهاية Ube3a بما في ذلك إنترون 8، 9 اكسون، إنترون 9، 10 اكسون و-UTR 3'(F: 5'-GTTTCGTCACTTCTTTCTTCCGCTC؛ R: 5'-TGTTAGTTTCCAATGCCTCCTACGC). وTA-استنساخ جزء PCR في TOPO-XL ناقلات (إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا). تم هضمها الأسلحة تناظر في موقع SPH أنا موجود ثمانية النيوكليوتيدات المنبع من Ube3a توقف متعدية كودون. A رابط، الذي تضمن 3 'نهاية تسلسل الترميز دون توقف متعدية لكن مع موقع تقييد Xho الأول، كان ligated في موقع SPH I (F: 5'-CTGTTCTCGAGGAATTCCGCGGTCATG؛ R: 5'-ACCGCGGAATTCCTCGAGAACAGCATG). وEYFP: loxP: PGK-النيومايسين: كان ligated كاسيت loxP في الموقع Xho I السماح للانصهار في إطار الجين EYFP لكامل طول Ube3a. تم خطي استهداف بناء Ube3a YFP و electroporated إلى خلايا ES AB2.2 كما هو موضح سابقا (9). تم فحص الحيوانات المستنسخة مقاومة للG418 بواسطة النشاف الجنوبي باستخدام مسبار 5'-PCR (F: 5'-GGACTTTGCTTGGTGTTGGT؛ R: 5'-GGAAGTCAGAAGGGGGAA) و3'-PCR التحقيق (F: 5'-GGGTCTTTTGAGTTGCGGTA؛ R: 5'- TCATCTGTCCCAGGGAAAAC). تم توسيع واحد استنساخ الإيجابي وأكد لإعادة التركيب مثلي قبل الجولة الثانية من النشاف الجنوبي باستخدام نفس 5'- و3'-تحقيقات. تم حقن استنساخ المستهدفة في البيضاء الكيسات الأريمية C57 / BL6 من خلال إجراءات القياسية. كانت ولدت ثلاثة الوهم النسبة المنخفضة والمتوسطة إلى C57 / BL6، وتقرر نقل سلالة الجرثومية للأليل Ube3a YFP التي كتبها آغوطي لون المعطف وصمة عار الجنوبية. واستمر النمط الجيني Ube3a YFP على مختلطة 129 / SvEv وC57 / BL6 الخلفية.

تحليل لطخة غربية

تمت التضحية الفئران والعقول عزل فورا ونقله إلى PBS الجليد الباردة. تم تشريح أنسجة المخ من ونقل على الفور إلى أنابيب تحتوي على الجليد الباردة NP40 / SDS العازلة (1٪ Nonidet P-40، 0.01٪ SDS، 0،1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.2) والكامل مثبط البروتياز كوكتيل (العلوم التطبيقية روش، انديانابوليس ، IN) والمتجانس مع مدقة بمحركات. واستدارة لست] لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، طرد في 14 دورة في الدقيقة 000 لمدة 15 دقيقة لإزالة البروتينات غير قابلة للذوبان، ثم نقل إلى أنابيب جديدة وضعت على الجليد. وقد تكرر هذا وتم الجمع بين supernatants في أنبوب واحد. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام كاشف برادفورد (بيو راد، هرقل، CA).
تم حل الدماغ الخليط الأنسجة على 7.5٪ هلام SDS-PAGE ونقل إلى غشاء النيتروسليلوز TransBlot (بيو راد). وأغلقت الأغشية في 3٪ الحليب الخالي من الدسم في 0.1٪ T-TBS (10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 150 م م كلوريد الصوديوم و 0.1٪ توين 20) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. حضنت الأغشية في الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم غسلها ثلاث مرات مع T-TBS. ثم حضنت الغشاء في الضد الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وجرفت المياه الأغشية مرة أخرى ثلاث مرات في T-TBS قبل أن يتم تطويرها من قبل تعزيز أسلوب التوهج (أمرشام، بيسكاتواي، NJ). والمخفف لمكافحة GFP في 1: 3000 (8371؛ BD العلوم البيولوجية، سان خوسيه، كاليفورنيا)، ومكافحة E6-AP (611416؛ BD العلوم البيولوجية) والمخفف في 1: 1000. تم المخفف الأجسام المضادة الثانوية في 1: 3000.

ثقافة العصبية الحصين

وقد تم الحصول على الثقافات الأولية من الخلايا العصبية قرن آمون من الجراء P0-P1 من C57 / عبرت الذكور BL6 للإناث Ube3a YFP. تم فصلها الحصين مع غراء والمثقف في المتوسط ​​محددة الصفات كيميائيا (Neurobasal المتوسطة A؛ إينفيتروجن، سان دييغو، CA) تستكمل مع B27 (إينفيتروجن) والبنسلين / الستربتومايسين (إينفيتروجن) على coverslips الزجاج المطلي مع بولي د -Lysine (سيغما) والكولاجين (BD العلوم البيولوجية)، كما ذكرت سابقا (34). والمحافظة على الثقافات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حتى الاستخدام.

المناعية

تم perfused الفئران مع امتصاص العرق والأنسجة الجليد الباردة PBS و 4٪ تحصد كما هو موضح سابقا (35). لأقسام المجمدة، قطعت 45 ميكرون أقسام الاكليلية على ناظم البرد وتخزينها في برنامج تلفزيوني. تم غسلها المقاطع في برنامج تلفزيوني وثم منعت في T-TBS (10 م م تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 0.3٪ TritonX-100) بالإضافة إلى 5٪ مصل الماعز العادي لمدة 1-2 ساعة عند 4 درجات مئوية. وحضنت المقاطع في الأجسام المضادة الأولية ل48-72 ساعة عند 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب مع الإثارة لطيف. وقد استخدم في 1؛ المضادة للGFP (نوفوس البيولوجية، ليتلتون، CO NB 600-308): 2000 التخفيف، ومكافحة GFAP (MAB360؛ Chemicon، تيميكولا، كاليفورنيا) في 1: 250 ومكافحة calbindin (C9848، سيغما) في 15:00. تم غسلها أقسام ثلاث مرات في T-TBS لمدة 10 دقيقة لكل منهما ثم حضنت مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى (جاكسون ImmunoResearch، غرب غروف، PA) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية في الظلام. تم استخدام 200، ومكافحة فأر اليكسا 557 في 1: المضادة للأرنب كان يستخدم اليكسا 488 في 1 200 (إينفيتروجن). تم غسلها مرة أخرى في أقسام T-TBS لمدة 20 دقيقة لكل منهما والتي شنت على الشرائح الزجاجية مع Vectashield (مختبرات المتجهات، بورلنجام، كاليفورنيا) تركيب كاشف. وقد تم الحصول على الصور مبائر باستخدام LSM زايس 510 المجهر متحد البؤر (زايس، Oberkochen، ألمانيا).

المناعية تحليل البيانات

Ube3a YFP التعبير الوالدين

تم الحصول على جميع الصور على المجهر متحد البؤر زايس LSM 510 مع الهدف المغمورة بالزيت 10 × أو 43 ×. وأبقى ضبط التعرض للكشف عن ومكبر للصوت مكاسب نفسه بين مجموعة عينة. لمضان مكافحة GFP في Ube3a YFP الأم وUbe3a YFP الفئران الأب، تم تصوير مقاطع WT من أجل تحديد الحد الأقصى لكثافة الليزر وكشف تحقيق مكاسب دون مستوى عتبة الكشف عن مضان ثم تم مسحها ضوئيا Ube3a YFP الأم وUbe3a YFP أقسام الأب باستخدام هذه الشروط التصوير.

الخلايا العصبية تشجر شجيري

للخلية العصبية تشجر شجيري، 45 ميكرون cryosections من WT عمره 6 أسابيع = 2) وAS = 2) و immunostained تتزاحم المطابقة الجنس مع مكافحة calbindin (1: 500). تم الحصول على جميع الصور على المجهر متحد البؤر زايس باستخدام الهدف 43 ×. وقد تم تحليل نفس الورقات وعمق تقريبي للقسم لكل حيوان. تم الحصول على صور من الخلايا العصبية سوما تمتد إلى نهاية البعيدة من الفروع الشجيرية في طبقة الخلايا الجزيئية. تم الحصول متتابعة ميكرون خمسة وعشرين، 0.5 الصور الضوئية سميكة وكان من المتوقع باستخدام NIH يماغيج ظيفة Z-الإسقاط المحددة لمتوسط ​​كثافة. لكل نمط وراثي، وقد تم اختيار قسم مستطيلة 20 × 160 ميكرون تركز على سوما PC الأفراد من نفس المنطقة من كل حيوان. تم احتساب ملف كثافة مضان من هذه المنطقة باستخدام ملف المؤامرة في يماغيج. يعني مضان = 5) لقسم البصرية وحسبت كل 2.25 ميكرون على طول سوما PC والتشعبات. تم إجراء الطالب ر -test على مضان يعني للقسم بصري كامل (P = 0.421) وعلى مضان شجيري يعني (P = 0.437).

تحليل العمود الفقري شجيري

تم تنفيذ جولجي التشريب وفقا لبروتوكول الواردة في FD السريع GolgiStain كيت (FD Neurotechnologies، إليكت، MD). قطعت مائة ميكرومتر أقسام المسلسل من المخيخ والحصين وشنت. تم الحصول على الصور باستخدام زايس (زايس تصوير Z.1) مجهر الضوء. لكثافة العمود الفقري وطول القياسات الجذعية، تم الحصول على 30-40 التسلسلية الصور مكدسة ض تغطي التغصنات بأكملها وجاحظ العمود الفقري (0.36 ميكرون / صورة) باستخدام عدسة الغمر 100 × النفط. لالخلايا العصبية الهرمية قرن آمون، تم تصوير ستة إلى سبعة التشعبات الثانوية المتفرعة من التغصنات قمي ومعظم الأقرب إلى سوما خلايا الجسم لكل حيوان. لالخلايا العصبية الهرمية القشرية، 05:55 التشعبات قمية، ~100 ميكرون من سوما خلايا الجسم، تم تصوير لكل حيوان. وقد تم تحليل الصور المتسلسلة باستخدام برنامج NIH يماغيج. وتم قياس كمية كثافة العمود الفقري وطول طريق التركيز من خلال كل صورة المسلسل، وقدمت التهم والقياسات باستخدام وظيفة القياس. للصور، ويتوقع 20-25 الصور مكدسة ض من خلال برنامج deconvolution. ذكر العمر ثمانية أسابيع سبعة إلى وWT الإناث = 3) وAS = 3) كانت تستخدم الفئران littermate للتحليل.

إحصائيات

وقد استخدم Microsoft Excel لتحليل الإحصائي. للمقارنات WT وAS، كان يستخدم الطالب ر -test لتحديد الدلالة الإحصائية. تمثل جميع البيانات ± متوسط ​​الخطأ المعياري للمتوسط. طالب تي -test بقيمة P <0.05 اعتبر كبيرة (يشار فرد -values ​​P بعلامة النجمة في الأرقام).

التمويل

معتمدة SVD وALB من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (F32 HD-049248؛ R01 HD-037283). وأيد هذا العمل من قبل كلية بايلور للطب التخلف العقلي ومركز أبحاث الإعاقة التنموية (MRDDRC) NIH منحة HD-24064.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس