عرض مشاركة واحدة
  #10  
قديم 10-20-2015, 12:31 AM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي المتلازمات نماذج الخلايا الجذعية المحفزة للاضطرابات يطبع الجينومية Angelman وبرادر ويلي

 

http://www.pnas.org/content/107/41/17668.full

https://translate.googleusercontent....OK00uB4QRH03pw

ملخص

متلازمة أنجلمان (AS) ومتلازمة برادر ويلي (PWS) هي الاضطرابات العصبية النمائية من يطبع الجينوم. AS النتائج من فقدان وظيفة يغاز البروتين بتحول E3A (UBE3A) الجينات، في حين أن الخلل الجيني في PWS غير معروف. على الرغم من أن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) توفير نماذج لا تقدر بثمن من الأمراض التي تصيب البشر، يمكن إعادة برمجة النووية يحد من فائدة iPSCs من المرضى الذين AS وPWS يجب بالانزعاج علامات بصمة الجينومية من عملية إعادة برمجة جينية. لدينا iPSCs المستمدة من المرضى الذين يعانون من AS وPWS تظهر أي دليل على الحامض النووي بصمة المحو في رابطة الدول المستقلة -acting مركز PSW يطبع. الأهم من ذلك، نجد أن، كما هو الحال في الدماغ العادي، يتم تأسيس يطبع من UBE3A خلال تمايز الخلايا العصبية من AS iPSCs، مع الأب UBE3A أليل قمع بالتزامن مع ما يصل التنظيم من محضر UBE3A العقاقير. وهذه النماذج التوجيهية من اضطرابات يطبع الجينومية تسهيل التحقيق في عمليات المرض AS وPWS وتسمح دراسة توقيت التنموي وآلية UBE3A القمع في الخلايا العصبية البشرية.
متلازمة أنجلمان (AS) هو اضطراب عصبي يتميز الإعاقة الفكرية العميقة، والكلام غائبا، نوبات متكررة، والعجز الحركي، وسلوكه المميز سعيد (1، 2). وتتميز متلازمة برادر ويلي (PWS) فرط الأكل / السمنة. قامة قصيرة، واليدين، والقدمين. والمشاكل السلوكية التي تشبه الوسواس القهري (3). AS يسببه فقدان وظيفة أليل ورثت أمومي من E3 يغاز بتحول UBE3A. UBE3A يخضع لأنسجة محددة يطبع الجينومية. على الرغم من أن يتم التعبير عن كل من الأليلات في معظم الأنسجة، وقمع أليل الموروثة من الأب في الدماغ (4 - +6). ويعتقد التعبير مطبوع من UBE3A أن تحدث نتيجة التعبير المتبادل من نص طويل غير المكودة العقاقير، UBE3A-ATS، الذي هو جزء من نص> 600 كيلو بايت الشروع في ميثليته تفاضلي مركز يطبع PWS (IC) الواقعة في اكسون 1 من الجين SNURF-SNRPN (7 - 9). ويرتبط PWS مع فقدان العديد من أنواع الرنا نويي صغيرة (snoRNAs) (10)؛ ومع ذلك، أساس الجيني غير معروف حاليا، وليس هناك نموذج الفأر الذي يلخص كافة الميزات من PWS.
وقد أثبتت نماذج الماوس من AS كبير في دراسة جوانب هامة من آلية المرض AS. هناك، ومع ذلك، فإن الاختلافات في نوعية الأنسجة من النص التي تؤوي UBE3A-ATS بين البشر والفئران (11)، مشيرا إلى أن توقيت وآلية UBE3A القمع قد تختلف بين هذه الأنواع. القدرة على دراسة توقيت التنموي وآلية القمع الدماغ محددة من UBE3A أليل الأب في نموذج التنمية البشرية أمر بالغ الأهمية لفهم أفضل لعملية المرض AS واستخدام الخلايا العصبية الحية من المرضى الذين يعانون من AS لاكتشاف التدخلات العلاجية غير موصوف سابقا. هنا، وقد وضعنا هذا النموذج عبر الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (التوجيهية) التكنولوجيا.
النتائج

iPSCs البشرية الناتجة عن AS وPWS الخلايا الليفية.

تم إنشاء خطوط التوجيهية باستخدام الخلايا الليفية من مريضين مختلفة مع AS الذين قاموا رثت أمومي الحذف من كروموسوم 15q11-Q13 ومن مريض واحد مع PWS الذين قاموا حذف الأب من كروموسوم 15q11-Q13. تم إنشاؤها باستخدام ناقلات iPSCs فيروسات ترميز OCT4، SOX2، KLF4، MYC، وLIN28 (12، 13). وقد حددت المستعمرات برمجتها في البداية شكليا وتم التحقق في وقت لاحق باستخدام مناعية للتحقق من التعبير عن NANOG علامات تعدد القدرات، SSEA4، TRA1-60، وTRA1-81 (الشكل 1 والشكل S1). AS عرضت iPSCs أن يكون [كروتب المتوقع من 46، XX أو XY، ديل (15) (pter> Q11 Q13 ::> qter) وللتعبير عن الجينات المرتبطة مع تعدد القدرات على مستويات مماثلة لH9 (WA09) الخلايا ES الإنسان ( HESC) خط (الشكل 1 والشكل S2). واستخدمت الجذعية صفائف تعدد القدرات الخلية البشرية لالكمي RT-PCR (QRT-PCR) للتحليل التعبير الجيني الهيئات مضغي AS التوجيهية المشتقة (EBS) بعد 14 د من التمايز عفوية. تدل هذه البيانات على أن AS iPSCs هي قادرة على التمايز multilineage، ليتم التعبير عن علامات مبكرة النسب تمثل كل طبقة من طبقات جرثومية جنينية ثلاثة وكذلك طبقة الأديم الظاهر الغاذي (الشكل S3).

تين. 1.
AS iPSCs التعبير عن علامات تعدد القدرات وكان يتوقع كروتب]. (A) على النقيض من المرحلة (أ-ج) صور AS تظهر iPSCs مثل HESC التشكل. مناعية للعلامات تعدد القدرات على خطوط التوجيهية تمثيلية يظهر التعبير عن NANOG (د-F)، SSEA4 (ز-ط)، TRA1-60 (ي-ل)، وTRA1-81 (م-ص). تم تنفيذ (B) تحليل النمط النووي على الكروموسومات G النطاقات من قبل خلية خط الوراثة. ممثل الكروموسومات من اثنين G النطاقات AS خطوط التوجيهية تظهر التهم كروموسوم العادية من 46 XX (ASdel1-0) و 46 XY (ASdel2-0).

AS وPWS iPSCs الحفاظ على المناسبة مثلأيشن بصمة بعد إعادة برمجة.

لأن إعادة برمجة النووية من الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة قد تنطوي على محو العالمي للعلامات جينية، فقد قيل أن مثيلة التفاضلية التي يصادف PWS-IC ويمكن أيضا أن تمحى خلال إعادة برمجة، مما يجعل من الصعب إنشاء نموذج التوجيهية للAS ( 14). وفي هذا الصدد، ذكر الحامض النووي الشاذة في مطبوع H19 وKCNQOT1 الجينات في iPSCs في الآونة الأخيرة (15). قمنا بتقييم بصمة الحامض في وضعها الطبيعي، AS، وPWS iPSCs التي كتبها مثيلة محددة PCR (16، 17). وأظهرت iPSCs من الأشخاص الطبيعيين والأشخاص ذوي AS من وPWS أنماط مثيلة نفس خطوط الخلايا الليفية التي كانت مشتقة. كانت أليل الأمهات الميثيلي وأليل الأب unmethylated كلا موجودة في iPSCs العادية، في حين لوحظ فقط أليل الأب unmethylated في AS iPSCs ولوحظ فقط أليل الأمهات ميثليته في PWS iPSCs (الشكل 2 والشكل. S4 A). وقد تأكدت هذه النتائج باستخدام حساسة للمثيلة نوكلياز داخلية تقييد الكمي فحص PCR (الشكل. S4 B).

تين. 2.
يتم الاحتفاظ بصمة الحامض في PWS-IC خلال إعادة برمجة. (A) مثلأيشن محددة تحليل PCR من الحمض النووي الجيني من العادية، الخلايا الليفية AS، وPWS. الاشعال محددة لأليل مميثل تضخيم الفرقة التي هي 174 سنة مضت، في حين الاشعال محددة لأليل unmethylated تضخيم منتج 100-BP. حصيرة، الأمهات؛ بات، الأب. (B) مثلأيشن محددة PCR باستخدام الحمض النووي الجيني من ثلاثة مختلفة AS خطوط التوجيهية واثنين من مختلف خطوط التوجيهية العادية. NEG، سلبية. (C) مثلأيشن محددة PCR باستخدام الحمض النووي الجيني من ثلاثة خطوط PWS التوجيهية المختلفة.

AS iPSCs يمكن التفريق إلى الخلايا العصبية الوظيفية.

لأنه كما هو اضطراب عصبي، سعينا لتوليد الخلايا العصبية الوظيفية من AS iPSCs. وقد تختلف AS وطبيعية iPSCs إلى الخلايا العصبية باستخدام EB سيطة لتقريب التطور الطبيعي الإنسان (18، 19) (التين. S5 و S6). وتمشيا مع تقرير صدر مؤخرا (20)، تفاوت كبير في كفاءة التمايز لوحظ بين خطوط التوجيهية المختلفة. لذلك، اخترنا خط عادي واحد واحد خط AS التوجيهية التي يتم عرضها كفاءة الخلايا العصبية النسب التمايز لمزيد من الدراسات.
وجاء توقيت التنموي التمايز العصبي لكلا AS وiPSCs العادية بشكل وثيق التي سبق أن أبلغت عن hESCs (19). بعد 4 أسبوع من التمايز، MAP2- والخلايا العصبية TUJ1 إيجابية يمكن تحديد (الشكل 3 ألف وباء. والشكل S6 B - D). تم الكشف عن الخلايا النجمية بعد 6 أسبوع من التمايز عن طريق تلطيخ لS100β (الشكل 3 C و الشكل. S6 B). كانت بالتزامن مع ظهور الخلايا النجمية تطوير نقاط الاشتباك العصبي واضحة من جانب ظهور Synapsin خلايا I-الإيجابية (التين. S5 D وS6 C). بعد 10 أسبوع من التنمية، المناعية مع الأجسام المضادة قناة الصوديوم (PanNav) إلى أن قنوات الصوديوم المترجمة إلى الجزء الأولي محور عصبي في بعض وليس كل الخلايا العصبية (التين. S5 E و F وS6 E).

تين. 3.
يمكن توليد الخلايا العصبية الوظيفية من AS iPSCs. صورة (A) المرحلة النقيض من الخلايا العصبية عمرها 10 فالتر كالين في المختبر متباينة الناتجة عن AS iPSCs. (B) الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من وصمة عار إيجابيا لβIII تويولين (TUJ1 والأخضر). تنشأ (C) النجمية S100β إيجابية تلقائيا في الثقافات الخلايا العصبية AS التوجيهية المستمدة من بعد 6 أسبوع من التمايز. (D) التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية الناضجة AS التوجيهية المستمدة من بعد 10 أسبوع من التمايز. (العليا) تدريب من إمكانات العمل التي حركها depolarizing الحقن الحالية (50 سنويا). (أشرطة المعايرة: 20 فولت، 0.1 ثانية.) (السفلى) الاحتلالات مثال EPSCs عفوية المسجلة من نفس الخلايا العصبية في غياب أو حضور أمبا مستقبلات DNQX (10 ميكرومتر). (أشرطة المعايرة: 10 السلطة الفلسطينية، 1 ق.) (E) التسجيلات الكهربية من غير ناضجة AS الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من بعد 10 أسبوع من التمايز. (العليا) الاستجابة إلى depolarizing الحقن 60-السلطة الفلسطينية الحالي. (السفلى) عدم وجود نشاط متشابك عفوية. الحانات المعايرة هي نفسها كما في D.

وأشارت هذه البيانات إلى أن الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من والنضج في الثقافة وأن بعض وليس كل الخلايا العصبية كانت ناضجة وظيفيا. في اتفاق مع البيانات مناعية، 10 فالتر كالين متباينة AS الثقافات التوجيهية الواردة الخلايا العصبية التي عرضت القطارات من إمكانات العمل والتيارات بعد المشبكي مثير (EPSCs) بوساطة أمبا تنشيط مستقبلات (على سبيل المثال في الشكل 3 D). ويمكن أيضا أن يتم تحديد الخلايا العصبية التي لم يكن لديك القطارات المتكررة من إمكانات العمل و / أو EPSCs قوية (الشكل 3 E). أظهرت العادية الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من تنوع مماثل بعد 10 أسبوع من تطوير (على سبيل المثال في الشكل S7). على الرغم من أن الخلايا العصبية الوظيفية ناضجة مع النشاط متشابك يمكن أن تتولد من AS iPSCs من قبل في المختبر تطوير والثقافات 10 فالتر كالين غير متجانسة في نضجها. وهذا ليس مستغربا لأن 14٪ فقط من الخلايا العصبية لوحة القشرية الإنسان العينات التي أخذت في 16 أسبوع من الحمل النار إمكانات العمل المتكررة (21).

UBE3A الأب هو مكبوت خلال تكوين الخلايا العصبية في المختبر من AS iPSCs.

بالإضافة إلى صيانة المؤمنين من مثيلة بصمة PWS-IC، وغيرها من سمات جينية الرئيسية لنموذج مناسب لAS هي قمع أليل UBE3A الأب على التمايز العصبي. على الرغم من أن يتم التعبير عن كل من الأليلات UBE3A في معظم الأنسجة، وقمع أليل الموروثة من الأب في الدماغ (+4 - 6). ويعتقد التعبير مطبوع من UBE3A أن تحدث نتيجة التعبير المتبادل من نص طويل غير المكودة العقاقير، UBE3A-ATS، الذي هو جزء من نص> 600 كيلو بايت الشروع في ميثليته تفاضلي PWS-IC تقع في اكسون 1 من SNURF الجينات -SNRPN (+7 - +9).
القدرة على استخلاص المختلطة السكان من الخلايا العصبية الناضجة من AS وطبيعية iPSCs سمحت لنا لاختبار ما إذا كانت عملية إعادة برمجة جينية قد أثرت على تنظيم الأنسجة محددة من UBE3A يطبع. وكان يعاير UBE3A التعبير QRT-PCR في iPSCs والثقافات الخلايا العصبية التوجيهية المشتقة من المرضى العادي والمرضى الذين يعانون AS. الشكل. 4 A يظهر QRT-PCR للتعبير UBE3A في AS وiPSCs الطبيعية والخلايا العصبية التوجيهية مشتقة. لوحظ انخفاض مستويات UBE3A التعبير في كلا AS iPSCs والثقافات الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة النسبية لنظرائهم العادية. علاوة على ذلك، انخفض التعبير UBE3A في الخلايا العصبية AS التوجيهية المستمدة من النسبي إلى AS iPSCs، مما يدل على قمعها جينية على تمايز الخلايا العصبية. على العكس من ذلك، مستويات UBE3A التعبير لا تتغير بين iPSCs الطبيعية والخلايا العصبية التوجيهية المشتقة، على الرغم من القمع واضح من UBE3A أليل الأب.

تين. 4.
وقمعت UBE3A الأب في AS الخلايا العصبية التوجيهية مشتقة. (A) تحليل QRT-PCR التعبير UBE3A في AS وiPSCs الطبيعية والخلايا العصبية التوجيهية مشتقة. التعبير الجيني هو تطبيع لGAPDH ويرد بأنه التغير النسبي أضعاف إلى مستويات التعبير UBE3A في iPSCs العادية. أشرطة الخطأ تشير SD لثلاث ثقافات مستقلة. (B) تحليل لطخة غربية من المعتاد وAS iPSCs (I) والخلايا العصبية القديمة 10 فالتر كالين-التوجيهية المستمدة من (N).

لتحديد ما إذا كان للقمع الأبوي UBE3A أليل يؤدي إلى انخفاض مستويات البروتين UBE3A في نموذجنا في المختبر من AS، تم إجراء تحليل لطخة غربية على AS وiPSCs الطبيعية والثقافات الخلايا العصبية التوجيهية المشتقة (الشكل 4 B). على غرار نتائج QRT-PCR، يتم تقليل البروتين UBE3A بشكل ملحوظ في AS مقارنة مع iPSCs العادية. وتمشيا مع يطبع الأنسجة محددة، وزيادة تخفيض مستويات البروتين UBE3A في AS الثقافات العصبية التوجيهية المستمدة مقارنة مع AS iPSCs. وكانت مستويات البروتين UBE3A مماثلة بين iPSCs الطبيعية والثقافات الخلايا العصبية التوجيهية مشتقة. في نظامنا التوجيهية النموذج، وقمع وUBE3A أليل الأب بشكل كبير في الخلايا العصبية مشتقة من AS التالية iPSCs 10 أسبوع من التمايز، تلخص خاصية جينية الرئيسية للمرض في المختبر.

الخلايا العصبية النوعية أعلى إلى تنظيم UBE3A-ATS الاقتران مع UBE3A القمع.

على الرغم من أن آلية القمع UBE3A في الدماغ لم يتم توضيحها بشكل كامل، فإنه لا ينتج من الأنسجة محددة الحامض النووي الفرق من المروج UBE3A لأن المروج الدليل السياسي الشامل الغنية UBE3A هو unmethylated في جميع أنسجة الإنسان والفأر التي تم فحصها ، بما في ذلك الإنسان الأنسجة بعد الوفاة الدماغية (1). أكدنا أن UBE3A المروج الأب هو unmethylated في الخلايا العصبية التوجيهية المشتقة وكذلك في الخلايا الليفية وiPSCs (الشكل S8). نستنتج أن إسكات أليل UBE3A الأب في الخلايا العصبية التوجيهية المستمدة من هو ليس نتيجة مثيلة زائفة من المروج UBE3A أثناء عملية إعادة البرمجة، بل أنه يعكس آلية طبيعية من UBE3A يطبع في الدماغ.
هناك أدلة تشير إلى أن الدماغ محددة UBE3A القمع بوساطة طويلة غير المكودة العقاقير RNA (+7 - +9) (الشكل 5 A). لتحديد ما إذا كان UBE3A العقاقير نسخة UBE3A-ATS يعرض خصوصية الأنسجة المتوقعة التعبير، تم تحليل الإكسونات غير المرمزة noncoding الموجودة المصب SNURF-SNRPN. تم استخدام التهجين لطخة الشمالي لتقييم التعبير عن snoRNAs معالجتها، SNORD116 (وتسمى أيضا HBII-85) وSNORD115 (وتسمى أيضا HBII-52)، مما يدل على أن يتم التعبير عن SNORD116 في كل iPSCs والخلايا العصبية، في حين يقتصر SNORD115 التعبير iPSC- الخلايا العصبية مشتقة (الشكل 5 B)، بما يتفق مع تقارير أخرى أن يتم التعبير عن ذلك على وجه التحديد في الدماغ (11). RT-PCR باستخدام بادئات الاعتراف الإكسونات تقسم في الكتلة SNORD116، الكتلة SNORD115، وUBE3A-ATS (9) أكد هذه النتيجة (الشكل 5 C). تشير هذه البيانات إلى أن على الرغم من أن يتم التعبير عن الترميز وغير مكود الداني الإكسونات SNURF-SNRPN ومعالجتها في الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان، الإكسونات أكثر البعيدة تصبح أعرب ومعالجتها كما هو الحال في المختبر تقدم التطور العصبي على نحو متزايد. لأن النص UBE3A-ATS، الذي يتداخل UBE3A، تم الكشف فقط في الثقافات الخلايا العصبية، فإننا نستنتج أن قمع الخلايا العصبية محددة من UBE3A قد تحدث في وقت متأخر نسبيا خلال تكوين الخلايا العصبية، تتزامن مع ما يصل التنظيم من SNORD116، SNORD115، وUBE3A-ATS .

تين. 5.
وأعرب عن UBE3A-ATS فقط في الثقافات الخلايا العصبية ويرتبط مع الأب القمع UBE3A. (A) خريطة للSNURF-SNRPN والنصوص UBE3A. الأبيض ودوائر بيضاوية الشكل سوداء تشير إلى unmethylated وميثليته PWS-IC، على التوالي. خط الصلبة مع السهام تشير النصوص التي أعرب عنها في iPSCs، في حين أن خط منقط يشير النصوص العصبية محددة. AS iPSCs ومشتقاتها العصبية تفتقر إلى كامل أليل ورثت أمومي من هذه المنطقة. (B) لطخة الشمالية باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع من AS وiPSCs العادية (I) والتوجيهية المستمدة من الخلايا العصبية القديمة 10 أسبوع (N) ويظهر التعبير عن snoRNAs SNORD116 وSNORD115 خلال المختبر في التطور العصبي. (C) RT-PCR باستخدام بادئات تمتد الإكسونات متعددة من SNORD116، SNORD115، وUBE3A-ATS في iPSCs (I)، البالغ من العمر 3-أسبوع-التوجيهية المستمدة من الخلايا العصبية السلائف (P)، والكبار 10-أسبوع-التوجيهية المشتقة الثقافات الخلايا العصبية (N).

مناقشة

قد توفر iPSCs نماذج قوية من الاضطرابات الجينية البشرية المعقدة (+22 - 24). واحد عائقا أمام استخدام iPSCs لنموذج اضطرابات الإنسان تنطوي يطبع الجينوم هو احتمال أن بصمة إما أن تمحى خلال إعادة برمجة أو لم يتواصل خلال ثقافة iPSCs. البيانات المتوفرة لدينا (الشكل 2 والشكل. S4)، مشيرا إلى أن بصمة الحامض في PWS-IC لا تمحى أو إعادة تعيين أثناء عملية إعادة البرمجة النووية في كل من خطوط التوجيهية الذكور والإناث، ويدعم النموذج المقبول على نطاق واسع أن PWS-IC يتم مسح مثيلة بصمة في سلالة الجرثومية، التي أنشئت إما في سلالة الجرثومية أو خلال المراحل الأولى من التطوير قبل الغرس، وبعد ذلك حافظت طوال تنمية (25 - 28). وتشير هذه النتائج إلى أن مثيلة بصمة PWS-IC هو صهر لمحو العالمي للعلامات جينية الناجمة عن عملية إعادة البرمجة. ومن المثير للاهتمام، وأيضا الحفاظ على هذا بصمة مستقر خلال ثقافة على المدى الطويل من خلايا الإنسان والفئران ES (سواء +29 - 31).
على الرغم من أن لاحظنا التباين في إمكانية التفريق العصبية لدينا AS iPSCs، كنا قادرين على إثبات أننا يمكن أن تنتج وظيفية مباشرة AS الخلايا العصبية في الثقافة. الأهم من ذلك، أظهرت هذه الخلايا العصبية أمبا EPSCs بوساطة مستقبلات. في الآونة الأخيرة، جرير وآخرون. (32) أثبتت أن نقاط الاشتباك العصبي مثير في الخلايا العصبية الفئران مع انخفاض UBE3A لديها مستقبلات أمبا أقل وانخفاض وظيفة أمبا مستقبلات. جارية لتحديد ما إذا كان أمبا مستقبلات توطين وظيفة تختلف بين AS والخلايا الطبيعية في ثقافاتنا الخلايا العصبية البشرية مزيد من الدراسات الكهربية وimmunocytochemical الناضجة الخلايا العصبية التوجيهية مشتقة.
واحدة من النتائج الأكثر لفتا للدراستنا هو أن التعبير عن المصب غير المرمزة noncoding الموجودة الإكسونات SNURF-SNRPN يصبح أكثر الخلايا العصبية محددة بطريقة الداني، لالقاصي. وهذا يختلف عن نماذج الماوس، حيث كل الإكسونات غير المرمزة noncoding الموجودة المصب Snurf-Snrpn هي الدماغ محددة (11). تشير الدلائل إلى أن تنظيم هذه النسخة، وبشكل أكثر تحديدا، الجزء UBE3A-ATS من محضر يلعب دورا هاما في قمع UBE3A الأب (+7 - +9). تعبير منسق من الأب UBE3A-ATS وقمع UBE3A الأب في AS iPSCs خلال في المختبر تكوين الخلايا العصبية تسمح لنا استخدام هذا النموذج لدراسة تنظيم وتجهيز UBE3A-ATS وآثاره على هيكل لونين من UBE3A المروج الأب أثناء البشرية التطور العصبي.
لدينا نموذج خلية ثقافة الإنسان للAS يلخص نمط الأنسجة محددة من UBE3A يطبع، وبالتالي يوفر أداة هامة لمعالجة توقيت وآلية جينية UBE3A إسكات خلال تطوير العصبية البشرية. في المختبر AS نظام نموذجي هو موضح هنا سوف تكون ذات فائدة في تشخيص التشوهات الفسيولوجية للمرض على المستوى الخلوي، بما في ذلك تحليل الكهربية للخلايا العصبية AS التوجيهية المشتقة أيضا. تطوير في المختبر من أمبا بوساطة مستقبلات النشاط متشابك عفوية إلى أن هذه الخلايا العصبية التوجيهية المشتقة يمكن استخدامها لدراسة هيكل متشابك والتنمية في AS الخلايا العصبية. سيكون لدينا نموذج التوجيهية للPWS تكون مفيدة في مواصلة التحقيق في الأساس الجيني للPWS، بما في ذلك كيفية فقدان العديد من أنواع snoRNAs تساهم في اضطراب. ونحن نخطط أيضا لاستخدام تكنولوجيا التوجيهية لنموذج كروموسوم 15q11-Q13 المرتبطة الازدواجية التوحد. فإن نماذج الثقافة خلية من هذه الاضطرابات العصبية الوراثية والبشرية الأخرى توفير أدوات هامة لتعزيز فهم آليات المرض وتطوير أدوات فريدة من نوعها لاكتشاف الأدوية.

المواد والأساليب

الليفية المريض محددة.

تم تخزين الخلايا الليفية في وقت لاحق من ASdel1 المريض معزولة والمقدم من قبل بروس KORF (مستشفى الأطفال في بوسطن، بوسطن، MA) في عام 1995 الأنسجة مجهولة المصدر في النيتروجين السائل. تم تنفيذ FISH لتأكيد الحذف 15q11-Q13 قبل إعادة برمجة. تم الحصول على ASdel2، PWSdel1، والخلايا الليفية الطبيعية من مستودع لالمسخ سلالات الخلايا البشرية في المركز الصحي لجامعة ماكجيل / مونتريال مستشفى الأطفال (مونتريال، QC، كندا)، وهي الخلايا أرقام الأسطر WG1631، WG1534، وMCH065، على التوالي.

زراعة الخلايا.

وقد حافظت الخلايا الليفية الإنسان، الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS)، و293T / 17 الخلايا في DMEM (إينفيتروجن) تستكمل مع 10٪ (المجلد / المجلد) FCS. وكانت iPSCs مثقف في المتوسط ​​HESC التقليدية تتألف من DMEM-F12 (إينفيتروجن) تستكمل مع 20٪ (المجلد / المجلد) خروج المغلوب بديل المصل، والأحماض الأمينية غير الأساسية، 1 ملي L-الجلوتامين، و 100 ملم β المركابتويثانول و 4 نانوغرام / مل جمعية جيل المستقبل الأساسية. واستمرت الخلايا في حاضنة الرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ (المجلد / المجلد) CO 2. تم passaged iPSCs حوالي مرة واحدة في الأسبوع عن طريق خفض المستعمرات يدويا باستخدام إبرة.

الإنتاج الارتجاعي.

تم الحصول على pMXs ناقلات فيروسات تحمل إدراجات لOCT4 (البلازميد 17217)، SOX2 (البلازميد 17218)، KLF4 (البلازميد 17219)، وC-MYC (البلازميد 17220) من Addgene. ولدت A pBABE-GFP ناقلات فيروسات تحمل LIN28 التي كتبها subcloning PCR تضخيم LIN28 كدنا] بين المواقع SnaBI وEcoRI. وتم التحقق من الحيوانات المستنسخة عن طريق الهضم التقييد ومتسلسلا.
وبناء التغليف فيروسات، pMDL.Gagpol، كان هدية من الكسندر Lichtler (جامعة كونيتيكت المركز الصحي، فارمينغتون، CT)، والبلازميد المغلف، pMD2.G، تم الحصول عليها من Addgene (البلازميد 12259). تم إنتاج الفيروسات القهقرية في 293T / 17 الخلايا ترنسفكأيشن باستخدام Lipofectamine 2000 (إينفيتروجن). تم جمع supernatants المحتوية على الفيروس في 24 و 48 ساعة posttransfection واستخدامها مباشرة لإعادة البرمجة أو تجميدها لاستخدامها لاحقا.

الجيل التوجيهية.

تم إنشاء iPSCs التالية البروتوكولات نشرت سابقا (12). على وجه التحديد، تم تنفيذ اثنين transductions التسلسلية باستخدام كميات متساوية من supernatants المحتوية على الفيروس الارتجاعي خمسة أكثر من 48 ساعة. بعد ستة أيام من تنبيغ الأول، كانت مطلية 10 5 الخلايا الليفية transduced إلى طبقة المغذية MEF المشع على 10 سم 2 الطبق. تم تغذية الخلايا الليفية Transduced مع HESC المتوسط ​​كل يوم. تم القبض على المستعمرات مع HESC مورفولوجيا (ضيق جدا ومستديرة جدا) لتعيش المشع طبقات المغذية MEF بعد ≈4 أسبوع.

تمايز الخلايا العصبية.

وقد أجريت تمايز الخلايا العصبية وفقا لبروتوكولات المنشورة (18، 19) مع تغييرات طفيفة. على وجه التحديد، وiPSCs قطع يدويا ورفع من الطبقة المغذية الماوس الليفية بدلا من فصلها مع Dispase (إينفيتروجن).
وقد تم توليد خلايا عصبية عادية تستخدم في دراستنا من مرور 20 iPSCs وكان لا يقل عن 10 أسبوع من العمر. كانت الخلايا العصبية AS مثقف من مرور 15-20 iPSCs وكانت أيضا لا يقل عن 10 أسبوع من العمر لجميع التجارب مبين. أخذت الخلايا العصبية السلائف بعد 3 أسبوع للثقافة، قبل الطلاء الثاني على الأطباق المغلفة laminin.

مثيلة-PCR محددة.

لأداء مثيلة محددة PCR، تعرضت السلطات الوطنية المعينة الجينومية لتحويل بيسلفيت باستخدام أدوات EZ الحامض النووي الذهب (للبحوث Zymo) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم استخدام الحمض النووي بيسلفيت تحويلها إلى البذور وPCR تعدد باستخدام بادئات التالية: 15maternalF، 5'-TAATAAGTACGTTTGCGCGGTC-3؛ 15maternalR، 5'-AACCTTACCCGCTCCATCGCG-3؛ 15paternalF، 5'-GTAGGTTGGTGTGTATGTTTAGGT-3؛ و15paternalR، 5'-ACATCAAACATCTCCAACAACCA-3 ". تم تنفيذ الضوابط الأبوية الأم وباستخدام مجموعات التمهيدي الأب أو الأم وحدها في قوالب تضخيم سابقا. حجم جزء الأمهات 174 سنة مضت، وحجم جزء الأب هو 100 سنة مضت.

مناعية.

تم تنفيذ مناعية على iPSCs والخلايا العصبية وفقا للأساليب التي نشرت سابقا (33)، مع تغييرات طفيفة. على وجه التحديد، coverslips الموجهة لتلطيخ مع علامات غير النووية لم permeablized مع العازلة هيكل الخلية (CSK) قبل التثبيت، وcoverslips أن ملطخة لم permeabilized علامات سطح الخلية. كانت ثابتة Coverslips ملطخة GAD65 / 67 و TUJ1 في الميثانول لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية ثم ممهى لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني بدلا من امتصاص العرق التثبيت. وتصور الشرائح ملطخة بواسطة المجهر مضان وتصوير باستخدام مجهر زايس Axiovision في تكبير من 5 × 20 × و 63 ×.

الكهربية.

تم نقل الخلايا في ثقافة نمت coverslips على الفردية إلى غرفة تسجيل (درجة حرارة الغرفة) ثابتة إلى مرحلة المجهر تستقيم أوليمبوس BX51WI مزودة 40 × الغمر بالمياه عدسة الهدف. خلال التسجيلات، وcoverslips perfused باستمرار في 2 مل / دقيقة مع الحل حمام. تم معايرتها درجة الحموضة محتدما المستمر مع 95٪ (المجلد / المجلد) O 2 -5٪ (المجلد / المجلد) CO 2. تم الحصول على خلية كاملة الجهد المشبك [الانتظار V (عقد الجهد) = -70 بالسيارات] والمشبك الحالي تسجيلات من الخلايا في ثقافة استخدام تقنيات المحددة سابقا (34). تم ترشيح كل الأحداث الكهربائية في 2.9 كيلو هرتز ورقمية في ≥6 كيلو هرتز باستخدام HEKA ITC-16 التحويل الرقمي بنيت إلى EPC9 / 2 مكبر للصوت (حكا ELEKTRONIC). تم تعويض سلسلة المقاومة 70٪ عند تأخر من 10-100 ميكرو ثانية. تم رصد مقاومة الإدخال مع 5-بالسيارات (50 مللي) الخطوات hyperpolarizing الجهد. خارج خط أجري التحليل باستخدام Clampfit (الصكوك أكسون).

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس