عرض مشاركة واحدة
  #14  
قديم 11-23-2015, 09:09 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي العلاج الجيني يمنع الموت مبصرة ويحافظ على وظيفة الشبكية في متلازمة نموذج الفأر بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/108/15/6276.full


ملخص

المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه-بيدل (BBS) تجربة تنكس الشبكية الشديد نتيجة لعمليات النقل مبصرة ضعاف التي لا تزال غير مفهومة تماما. حتى الآن، لا يوجد علاج فعال لBBS المرتبطة تنكس الشبكية والعمى وشيك من قبل العقد الثاني من العمر. نحن هنا تقرير وضع الغدة المرتبطة الفيروسي (AAV) المتجه أن ينقذ رودوبسين mislocalization، ويحافظ على قضيب قطاعات الخارجي العادية، التي تظهر تقريبا، ويمنع موت مستقبلة للضوء في Bbs4 نموذج الفأر -null. تحليل مخطط كهربية على الموجة يشير إلى أن الخلايا قضيب انقاذ لا يمكن تمييزها وظيفيا من النوع البري قضبان. وتبين هذه النتائج أن العلاج الجيني يمكن أن تمنع تنكس الشبكية في النموذج BBS الثدييات.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) يتم تشخيص سريريا من خلال وجود أربعة على الأقل من العلامات التالية: ضمور شبكية العين، polydactyly، والسمنة، وصعوبات التعلم، قصور الغدد التناسلية الذكور، والشذوذ الكلوي (1). من هذه، والنمط الظاهري البصرية مدمر على وجه الخصوص: فإن متوسط ​​BBS المريض التقدم إلى العمى القانوني قبل له أو عيد ميلادها ال16. يوجد حاليا 15 المواضع الجينية (أون لاين الوراثة مندلية في مان # 209900) التي هي معروفة لتترافق مع BBS، وعلى الرغم من وراثة هذا المرض كان يعتقد مرة واحدة لمتابعة جسمية نمط المتنحية الكلاسيكية، وتشير الأدلة مؤخرا أن نمطا أكثر تعقيدا، ووصف "الميراث triallelic"، ويشارك في بعض مواضع BBS (2). وقد ظهرت أدلة فقط خلال العقد الماضي أن البروتينات BBS تلعب دورا في وظيفة الهدبية (3). وبشكل أكثر تحديدا، Bbs4 ومكونات BBSome أخرى يبدو أن تشارك في كل من تجنيد البضائع نحو الجسم الهدبي القاعدية (4، 5) والنقل intraflagellar على طول هدب (5 - +7). وتوضيح عدة تقارير الآليات التي تعطل بروتينات BBS تؤدي إلى الظواهر الفردية ينظر في هذه المتلازمة عديد المظاهر غاية (8 - 11).
تنكس الشبكية هو سمة أساسية من جميع النماذج BBS الماوس ولدت حتى الآن (8، +12 - 16). في قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية، وربط هدب هو بنية الهدبية درجة عالية من التخصص الذي يخدم كقناة الوحيدة من قطاع الداخلي إلى الجزء الخارجي. لأن تخليق البروتين يحدث الأقرب إلى الجزء الخارجي، رودوبسين والبروتينات البصرية الأخرى يجب أن يتم الاتجار بهن من خلال هدب ربط للوصول إلى موقع عملها في الجزء الخارجي. عبد البر وآخرون. (11) أظهر أنه عندما تم حذف Bbs4 في الفئران، رودوبسين ومخروط opsins أصبح mislocalized بشكل صارخ في قضيب ومخروط المستقبلات الضوئية، على التوالي. وأعقب ذلك أفكارك الموت مبصرة وتدهور مخطط كهربية (أرج) موجات ب أ- و(14). وكشف تحليل التركيبية قضبان من الحيوانات الصغيرة التي تربط أهداب والهياكل القاعدية التي تظهر الجسم الطبيعي. هذا الاستنتاج الأخير له انعكاسات هامة على العلاج الجيني: لأن جهاز النقل الهيكلي يبدو أن تتطور بشكل طبيعي في خلايا مستقبلة للضوء Bbs4 -null، ونحن افترضنا أن مكملات ما بعد الولادة من الجين Bbs4 في قضبان شأنه انقاذ رودوبسين mislocalization ومنع قضيب الموت مبصرة.
لاختبار الفرضية لدينا، اخترنا فيروس الغدة المرتبطة-pseudotyped (AAV) كناقل التسليم. AAV المرغوب فيه ميزات كثيرة باعتباره الشبكية العلاج الجيني ناقلات، بما في ذلك المناعية منخفضة (17)، الكفاءة تنبيغ عالية (18)، والتعبير التحوير على المدى الطويل (19)، وtropisms محددة تعتمد على المصلي الخلوية (20). وعلاوة على ذلك، بيانات من ثلاث مراحل التاريخية الأولى من التجارب السريرية تشير إلى أن AAV ديه صورة ممتازة سلامة في البشر (+21 - 23). هنا، نحن تصف نتائج بوساطة AAV تسليم Bbs4 إلى قضبان من الفئران Bbs4 -null. وتوضح النتائج التي توصلنا إليها أن العلاج الجيني يمكن انقاذ رودوبسين mislocalization في هذا النموذج الماوس BBS والحفاظ العادي تقريبا قضيب التشكل الجزء الخارجي. وعلاوة على ذلك، معالجتنا يمنع الموت مبصرة، ويحسن وظيفة الكهربية من شبكية العين، ويحافظ على الاستجابات السلوكية أثار بصريا. وتشير هذه البيانات من نموذج الثدييات التي BBS المرتبطة تنكس الشبكية يمكن علاجها.
النتائج

تنكس الشبكية في Bbs4 -Null ماوس.

أجرينا دراسات تشريحية وظيفية في Bbs4 الفئران -null والنوع البري تتزاحم للحصول على القيم الأساسية قبل التجارب نجدتنا. في البرية من نوع شبكية العين، المناعى تلطيخ رودوبسين (الأحمر) مترجمة إلى منطقة الجزء الخارجي من المستقبلات الضوئية قضيب وكان غائبا تماما عن الطبقة النووية الخارجي (ONL) (الشكل 1 8 أسبوع من العمر). تم العثور على رودوبسين أيضا في منطقة الجزء الخارجي من العمر المتطابقة Bbs4 -null (- / -) شبكية العين، ولكن هذا كان يرافقه mislocalized جزيئات رودوبسين التي تميل إلى تشكيل أنماط حلقية (الشكل 1 B. حول نواة مبصرة الفردي (، النصال) الأزرق). الشكل. 1 C يوضح الفقدان التدريجي للنوى مستقبلة للضوء في شبكية العين BBS، والبعض الآخر الذي قد أظهرت أن تحدث من خلال موت الخلايا المبرمج (11، 12). في 2 أسبوع من عمر - / - شبكية العين أظهر بالفعل دليل على فقدان مبصرة (سبعة إلى ثمانية نوى في العمود ONL) مقارنة مع + / + ضبط نفس العمر الذي كان 10-11 نوى سميكة فقط. الموت مستقبلة للضوء في - / - شبكية العين تقدما مطردا على مر الزمن، وظلت 1-2 فقط نوى في العمود ...... قل في 16 أسبوع. وكانت الشبكية أقصر وأكثر غير متجانسة من + / + شرائح الخارجي في أقرب نقطة زمنية بحثت وكانت لا يمكن التعرف عليها تماما من قبل 16 أسبوع - شرائح الخارجي في - /.

تين. 1.
رودوبسين mislocalization وتنكس الشبكية في الفئران Bbs4 -null. Immunolocalization من رودوبسين (الأحمر) في القديم 8-أسبوع-من النوع البري (A) وBbs4 - / - (B) شبكية العين. Topro-3 (الأزرق) يمثل نواة، والسلطة الوطنية الفلسطينية (الأخضر) يحدد الأغماد مخروط. النصال في B تشير مبصرات قضيب الذي يحمل رودوبسين mislocalized. وتوضح (C) Photomicrographs الفقدان التدريجي للخلايا مستقبلة للضوء في ONL من Bbs4 - / - شبكية العين، مع أقسام من النوع البري على طرفي للمقارنة. (D-F) التوهين من أرج يصاحب فقدان مبصرة. في 8 أسبوع، Bbs4 - / - (الأحمر) الاستجابات هي أصغر بكثير من النوع البري تتزاحم (الأسود) في شدة فلاش انتزاع إما قضيب فقط (D) أو مختلطة قضيب مخروط (E) ردود F هو تضخم عالية. نظرا لوجود موجة حواف الرائدة في اثنين من كثافات مختلفة، مع نموذج photoresponse تركيبها على البيانات (آثار المنقطة). شدة فلاش في سجل الاسكتلندي مؤتمر نزع السلاح * ق / م 2 هي -3.65، -2.93، -2.08، -0.89 و لD؛ 3.45 لE؛ 2.10 و3.45 لF. (أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر في A و B، و 10 ميكرون في C).

أجرينا ERGs لقياس وظيفة الشبكية في Bbs4 الفئران -null مع مرور الوقت. في جميع الأعمار وشدة فلاش فحصها، وسعة A و B موجة الموهن بشدة في - / - الفئران (آثار حمراء اللون) مقارنة مع + / + الضوابط (آثار سوداء). وأظهرت البيانات القديمة 8-أسبوع-تمثيلية للقضيب فقط (الشكل 1 D) والمختلط قضيب مخروط (الشكل 1 E) الاستجابات. لبالحدود وphotoresponses قضيب، أجرينا نوبة الفرقة من طراز photocurrent Cideciyan-جاكوبسون (24) ضد أرج البيانات على بعد موجة من اثنين من شدة فلاش مختلفة. الشكل. 1 F يظهر على الموجة الحواف الأمامية من ممثل - / - العين (يمين) الذي هو أقل في كل من السعة وحساسية مقارنة مع عنصر تحكم من النوع البري العين يقابل عمر (يسار) استجابة قضيب.

التعبير عن AAV الجينات المحورة.

وقد أظهرت التوصيف السابق من هذا نموذج الفأر أن مخروط أوبسين mislocalization شديد من قبل 2 أسبوع من العمر (11)، والموهن مخروط ERGs بنسبة 88٪ في 4 أسبوع (14). لهذه الأسباب، اخترنا لتوجيه جهودنا العلاج الجيني نحو إنقاذ مبصرات قضيب، والتي لها بالطبع أبطأ من انحطاط. كنا على بعد التكميلي النفس الغدة المرتبطة بفيروس pseudotyped (scAAV5) التي تحتوي على المروج الماوس أوبسين (MOP) لدفع تعبير قوي في قضبان (25). واستخدمت اثنين من بنيات الفيروسية في هذه الدراسة: فيروس تحكم يحتوي GFP (المشار إليه فيما scAAV5-MOP-GFP) وفيروس العلاجية التي تحتوي على الماوس Bbs4 الجينات مع علامة HA N-الطرفية (scAAV5-MOP-BBS4). في أيدينا، أدى حقن تحت الشبكية من 1.1 ميكرولتر من scAAV5-MOP-GFP إلى البرية من نوع الماوس العين في منطقة المترجمة من التعبير GFP (الشكل 2 A) التي تغطي 4.8٪ ± 1.1٪ من شبكية العين (يعني ± SEM ، ن = 6). كان تنبيغ من الخلايا قضيب داخل تلك المناطق فعالة للغاية، مع ما يقرب من 100٪ من الخلايا قضيب معربا عن GFP على مقربة من موقع الحقن (الشكل 2 B ط). في المقابل، مبصرات مخروط (النصال في الشكل 2 B ط، إشارة حمراء في الشكل 2 B كانت ب) معربا عن GFP الحالية ولكنها نادرة. وقد تم تحديد الأقماع عن طريق فحص المقاطع البصرية مسلسل من شبكية العين مسطحة شنت ملطخة-رودامين مترافق الفول السوداني راصة (PNA) (فيلم S1).

تين. 2.
التعبير التحوير بعد الحقن تحت الشبكية من AAV. (A) flatmount الشبكية 4 مو بعد الحقن scAAV5-MOP-GFP كشفت مترجمة التعبير الجيني فقط بالقرب من موقع الحقن. (شريط مقياس، 1 ملم.) (بي) متحد البؤر صورة من الجزء العلوي من ONL تظهر قضبان (الأخضر من GFP) والمخاريط (زنازين مظلمة تميزت السهام). وقد تم تحديد الأقماع التي تلطيخ رودامين-السلطة الوطنية الفلسطينية في المقاطع البصرية التسلسلية. (شريط مقياس، 10 ميكرون.) (BII) شرائح الداخلية ينتمون إلى ثلاثة مخاريط (PNA) هي الوحيدة التي لا تعبر عن GFP. (شريط مقياس، 5 ميكرون.) (C) تحليل لطخة غربية لعينة الشبكية حقن AAV تحمل بناء HA-Bbs4 يظهر الفرقة HA-مناعيا قرب 59 كيلو دالتون الذي هو غائب في العينة الضابطة uninjected. (D) بوساطة AAV Bbs4 التعبير يموضع في المقام الأول إلى قطاعات الداخلية والقطاعات الخارجية القريبة (النجمة)، في حين ينظر لا يوجد مثل هذا في تلطيخ الضوابط uninjected. (مقياس شريط 20 ميكرون) الحق: ويرد إشارة رودوبسين لتحديد نظام التشغيل / IS الحدود. أجريت جميع التجارب في ظاهريا الضوابط العادية (Bbs4 + / + أو Bbs4 +/-). Topro-3، وصمة عار النووية؛ السلطة الوطنية الفلسطينية، مخروط غمد علامة. OS، الجزء الخارجي؛ هو، الجزء الداخلي. اوبل، طبقة ضفيري الخارجي.

حقن لدينا scAAV5-MOP-BBS4 بناء إلى نجم الفضاء تحت الشبكية في واحدة الفرقة HA-مناعيا لطخة غربية (الشكل 2 C). وتقع هذه الفرقة، التي كانت غائبة في العينة الضابطة uninjected، في ≈59 كيلو دالتون، الكتلة الجزيئية المتوقع لBbs4 (UniProt # Q8C1Z7) مع علامة HA. لتحديد توطين التحت خلوية من البروتين الفيروسي Bbs4، أجرينا المناعية على المقاطع vibratome 40 ميكرون. تظاهر شبكية العين حقن scAAV5-MOP-BBS4 الفرقة واضحة لتلطيخ منقط HA-الإيجابي (النجمة) التي لم يكن ينظر في شبكية العين السيطرة uninjected (الشكل 2 D). وكانت هذه الفرقة من تلطيخ الأكثر كثافة في المنطقة الواقعة بين الجزء الداخلية نوى مبصرة (ONL) و-رودوبسين الغنية قطاعات الخارجي (الشكل 2D.، يمين). ولكن لوحظت بعض punctae على هامش القريبة من طبقة الجزء الخارجي. هذه البيانات متوافقة مع التعريب الأنسجة من البروتين الذاتية (4، 11)، وكذلك الملاحظات من تجارب زراعة الخلية التي BBS4 يمكن العثور عليها على حد سواء داخل هدب (5) وعلى الأقمار الصناعية مريكزي (4، 5).

إنقاذ رهودوبسن Mislocalization.

بعد إنشاء توطين التحت خلوية من الفيروسية Bbs4، نحن مصممون المقبل ما إذا كان لدينا الجين العلاج العلاج يمكن أن يمنع رودوبسين mislocalization. عولجت فئران Bbs4 القديمة اسبوعين -null عن طريق الحقن تحت الشبكية من scAAV5-MOP-BBS4 في hemiretina الزماني للعين واحدة. في 12 أسبوع من العمر، وقطعت أقسام ناظم البرد الأفقية التي تحتوي على المنطقة المعالجة الفيروس في النصف الصدغي من هذا الباب، والمنطقة ضابطة في النصف الأنف. وأشار المناعية أن نسبة خلايا مستقبلة للضوء مع الحلقي mislocalized رودوبسين تلطيخ (السهام) كانت أقل في المناطق المعالجة (الشكل 3 A) مقارنة مع المناطق غير المعالجة (الشكل 3 B). النسب المئوية في معاملة مقابل المناطق غير المعالجة لشبكية العين ثلاثة فحص (الشكل 3 C كانت) 0.30٪ مقابل 4.19٪ (P <0.0001)، 0.23٪ مقابل 1.58٪ (P <0.01)، وبنسبة 0.09٪ مقابل 2.30 ٪ (P <0.0001). تم إحصاء ما لا يقل عن 600 خلايا ...... قل في كل منطقة، وكان يحسب أهمية باستخدام اختبار χ 2 لجدول طوارئ 2 × 2.

تين. 3.
scAAV5-MOP-BBS4 ينقذ رودوبسين mislocalization ويعيد التشكل الجزء الخارجي. المعالجة (A) وغير المعالجة (B) مناطق نفس الشبكية تظهر اختلافات واضحة في نسبة خلايا مستقبلة للضوء مع رودوبسين mislocalized (السهام). إشارة حمراء مباشرة أسفل ONL تمثل سمة غير محددة تلطيخ هذه الأجسام المضادة (الشكل 1 A). نلاحظ أيضا أن ONL هو أكثر سمكا كبيرا في الشبكية المعالجة (A). الأحمر، رودوبسين؛ الأزرق، وصمة عار النووية Topro-3. (. أشرطة النطاق، 20 ميكرومتر) (C) في كل شبكية العين ثلاثة درست في هذا العصر، وكانت النسبة المئوية للخلايا مستقبلة للضوء واظهار رودوبسين mislocalization أقل من ذلك بكثير في معاملة مقابل المناطق غير المعالجة (* P <0.01 **؛ P <0.0001؛ أهمية محسوبة بواسطة χ 2 الاختبار لجدول طوارئ 2 × 2). (D) الأقاليم من Bbs4 - / - شبكية العين تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 الواردة قطاعات الخارجية التي كانت مشابهة لافت للنظر في WT قطاعات الخارجي. في غير المعالجة السيطرة Bbs4 - / - شبكية العين، وقطاعات الخارجي لا يمكن التعرف عليها في 16 أسبوع من العمر. (شريط مقياس، 10 ميكرون). OS، الجزء الخارجي؛ هو، الجزء الداخلي. INL، طبقة النووية الداخلية.

كما أظهرت قطاعات الخارجي في Bbs4 شبكية العين -null التحسن بعد العلاج مع scAAV5-MOP-BBS4. تعامل - / - الفئران قتل في 16 أسبوع أظهرت بقع كثيفة، شرائح الخارجي متجانسة في hemiretina الزمانية قياس 20.7 ± 0.52 ميكرومتر في الطول (يعني ± SEM، ن = 12) (الشكل 3 D.، يمين). وكانت هذه مشابهة لمن النوع البري قطاعات الخارجي (الشكل 3D، يسار) في كل من المظهر وطول (22.6 ± 0.21 ميكرون، ن = 12). قطاعات الخارجي من دون علاج - / - شبكية العين، في المقابل، كانت متفرق، غير متجانسة، وقصيرة (13.1 ± 0.44 ميكرون، ن = 12) في 4 أسبوع والتعرف عليها في 16 أسبوع (الشكل 3 D.، مركز لليسار ويمين مركز).

مبصرة الإنقاذ.

لتحديد ما إذا كان العلاج الجيني يمكن أن يمنع موت الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية العين -null Bbs4، أحصينا عدد الأنوية المتبقية في الأعمدة الخلوية من ONL. الشكل. 4 يظهر كلتا العينين من - / - الماوس العلاج في 2 أسبوع وقتل في 16 أسبوع. تلقت العين اليسرى لحقن scAAV5-MOP-BBS4 الزمني، في حين أن العين اليمنى تلقت حقن scAAV5-MOP-GFP الزمني، وترك أجزاء الأنف كل من شبكية العين غير مصورة على أي فيروس. خرائط الحرارة من سمك فقط. t (الشكل 4 أ) تدل بوضوح على المنطقة المحلية في النصف الصدغي للعين اليسرى، حيث كان ONL أربع إلى ست نوى مستقبلة للضوء في السمك. هذه المنطقة تقابل بالضبط إلى جزء من شبكية العين تتعرض لفيروس Bbs4 العلاجي. مناطق لا يتلقى الفيروس العلاجي (أي النصف الأنف للعين اليسرى وكل شطر من العين اليمنى) قد شهد انحطاط لا هوادة فيه أن ترك طبقة مبصرة 1-2 فقط نوى سميكة. Photomicrographs (الشكل 4 B) من المواقع الخمسة المشار إليها في خرائط الحرارة توضح تناقض صارخ بين - / - شبكية العين مع وبدون العلاج العلاج الجيني. المناطق المعالجة (الأول والثاني) لديها ONL سمكا بكثير جنبا إلى جنب مع ما يقرب من المعتاد الظهور-شرائح الخارجي، في حين أن المناطق غير المعالجة (الثالث إلى الخامس) لديها ONL رقيقة متجانس وليس قطاعات الخارجي.

تين. 4.
العلاج مع scAAV5-MOP-BBS4 يمنع الموت مبصرة. (A) في 16 أسبوع، مبصرة البقاء على قيد الحياة وتقييمها من قبل طبقة النووية الخارجي (ONL) سمك في أقسام أفقية تحتوي على العصب البصري. خرائط الحرارة تشير إلى طبقة سميكة الخارجي النووية (الأحمر) في موقع الحقن scAAV5-MOP-BBS4، والطبقة النووية الخارجي رقيقة (الأزرق) في جميع المناطق الأخرى. (B) Photomicrographs من المعالجة (الأول والثاني) وغير المعالجة (من الثالث الى الخامس) مواقع مبين في A. (شريط مقياس، 10 ميكرون). وأصبحت قطاعات الخارجي في BII عازمة أثناء التثبيت وتظهر في المقطع العرضي. هو، الجزء الداخلي. OS، الجزء الخارجي؛ INL، طبقة النووية الداخلية.

كان نمط المترجمة سمك فقط. t في المنطقة تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 متناسقة عبر جميع شبكية العين فحصها. تضمين هذا حيوانين قتل في 12 أسبوع (التين. S1 و S2)، واثنين من الحيوانات قتل في 16 أسبوع (الشكل 4 والشكل S3)، واحد حيوان قتل في 45 أسبوع (الشكل. S4). كان هذا أقدم الحيوانات ذات أهمية خاصة لأن العين غير المعالجة الواردة على الإطلاق أي خلايا مستقبلة للضوء، في حين أن المنطقة الزمنية للعين المعالجة كان ستة إلى سبعة صفوف من خلايا مستقبلة للضوء في أنحف نقطة فيه.

تحسين وظيفي من الرؤية.

لتقييم وظيفة قضيب في شبكية العين -null Bbs4 بعد العلاج الجيني، أجرينا ERGs ومعلمات الردود على الموجة باستخدام المربعات الصغرى يصلح للphotocurrent نموذج Cideciyan-جاكوبسون (المعادلة 1). أنتج هذا التحليل اتساع (R كحد أقصى) والحساسية (σ) قيمة لوصف استجابة قضيب من كل عين. الشكل. 5 A يدل على البيانات الفعلية على الموجة (آثار الصلبة) في اثنين من كثافات مختلفة ومنحنيات المجهزة (آثار متقطع) لمدة 12 فالتر كالين من العمر - / - الفأر مع عين واحدة تعامل (يسار) ودون علاج البعض (يمين).

تين. 5.
تحليل ERG موجة بعد العلاج scAAV5-MOP-BBS4. (A) التمثيلية 12 أسبوع من موجة الحواف الأمامية وآثار نموذج المجهزة (الخطوط المنقطة) للتعامل (يسار) والتحكم (يمين) عيون Bbs4 - / - الماوس. (B) وعاد إجراءات تركيب نموذج السعة (R كحد أقصى) والحساسية (σ) معلمات للعيون اختبارها في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوع. وتظهر عيون الفردية رموز المفتوحة (الأزرق وscAAV5-MOP-BBS4، الأحمر وscAAV5-MOP-GFP أو أي حقن)، وتمثل الرموز شغل المتوسطات (أشرطة الخطأ = SEM). المتوسطات مجموعة مختلفة إحصائيا في 8 و 12 و 16 أسبوع (الجدول 1). وتظهر (C) متوسط ​​R ماكس واستخدمت القيم سيجما من B كمدخلات لنموذج photocurrent، وآثار الإخراج لكل نقطة من النقاط الزمنية الأربعة التي تم فحصها.

بعد العلاج في 2 أسبوع من العمر، وقد تم تحليل ERG على موجات في 4 و 8 و 12 و 16 أسبوع. يتم عرض البيانات في الشكل. 5 مع كل من الفردية عيون (رموز فتح) ومتوسط ​​القيم (رموز شغل) هو مبين. في جميع نقاط الوقت الأربعة، وكان يعامل عيون (scAAV5-MOP-BBS4) في المتوسط ​​على حد سواء أعلى سعة وحساسية أعلى من عيون التحكم (scAAV5-MOP-GFP أو uninjected). كان الفرق بين عيون المعالجة والسيطرة صغير في 4 أسبوع لكن نما أوسع وصلت دلالة إحصائية عند كل نقطة زمنية لاحقة الثلاث (الجدول 1). أهمية خاصة هو حقيقة أن متوسط ​​حساسية العينين تعامل زاد فعلا من 12 إلى 16 أسبوع، لتصل إلى قيمة 3.80 ± 0.077 سجل الاسكتلندي مؤتمر نزع السلاح -1 م 2 ق -3 (يعني ± SEM، ن = 15). وكانت هذه القيمة يمكن تمييزها تقريبا من قيمة من النوع البري العمر المتطابقة من 3.83 ± 0.064 = 6). قيم متوسط ​​R ماكس وσ من الشكل. 5 B تم استبداله في المعادلة 1 لإنتاج متوسط ​​حواف الموجة الرائدة لكلا الفريقين (الشكل 5 C) في جميع نقاط الوقت الأربعة (4 أسبوع يسار، 16 أسبوع اليمين). لاحظ أسرع الارتفاع الوقت وزيادة سعة المعالجة (الأزرق) يتتبع في جميع الأوقات. ومن المثير للاهتمام، وظل الفرق السعة بين المعالجة ومراقبة ثابتة نسبيا على مر الزمن، على الرغم من العمليتين انخفضت في السعة المطلقة (مناقشة).

الجدول 1.
مخطط كهربية على الموجة تحليل

أجرينا أيضا حركة العين استجابة (OKR) اختبار لتحديد ما إذا كانت المنطقة محدودة من شبكية العين الحفاظ كافية للحصول على رد السلوكية أثار بصريا. تم اختبار ما مجموعه تسعة الفئران (تتراوح أعمارهم بين 9-11 شهر)، بعد أن تلقى كل حيوان لحقن scAAV5-MOP-BBS4 أحادي في 2 أسبوع من العمر. كشفت التجارب الأولية في ظل ظروف ظلامية أن أربعة من تسعة عيون المعالجة يمكن أن انتزاع OKR إيجابي، في حين كان ينظر توجد مثل هذه الاستجابة لأي من أعين غير المعالجة المقابل. مزيد من الاختبارات السلوكية ويجري حاليا.

نقاش

نحن هنا تقديم دليل على أن العلاج الجيني يمكن أن تمنع بصمات مرضية الرئيسية التي توجد في شبكية العين -null Bbs4 (11، 13، 14). على وجه التحديد، والتعبير Bbs4 الفيروسي في المستقبلات الضوئية قضيب ينقذ رودوبسين mislocalization ويحافظ على قضيب قطاعات الخارجية التي تظهر صحية. يتم منع الموت مستقبلة للضوء في المناطق تلقي العلاج الجيني العلاج، في حين أن المناطق غير المعالجة تتحول بسرعة. نحن تأكدت هذه النتائج التشريحية التي كتبها تخطيط كهربية الشبكية والسلوك. أظهرت ردود قضيب أرج أكبر سعة وارتفاع حساسية في العينين تعامل مقابل الضوابط غير المعالجة، وكانت أثارت OKRs إيجابية من بعض العيون المعالجة ولكن لا علاج الضوابط. بشكل جماعي، وتشير هذه النتائج إلى أن العلاج الجيني هو نهج ممكنا لعلاج العمى في المرضى الذين يعانون BBS البشري. على أساس نجاحنا في استكمال هذا الجين Bbs4، يبدو من المرجح جدا أن أشكالا أخرى من BBS، وخصوصا تلك التي ترتبط جزيئيا إلى BBSome (5)، وسوف تكون أيضا أهدافا مناسبة للعلاج بالجينات. والشيء نفسه يمكن أن ينطبق على ciliopathies الشبكية الأخرى، بما في ذلك متلازمة حاجب، متلازمة جوبير، متلازمة العليا-لوكن، وبعض أشكال يبر كمنة خلقية (26). وعلاوة على ذلك، لأنه يعتقد السمنة في BBS أيضا أن يحدث بواسطة آلية البروتين mislocalization مماثلة تنطوي على مستقبلات هرمون الليبتين في الخلايا العصبية المهاد (9)، فمن الممكن أن بعض أشكال السمنة المتلازمات قد تكون أيضا المرشحين للعلاج بالجينات.
في أيدينا، أدى حقن تحت الشبكية من scAAV5-MOP-GFP في GFP التعبير بمتوسط ​​تغطية شبكية العين من 4.8٪ فقط. على الرغم من أن هذا هو أقل مساحة من وقدر الآخرين، حققنا مرتفعة للغاية قضيب تنبيغ داخل منطقة التغطية (تقترب من 100٪ قرب موقع الحقن) والأحداث السلبية التقليل الناتجة عن الإصابات الميكانيكية للأنسجة. كان نمط تغطية الفيروسي من المفيد لدراستنا: أنها قدمت الرقابة الداخلية مريحة عند دراسة المعالجة (الزمانية) وغير المعالجة (الأنف) مناطق أقسام الشبكية عرضية. وعلاوة على ذلك، لأن تنبيغ من الخلايا قضيب كان ما يقرب من 100٪ محليا وغائبة في المناطق البعيدة، وكانت آثار نسيجية للفيروس جلية واضحة. لأسباب سبق ذكرها، اخترنا الماوس أوبسين المروج أن نركز جهودنا على إنقاذ مبصرات قضيب. ونتيجة لذلك، أدى لدينا بناء الفيروسي العلاجية إلى تحسن واضح في نظام قضيب ولكن تحسين مخروط قليلا. ومع ذلك، ونظرا لأوسع نافذة الوقت العلاجية والمروج المناسب (+27 - +29)، وليس هناك سبب واضح لماذا لا يمكن أيضا أن أنقذ المخاريط. على عكس الفأر المستخدمة في هذه الدراسة، وBbs1 M390R ديه knockin عادية نسبيا مخروط أرج وظيفة في 11 أسبوع من العمر (16)، وبالتالي قد يكون نموذجا مناسبا للتقييم المستقبلي لإنقاذ مخروط.
على الرغم من أن دور الجزيئي الدقيق للBbs4 والبروتينات BBS أخرى في المستقبلات الضوئية ليست مفهومة تماما [انظر زغلول وKatsanis (30) لمراجعة]، والكثير من النقاط الأدب دورا في الاتجار داخل الخلايا البروتين والتعريب في المنطقة المجاورة لل الجسم الهدبي القاعدية. ملاحظتنا التعبير Bbs4 الفيروسي في الجزء الداخلي والجزء الخارجي القريب يتسق تماما مع هذه الفكرة. كان قادرا على عكس النمط الظاهري تنميط رودوبسين mislocalization ينظر في عدة نماذج BBS الماوس (ScAAV5-MOP-BBS4 11، 12، 15)، وكذلك نماذج الأخرى التي تم حذفها البروتينات الهدبية (31، 32). وليس من الواضح تماما ما إذا mislocalization رودوبسين في هذا النموذج هو نتيجة مباشرة لBbs4 حذف أو بالأحرى إهانة الثانوية الناجمة عن انحطاط مبصرة. هذا التمييز، ومع ذلك، لا تحدث أثرا يذكر لهذه الدراسة. تم العثور رودوبسين mislocalization أن تسبق الموت مبصرة أفكارك في Bbs2 - وBbs4 نماذج الماوس -null (11، 12)، وذلك على أساس لدينا وجدت أن عمليات الإنقاذ العلاج الجيني رودوبسين mislocalization، وكنا نتوقع تماما أن العلاج الجيني من شأنه أيضا أن يمنع الموت مبصرة . والواقع أن هذه القضية: أدى الحقن الموضعي للscAAV5-MOP-BBS4 في 2 أسبوع من العمر في المترجمة الإنقاذ مبصرة التي لا تزال قائمة حتى حتى بحثت نقطة زمنية مشاركة (45 أسبوع). على العكس، المناطق غير المعالجة تدهورت بشكل مطرد حتى بلغت خسائر مبصرة كاملة. ولذلك أنشأنا التي نافذة علاجية موجود في الماوس -null Bbs4 خلالها عملية مرض شبكية العين هو عكسها.
تحليل كامل الحقل أرج على الموجة باستخدام نموذج Cideciyan-جاكوبسون (24) أثبتت أن لديها حساسية بشكل ملحوظ في هذه الدراسة. دون الحاجة إلى استخدام تقنية أرج متعددة البؤر كنا قادرين على ملاحظة هامة للغاية (P <0.0001) تحسن في وظيفة قضيب الرغم من الحقن تحت الشبكية لدينا تغطي سوى 5٪ من شبكية العين. إمكانية أرج القرنية هي محصلة جميع التيارات خارج الخلية الشعاعية في العين، لذلك لدينا في فوج من العيون تعامل مع scAAV5-MOP-BBS4 افترضنا أن أرج يمثل تركيبة خطية من 5٪ الصحية (المعالجة) شبكية العين و 95٪ المنحطة (غير المعالجة) شبكية العين. السعة القصوى لالموجة، R كحد أقصى، ويرتبط إلى مجموع الظلام الحالي المتداول في قطاعات الخارجي في وقت ظهور ضوء (33)، وبالتالي من المتوقع أن ينخفض ​​في هذا النموذج الماوس كما تفقد قطاعات الخارجي بسبب وفاة مبصرة . لدينا بيانات على الموجة (الشكل 5 C) تبين أن R كحد أقصى في التعامل مع عيون انخفاض 4-16 أسبوع ولكن أكبر من R الحد الأقصى من أعين الرقابة غير المعالجة في كل نقطة زمنية. الأهم من ذلك، والفرق السعة بين المجموعتين التجريبية هو ثابت تقريبا. الفرق ثابت يشير إلى أن عيون المعالجة لديها عدد قليل من السكان انقاذ قطاعات الخارجية التي تبقى في صحة جيدة على مر الزمن (الشكل 4 B i و B II) والإسهام بشكل مطرد إلى والموجة. هذا، ومع ذلك، يتم فرضه على إشارة الخلفية الكبيرة القادمة من شرائح الخارجي غير الصحية التي تتدهور مع مرور الوقت.
معتمد لدينا الخطية الجمع الفرضية أيضا بالتغيرات في حساسية على الموجة (σ) على مر الزمن. شادي وآخرون. (34) خلصت من مرضى التهاب الشبكية الصباغي البشري الذي قضيب انحطاط أدى إلى تخفيض تدريجي من التضخيم تنبيغ، وهي كمية ترتبط ارتباطا وثيقا المعلمة حساسية عنها في هذه الدراسة. وتبين لنا أن حساسية قضيب في غير المعالجة Bbs4 عيون -null تنخفض مفردة النغمة 4-16 أسبوع. في عيون المعالجة، إلا أن انخفاض حساسية 4-12 أسبوع، تليها زيادة ملحوظة من 12 إلى 16 أسبوع. ومن المثير للاهتمام خاصة أن حساسية العين العلاج في 16 أسبوع هي مشابهة جدا لحساسية النوع البري عيون العمر المتطابقة. في سياق نموذجنا الجمع الخطي، وتشير هذه البيانات إلى أن القفزة في حساسية بين 12 و 16 أسبوع يمثل الاختفاء التدريجي لل95٪ قضيب صحي إشارة وهيمنة الناشئة من 5٪ الصحية (المعالجة) قضبان مع قضيب عادية نسبيا المعلمات phototransduction. ويؤكد الحفاظ على الاستجابات السلوكية أثار بصريا من أربعة من تسعة عيون يعامل كذلك إلى أن عدد سكان قضبان الوظيفية نجا نتيجة العلاج لدينا. والحقيقة أن أي الفئران التي عولجت عرضت هذه الاستجابات السلوكية مفاجئا، بالنظر إلى مساحة محدودة من المستقبلات الضوئية انقاذهم. مزيد من الدراسات جارية حاليا لربط تشريحية، الكهربية، والإنقاذ السلوكي على مستوى الفرد العينين.
من منظور تجريبي لدينا عامل التغطية المتوسط ​​من 5٪ في حقن الفيروس كان أكثر من كافية لمراقبة مصلحة التشريحية والوظيفية، وبالتالي التحقق من فعالية لدينا بناء الفيروسي. في النماذج الحيوانية الكبيرة، والتغطية الشبكية من 20-30٪ يمكن تحقيقه بسهولة عن طريق الحقن تحت الشبكية (35، 36). إذا ترجم إلى موضوع الإنسان، أن 30٪ تحتوي على تغطية منطقة البقعة الصفراء لديها القدرة على الحفاظ على حدة البصر العادي تقريبا. شرط هام للعلاج بالجينات، ومع ذلك، هو التشخيص الوراثي في ​​الوقت المناسب قبل حدوث الموت مبصرة واسعة النطاق. وتشير الدراسات السريرية أن من بين المرضى BBS1، نصف فقط سيكون حدة البصر من 20/60 أو أفضل في وقت التشخيص. يبدو أن الوضع يكون أسوأ بالنسبة لأولئك مع BBS10 (37، 38). وهذا يؤكد على أهمية الوعي BBS في طب العيون والمجتمعات طبية واسعة النطاق. نتائجنا هي خطوة مشجعة أولى نحو الحفاظ على الرؤية في المرضى الذين يعانون BBS، ولكن النجاح النهائي لمثل هذا العلاج يتطلب جهد تعاوني بين الباحثين والأطباء متعدية يقظة.

المواد والأساليب

التركيبات الفيروسية.

كامل طول كدنا] للماوس Bbs4 الجين (الانضمام لا. BC145771 تم الحصول عليها) من النظم البيولوجية فتح. تمت إضافة حاتمة العلامة HA (YPYDVPDYA) إلى N محطة من Bbs4، تليها ربط من HA- Bbs4 إلى البلازميد SC-MOPS500-hGFP في مكان hGFP. طريقة البلازميد ترنسفكأيشن باستخدام خلايا HEK293 كما هو موضح سابقا (39) تم استخدامه لإنتاج وتنقية scAAV2 / 5 ناقلات تحمل إما Bbs4 أو GFP. تم تحديد التتر الفيروسية التي كتبها في الوقت الحقيقي PCR كما هو موضح سابقا (40) وكانت 6.82 × 10 12 VG / مل لscAAV5-MOP-BBS4 و 3.64 × 10 12 VG / مل لscAAV5-MOP-GFP.

الحيوانات وتحت الشبكية الحقن.

تم إنشاؤها الفئران Bbs4 -null كما (هو موضح سابقا 8). وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في كلية بايلور للطب. وترد تفاصيل تقنية الحقن تحت الشبكية بطريق الصلبة في مواد SI وطرق.

الأنسجة وImmunoblotting.

تم تنفيذ طرق كما هو موضح سابقا (11) مع تعديلات طفيفة. كانت ملطخة أقسام المجمدة عشرة ميكرومتر مع 1: 1000 لمكافحة رودوبسين (استنساخ RET-P1؛ Neomarkers) ماب ودابي. لتحديد HA-BBS4، 1: تم استخدام 1000 التخفيف من مكافحة HA ماب (16B12 استنساخ؛ كوفانس). لالمجهر الضوئي، كانت ملطخة أقسام الإي بي 1 ميكرومتر مع الميثيلين الأزرق الفوكسين والأساسي. لخلق تمثيل خريطة الحرارة، تم تقسيم الصور الرقمية بشكل متساو إلى 32 مناطق في hemiretina. تم تحديد قيمة سمك لكل منطقة عن طريق حساب متوسط ​​ثلاث تهم من النوى الموجودة في عمود فقط.

اختبار الرؤية وظيفية.

تم تخدير الفئران عن طريق الحقن الملكية الفكرية من 51 ملغم / كغم من الكيتامين، 10 ملغ / كغ زيلازين، و 0.86 ملغم / كغم آسيبرومازين، وسجلت ERGs كما هو موضح سابقا (11). وعلى غرار A-موجة الرائدة الحواف باستخدام طريقة وصفها Cideciyan وجاكوبسون (24). لفترة وجيزة، تم تسجيل ERGs الظلام تكييفها استجابة لاثنين من ومضات مشرقة (2.10 و 3.45 سجل الاسكتلندي * CD * ق / م 2)، والمعادلة التالية كان يصلح لكلا منحنيات وقت واحد باستخدام المربعات الصغرى التقليل: حيث I هي شدة فلاش، R كحد أقصى، وأقصى اتساع الاستجابة؛ σ، والحساسية؛ ور، مرة بعد بداية التحفيز. مزيد من المعلومات حول المعادلة. منحنى البرنامج المناسب، واختبار OKR يمكن العثور عليها في مواد SI وطرق.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس