عرض مشاركة واحدة
  #25  
قديم 11-23-2015, 10:05 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي تثبيط الهجرة قمة العصبية راء dysmorphology القحفي والمرض هيرشسبرونغ في متلازمة بارديه-بيدل

 

http://www.pnas.org/content/105/18/6714.full




التعرف على الوجه أمر أساسي لتشخيص العديد من المتلازمات، وربما تعكس أنماط القحفي مسببات المشتركة. في متلازمة عديد المظاهر بارديه-بيدل (BBS)، وciliopathy الابتدائية يعانون من ضعف النقل intraflagellar، المرضى الذين لديهم الوجه "الجشطالت" المميز الذي dysmorphologists وجدت صعوبة في تميز. هنا، فإننا نستخدم النمذجة السطحية كثيفة (DSM) لتكشف عن أن المرضى BBS والمسوخ الماوس لديها عيوب منتصف الوجه التي تشمل الهياكل المستمدة من قمة العصبية المتجانسة التي تتقاسمها morphants الزرد. تنشأ هذه العيوب من القحفي (CF) هيكل عظمي من الجمجمة الشاذة خلية قمة العصبية (NCC) الهجرة. ولا تقتصر هذه الآثار إلى المنطقة القحفي، ولكن تفشل البلدان المساهمة الصافية العصب الحائر المشتقة لتجميع الجهاز العصبي المعوي، وبلغت ذروتها في المختلين الأمعاء على الحركة. وعلاوة على ذلك، morphants عرض بصمات تعطلت سونيك القنفذ (Shh على) يشير من خلاله البلدان المساهمة الصافية تأخذ العظة الموضعية. نقترح نموذجا حيث البروتينات BBS تعدل الهجرة NCC، والمساهمة في التشكل القحفي وتطوير الجهاز العصبي المعوي. كما شرح هذه العيوب الهجرة جمعية مرض هيرشسبرونغ (HD) مع BBS. وعلاوة على ذلك، وهذا هو أسلوب غير موصوف سابقا من استخدام توصيف dysmorphology الوجه كأساس للتحقيق في ميكانيكية حدوث تنمية CF في متلازمات تشوه.
الاعتراف ب "الجشطالت" الوجه أمر أساسي لتشخيص كثير من الأمراض الوراثية، ولكن التقلب الكبير في ملامح غالبا ما يعيق تصنيف الناجح (1). dysmorphology مؤخرا، وقد تميزت موسع التصوير 3D سطح في متلازمات (2، 3). لا شيء، ومع ذلك، فقد استخدمت لتحديد الوجه إما خلل البنية؛ شوهة أو المساعدات التحقيق خفية من آليات dysmorphology القحفي.
متلازمة بارديه-بيدل (BBS) يسبب تنكس الشبكية، آخر polydactyly المحوري، والسمنة، والفشل الكلوي، وضعف الادراك. وقد تم اكتشاف اثني عشر BBS الجينات (BBS1-BBS12)، والتسبب في خلل يكمن أهداب الابتدائي (4). يتم التعبير عن BBS4، BBS6، وBBS8 (التحقيق في هذه الدراسة) في ظهائر مهدبة وتوطين للهيئات الجسيم المركزي والقاعدية من الخلايا المهدبة (5 - 7). وقد تم الإبلاغ عن حالات الشذوذ القحفي خفية في المرضى (8 - 10). من بين ميزات إضافية عديدة من BBS هو مرض هيرشسبرونغ (HD)، اضطراب في الجهاز المعوي العصبي (ENS) (11).
تيارات الخلايا قمة العصبية (البلدان المساهمة الصافية) من النموذج الدماغ الذيلية معظم من القحفي (CF) هيكل عظمي (انظر المرجع 12 للمراجعة). الجمجمة البلدان المساهمة الصافية (CNCC) تتبع مسارات محددة لتجميع بروز جبهي أنفي وخيشومي قوس اللحمة المتوسطة. هنا، فإنها تتكاثر وتتمايز إلى هياكل الوجه والجمجمة. سونيك القنفذ (Shh على) أعرب في الدماغ بطني والأديم الظاهر الشفوي ضروري لتشكيل معظم الهياكل الوجه (12). الفئران التي تعاني من نقص SHH لها خسارة فادحة في العظام القحفي، و، في البشر، والطفرات SHH تسبب عيوب خط الوسط CF مع اندماج مقدم الدماغ (HPE) (12).
وENS ينظم حركية الجهاز الهضمي وإفراز. انها تستمد من البلدان المساهمة الصافية العصب الحائر والقطنية العجزية (13). في HD، وتتميز تضخم القولون، وهناك انخفاض أو العقد المعوي غائبة في القولون البعيدة.
على الرغم من وفرة الأدلة الحديثة تشير إلى خلل وظيفي الهدبي في BBS، سواء عيوب الوجه و الجهاز الهضمي يصعب التوفيق على هذا الأساس وحده. في هذه الدراسة، وتبين لنا أن البروتينات BBS مطلوبة للهجرة NCC، وبلغت ذروتها في العيوب القحفي Shh على التي تعتمد، واضطراب الأمعاء على الحركة، من المحتمل وراء جمعية HD مع BBS.
النتائج

ثلاثي الأبعاد الكثيفة النمذجة السطحية (DSM) تكشف عيوب الوجه والجمجمة المقارنة في الإنسان والفأر.

لتقييم عيوب CF في BBS، أجرينا 3D DSM تحليل الوجه على 83 مريضا (بغض النظر عن الطفرات) و 230 الضوابط. لمراعاة الفروق النمو، وأجريت التحليلات بشكل منفصل عن مواضيع <20 عاما. تم المشروح بمسح الوجه مع المعالم الرئيسية [المعلومات الداعمة (SI) الشكل. S1]، حسبت DSMs من مناطق الوجه والأنف لمجموعات فرعية من وجوه، وتم قياس الفروق بين السيطرة والمعالم BBS. العديد من القياسات بين المعالم أو كانت أهم طول الشاذة وعرض الوجه (الشكل S2). لتجنب آثار الأنسجة الرخوة المفرطة في وجوه المرضى، ونحن المقيد الأول تحليل شكل لمنطقة الأنف حيث السمنة لديه الأقل تأثير. أظهرت اللون لمسافات تلوينها مقارنات متوسط ​​BBS وأنوف السيطرة للأطفال والكبار الأنف تنسج الجسر وتقصير الانف / انخفاض bulbosity في طرف الأنف (الأحمر والأصفر، الشكل 1 A و B). نقرأ ديناميكية بين BBS والسيطرة تعني أنوف تظهر هذه الخلافات وشكل أخرى في جناح الكبير الأنف وcolumella (انظر أفلام S1 و S2). اختبار Multifolded باستخدام نمط خوارزميات الاعتراف أقامت تمييزا كبيرا [المتلقي مشغل خاصية (ROC) تحليل]، وذلك باستخدام شكل الأنف وحدها (الجدول S1). في المرضى البالغين، وأظهرت مقارنات مرمزة المسافة من متوسط ​​شكل الوجه مع أن من الضوابط النزوح التصاعدي النسبي للأنف والشفة العليا (المناطق الزرقاء في الشكل 1 C)، في منتصف الوجه تنسج وretrognathia معتدل (المناطق الأحمر والأصفر من الشكل 1 D).

تين. 1.
لون لمسافات تلوينها التشكل نفسه من المرضى BBS (الأنف والوجه) وBbs6 فئرانا معدلة وراثيا (جماجم الجافة) مقارنة مع الضوابط WT. (A و B) مقارنة وضعها الطبيعي على السطح للأطفال BBS (A) / بالغين (B) مع بقع حمراء والأصفر يظهر نقص تنسج على جسر الأنف وتقليل طول / bulbosity في طرف الأنف. (C) مقارنة الرأسية للمرضى البالغين من الذكور مع التصحيح الأزرق يظهر تقصير منتصف الوجه. (D) عمق الحكمة للمرضى الكبار أنثوية المنطقة الحمراء الأصفر تظهر تسطيح منتصف الوجه وretrognathia معتدل. المقارنة (E) عمودي للأطفال BBS مع التصحيح الأزرق يظهر تقصير منتصف الوجه. (F) مقارنة العمق الحكمة للأطفال BBS مع المنطقة الحمراء الأصفر تظهر تسطيح منتصف الوجه وretrognathia معتدل. (G) عادي على السطح بالنسبة للفئران Bbs6 مع الأحمر والأصفر المنطقة للحد من يظهر في المناطق القاطعي والفكين (ملاحظة: تم إزالة الفك السفلي قبل التصوير). عرض (يسار) Dorasl. (يمين) عرض جانبي.

المكون الرئيسي 3 من DSM للأطفال تحكم يعكس التسطيح من منتصف الوجه، وارتبط توضع خلفي الفك السفلي بقوة [بيرسون حظة المنتج الارتباط (PPMC) = 0.81] مع الموقف تصنيف وجها فيما يتعلق السيطرة متوسط ​​وBBS الأطفال وجوه (الشكل S3). و/-تعديل حجم المقارنة عمر متوسط ​​أثرت BBS وأظهرت وجوه الأطفال التحكم أكبر عرض الوجه والأنف النزوح التصاعدي (الشكل 1 E)، وكذلك تسطيح منتصف الوجه وretrognathia (الشكل 1 F). نتائجنا تشير إلى أن هذه التقنية يمكن أن يميز الظواهر الوجه خفية تتحدى حتى dysmorphologists خبرة.
نحن التحقيق المقبل ما إذا كانت نماذج الماوس BBS (Bbs4 - / - وBbs6 - / -) قد يكون التشوهات القحفي مماثلة Bbs4 - / - = 31)، متخالف = 30)، وWT = 20) وكانت الفئران تصوير باستخدام الليزر الماسح الضوئي 3D (الشكل S2). على الرغم من الخلافات الجسيمة في علم التشريح القحفي بين البشر والفئران، وهناك أوجه تشابه كبيرة في النسب الرئيسية، بما في ذلك أكبر عرض منتصف الوجه إلى ارتفاع (P <0.01)، وخطم أقصر (P <0.01). شوهدت تشوهات مماثلة في سطح Bbs6 الفئران -null (الجدول S2). وأظهرت الزيجوت لم الشذوذ التاريخي.
لتحديد أصول العظمية مفصلة للتغيرات القحفي، فإننا 3D المقبل ليزر سطح الممسوحة ضوئيا Bbs6 - / - = 9) وWT = 15) الجماجم. مرمزة مقارنات بين الأسطح الجمجمة يعني تؤكد أن تقصير يعزى إلى نقص تنسج طليعة الفك العلوي والفك العلوي، مما أدى إلى خطم أقصر بكثير، على غرار عجز الإنسان (الشكل 1 F و G والسينما S3).
BBS Morphants الزرد لديها عيوب الوجه والجمجمة انعكاس المسوخ الثدييات.

على الرغم من الاختلافات الشكلية بين الجماجم الثدييات والأسماك، وكثير من نفس الجزيئات يشير تنظيم تنميتها، وتنظيم الهيكل العظمي الجمجمة يشبه بشكل ملحوظ (12). وneurocranium الأمامي (ANC) ويتكون من الترابيق ولوحة الغربالية، وكلاهما NC مستمدة ومماثلة للفك العلوي الثدييات (14).
لتقييم مسببات العيوب CF الإنسان والفأر، ونحن حقن الأجنة الزرد مع bbs4، bbs6، وmorpholinos bbs8 (MO) وتصور الغضاريف في الجمجمة في 5 أيام postfertilization (إدارة الشرطة الاتحادية). وعلى الرغم من التقارب والإرشاد (CE) عيب (15، 16)، وكان morphants bbs4 التشكل CF طبيعي إلى حد كبير (الشكل 2 B، G، وL و A،K و) على الرغم من ان الفك السفلي أوسع وأقصر. في morphants bbs6، وتقصير ANC، ضغط الوجه (الجدول S3). وقد تقلص إلى حد كبير في الفك السفلي، وكان هناك عدد أقل من الأقواس خيشومي مصبغ (الشكل 2 وأعرب على نطاق واسع وM). bbs8 في الجنين الزرد (الشكل. S4).

تين. 2.
عيوب قمة القحفي والعصبية في BBS الزرد morphants. (A-E) وجهات النظر بطني من wholemount، الألسيان الأزرق الملون، الزرد 5 DPF. morphants bbs8 هم أشد (D)، مع فقدان جهاز البلعوم (2D رأس السهم)، الفك السفلي، وتقصير من القحف الغضروفي. (F-J) إطلالة جانبية على اليرقات التي تبين الحد من الأقواس خيشومي وتقصير من الفك السفلي في bbs6 وbbs8 morphants. (K-O) Flatmounts من neurocrania من الضوابط وmorphants. morphants bbs8 غالبا ما يكون انصهار الترابيق في خط الوسط (رأس السهم) مماثلة لسيو المسوخ. (P-T) Crestin في الموقع في الأجنة 20ss يكشف تيارات الهجرة البلدان المساهمة الصافية في الضوابط (رأس السهم) مع عدد أقل من تدريجيا تيارات في bbs4، bbs6، وmorphants bbs8، على التوالي. (U-X) Sox10: EGFP التعبير في الهجرة تيارات (السهام) يظهر انخفاض مماثل في عدد من تيارات إلى التعبير crestin. (Y) الكمي لعدد من تيارات في morphants يؤكد وجود خلل الهجرة قمة العصبي الشديد في morphants bbs8 التي يمكن انقاذهم من قبل مرنا البشري. (Z و AA) التعبير DCT في 27 HPF الأجنة التحكم (Z) وmorphants bbs8 (AA). [الحانات مقياس: 500 ميكرون (A-J)، و 100 ميكرون (K-O)، و 100 ميكرون (P-X).]

وقد لوحظت العيوب أشد باستمرار مع MO bbs8: تصبغ، تصقلب جزئية، والحد من القحفي الذي تم تقصير ANC مع خط الوسط انصهار الترابيق (الشكل 2 وN). في ≈20٪ من الحالات، كان الغضروف غائبة تماما في الرأس (الشكل 2 D أقحم). وكانت الفك السفلي والأقواس خيشومي غائبة تماما في 5 DPF (الشكل 2 D)، وSox10 التعبير في 72 HPF (انظر الشكل S5 A) أظهرت هذه فشلت في تشكيل. Coinjections مع bbs8 الإنسان مرنا انقاذ هذه العيوب تماما (الشكل 2 وO)، كما فعل bbs4 وbbs6 مرنا (لا تظهر البيانات). عن طريق حساب النسبة بين حزب المؤتمر الوطني الافريقي وطول الجسم، وأظهرت أن حزب المؤتمر الوطني الافريقي تقصير مستقلة عن عيوب CE (الشكل. S6 A).
NCC الهجرة يكمن وراء النمط الظاهري الجمجمة في الزرد.

الغالبية العظمى من هيكل عظمي رئيس مستمد من CNCC، والتي تهاجر الخلايا بطريقة النمطية إلى الأقواس الخيشومية وعملية الجبهي الأنفي. لمعرفة ما إذا كانوا متورطين البروتينات BBS في الهجرة NCC وCF التشكل، ونحن التحقيق ثلاث مراحل رئيسية في وقت مبكر NCC التنمية: المواصفات، والصيانة، والهجرة في morphants BBS. كانت تعبيرا عن foxd3 وsox10 العادي في مرحلة 5 الجسيدة (اس اس)، تثبت أن تلك المواصفات دون تغيير (الشكل S7). في الشمس 12ss، تدل التعبير عن crestin أن صيانة NCC كانت طبيعية (الشكل S7).
ومع ذلك، في 20ss، تعطلت تيارات crestin -expressing البلدان المساهمة الصافية التي تهاجر عادة من الناحية البطنية من الأنبوب العصبي (NT) في الجذع في BBS morphants. درجة الهجرة ترتبط مع مستوى CF عيب (أشد في morphants bbs8) (الشكل 2 P-S). الكمي للتيارات الهجرة (الشكل 2 Y) يرتبط مباشرة مع نسبة تناقص طول قحفي عصبي إلى العرض في bbs4، bbs6، وmorphants bbs8، على التوالي (الشكل. S6 B). لإثبات هذه البيانات في الموقع التهجين، لاحظنا وجود نمط مماثل للهجرة NCC باستخدام Sox10: EGFP الزرد، التي تعبر عن GFP في البلدان المساهمة الصافية (هدية من R. Kelsh) (الشكل 2 U-X) (14). مرة أخرى، تم انقاذ النمط الظاهري bbs8 مع مرنا البشري (الشكل 2 T). وفرة من البلدان المساهمة الصافية في NT تشير إلى أن الاستقراء، والصيانة، أو الانتشار لا يتأثر. بدلا من ذلك، هناك تثبيط هجرة الخلايا.
دعما لدور مشتبه بهم لBbs8 في تطوير NC، وmorphants bbs8 التي عرقلت التشكل القحفي وتقريبا لا الجذع NC الهجرة، يفتقر أيضا الخلايا الصباغية، النسب آخر NC مشتقة. لم يكن هناك أي تعبير عن DCT، علامة السلائف الصباغية، في morphants bbs8 في 27 HPF مقارنة مع الضوابط (الشكل 2 Z و AA).
اخترنا لدراسة morphants bbs8 أبعد من ذلك، باستخدام Sox10: الزرد المعدلة وراثيا EGFP. في التحكم في الشمس 12ss، البلدان المساهمة الصافية قد بدأت للتو إلى الهجرة من المنطقة وراء العين في الرأس (الشكل 3 A). بواسطة 20ss، والبلدان المساهمة الصافية هاجروا إلى المنطقة الأمامية الأكثر من الجنين، ≈250 ميكرون (الشكل 3 B). في morphants bbs8، فشلت الهجرة ليبدأ بحلول الشمس 12ss (الشكل 3 C). بواسطة 20ss، قد الخلايا هاجروا فقط في منتصف العين، ≈80 ميكرون (الشكل 3 D).

تين. 3.
الهجرة قمة العصبية في morphants bbs8. (A و B) Sox10: GFP الزرد المعدلة وراثيا تظهر هجرة CNCCs الأمامية بين 12 (A) و20ss (B). ويمثل كمية الحركة خلال الفترة 4-ساعة في B عن طريق الفرق بين الأبيض (الموقف في الشمس 12ss) والأحمر (الموقف في 20ss) النصال، ≈250 ميكرون. (C و D) تثبيط الهجرة CNCC في morphants bbs8. انتقلت على بعد مسافة صغيرة (80 ميكرون) فقط في الفترة 4-ساعة. (E و E ') البلدان المساهمة الصافية من السيطرة الأجنة المحقونة MO المطعمة إلى المضيفين السيطرة تهاجر الأمامية لملء الرأس. يظهر السهم في موضع الخلية anteriormost يظهر تغير في الموقف خلال الفترة 4-ساعة. (F و F ') الخلايا المأخوذة من متبرعين morphant bbs8 تفشل في ترحيل عند زرعها في المضيفين السيطرة، مما يشير إلى أن الخلل الهجرة غير خلية مستقلة. (G و G ') خلايا مراقبة زرعها في bbs8 المضيفين morphant الهجرة كالمعتاد. (H) وانا مراقبة والأجنة morphant في 48 HPF تظهر Sox10: EGFP التعبير في الترابيق النامية التي تفشل في استطال في morphants. (J) المهاجرة CNCCs التحكم في 14ss تظهر نتوءات filopodial الاستقطاب (السهام) أساسا في اتجاه الهجرة (السهم كبير). تبقى (K) CNCCs bbs8 morphant تتجمع بإحكام وعدم وجود نتوءات الاستقطاب. (L) في المختبر الصفر التئام الجروح فحص على 3T3 الخلايا يظهر الإغلاق المتأخر من الفجوة في Bbs8 خلايا ضربة قاضية مقارنة مع الضوابط. (M) الرسم البياني قياس عرض الفجوة على مدار الساعة 48 ساعة. (N) نفس التئام الجروح فحص باستخدام الخلايا الليفية الأولية المأخوذة من يتأثر وBBS8 - / - المرضى يظهر أيضا الهجرة تأخر. الخلايا (O) BBS8 المرضى تهاجر أبطأ من السيطرة. (P) الاستقطاب microfilaments الأكتين في السيطرة 3T3 الخلايا المهاجرة إلى الفجوة الجرح. خلايا ضربة قاضية (Q) Bbs8 لها الأكتين الهيكل الخلوي المختلين. (R و S) ولخص هذا الاضطراب في هجرة الخلايا الليفية الأولية للمرضى. [الحانات مقياس: 100 ميكرون (A-G)، 100 ميكرون (H وI)، 20 ميكرون (J و K)، و 200 ميكرون (L و N)، و 20 ميكرون (P-S)]

لتحديد ما إذا كان هذا الاضطراب الهجرة غير خلية مستقلة أو نتيجة لتثبيط الأنسجة المجاورة، أجرينا تجارب التطعيم. تم coinjected EGFP الأجنة وراثيا مع عنصر تحكم أو bbs8 MO: Sox10. في 4 HPF، تم زرع خلايا من متبرعين حقنها التحكم أو المضيفين morphant. تم تصوير عملية زرع ناجحة في الشمس 12ss لمدة 4 ساعات. على زرع ضبط MO حقن الخلايا في المضيفين السيطرة، والبلدان المساهمة الصافية هاجر الأمامية ≈150 ميكرون (الشكل 3 E وE '). ومع ذلك، الخلايا المانحة bbs8 morphant زرعها في المضيفين السيطرة فشلت في الهجرة، مما يوحي بأن فقدان Bbs8 لها دور خلايا مستقلة في تثبيط الهجرة (الشكل 3 F وF '). الخلايا المانحة السيطرة زرعها في المضيفين morphant هاجرت عادة، مما يثبت أن تثبيط الهجرة غير الثانوي إلى تثبيط الأنسجة (الشكل 3 G و G ').
لاستبعاد احتمال وجود فشل في وقت مبكر من انتشار NC، نحن FACS فرز كاملة Sox10: السيطرة EGFP والأجنة morphant في 16ss و20ss. وكانت نسبة البلدان المساهمة الصافية في morphants مماثلة لضوابط في 20ss (4.4٪ مقابل 4.7٪، P = 0.23) (الشكل. S6 G و H). نحن أيضا استبعاد موت الخلايا NC كما أن العامل المسبب، وذلك باستخدام 7AAD لتحديد عدد الخلايا الميتة Sox10 إيجابية (الضوابط 0.5٪ مقابل 0.7٪ morphants). وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام علامة PH3 الإنقسامية، ونحن لا نرى أي اختلاف في انتشار الخلايا Sox10 إيجابية في 24 HPF أو 72 HPF في morphants (الشكل S5 A-D).
استبعدنا بجانب إمكانية misdifferentiation من البلدان المساهمة الصافية. على الرغم من أن جذع morphant البلدان المساهمة الصافية بقي في NT، فإنها لم تفرق بشكل غير لائق في الخلايا العصبية في 30 HPF (HUC / D) (الشكل S5 E و F).
في 48 HPF، لاحظنا عدم تمديد الترابيق البدائية وعدم وجود لوحة الغربالية في تأسيس المؤتمر الوطني الأفريقي في morphants bbs8 في Sox10: الأجنة EGFP (الشكل 3 H وI)، مما يدل على أن dysmorphology CF ينشأ من انخفاض في في وقت مبكر الهجرة NCC، مما يؤدي إلى فشل خلايا لتجميع لوحة الغربالية.
التصوير عالية الطاقة من CNCCs المهاجرة الأمامية حول العين يظهر نتوءات خلية الاستقطاب أساسا في اتجاه الهجرة في التحكم في الشمس 12ss (الشكل 3 J). في morphants bbs8، كانت هذه الخلايا متفاوت بإحكام وتفتقر إلى نتوءات رأيت على الخلايا السيطرة (الشكل 3 K).
بعد ذلك، درسنا الهيكل الخلوي أكتين في الهجرة CNCCs، NIH 3T3، والخلايا الليفية الأولية من المرضى BBS8. على الرغم من الصعوبات في حل الهيكل الخلوي من CNCCs في الجسم الحي، لاحظنا microfilaments غير منظم في morphants (لا تظهر البيانات). وكان الهيكل الخلوي أكتين mispolarized أكثر وضوحا في Bbs8 تعاني من نقص الخلايا الليفية 3T3 والابتدائية (الشكل 3 L-O). وأظهرت هذه الخلايا نقص حاد في استقطاب الهيكل الخلوي. في البداية المقايسات التئام الجروح، تم تخفيض الهجرة في المسوخ كل أنواع الخلايا، مقارنة مع الضوابط (الشكل 3 P-S).
شاذ Noncanonical WNT اشارة قد تكمن وراء النمط الظاهري هجرة.

وينظم الهجرة NCC في وقت مبكر عن طريق الإشارات WNT noncanonical (17). الأعلى وإلى الأسفل تنظيم noncanonical WNT يشير كلا تمنع الهجرة NC (17). في ضوء الأدلة مسبق من تورط من البروتينات BBS في هذا المسار (16)، ونحن اختبار ما إذا كان هذا الدور قد يمتد إلى البلدان المساهمة الصافية.
نحن الناجم عن noncanonical يشير WNT في الزرد بالإعراب عن شكل اقتطاع من Dishevelled (DVL Δ N) (18). في 20ss، أظهرت الأجنة المحقونة مع DVL Δ N تثبيط الهجرة تيارات من البلدان المساهمة الصافية من NT (crestin في الموقع؛ الشكل 4 أ و ب). حقن bbs8 MO أيضا الهجرة تحول دون (الشكل 4 C). ومع ذلك، coinjecting 3 نانوغرام من bbs8 MO وDVL Δ N مرنا انقاذ جزئيا الخلل الهجرة NCC (الشكل 4 D). كان هذا الإنقاذ الجرعة التي تعتمد على لحقن 2 نانوغرام من bbs8 MO فشلت في إنقاذ عيب الهجرة (الشكل 4 E).

تين. 4.
Noncanonical يشير WNT والهجرة NC. (A-C) حقن كل من DN مرنا DVL وbbs8 MO ينتج بشكل فردي في تثبيط NCC الهجرة بالنسبة للضوابط. (D) Coinjection من 3 نانوغرام من bbs8 MO مع نتائج DVL DN في عمليات الإنقاذ الجزئي للهجرة NCC التي كتبها ≈4 أضعاف نسبة إلى morphants bbs8. فشل (E) Coinjection من DN DVL مرنا مع 2 نانوغرام من bbs8 MO لانقاذ الهجرة NCC. (F) حقن 50 خريج من MYR / بال الأسباب DVL تثبيط الهجرة NCC. (G) Coinjection من MYR / بال DVL مع 3 نانوغرام من bbs8 MO أيضا ينقذ جزئيا هجرة NC الكبت. (H) رسم بياني تحديد عدد من تيارات crestin -positive البلدان المساهمة الصافية المهاجرة من خلال الجذع. (شريط مقياس: 200 ميكرون).

نحن تأكدت هذه النتائج عن طريق حقن DVL التي تستهدف غشاء بناء (MYR / PAL DVL) (19)، وهو ما تسبب أيضا تثبيط للهجرة، ومرة أخرى تم انقاذ جزئيا coinjection مع 3 نانوغرام من bbs8 MO (الشكل 4 F و G) . معا، وتشير هذه النتائج إلى أن اضطراب مسار WNT noncanonical يمكن أن تسهم في تثبيط الهجرة NC.
عدم وجود المعوية الخلايا العصبية في Morphants النتائج في العيوب الأمعاء على الحركة.

النظر في دور الملاحظة لBbs8 في الجذع والجمجمة الهجرة NC، ونحن التحقيق التالي إذا كان لديها دور في تنمية ENS. هذا السؤال هو المناسب في ضوء ارتباط نشرت من BBS مع HD، فشل الخلايا العصبية المعوية لتجميع المعى المؤخر.
درسنا ENS الاستعمار من الأمعاء باستخدام علامة العصبية HUC / هود. في اليرقات تحكم في 4 DPF الخلايا العصبية المعوية بالسكان على طول القناة الهضمية لفتحة الشرج (الشكل 5 A). في morphants bbs8 (2 نانوغرام)، امتدت هذه الخلايا في منتصف الطريق على طول المعى المؤخر، أبدا الوصول إلى فتحة الشرج (الشكل 5 B). مع 4 نانوغرام من MO، فشل الخلايا العصبية للدخول في المعى المؤخر (الشكل 5 C). تم تخفيض كمية من الخلايا العصبية في المنطقة بين فتحة الشرج وبداية ساق صفار من 108 في الضوابط إلى 22 و 5 في 2 نانوغرام من و4 نانوغرام من والأجنة MO حقن، على التوالي = 10 في كل الحالات ؛ P <0.001 لmorphants) (الشكل 5. D).

تين. 5.
تطوير المعوية الجهاز العصبي في BBS morphants. الأجنة (A) تحكم في 4 DPF تظهر الخلايا العصبية المعوية ملء طول القناة الهضمية من الأمامي (الجانب الأيسر) إلى فتحة الشرج (رأس السهم). (B) مع 2 نانوغرام من bbs8 والهجرة MO من الخلايا العصبية المعوية تتوقف في منتصف الطريق على طول القناة الهضمية (النجمة)، وليس الخلايا العصبية تصل إلى فتحة الشرج (رأس السهم). (C) أربعة نانوجرام من bbs8 MO تسبب غياب كامل للخلايا العصبية المعوية، مما أدى إلى عيوب القناة الهضمية الحركة (انظر الفيلم S4 وفيلم S5). (D) الكمي لخفض عدد الخلايا العصبية المعوية مع الجرعات الكبيرة تدريجيا من bbs8 MO. (E و F) البلدان المساهمة الصافية الخروج من منطقة العصب الحائر تصور من قبل crestin تظهر أي فرق بين الرقابة وmorphant. (G و H) التعبير phox2b في 48 HPF يظهر عدد محدود من البلدان المساهمة الصافية في الأقواس الخيشومية. (I و J) عرض جانبي من الأجنة في G و H يدل على فشل الخلايا لترك الأقواس البلعومية وإدخال أنبوب الأمعاء. (K) phox2b الخلايا العصبية المعوية -positive ملء طول القناة الهضمية على طول الطريق إلى فتحة الشرج. يظهر السهم على مدى تأخرا من الهجرة، وتمثل النجمة فتحة الشرج. (L و M) حقن 2 نانوغرام من و4 نانوغرام من، bbs8 MO، على التوالي، يسبب الخلايا العصبية للهجرة في منتصف الطريق فقط على طول القناة الهضمية (2 نانوغرام) أو تفشل في دخول القناة الهضمية على الإطلاق (4 نانوغرام). [الحانات مقياس: 500 ميكرون (A-D)، و 100 ميكرون (E و F)، 200 ميكرون (G-J)، و 300 ميكرون (K-M).]

للتحقيق في سبب هذا النمط الظاهري، درسنا على مدار الساعة من العصب الحائر الهجرة NC. في 36 HPF، البلدان المساهمة الصافية هاجروا من منطقة العصب الحائر عادة في morphants bbs8، كما يتضح من crestin التعبير (الشكل 5 E و F). في 48 HPF، ويظهر التعبير phox2b انخفاض في عدد الخلايا في الأقواس الخيشومية (شرح عدم وجود الأقواس الخيشومية في morphants bbs8) (الشكل 5 G و H). يظهر منظر جانبي أن هناك خلايا المهاجرة في أنبوب الأمعاء في morphants في هذا الوقت (الشكل 5 الأول وJ)، مما يشير إلى أن عدم وجود ENS ينشأ من فشل الخلايا على الهجرة من منطقة العصب الحائر، من خلال الأقواس وداخل القناة الهضمية، وليس من فشل مواصفات أو الخروج من منطقة العصب الحائر.
أكدنا نتائج HUC من قبل في الموقع التهجين لphox2b في 72 HPF. في الضوابط، وخلايا -positive phox2b ملؤها الأمعاء إلى فتحة الشرج (الشكل 5 K). مع 2 نانوغرام من MO، خلايا تصل إلى منتصف المعى المؤخر (الشكل 5 L) في حين أن الجرعات العالية (4 نانوغرام من MO) أدى إلى غياب الخلايا -positive phox2b من المعى المؤخر (الشكل 5 M).
لأن يرتبط GI الحركة مع الأرقام الخلايا العصبية المعوية، استخدمنا المجهري الفيديو لمراقبة منتصف الأمعاء في اليرقات عند 4.5 DPF. في كل morphants (2 نانوغرام من MO)، لاحظنا عدم وجود التمعج ربط مع قلة الخلايا العصبية المعوية (أفلام S4 و S5). وتشير هذه البيانات إلى أن Bbs8 أمر مهم لالمعوي السكان الجهاز العصبي من خلال البلدان المساهمة الصافية المهاجرة من منطقة العصب الحائر وعلى الأرجح ما يفسر جمعية HD مع حالات BBS.
القنفذ اشارة تشعر بالانزعاج في BBS Morphant السمك.

وأخيرا، فإننا التحقيق في آلية محتملة لmispatterning المنطقة القحفي في BBS morphants. الانصهار من الترابيق في الأجنة morphant bbs8، جنبا إلى جنب مع تصقلب الجزئية (الشكل 2 D أقحم)، وكان يذكرنا Shh على المسوخ ممرا أو أجنة الأسماك المعالجة سايكلوبامين (12). غضاريف الرئيسيان لحزب المؤتمر الوطني الافريقي اليرقات، لوحة الغربالية والترابيق (الشكل 2 رأس السهم)، تنشأ من السلائف NCC متميزة، وكلاهما يعتمد على Shh على إشارات لتنميتها (14). والجدير بالذكر أن المرضى BBS يكون polydactyly ونقص الأعضاء التناسلية، وكذلك وجود نسبة منخفضة من عيوب الجسم الثفني والقاطعة مركزي واحد (الملاحظة الشخصية)، بصمات الشاذة يشير SHH.
أثناء الهجرة، Shh على توجيه الهجرة والزخرفة من البلدان المساهمة الصافية (12). دراسات في الزرد وفرخ تشير إلى أن Shh على من الأديم الظاهر الوجه يعزز الفك وثمرة الجبهي الأنفي (12). نحن التحقيق Shh على إشارات في BBS morphant الزرد. Patched1 (ptc1)، في حد ذاته هدفا النسخي من Shh على الإشارات، هو علامة موثوقة عن الاستجابات الخلوية لShh على (20). في 24 HPF morphant الأجنة، كان هناك انخفاض عام في ptc1 التعبير في جميع morphants النسبي لضوابط، الأكثر لفتا في bbs8 (تخفيض 64٪ بحلول QRT-PCR) (الشكل S8 A-D). كما أظهرت QRT-PCR Gli1 أن ينظم إلى أسفل إلى 52٪ من السيطرة التعبير في morphants bbs8. على النقيض من ذلك، فإن العامل pax6 النسخ، وقمع عادة Shh على الإشارات، والمتابعة تنظيما وأعرب ectopically في جميع أنحاء الأنبوب العصبي في morphants bbs8 (الشكل S8 E-H) (21)، مما يدل على misregulation من Shh على الإشارات.
حقن ptc1 MO (أو SHH مرنا، لا تظهر البيانات) التي يسببها مسار Shh على (الشكل S8 I.)، وcoinjection مع bbs8 MO انقاذ جزئيا هذا الاستقراء (الشكل S8 J.)، مشيرا إلى أن وظائف Bbs8 المصب Ptc1 لكن ليست ضرورية لShh على تنبيغ.
ويلزم البروتينات IFT لكلا GLI المنشط وكاظمة وظائف النسخي، والبروتينات جلي لا تعير اهتماما لسمو يجند في غياب البروتينات IFT. نحن اختبار ما إذا كان Bbs8 ينظم معالجة جلي في خلايا الثدييات. إضافة ناهض Purmorphamine Shh على الخلايا NIH 3T3 يحفز مسار Shh على المؤلمة التي كتبها مباشرة مملس. والموهن ردا على التحفيز في ضربة قاضية shRNA بوساطة من Bbs8 التي كتبها ≈40٪ (P <0.01) (الشكل S8 M). تحليل لطخة غربية لGli3A: نسب Gli3R في هذه الخلايا كشفت ردود اضعافها لSHH منبهات (الشكل S8 N و O.). وهذا ما أكده في الجسم الحي من قبل coinjecting الأجنة الزرد مع المهيمن السلبي PKA مرنا (الذي يعطل Gli3 الفسفرة)؛ bbs8 مرنا انقاذ النمط الظاهري (الشكل S8 K و L.). هذه النتائج تشير إلى أن bbs8 أمر مهم، ولكنه ليس أساسيا، لسمو الإشارات من خلال العمل المصب من Ptc1 وتنظيم وتجهيز Gli3.
الخلايا العصبية كريست الدب سيليا الابتدائية.

ونظرا لأهمية أهداب لShh على وnoncanonical إشارات Wnt، أن Shh على أمر ضروري لتوجيه خط الوسط المهاجرة CNCCs، ودور noncanonical WNT في الهجرة NCC، نحن مسبب أن تهاجر البلدان المساهمة الصافية يجب أن يتحمل أهداب الأولية التي شعروا التدرجات محدثة التخلق وربما تنظيم الخلية القطبية (14، 17، 22). بعد تسليخ مجهري مضان من Sox10: EGFP البلدان المساهمة الصافية، لاحظنا أهداب اضح القمي الأساسي (ملطخة تويولين الأسيتيل) بما يتفق مع متطلبات تعتمد على أهداب Shh على التنبيغ (الشكل S9 A، B، و B '.).
أكدنا أن Shh على لم يكن مهما للاوائل الهجرة NCC التي كتبها استعداء Shh على الإشارات باستخدام سايكلوبامين. CNCCs لا يزال هاجر عادة في 19 HPF على الرغم من الزخرفة تعطلت بنسبة 30 HPF (الشكل S10).

نقاش

في هذه الدراسة، لقد أظهرنا أن تحليل DSM يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد خلل البنية؛ شوهة الوجه خفية في كل من البشر والفأرة. DSM يمكن تسليط الضوء على الاختلافات الرئيسية في سحنة من الأمراض الوراثية مثل متلازمة سميث Magenis، متلازمة فيلو-القلب والوجه، والمتلازمات ويليامز، والآن BBS (2، 3).
مزايا استخدام تحليل DSM مورفولوجيا الوجه BBS الإفراط في الاعتماد على الملاحظة البشرية هي الموضوعية والقدرة على ضبط حجم بحيث لا يسيطر المرصودة الزخرفة منتصف الوجه من قبل أنسجة الوجه المفرطة. يمكننا الآن التأكد لفك تسطيح مع متوسط ​​على أنف أصغر وretrognathia معتدل توفير وسيلة موضوعية لم يسبق وصفه من التعرف على الوجه في BBS (فيلم S1). يحلل التمييز مؤخرا من وجوه الضوابط والأفراد المتطابقة مع الظروف الوراثية أدوا عند مستويات دقة ما بين 85٪ و 95٪ (2)، والآن منطقة الأنف وحدها في BBS تقدم دقة مماثلة. مددنا أيضا التحليل القائم DSM-على الفئران وأظهرت تشوهات مقارنة القحفي في الماوس، فضلا عن الأسماك، ونماذج من BBS. هذه النتائج تشير إلى أن الجينات BBS دورا حاسما في التنمية CF.
على الرغم من الاختلافات الشكلية بين الجماجم السمك الإنسان، والماوس، والعديد من نفس مسارات الإشارات وتسلسل الجنينى تنظيم تطوير CF بهم (12). أصبح الزرد نموذجا صالحا لدراسة تطوير CF (14).على غرار النماذج الزرد ذكرت سابقا من الأمراض الوراثية البشرية، الظواهر وحظ في كثير من الأحيان أكثر وضوحا على الأرجح بسبب التطور السريع والحساسية المرتبطة اضطراب وراثي (23، 24).
وقد لاحظنا التطور المعيبة في مناطق الهيكل العظمي مماثلة من منتصف الوجه في كل من الفأر وتحور الجينات البشر لBBS. في السمك، وحددنا شرط Bbs8 للهجرة CNCC في لقسم الأمامي من الرأس. العيوب القحفي مثل SHH في bbs8 أدت morphants لنا لإثبات أن هناك حاجة أيضا البروتينات BBS لكفاءة مما يشير SHH. في ضوء الدراسات الحديثة تشير إلى أهمية أهداب وIFT في نجاح Shh على التنبيغ (22، 25، 26)، ومعرفة أن البروتينات BBS تنظم عمليات التحويل غير الرسمية (5، 27)، ويمكن نقص BBS شرح dysmorphology القحفي.
لم تقتصر هذه العيوب المهاجرة إلى CNCCs: أظهرنا عدم وجود تنمية ENS وفقدان الأمعاء على الحركة في morphants BBS ربما يفسر ارتباط HD مع BBS (8، 28، 29). ينشأ HD نتيجة لعيوب الهجرة NCC وارتبط لسمو رفع القيود. SHH فئرانا معدلة وراثيا تطوير كولون بانعدام العقد والتشوهات الشرجية (30، 31)، وعلاوة على ذلك، ارتبط HD مع العيوب البعيدة أطرافهم، والتشوهات الشرجية، وHPE (11).
على الرغم من أوائل الهجرة NC هي Shh على المستقلة، وتبين لنا أنه قد تعتمد، على الأقل جزئيا، على noncanonical إشارات Wnt. ولذلك، فإننا نقترح فرضية لتطوير dysmorphology CF وHD حيث نقص البروتينات BBS يشوش noncanonical WNT يشير ضروري لأوائل الهجرة NCC. لأن Shh على إشارات في CNCCs أمر ضروري لتنميط العادية (12)، ونحن التكهن بأن البلدان المساهمة الصافية وصوله في الرأس لديهم رد فعل من الاكتئاب إلى SHH يفرز من الأديم الظاهر الوجه، وبلغت ذروتها في ضعف الفك وثمرة الجبهي الأنفي. مزيج من تثبيط للهجرة وShh على عدم الاكتراث في BBS-نقص البلدان المساهمة الصافية يوفر آلية لتطوير قطاعات اعقدي في HD BBS المصاحب.

طرق

ماوس الجمجمة دراسة الإنسان و.

تعرض المرضى BBS والضوابط تتأثر لمسح الوجه 3D، و"يعني" حسبت الوجه. Bbs4 - / - ورسمت الفراء WT الفأر مع نشا الذرة ومسحها ضوئيا لالتشكل الوجه الإجمالي. وباستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم إعداد جماجم ومسحها على الماسح الضوئي الفوق الليزر. وقد تم تجميع قياس الأشكال سطح كثيف باستخدام برامج مخصصة في المنزل.

الزرد.

Morpholinos ضد bbs4، bbs6، وbbs8 تم حقنها في أجنة الزرد. لwholemount في الموقع التهجين، واستخدمت البروتوكولات القياسية مع تحقيقات التالية: ptc1، pax6، phox2b، foxd3، sox10، وcrestin. تم تنفيذ المناعية باستخدام البروتوكولات القياسية. تم تصوير الأجنة على المجهر متحد البؤر ايكا SPUV. لتحليل FACS، تم فصل الأجنة مع التربسين وtriturated قبل الفرز مع آلة بيكتون ديكنسون FACS.

زراعة الخلايا.

خلايا NIH 3T3 التعبير عن ثابت وshRNA ضد bbs8 وقد حفزت أو السيطرة التسلسل مع purmorphamine (Calbiochem) أو المؤتلف Shh على (R & D الأنظمة)، وتعرض لفحص luciferase المراسل (PROMEGA). بدلا من ذلك، كانت هي lysed الخلايا، وكانت electrophoresed البروتينات ونشف مع الأجسام المضادة لمكافحة Gli3 (سانتا كروز). لفحوصات شفاء الجروح، وقدم الصفر على مثقف NIH 3T3 أو الخلايا الليفية الإنسان الأساسية. كانت ملطخة الهيكل الخلوي الأكتين مع Phalloidin-594 (إينفيتروجن) وتصويرها على زايس AxioImager. المواد كاملة وأساليب يمكن العثور عليها في مواد SI وطرق.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس