الأوعية الدموية عامل النفاذية / الأوعية الدموية (عامل نمو بطانة VPF / VEGF) هو خلوى متعدد الوظائف القوية التي permeabilizes بطانة الأوعية الدموية للبروتينات البلازما ويعيد البرمجة البطانية التعبير الجيني الخلية وذلك للحث على الأوعية الدموية
(كلارك وآخرون 1996.؛ براون وآخرون 1997.؛ فيرارا وديفيس-سميث 1997؛ دفوراك وآخرون 1999.؛ فنغ وآخرون 1999a.؛ فيرارا 1999). ويفرز VPF / VEGF من قبل العديد من الأورام وتفعيل الضامة، الخلايا الكيراتينية والخلايا المفاصل، والخلايا الجنينية المختلفة، والظهارية مثقف وخطوط الخلايا الوسيطة. VPF / VEGF يدفع تأثيرها البيولوجي عن طريق الربط بين اثنين من مستقبلات كيناز التيروزين، VEGFR-1 (FMS مثل التيروزين كيناز مستقبلات أو FLT) وVEGFR 2 (الجنين كيناز الكبد 1، أو FLK-1، في القوارض، مجال إدراج كيناز المحتوية على مستقبلات أو KDR، في البشر) التي يتم التعبير عنها بشكل انتقائي في بطانة الأوعية الدموية
(ماثيوز وآخرون 1991.؛ تيرمان وآخرون 1991.، 1992؛ دي فريس وآخرون 1992.؛ كوين وآخرون 1993.؛ موستونين وAlitalo 1995) . وupregulated كل من مستقبلات لافت للنظر في الأورام والجروح، وأنواع معينة من التهاب (مثل التهاب المفاصل الرثياني والصدفية) التي هى overexpressed VPF / VEGF
(براون وآخرون 1997). وقد اعترف المجمع الذي يشكل بين-يفرز الورم VPF / VEGF ومستقبلاته كهدف محتمل جذابة للعلاج antiangiogenesis
(دفوراك وآخرون 1991.؛ Brekken وآخرون 1998.). في الآونة الأخيرة، كما وصفت ثالث غير التيروزين كيناز مستقبلات للVPF / VEGF، neuropilin،
(Soker وآخرون 1998).
على الرغم من أن كلا VEGFR-1 وVEGFR-2 الخضوع الفسفرة بعد التفاعل مع VPF / VEGF، ويعتقد VEGFR-2 لتكون مستقبلات أكثر أهمية فيما يتعلق الحث على زيادة نفاذية الاوعية الدموية الدقيقة والأوعية الدموية
(Millauer وآخرون 1993.؛ Waltenberger وآخرون. 1994؛ كرول وWaltenberger 1997؛ جربر وآخرون 1998.؛ فنغ وآخرون 1999b.). VEGFR-2 هو أيضا مستقبلات لأعضاء آخرين في الأسرة VEGF، بما في ذلك VEGF-C، VEGF-D، وVEGF-E
(Jeltsch وآخرون 1997.؛ Achen مباشرة وآخرون 1998.؛ اوجاوا وآخرون 1998.).
وتم حصر التعبير على حد سواء VEGFR-1 وVEGFR-2 بواسطة التهجين في الموقع لالاوعية الدموية الدقيقة البطانة الكلى طبيعية، والأورام، والتئام الجروح، ومواقع التهابات
(براون وآخرون 1997). كما تم تحديدها VEGFR-2 في الأوعية الدموية للمشيمة الآدمي، سرطان الثدي، سرطان المعدة والتي المناعية المجهرية الخفيفة
(فوكوفيتش وآخرون 1996.؛ تانيجاوا وآخرون 1997... دي يونج وآخرون 1998a، ب). ومع ذلك، لم تكن هناك أي تقارير تصف توطين التركيبية إما مستقبلات في بطانة الأوعية الدموية.
نفيدكم هنا توطين التركيبية من VEGFR 2 (FLK-1 / KDR) في بطانة الأوعية الدموية في ثلاثة أنظمة النموذج الذي يعبر غاية VPF / VEGF: (أ) الشعيرات الدموية الكبيبي وperitubular الكلى الفأر العادي. (ب) microvessels تزويد جيدا اتسم سرطان الثدي الماوس. و (ج) السفن الجديدة الناجمة عن ناقلات الفيروسة الغدانية صممت لبإفراط VPF / VEGF (الغدة VPF / VEGF) (بيترسون وآخرون تحت الطبع). وتم الحصول على نتائج مماثلة باستخدام preembedding الأساليب التي تستخدم إما محسنة الفضة nanogold أو البيروكسيديز الفجل كصحفيين. وكانت الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة إيجابية لVEGFR-2 في جميع النماذج الثلاثة، وفي الأخيرين، يمكن أن تكون مترجمة إلى اللمعية ومجافي اللمعة الأسطح والأغشية العضيات السيتوبلازمية vesiculovacuolar (VVOs). هذه النتائج تتفق مع الأدلة الأخرى التي VVOs توفير ممر مهم للتسرب من البلازما والبلازما البروتينات ردا على VPF / VEGF
(فنغ وآخرون 1996، 1997، 1999a). تم المترجمة VEGFR-2 أيضا أن البطانة اللمفاوية في الغدة-VPF / مواقع حقن عامل نمو بطانة الاوعية ولكن لم يتم الكشف في الهيئات عديد الحويصلات والهيئات ويبل-بالادي، حفر المغلفة، حويصلات المغلفة، أو في الصفيحة القاعدية الكامنة البطانة VEGFR-2-إيجابية.
المواد والأساليب
الحيوانات، الأورام، والمتجهات
TA3 / سانت الأورام، والمستمدة أصلا من غدية الثديية التي وضعت بشكل عفوي في A / HeHa سلالة الماوس، تم passaged أسبوعيا في شكل استسقاء في تجاويف البريتوني من الإناث الفئران A / جاكس. للحث على الأورام الصلبة، تم حقن 1 × 10 6 الخلايا السرطانية في الفضاء تحت الجلد من ~20-ز أنثى A / جاكس الفئران. أعدت ناقلات الفيروسة الغدانية كما هو موضح سابقا
(أوري وآخرون 1996.؛ هاردي وآخرون 1997.). أنثى BALB / ج BYJ
Hfh11 الفئران عارية
نو العوز المناعي، 4-6 أسابيع من العمر، تم الحصول عليها من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). تم تصميم ناقلات الفيروسة الغدانية للتعبير عن الفئران VPF / VEGF 164
(جوزمان وآخرون 1993 تم حقن) و 2.5 × 10 8 PFU في الجلد الجناح أو الساق العضلات عارية (العوز المناعي) الفئران (بيترسون وآخرون تحت الطبع). وباختصار، / الحيوانات المحقونة VEGF-الغدة VPF تتطور استجابة عائية قوية مصحوبة فرط النفوذية الوعائية وذمة ولكن من دون الخلايا الالتهابية.
تم استخدام الماوس FLK-1 / SEAP أو المجال للذوبان خارج الخلية من FLK-1 (sFlk-1) كما مستمنع مع نتائج مماثلة. FLK-1 / SEAP تم عزل وتنقيته كما هو موضح سابقا
(تسلر وآخرون 1994.؛ Brekken وآخرون 1998.). بعد تنقيتها، ومستقبلات (في PBS) العقيمة التي تمت تصفيتها والمجمدة في قسامات حتى الاستخدام. وقد تم توليد الأجسام المضادة بتحصين ثلاث إناث الأرانب مع 60-70 ميكروغرام من أي FLK-1 / SEAP أو المجال خارج الخلية القابلة للذوبان من FLK-1 (sFlk-1). تم تقسيم الحقن (50 ميكرولتر لكل منهما) على مدى ثلاثة مواقع تحت الجلد على كل أرنب. وفي وقت لاحق، كانت تدار SC حقن منشطة من 25-40 ميكروغرام من sFlk-1 في TiterMax كل 5 أسابيع لمدة 6 أشهر إلى سنة 1. وقد نزف الحيوانات من الأذن والأمصال التي تم جمعها وتجميعها بعد 2-3 أسابيع كل حقنة منشطة. تم قياس التتر مع فحص ELISA غير المباشرة باستخدام sFlk-1 كما المستضد
(هوانغ وآخرون 1998) وأيضا من خلال تحليل FACS على الخلايا التي كانت إما VEGFR 2 (FLK-1) -positive أو -negative [يرجى المقدمة من الدكتور J. Waltenberger، أولم، ألمانيا
(Waltenberger وآخرون 1994)]. كانت الأجسام المضادة بعد ذلك من ارتفاع عيار-تنقية تقارب (≥ 1: 50،000) مصل. (؛ بيسكاتواي، NJ فارماسيا) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وعن طريق الربط بين 1-2 ملغ من تنقيته sFlk-1 إلى 1.0 مل HiTrap NHS تنشيط العمود سيفاروز إعداد عمود النسب. تم المخفف الأمصال 1: 2 في برنامج تلفزيوني مع نان 3 وتعميمها على عمود لمدة 24-48 ساعة في 4C. ثم غسلها العمود مع 50-100 كميات عمود من برنامج تلفزيوني ومزال في درجة الحموضة المنخفضة والعالية مع 0.1 M حمض الستريك، ودرجة الحموضة 2.8، و 0.1 M ثلاثي الإيثيلامين، ودرجة الحموضة 11.5 على التوالي. وكانت غلة النموذجية ~200 ميكروغرام من معين مفتش / مل مصل. وقد تبين الأجسام المضادة أن تكون محددة لVEGFR-2 بواسطة ELISA وتحليل لطخة غربية
(هوانغ وآخرون 1998). تسعة أيام بعد تلقي TA3 / سانت الورم، تم التضحية ستة الفئران A / جاكس تحمل الصلبة TA3 / سانت الأورام وستة السيطرة على الفئران من نفس السلالة التي كتبها CO 2 الخدر والأورام، جنبا إلى جنب مع عينات الجلد والكلى السيطرة A / الفئران جاكس، تم حصادها. تم حصاد أجزاء من الجلد الأذن وعضلات الساق بالمثل من الفئران عارية في 1، وبعد 3 أو 5 أو 8 أيام حقن-الغدة VPF / VEGF أو اتش تحمل إدراج التحكم (lacZ أو البروتين الفلوري الأخضر).
وكانت محاولات لإثبات VEGFR-2 على مستوى الإلكترون المجهري عن طريق إجراءات postembedding ناجحة. لذلك، اعتمدنا البروتوكول قبل التضمين باستخدام nanogold أو الغلوثانيون كمراسلة. كانت مغمورة الأنسجة فورا في طازجة 4٪ لامتصاص العرق في 0.02 M العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4. بعد 4 ساعات من التثبيت في درجة حرارة الغرفة (RT)، تم نقل الأنسجة إلى 30٪ سكروز في المخزن نفسه PBS بين عشية وضحاها في 4C. وأخيرا، كانت جزءا لا يتجزأ الأنسجة في أكتوبر مجمع (مايلز، الخرط، IN) وتخزينها في النيتروجين السائل في -176C لاستخدامها لاحقا. أقسام المجمدة أو 5 أو 10 ميكرون سميكة، وقطعت على ناظم البرد القياسي (الأنسجة تيك II) وجمعت على الشرائح المجهرية تنظيفها مسبقا (Fisherbrand، Colorfrost / زائد؛ فيشر العلمية، بيتسبرغ، PA). كانت الشرائح لمدة 20 دقيقة المجفف في الهواء قبل تلطيخ للضوء أو المجهر الإلكتروني.
بروتوكول المناعي
قطعت أقسام ناظم البرد خمسة ميكرون والتي شنت على الشرائح الزجاجية لالمناعية المجهرية الخفيفة. قطعت أقسام ناظم البرد عشرة ميكرومتر، التي شنت، ومعالجتها وفقا لنفس بروتوكول المناعية للالغرز لاحق في الإي بي لقطاعات مجهرية ضوء 1μm وأيضا للفحص المجهري إلكترون. تم تنفيذ كافة الخطوات التالية المناعية في RT مع أقسام ناظم البرد التي شنت على الشرائح الزجاجية: (أ) غسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.6، 5 دقائق. (ب) تزج في 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين (فيشر العلمي، معرض الحديقة، NJ) في الميثانول، 30 دقيقة، (ج) ويغسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق. (د) تزج في 5٪ الماعز العادي المصل (خ ع) (مختبرات النواقل؛ بورلنجام، CA)، و 20 دقيقة. (ه) الابتدائية بولكلونل الأجسام المضادة أرنب لVEGFR 2 (T014) من قبل اثنين من المؤلفين (RAB، PET) إعداد (تنقية تقارب
هوانغ وآخرون 1998) كانت تستخدم في التخفيف من البروتين 01:40 (= 1 ميكروغرام / ميكرولتر) في 0.02 M PBS، 60 دقيقة، (و) ثلاثة يغسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق لكل منهما؛ (ز) الضد الثانوية (تنقية تقارب والماعز البيروكسيديز المضادة للأرنب مفتش الأضداد؛ (ناقلات)، 1: 100 في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 60 دقيقة، (ح) ثلاثة يغسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقيقة لكل منهما؛ مجمع الغلوثانيون (ط) أفيدين-البيوتين الفجل (ABC) (ناقلات) في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 30 دقيقة، (ي) ثلاثة يغسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق لكل منهما؛ (ك) 0.05٪ 3،3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، التي تحتوي على 0.003٪ بيروكسيد الهيدروجين، 5 دقائق، (ل) ويغسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق، (م) بوستفيكس في 1 ٪ غلوتارالدهيد في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 5 دقائق؛ (ن) بعد الشطف بالماء، وcounterstained المقاطع مع تعديل الهيماتوكسيلين ماير (أمريكا الأنسجة الكواشف، ستوكتون، كاليفورنيا) لمدة 5 دقائق. (س) ويغسل في الماء لمدة 30 دقيقة تليها الجفاف من خلال سلسلة من ethanols وجبل الأقسام تحت coverslips.
تم تنفيذ خمسة ضوابط لضمان خصوصية الغلوثانيون المناعية: (أ) استبدال الأجسام المضادة الأولية من قبل مفتش أرنب غير ذي صلة؛ (ب) إغفال الأجسام المضادة الأولية محدد؛ (ج) إغفال من الأجسام المضادة الثانوية؛ (د) إغفال مجمع ABC؛ (ه) إغفال DAB.
أعدت أقسام بالنسبة للبروتوكول المناعي. تم إجراء الخطوات التالية في RT مع أقسام ناظم البرد التي شنت على الشرائح الزجاجية: (أ) غسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.6، 5 دقائق. (ب) تزج في 50 ملي الجلايسين في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 10 دقيقة، (ج) ويغسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق. (د) تزج في 5٪ NGS (ناقلات)، و 20 دقيقة. (ه) في احتضان الأجسام المضادة الأولية، T014، كما لتلطيخ المناعي. (و) ثلاثة يغسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق لكل منهما؛ (ز) في احتضان الأجسام المضادة الثانوية (تنقية تقارب nanogold، 1.4 نانومتر في القطر مترافق الماعز المضادة للأرنب مفتش الأضداد أو nanogold مع 1.4 نانومتر في القطر مترافق الماعز المضادة للأرنب تنقية تقارب فاب "(Nanoprobes؛ ستوني بروك، NY)، 1: 100 في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 60 دقيقة، (ح) ثلاثة يغسل في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق لكل منهما؛ (ط) بوستفيكس في 1٪ غلوتارالدهيد في 0.02 M PBS، ودرجة الحموضة 7.4، 5 دقائق؛ (ي) ثلاثة يغسل في الماء المقطر، 5 دقائق لكل منهما؛ (ك) وضع مع HQ حل تعزيز الفضة (Nanoprobes) ل11/06 دقيقة في غرفة مظلمة؛ (ل) اثنين يغسل في الماء المقطر، 2 دقيقة لكل منهما؛ (م) إصلاح في 5٪ وحمض الصوديوم، 1 دقيقة، (ن) يشطف بالماء ومباين مع تعديل الهيماتوكسيلين ماير لمدة 5 دقائق. (س) ويغسل في الماء لمدة 30 دقيقة، تليها الجفاف من خلال سلسلة من ethanols، وجبل الأقسام تحت ساترة.
تم تنفيذ أربعة ضوابط لضمان خصوصية nanogold المناعية: (أ) استبدال الأجسام المضادة الأولية من قبل مفتش أرنب غير ذي صلة؛ (ب) إغفال الأجسام المضادة الأولية محدد؛ (ج) إغفال من الأجسام المضادة الثانوية؛ (د) إغفال الحل HQ تعزيز الفضة.
معالجة الأنسجة ل1 ميكرون أقسام الإي بي والمجهر الإلكتروني
بعد المناعية مع أي من البروتوكولين، وpostfixed أقسام 10 ميكرومتر تعلق على الشرائح الزجاجية في 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في المخزن SYM-Collidine، ودرجة الحموضة 7.4، لمدة 10 دقيقة في RT، وغسلها مع 0.05 M الصوديوم العازلة ماليات، ودرجة الحموضة 5.2، وملطخة 2٪ خلات اليورانيل في 0.05 M الصوديوم العازلة ماليات، ودرجة الحموضة 6.0، لمدة 5 دقائق على RT. تم غسلها أقسام بالماء المقطر ثم المجففة في ethanols متدرج وتسلل مع تسلسل أكسيد البروبيلين-الإي بي 812. تم إجراء الغرز التي كتبها قلب كبسولات بلاستيكية Eponfilled على أقسام الأنسجة المرفقة الشريحة. بعد البلمرة لمدة 16 ساعة في 60C، تم فصل كتل الإي بي من الشرائح الزجاجية عن طريق الغمر وجيزة في النيتروجين السائل.
قطعت أقسام البلاستيك ميكرون واحد للفحص المجهري الخفيفة مع ultratome (رايشرت، فيينا، النمسا) وملطخة بالغيمزا القلوية في فرن 60C لمدة 60 دقيقة. لالمجهر الإلكتروني، وقطعت أقسام رقيقة بسكين الماس على ultratome (رايشرت) والتي تم جمعها على غير المصقول شبكات-200 شبكة النحاس (تيد بيلا، أوستن، تكساس). كان ينظر شبكات غير ملوثين مع المجهر الإلكتروني النافذ (CM 10؛ فيليبس، ايندهوفن، هولندا).
الإلكترون المجهري والتحليل الإحصائي
درست الكلى، الأورام، والجلد حقن اتش والعضلات والهيكل العظمي في ثلاثة حيوانات في الأوقات المحددة في النص. درسنا ست عينات منفصلة لكل الأنسجة وما مجموعه 30 EM أقسام الكلى، 24 من الورم، و 36 من أنسجة حقن اتش. تم إجراء التحليل الإحصائي مع -test مان ويتني U.
النتائج
توطين VEGFR-2 في الكلى Microvessels من الفئران العادية
وأعرب عن VPF / VEGF بقوة podocytes الكبيبي وظهارة أنبوبي الكلى طبيعية، والكلى هي واحدة من عدد قليل من أنسجة البالغين الطبيعي التي يتم فيها الكشف عن VPF / VEGF مستقبلات التعبير بسهولة عن طريق التهجين في الموقع
(Berse وآخرون 1992.؛ براون وآخرون . 1992a، 1997؛ دفوراك وآخرون 1999.). بواسطة المناعية المجهرية الخفيفة، الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الكبيبي وperitubular الملون بشكل مكثف مع الأجسام المضادة لVEGFR-2 مع أي مراسل
(الشكل 1A يوضح المناعية nanogold فقط). ومع ذلك، فإن الشرايين البطانة بطانة والشرايين الصغيرة ملطخة طفيفة أو لا على الاطلاق. كما لم ملطخة Podocytes وأنبوبي الظهارة.
بواسطة المجهر الإلكتروني، والجسيمات nanogold
(الشكل 2A) والإنزيم
(الشكل 2B) للصحفيين وصفت بدقة البطانة الكبيبي، تشفق على صفيحة القاعدية تحتاني وكذلك podocytes الظهارية والعمليات أقدامهم. لأن البطانة الكبيبي رقيقة للغاية، لم نكن قادرين على توطين تلطيخ على نحو أدق، أي إلى اللمعية أو سطح مجافي اللمعة. وكانت الضوابط لكل تقنية سلبي
(الشكل 2C). بواسطة المجهر الضوئي، سواء microvessels المرتبطة الورم
(الشكل 1B) والأوعية اللمفاوية (لا يظهر) أظهرت مكثفة ومحددة تلطيخ الخطية لVEGFR-2، في حين نوى الخلايا البطانية والخلايا السرطانية لا وصمة عار. يتم تكبير أول الأوعية الدموية الجديدة الناجمة عن TA3 / سانت الأورام، الجيوب-خلية حوطية الفقيرة وصفته السفن "الأم"
(ناجي وآخرون 1995.؛ بيترسون آخرون في الصحافة). تقسيم السفن الأم لاحقا في سفن ابنة أصغر من خلال عملية سد اللمعة من الخلايا البطانية
(ناجي وآخرون 1995.؛ فنغ آخرون في الصحافة؛. بيترسون آخرون تحت الطبع). وكان سد البطانة أيضا بقوة VEGFR-2-الإيجابي
(أرقام 1B و1D، السهام). الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية في الجلد الطبيعي المجاور للأورام ملطخة ضعيفة أو لا على الاطلاق لVEGFR 2
(الشكل 1C، السهام). وقدم كل من نانو الذهب والغلوثانيون للصحفيين نتائج مماثلة بواسطة المجهر الضوئي.
بواسطة المجهر الإلكتروني، وصفت مجافي اللمعة واللمعية بطانة الأوعية الدموية غير مستقر، وليس بشكل مستمر، مع الأجسام المضادة لVEGFR-2 مع كل أساليب immunocytochemical
(الشكل 3؛ فقط بيانات البيروكسيديز معروضة). لم يكن هناك اختلاف في كثافة العلامات nanogold بين التجويف البطانية وablumen
(الجدول 1). الخلايا البطانية المبطنة السفن المرتبطة الورم، مثل البطانة venular العادية، تحتوي على العديد من VVOs، مجموعات بارزة من الحويصلات مثل caveolae غير المصقول، والفجوات التي تمتد السيتوبلازم البطانية من التجويف لablumen
(كوهن وآخرون 1992.؛. دفوراك وآخرون 1996 ؛
فنغ وآخرون 1996.، 1999a). في الأوعية الورم وفي الأوردة العادية حفز مع VPF / VEGF، وتوفير VVOs مسارا لتسرب transendothelial بروتينات البلازما والجزيئات المنتشرة الأخرى. أيضا ملطخة VVOs تحديدا مع الأجسام المضادة لVEGFR-2؛ 52٪ من 102 VVOs عدها وصفت (يعني 1.5 جزيئات الذهب / VVO). وكانت أغشية البلازما الجانبية للاتصالات الخلوية interendothelial أحيانا إيجابية الوزراء البريطانى، ولكن فقط في الحالات شائعة فيه VEGFR-2-إيجابية حدث الحويصلة VVO لضمها
(الشكل 3A). كانت أغشية الثغور بعض VVOs وcaveolae VEGFR-2-إيجابية، وأفضل ينظر مع مراسل الغلوثانيون عندما لم يكن الملون الحويصلة برمتها (انظر السهام في
أرقام 3B و 3D). كانت أقل كثيرا المسمى الحويصلات VVO وفجوات أعمق داخل السيتوبلازم البطانية من تلك أقرب إلى اللمعية أو الأسطح مجافي اللمعة
(الشكل 3C).
وصفت أغشية البلازما ومكونات VVOs السفن الجلد الطبيعية البعيدة عن الأورام الشوري أيضا لVEGFR-2، ولكن بوتيرة أقل ومع انخفاض كثافة مقارنة مع السفن المرتبطة بشكل وثيق مع SC العقيدات الورم.
الشكل 1
المناعية من microvessels مع الأجسام المضادة لVEGFR-2.
(A) الكلى الماوس العادي، مما يدل تلطيخ قوية من البطانة الوعائية الكبيبي وperitubular (السهم) الشعيرات الدموية. المناعية Nanogold والفضة ما قبل التضمين منهجية، 1 ميكرون سميكة قسم الإي بي counterstained مع بالغيمزا.
(BF) الأجزاء الطرفية الصلبة TA3 / سانت الأورام تنمو في موقع SC الجلد بعد 9 أيام زرع
(B) والمواقع الجلد الماوس ضخت في وقت سابق من 4 أيام مع الغدة-VPF / VEGF
(CF). السفن الأم الموسعة (V) وصمة عار بقوة مع الأجسام المضادة لVEGFR-2 في جميع الأرقام. في
C، وتقع محيطيا السفن (أعلى اليمين، والسهام) وصمة عار أقل كثافة من السفن الأم والمحيطة بها على الفور microvessels التي استجابت ل-الغدة VPF / VEGF. البطانة اللمفاوية (رابطة شباب الصفوة) ملطخة أيضا بقوة
(E) ولكن البطانة تصلب (أ،
F)، لا. السهام في
B و
D تشير سد الخلايا البطانية
(ناجي وآخرون، 1995). تقسيم السفن الأم عادة لتشكيل التشابك سفينة glomeruloid
(F، السهم) التي ظلت بقوة VEGFR-2 إيجابية.
(BF) 5 ميكرون أقسام المناعي الثابتة المجمدة مع الهيماتوكسيلين مباين. القضبان:
A، BF = 20 ميكرون،
C = 50 ميكرون.
الرقم 2
أقسام الكلى الماوس أعدت مع المناعية Nanogold الفضي (A) أو بروتوكول المناعي (B) في توطين VEGFR-2 تظهر العلامات معين من الخلايا البطانية الكبيبي (السهام). لا الذهب محسنة الفضة (A) ولا الغلوثانيون (B) مراسل بربط العمليات القدم الخلايا الظهارية الكبيبي أو الصفيحة القاعدية بين الظهارية والخلايا البطانية. (C) لمراقبة (إغفال الأجسام المضادة المحددة، بروتوكول المناعي) لا يظهر أي وسم عمليات الظهارية القدم (EP)، الخلايا البطانية (E) أو الصفائح كل منهما القاعدية (BL) في هذا الكبيبة. نلاحظ أيضا أغشية شق الحفاظ عليها بين العمليات القدم الظهارية (السهم). القضبان: A = 260 نانومتر، B = 210 نانومتر، C = 196 نانومتر.
تم حقن الغدة VPF / VEGF في الجلد أو الساق عضلات الفئران عارية العوز المناعي العادية. أعربت خلايا انسجة Transduced VPF / VEGF، على النحو الذي يحدده في الموقع التهجين (بيترسون وآخرون في الصحافة)، مما أدى إلى استجابة عائية المحلية. كما هو الحال في TA3 / سانت الأورام، وقد تميزت الأوعية الدموية في البداية عن طريق تشكيل لسفن أم كبيرة، يليها تقسيم في وقت لاحق إلى سفن ابنة أصغر من خلال عملية سد الخلايا البطانية
(ناجي وآخرون 1995.؛ فنغ آخرون في الصحافة). كما هو مبين في
الأرقام 1C-1F، وupregulated VEGFR-2 التعبير لافت للنظر في كل من السفن الأم وابنتها مقارنة مع microvessels الطبيعية المجاورة. ملطخة اللمفاوية البطانة أيضا بقوة لVEGFR 2
(الشكل 1E)، ولكن البطانة بطانة الشرايين لم يكن وصمة عار
(الشكل 1F).
بواسطة المجهر الإلكتروني، وأيضا زيادة محددة VEGFR-2 وضع العلامات لافت للنظر في microvessels الغدة-VPF / التي يسببها VEGF مقارنة مع بطانة الاوعية الدموية الدقيقة العادية
(الجدول 1). الأغشية اللمعية ومجافي اللمعة البلازما أظهرت العلامات تعادل مع كل من الغلوثانيون وطريقة nanogold
(الجدول 1، أرقام 4A و 4B). ومع ذلك، كانت الجانبية البطانية أغشية البلازما خلية في تقاطعات خلية لا المسمى
(الشكل 4A). الحويصلات VVO، فجوات، والثغور ربط الحويصلات المجاورة والفجوات وكثيرا ما وصفت. وهكذا، 54٪ من 111 VVOs عدها وصفت (يعني 1.8 جزيئات الذهب / VVO)
(أرقام 4E-4G). بالإضافة إلى ذلك، بعض الخلايا البطانية أظهرت توسيع صهاريج من الشبكة الإندوبلازمية الخشنة وهذه، فضلا عن صهاريج حول النواة، وصفت أيضا مع الأجسام المضادة لVEGFR 2
(الشكل 4C). وصفت Caveolae أيضا نادرا، ولكن كانت الحويصلات المغلفة لا
(الشكل 4D).
نقاش
من خلال الاستفادة من بروتوكولين تضمين قبل مختلف عن مناعية قمنا المترجمة VEGFR 2 (FLK-1 / KDR)، واحد من اثنين عالية تقارب مستقبلات التيروزين كيناز VPF / VEGF، لبطانة الأوعية الدموية في ثلاثة مواقع من VPF قوي / التعبير VEGF في الماوس: الكلى العادي، وTA3 / سانت سرطان الثدي، والجلد حقن مع ناقلات الفيروسة الغدانية هندستها لبإفراط الفئران VPF / VEGF 164. ففي هاتين الحالتين، كل من اللمعية ومجافي اللمعة أغشية بطانة الأوعية الدموية الملون بقوة وعلى وجه التحديد، جنبا إلى جنب مع الأغشية وأغشية بعض caveolae وVVOs. لأن تصطف الشعيرات الدموية الكبيبي وperitubular من قبل البطانة رقيقة على غير العادة، لم نتمكن من التمييز اللمعية من تلطيخ مجافي اللمعة في هذه السفن. تم المترجمة VEGFR-2 أيضا على RER موسعة من الخلايا البطانية ومتصلا صهاريج محيط بالنواة من تزايد الخلايا البطانية في مواقع الجلد حقن الغدة-VPF / VEGF. لم يكن لوحظ VEGFR-2 تلطيخ في عدة مواقع أخرى في بطانة الأوعية الدموية، بما في ذلك أغشية البلازما الأفقي في تقاطعات خلية interendothelial، الميتوكوندريا، نوى، والهيئات عديد الحويصلات والهيئات ويبل-بالادي، حفر المغلفة، حويصلات المغلفة، والجسيمات الحالة، والصفائح القاعدية. كما لم ملطخة أغشية Fenestral أجزاء منوفذة من البطانة، الخلايا الظهارية الكبيبي، عمليات أقدامهم، وأغشية شق من أجل VEGFR-2 في الكلى. VEGFR-2-إيجابية كانت الخلايا الظهارية أنبوبي المتاخمة للالشعيرات الدموية peritubular سلبية أيضا. لم تكن ملطخة الخلايا TA3 / سانت الورم لVEGFR-2، ولا كانت الأعصاب أو الكولاجين خلالي في أي من الأنسجة التي تمت دراستها. وكانت الضوابط لكل إجراء immunocytochemical السلبية.
كل من عالية تقارب VPF / VEGF التيروزين كيناز مستقبلات، VEGFR-1 وVEGFR-2، وأعرب في أعداد نسخة منخفضة نسبيا في عدة أنواع من الخلايا البطانية مثقف. التقديرات المنشورة تختلف من 27،000 إلى 150،000 نسخة من VEGFR-2 في الخلية وتيرة VEGFR-1 هو ~10 أضعاف أقل
(فايسمان وآخرون 1990.؛ Detmar وآخرون 1995.؛ THIEME وآخرون 1995.). ومع ذلك، لا يعرف الكثير عن وتيرة إما مستقبلات على بطانة الأوعية الدموية في الجسم الحي. على النحو الذي يحدده في الموقع التهجين، يتم التعبير عن كل من مستقبلات بتكلفة منخفضة جدا إلى مستويات غير قابلة للكشف في معظم الأنسجة الطبيعية، باستثناء الكلى
(براون وآخرون 1997.؛ دفوراك وآخرون 1999.). ومع ذلك، يتم upregulated التعبير عن كل من مستقبلات لافت للنظر في الاوعية الدموية الدقيقة البطانة المتاخمة لمواقع VPF / VEGF overexpression، أي في الأوعية الدموية المصاحبة للورم
(براون وآخرون 1997)، وفي السفن الجديدة التي تشكل استجابة لحقن المحلي من الغدة -vpf / VEGF (بيترسون وآخرون تحت الطبع). البيانات المقدمة هنا هي متسقة مع الملاحظات السابقة في أنه VEGFR-2 غير قابل للكشف من قبل المناعية في الأوعية الدموية الدقيقة في معظم الأنسجة الطبيعية، باستثناء الكلى، ولكن وأعرب بقوة في موقعين VPF / VEGF overexpression (TA3 / سانت سرطان الثدي والجلد مواقع حقن الغدة-VPF / VEGF).
الشكل (3)
الاستعدادات المناعي غير ملوثين توطين VEGFR-2 إلى هياكل البطانية في TA3 / سانت الماوس الثدي غدية بعد 9 أيام من الحقن 1 × 10 6 الخلايا السرطانية في الفضاء SC من الفئران. VEGFR-2 موجود الوزراء البريطانى (على النحو الذي يحدده الإلكترون الكثيفة الغلوثانيون ناتج التفاعل) على اللمعية والأغشية البلازما مجافي اللمعة (AD) وعلى أغشية VVOs (A، C). بعض مكونات حويصلي من VVOs والفردية وصمة عار تماما عن VEGFR caveolae-2 (الأسهم في A، C). ترتبط الحويصلات الأخرى التي تفتح إلى الوحشي (A) أو مجافي اللمعة (C) السطوح مع ودائع واسعة من VEGFR-2 على المتاخمة غشاء البلازما (النصال مفتوحة). بعض caveolae تعلق على أغشية البلازما اللمعية تظهر VEGFR-2 المرتبطة أغشية أن إغلاق هذه الهياكل (الأسهم في B، D). العديد من الهياكل البطانية لا وصمة عار لVEGFR-2. وتشمل هذه الميتوكوندريا (M)، والهيئات ويبل-بالادي (W)، والهيئات عديد الحويصلات (MV)، وأغشية البلازما الجانبية التي تضم تقاطعات بين الخلايا (رأس السهم مغلقة، A). L، التجويف. القضبان: A = 480 نانومتر، B، C = 160 نانومتر؛ D = 80 نانومتر.
الجدول 1
سطح كثافة العلامات على الاوعية الدموية الدقيقة البطانة من TA3 / سانت الأورام 9 يوم، 4 أيام الغدة-VPF / السفن الأم الجلد الناجم عن VEGF، والجلد التحكم العادي مع الأجسام المضادة لVEGFR-2؛ خدم محسنة الفضة nanogold كما المراسل. تم قياس اللمعية ومحيطها مجافي اللمعة على حدة ومقارنتها إحصائيا مع -test مان ويتني U
في دراسات سابقة أننا المترجمة VPF / VEGF إلى بطانة الأوعية الدموية الأوعية المرتبطة الورم عن طريق المناعية
(دفوراك وآخرون 1991.؛ براون وآخرون 1997.). لأن هذه الخلايا البطانية لم تكن أنفسهم التعبير عن VPF / VEGF، استنتجنا أن تلطيخ لوحظ يمثل ورم يفرز خلايا VPF / VEGF التي كانت متجهة إلى مستقبلاته على بطانة الأوعية الدموية. تمديد هذا النهج إلى مستوى الإلكترون المجهري، وجدنا أن الأجسام المضادة لVPF / VEGF ملطخة بشدة السطوح مجافي اللمعة من ورم بطانة الأوعية الدموية، جنبا إلى جنب مع حويصلات VVO والفجوات. كانت ملطخة أيضا السطوح اللمعية من نفس الخلايا البطانية، ولكن إلى حد أقل بكثير
(تشو كونغ وآخرون 1995). عرضنا تفسيران لهذه النتائج. وكان أحد الاحتمالات أن مستقبلات VPF / VEGF وزعت غير متماثلة، مع أكثر كونها موجودة على مجافي اللمعة من على سطح الخلايا البطانية اللمعية. هذا قد يكون له معنى في أنه في معظم الحالات، على سبيل المثال، والأورام، التئام الجروح، والالتهابات، ويفرز VPF / VEGF من خلايا الأنسجة وبالتالي واجه سطح مجافي اللمعة من الاوعية الدموية الدقيقة البطانة قبل سطح اللمعية
(براون وآخرون 1992b.، 1997؛ Detmar وآخرون 1994.؛ فافا وآخرون 1994.؛. كوتش وآخرون 1994). من ناحية أخرى، والتعرض للأسطح مجافي اللمعة من بطانة الأوعية الدموية لتركيزات أعلى من VPF / VEGF الذي يفرز محليا من قبل ورم أو خلايا الأنسجة الأخرى يمكن أن تمثل بشكل جيد على قدم المساواة لملاحظاتنا من غير المتماثلة توزيع VPF / VEGF، حتى لو كان عدد متساو من VEGF كانت مستقبلات التي يمكن العثور عليها على اللمعية والسطوح مجافي اللمعة. البيانات المقدمة هنا تشير إلى أنه عندما كان overexpressed VPF / VEGF محليا في الجلد عن طريق الإدارة المحلية من VPF / الهندسة VEGF ناقلات الفيروسة الغدانية، تم العثور على أرقام يعادل VEGFR-2 على اللمعية ومجافي اللمعة أسطح بطانة الأوعية الدموية. وبطبيعة الحال، تقول هذه البيانات شيئا عن كفاءة الإشارات من VPF / VEGF عندما يتفاعل مع المستقبلات التي يتم التخلص منها على اللمعية مقارنة مع سطح البطانية مجافي اللمعة.
توطين VEGFR-2 إلى الأغشية VVO وإلى اللمعية والبلازما مجافي اللمعة أغشية بطانة الأوعية الدموية، ولكن ليس لأغشية البلازما الأفقي في تقاطعات خلية interendothelial، ويتسق مع آليات اقترحنا لزيادة نفاذية الاوعية الدموية الدقيقة التي يسببها VPF / VEGF وسطاء فعال في الأوعية الأخرى
(فنغ وآخرون 1996، 1997).باختصار، لقد قدمت دليلا على أن VVOs والهياكل التي غالبا ما تتركز بشكل استراتيجي في مناطق parajunctional من الوريد العادي وورم البطانة، وتوفير الأساسي
عبر الممر الخلوي للتسرب من الجزيئات عبر مستمرة بطانة الأوعية الدموية. ردا على وسطاء فعال في الأوعية، وأغشية تفصل الفردية الحويصلات VVO من بعضها البعض ومن معة الأوعية الدموية وablumen مفتوحة، مما يتيح
للالمتحولة مرور البطانية من استشفاف من حويصلة واحدة أو فجوة إلى أخرى حتى النهاية عبور حاجز غشائي. يقف هذا الرأي على النقيض من وجهة النظر التقليدية، التي اقترحتها أصلا
Majno والزميلة (1969)، ومؤخرا دعا من قبل المختبر ماكدونالد
(بالوك وآخرون 1997)، أن وسطاء فعال في الأوعية تعزيز تقلصات الخلايا البطانية التي تسحب الخلايا البطانية المجاورة بعيدا عن بعضها البعض لتوليد الثغرات خلية interendothelial من خلالها البلازما يمكن أن تسرب. لمناقشة مفصلة من الجدل الدائر حول مسارات التي اتخذتها تعميم الجزيئات الكلية في عبور بطانة الأوعية الدموية في استجابة لوساطة فعال في الأوعية، ويشار إلى القراء على عدة مقالات المراجعة الأخيرة
(دفوراك وآخرون 1999.؛
فنغ وآخرون 1999a.؛
ماكدونالد وآخرون 1999؛
ميشيل ونيل 1999).
الرقم 4
الاستعدادات المناعية Nanogold الفضة توطين VEGFR-2 إلى هياكل البطانية في مواقع عائية التي يسببها في وقت سابق من 4 أيام في جلد الفئران عارية كل الغدة VPF / VEGF (AE، G) أو في 5 أيام في العضلات (F). التسمية-الموسع الذهب والفضة تشير يرتبط VEGFR-2 مع أغشية البلازما (A، B)، ولكن ليس مع التقاطعات (الأسهم، A)، داخل صهاريج من RER (رأس السهم، C) وصهريج حول النواة، ولكن ليس مع الميتوكوندريا (السهم ، C)، مع caveolae (D) ولكن ليس مع حفر المغلفة أو حويصلات (السهم، D)، ومع VVOs (EG). L، التجويف. القضبان: A = 1.5 ميكرون، B = 140 نانومتر، C = 0.8 ميكرون، D = 140 نانومتر، E = 130 نانومتر، F = 70 نانومتر، G = 80 نانومتر.
وأخيرا، فإنه من الفائدة التي الأوعية اللمفاوية في مواقع حقن الغدة-VPF / VEGF الملون أيضا بقوة مع الأجسام المضادة لVEGFR-2. لم يتم الإبلاغ الأوعية اللمفاوية إلى بإفراط VEGFR-2 في مواقع الورم، ولكن هذا ليس مستغربا لأن عموما لم يعتقد أورام للحث على تشكيل الأوعية اللمفاوية جديدة. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون القنوات اللمفاوية الصعب التمييز من الأوعية الدموية الجديدة عن طريق التهجين في الموقع. من ناحية أخرى، ذكرت مفاوية للغشاء مشيمائي الفرخ للتعبير عن VEGFR-2 وVEGFR-3
(يا وآخرون 1997)، ويقال VEGF-C، الذي يتفاعل مع كل من هذه المستقبلات، للحث على تشكيل مفاوية على حد سواء والأوعية الدموية
(تساو وآخرون 1998).
بدعم من الولايات المتحدة الصحة العامة خدمة المعاهد الوطنية للصحة منح AI-33372 (AMD)، CA-50453 (HFD)، CA74951 وCA54168 (PET)، T32 GM07062 (RAB)، وHL-59316، وذلك بتمويل من هوارد هيوز المعهد الطبي (RCM). تلقى AP دعم الزمالة من مؤسسة ينر-جرين، ستوكهولم، السويد.
المادة ملاحظات