عرض مشاركة واحدة
  #36  
قديم 12-02-2015, 11:21 PM
رافت ابراهيم رافت ابراهيم غير متواجد حالياً
عضو ذهبي
 
تاريخ التسجيل: Dec 2011
المشاركات: 520
افتراضي التفاعل الجيني بين بارديه-بيدل الجينات متلازمة والآثار المترتبة على أطرافهم الزخرفة

 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/17/13/1956.full

قبلت 18 مارس 2008.

ملخص

متلازمة بارديه-بيدل (BBS) هو عديد المظاهر، واضطراب غير المتجانسة وراثيا تتميز البدانة، اعتلال الشبكية، polydactyly وضعف الإدراك، الكلى والتشوهات القلبية، فضلا عن ارتفاع ضغط الدم ومرض السكري. ومن المعروف أن الجينات متعددة لتسبب بشكل مستقل BBS. لا تظهر هذه الجينات إلى رمز لنفس الفئة الوظيفية للبروتينات. بعد، تحور كل النتائج في النمط الظاهري مماثلة. الجينات ضربة قاضية للجينات BBS المختلفة في الزرد تبين الظواهر المتداخلة لافت للنظر بما في ذلك النقل جسيم ميلانيني خلل واضطراب في الحويصلة المهدبة كوبفر. هنا، علينا أن نبرهن على ضربة قاضية الفردية bbs1 وbbs3 النتائج في نفس الظواهر نموذجية كما ذكرت سابقا للجينات BBS أخرى. نحن الاستفادة من نظام الزرد لتحديد ما إذا كانت شاملة في وقت واحد الزوج الحكيم ضربة قاضية للجينات BBS تكشف التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS. باستخدام هذا النهج، علينا أن نظهر ثمانية التفاعلات الوراثية بين مجموعة فرعية من الجينات BBS. العلاقات التآزر بين مزيج متميز ليست بسبب التكرار وظيفية ولكن تشير تفاعلات معينة داخل مجمع BBS متعددة الوحيدات. بالإضافة إلى ذلك، نحن الاستفادة من النظام النموذجي الزرد للتحقيق في تنامي الأطراف. polydactyly البشري هو سمة أساسية من BBS لا يرد في نماذج BBS-الماوس. قمنا بتقييم الزرد زعنفة برعم الزخرفة و نظرن تغيير القنفذ الصوتي (SHH) التعبير وتغييرات لاحقة إلى fin عناصر الهيكل العظمي. تم استخدام برعم النمط الظاهري SHH زعنفة أيضا لتأكيد التفاعلات الجينية المحددة بين الجينات BBS. وتكشف هذه الدراسة شرط في الجسم الحي من أجل وظيفة BBS في برعم الطرف الزخرفة. نتائجنا توفر رؤى جديدة هامة في آلية والأهمية البيولوجية للBBS.

مقدمة

متلازمة بارديه-بيدل (BBS، OMIM 209900) هي جسمية اضطراب المتنحية غير المتجانسة وراثيا تتميز السمنة، وتنكس الشبكية، polydactyly بعد المحوري، الادراكي، نقص الأعضاء التناسلية، وتشوهات الكلى والقلب والأوعية الدموية وارتفاع نسبة مرض السكري وارتفاع ضغط الدم (1 - 3). حتى الآن، تم تحديد 12 جينات BBS (4 - +15). وعلى الرغم من بعد إلى توضيح وظيفة محددة من البروتينات الفردية BBS، والأدوار دعم البيانات في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا.
من اجل الحصول على نظرة ثاقبة الفيزيولوجيا المرضية لBBS، وضعنا BBS نماذج الزرد وأثبتت أن ضربة قاضية لأي من سبعة orthologs الزرد BBS (bbs2، 4، 5، 6، 7، 8 و 11) النتائج في الظواهر المماثلة. وتشمل هذه الظواهر تعطل حويصلة المهدبة يسمى الحويصلة كوبفر (KV)، الاستعداد لعيوب تجانب الجهاز وتأخر نقل إلى الوراء بين الخلايا (16). تحور BBS1 في البشر يؤدي إلى الشكل الأكثر شيوعا من BBS. وظيفة BBS1 غير معروف. يحتوي هذا البروتين مجال بيتا المروحة، مشيرا إلى أنه يتفاعل مع البروتينات الأخرى. نحن في الآونة الأخيرة أنه BBS1، بالتزامن مع BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9، هو جزء من مجمع مستقرة متعددة البروتين المعروف باسم BBSome (17). BBS3، عاملا ADP-ribosylation (ARF) تشبه بروتين يعرف باسم ARL6 (18 تم التعرف)، عن طريق الاستنساخ الموضعية واستخدام علم الجينوم الحسابية (10). ويقترح البروتينات ARL أن يكون لها دور في حويصلة داخل الخلايا والاتجار الغشاء والتجمع أنيبيب (18، 19). باستخدام الزرد، ونحن اختبار ما إذا كان bbs1 وbbs3 الخسارة من وظيفة يلخص نموذجية BBS الظواهر ضربة قاضية بما في ذلك عيب KV وتأخير النقل داخل الخلايا. نحن أيضا تقييم التفاعل الوراثي الزوج الحكيم بين ثمانية جينات BBS الزرد (bbs1-bbs8). يسمح النظام النموذجي الزرد لفي وقت واحد الزوج الحكيم ضربة قاضية من مجموعات متعددة من الجينات BBS، بما في ذلك الجينات BBS هذا الرمز للبروتينات التي هي جزء من مجمع BBSome، وكذلك البروتينات التي ليست جزءا من المجمع. تركيبات الزوج الحكيم من أليغنوكليوتيد مكافحة الشعور تثبت ثمانية تفاعلات تعاونية هامة بين جينات معينة BBS. من المذكرة هو دور مركزي للbbs1 في خمس من هذه التفاعلات الوراثية. التفاعلات الوراثية في الجسم الحي المحددة في هذه الدراسة تكشف أن البروتينات BBS التي هي جزء من المجمع يمكن أن يؤدي إلى التفاعل الوراثي التآزر، والبروتينات يمكن أن ليست جزءا من مجمع BBSome.
polydactyly البشري هي واحدة من السمات الأساسية للBBS لا يرد في BBS نماذج الماوس خروج المغلوب (+20 - 23). وبالنظر إلى أن يتم التعبير عن العديد من الجينات BBS الزرد في مهدها زعنفة تطوير (16)، قمنا بتقييم زعنفة الزخرفة برعم في morphants BBS. ركزنا على منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) بسبب الدور الحاسم والحفظ تطويريا في الزخرفة في الطرف رباعي الأرجل / برعم الزعنفة. علينا أن نبرهن على ضربة قاضية الفردية الجينات BBS في الزرد، وكذلك الزوج الحكيم ضربة قاضية للجينات BBS، والنتائج في توسيع القنفذ الصوتي (SHH) التعبير، وهو مكون الجزيئي للZPA، وكذلك تغييرات على عناصر الهيكل العظمي لاحقة.

النتائج

عرض الزرد bbs1 وbbs3 knockdowns BBS الظواهر نموذجية

في السابق، أثبتنا أن ضربة قاضية الفردية bbs2، bbs4 - bbs8 وbbs11 (9، 16) يولد الظواهر نموذجية في الزرد. من أجل تحديد ما إذا كان knockdowns من bbs1 وbbs3 تؤدي إلى الظواهر المماثلة، كنا morpholinos العقاقير لاسقاط هذه الجينات. وقد صممت oligonucleitides العقاقير morpholino (موس) لاستهداف bbs1 تقع على الصبغي 21 وbbs3 تقع على الصبغي 1 في الجينوم الزرد (معهد ويلكوم ترست سانجر، http://www.ensembl.org). المنظمات الأعضاء الموسومة فلوريسئين استهداف ميثيونين البادئ (أغسطس-MO) أو لصق موقع من exon2 تم microinjected (exon2-MO) في الأجنة. وقد وزعت على المنظمات الأعضاء بشكل موحد في 12-14 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ولم الأجنة morphant لا تظهر أية تغييرات جسيمة في حجم الجسم العام ومورفولوجية مقارنة مع الضوابط. Bbs1 وقيمت morphants bbs3 المقبل لإجراء تعديلات نموذجية بما في ذلك الحد أو فقدان حويصلة مهدبة، والمعروفة باسم حويصلة كوبفر (KV)، الاستعداد لعيوب تجانب والتأخير في النقل جسيم ميلانيني الوراء (9، 16). الأسلاف KV تنشأ في خط الوسط الظهرية وتشكل حويصلة المهدبة في منطقة الذيل برعم خلال مراحل الجسيدة (+24 - +30). في البرية من نوع ومراقبة الأجنة المحقونة MO في مرحلة 10-13 الجسيدة، وKV على شكل دائرة يبلغ متوسط ​​حجم 50 ميكرون (الشكل 1 A و B). وقد لوحظت عيوب KV (خفض حجم ثلث أقل من المعتاد أو الكلي من غياب KV) بطريقة تعتمد على الجرعة في bbs1 MO وbbs3 حقن MO الأجنة (الشكل الجدول 1). وتمشيا مع وظيفة المقترحة للKV في اليسار واليمين التماثل محور (+24 - +30)، وأظهرت ضربة قاضية الزرد من bbs3 العيوب تجانب الجهاز تظهر الأجنة Bbs3 MO حقن التعديلات الركض هامة في 22-24 HPF (عكس أو لا هرول) و. حلقات العيوب في 36 HPF (31)، في حين أن جرعة منخفضة من bbs3 MO أو مراقبة الأجنة المحقونة MO لا تظهر KV كبير أو التعديلات تجانب (الشكل 1 E، الجدول 1).

الشكل 1.
bbs3 ضربة قاضية الظواهر في الزرد. (A - C) صور الأجنة الزرد حية في مرحلة 10-13 الجسيدة. (A) KV (مربع متقطع) هو حويصلة مهدبة تقع في منطقة الذيل برعم في البرية من نوع الجنين. (B) التكبير العالي للسيطرة KV (رأس السهم). (C) bbs3 حقن MO الجنين مع انخفاض KV (رأس السهم). التكبير: (A) 5 ×؛ (B و C) 10 ×. (D) نسبة العيوب KV الزرد (انخفاض أو غائبة) ولدت في MO ومجموعات التحكم. (E) نسبة العيوب تجانب القلب لوحظ في morphants bbs3 والضوابط. (F - H) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء، نظرا الأمامي الظهري من اليرقات البالغة من العمر 5 أيام. (F) من النوع البري اليرقات قبل العلاج ادرينالين و (G) عند نقطة 1.5 دقيقة بعد العلاج الادرينالين. (H) bbs3 morphant اليرقات يبدون استجابة تأخير بعد 3.0 دقيقة من العلاج الادرينالين. (I) التمثيل البياني للجسيم ميلانيني إلى الوراء مرة النقل التي يسببها الأدرينالين مما يدل على تأخير تعتمد على الجرعة في bbs3 ضربة قاضية بالمقارنة مع من النوع البري والأجنة حقن السيطرة. وأشارت العلاج وحجم العينة على X -axis وأشارت نسبة في الجزء العلوي من العارضة. * P <0.001.


الجدول 1.
وتشمل bbs1 وbbs3 ضربة قاضية الظواهر تعطيل تشكيل KV، عيوب تجانب القلب (الركض وحلقات) وتأخير كبير في جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء

أثبتنا سابقا تورط ظيفة BBS في مجال النقل داخل الخلايا العام. وأسفرت - (bbs8 وbbs11 bbs2، bbs4) في تأخير ذات دلالة إحصائية في النقل إلى الوراء (ضربة قاضية للجينات BBS الزرد 16). مكوك الزرد الأجسام الصباغية داخل melanophores ردا على الإشارات البصرية والمحفزات الهرمونية (32 - 35). في الزرد تكييفها الظلام، وفرقوا الأجسام الصباغية (الشكل 1 F). جسيم ميلانيني التجميع (إلى الوراء النقل) يتم تحفيز على العلاج مع ادرينالين (الشكل 1 G) (16، 36). من النوع البري والأجنة حقن السيطرة تتراجع بسرعة الأجسام الصباغية (الشكل 1 الأول؛ الجدول 1). في المقابل، وجرعة عالية من bbs3 الأجنة المحقونة MO تأخر كثيرا جسيم ميلانيني التراجع (الشكل 1 H) (P <0.001)، في حين تظهر جرعة منخفضة من bbs3 الأجنة المحقونة MO معدل مماثل لأجنة التحكم (P> 0.05) ( الجدول 1). لوحظ نتائج مماثلة مع الأجنة المحقونة MO bbs1. وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن الزرد bbs1 وbbs3 knockdowns تؤدي إلى الظواهر نموذجية مماثلة لغيرها من knockdowns BBS الجينات، بما في ذلك العيوب KV، الاستعداد لعيوب تجانب وإلى الوراء تأخير النقل داخل الخلايا.

التفاعل الجيني بين orthologs BBS الزرد

تحور أي من تحديد 12 جينات BBS الإنسان تسبب الظواهر المماثلة، بعد تحليل التنبؤ مجال البروتين تشير إلى أن البروتينات BBS لا تنتمي إلى أي فئة وظيفية واحدة (المواد التكميلية، الشكل S1). وقد اقترح أن التباين المظهري بين المرضى BBS ربما يعود إلى التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS (37). لذا نحن اختبار الزوج الحكيم ضربة قاضية من bbs1-bbs8 في الزرد لتقييم التآزر بين هذه الجينات في الجسم الحي. حددنا أول جرعة subphenotypic لكل الثمانية BBS المنظمات الأعضاء. تم تحديد جرعة subphenotypic بوصفها أعلى جرعة MO الذي لا ينتج النمط الظاهري كبير عندما تم حقنها بشكل فردي في الأجنة الزرد (المشار إليها باسم '-'، الشكل 2 A؛ الجدول 2). نحن المقبل شارك حقن 28 مجموعات الزوج الحكيم المحتملة لجرعة subphenotypic-bbs1 bbs8 المنظمات الأعضاء. واعتبرت تفاعلات كبيرة (المشار إليها باسم '+'، الشكل 2 أ) إذا لوحظت في تغيير دلالة إحصائية في العيوب KV وزيادة جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء بالمقارنة مع العلاج مع انخفاض جرعة واحدة MO. ثمانية من 28 حقن الزوج الحكيم الممكنة أدى إلى تفاعلات تعاونية. كل هذه التفاعلات المعنية إما bbs1 أو bbs2 كأحد مكونات التفاعل. حددنا خمسة bbs1 التفاعل المتآزرة (مع bbs2، bbs3، bbs4، bbs6 وbbs7 موس) وأربعة bbs2 التفاعل المتآزرة (مع bbs1، bbs3، bbs4 وbbs6 موس). Bbs3، bbs4 وbbs6 تفاعلت مع كل bbs1 وbbs2. تفاعلت Bbs7 فقط مع bbs1. أظهر Bbs5 وbbs8 لا التفاعلات الجينية مع أي الجينات BBS الآخرين. تركيبات التآزر ثمانية، وbbs1 مع مزيج bbs7 الزوج الحكيم أظهر الخلل KV أشد (الشكل 2 B) وتأخير النقل إلى الوراء (الشكل 2 C؛ الجدول 2). سبع مجموعات تعاونية أخرى، من أجل زيادة شدة،are bbs2 with bbs4 , bbs2 with bbs3 , bbs1 with bbs2 , bbs1 with bbs4 , bbs1 with bbs6 , bbs1 with bbs3 and bbs2 with bbs6 (Table 2 ). لتأكيد التفاعل المتآزرة، ونحن أجنة مع مجموعات الزوج الحكيم من جرعة عالية من bbs1 MO مع bbs7 MO شارك حقن. نحن أيضا تقييم جرعة عالية من مزيج من bbs3 MO مع bbs7 MO، وزوج غير متناغم. وجنبا إلى جنب جرعة عالية من bbs1 MO مع bbs7 MO إنشاء عيوب مثيرة، في حين أن جرعة عالية من الزوج الحكيم مزيج من bbs3 MO مع bbs7 MO أسفرت عن الظواهر مماثلة لتلك التي تم إنشاؤها بواسطة bbs3 MO جرعة عالية من حقن وحده، وbbs7 حقن جرعة عالية وحده (الشكل 3 أ و ب). توفر البيانات التآزر في أدلة الجسم الحي للتفاعل بين الجينات الوراثية المحددة BBS. هذه التفاعلات الوراثية يمكن أن تشير إلى التكرار وظيفية بين التفاعل الجينات و / أو رياضيات الكيمياء المطلوبة ضمن مجمع مهمة لوظيفة المناسبة من المجمع.

الرقم 2.
التفاعل الجيني بين ثمانية جينات BBS (bbs1 - bbs8). (A) ثمانية وعشرون تركيبات الزوج الحكيم subphenotypic من BBS MO أظهرت ثمانية فقط تفاعلات تعاونية، كما لاحظ علامة "+". التفاعلات الوراثية تؤدي إلى (B) اضطراب KV و (C) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني تأخير النقل إلى الوراء بالمقارنة مع الرقابة والأجنة جرعة منخفضة من BBS MO حقن. RNA محددة يمكن انقاذ تعطيل KV وجسيم ميلانيني تأخير النقل إلى الوراء. أضيفت مراقبة المنظمات الأعضاء عند الضرورة للحفاظ على التركيز النهائي موحد للMO في مزيج الحقن. * P <0.001؛ تابع والسيطرة.


الرقم 3.
جرعة متوسطة ضربة قاضية للوراثيا التفاعل BBS الجينات النتائج في زيادة شدة وانتفاذ من BBS الظواهر ضربة قاضية، بما في ذلك (A) اضطراب KV و (B) التي يسببها ادرينالين جسيم ميلانيني النقل إلى الوراء بالمقارنة مع من النوع البري، ضخت السيطرة والأجنة حقن مع مجموعات MO من BBS الجينات التي لا تتفاعل وراثيا. وأشارت العلاج وعدد الأجنة على المحور س والقيم على الجزء العلوي من القضبان. * P <0.001؛ تابع والسيطرة.


الجدول 2.
ملخص التفاعل الوراثي تقييمها من قبل BBS ضربة قاضية الجينات

خصوصية BBS ضربة قاضية

تم إجراء الانقاذ من الظواهر الناتجة MO-لتأكيد خصوصية ضربة قاضية الجينات. ركزنا هذا الجزء من الدراسة على bbs1 وbbs7 لسببين. أولا، لوحظ والجمع الأكثر أهمية التفاعل الجيني مع bbs1 وbbs7. ثانيا، تظهر bbs1 وbbs7 البروتينات تناظر كبير مع بعضها البعض. شارك في حقن في المختبر -transcribed bbs1 RNA مع جرعة عالية من bbs1 MO، وكذلك شارك في حقن bbs7 RNA مع جرعة عالية من bbs7 MO، النتائج في إنقاذ كل من KV والظواهر النقل إلى الوراء (الشكل 2 B و C ؛ الجدول 3). وهكذا، والإنقاذ RNA يدعم خصوصية bbs1 وbbs7 الظواهر التي يسببها MO. للتحقيق في ما إذا كان هو التفاعل بين الجينات الوراثية BBS يرجع إلى التكرار وظيفية، شاركنا في حقن جرعة عالية من bbs7 MO مع bbs1 RNA. لا يمكن انقاذ النمط الظاهري جرعة عالية من bbs7 يسببها MO مع bbs1 RNA. وبالمثل، جرعة عالية من bbs1 MO وجرعة عالية من الظواهر bbs3 MO لا يمكن انقاذ مع bbs7 RNA (الشكل 3 أ و ب). وتوفر هذه البيانات الإنقاذ RNA والجمع بين الزوج الحكيم في دليل فيفو للتفاعلات جينية محددة بين الجينات BBS وتشير إلى أن هذه التفاعلات الوراثية ليست بسبب التكرار وظيفية. في المقابل، إلى جرعة عالية من حقن MO التي تؤدي إلى الظواهر، وجرعة منخفضة من الحقن MO الفردية BBS المنظمات الأعضاء لا تولد الظواهر، ما لم يكن جنبا إلى جنب مع ثاني جرعة منخفضة محددة BBS MO. وعلاوة على ذلك، تم تقييم الإنقاذ RNA التفاعلات التآزر. وتم انقاذ الظواهر الناتجة عن الجمع بين حقن جرعة منخفضة من bbs1 MO مع bbs7 MO مع RNA bbs7 وحدها، وكذلك مع bbs1 RNA وحدها (الجدول 3). قدرة RNA bbs1 أو bbs7 RNA لانقاذ جرعة منخفضة جنبا إلى جنب ضربة قاضية إلى أن ضربة قاضية الجزئية إما bbs1 أو bbs7 وحده لا يؤدي إلى فقدان كامل للوظيفة مجمع BBSome.

الجدول 3.
BBS الجينات ضربة قاضية الإنقاذ واختبار وظيفة زائدة

الزخرفة تغيير في مهدها الزعنفة الصدرية الزرد

منذ polydactyly هي واحدة من السمات الأساسية للBBS البشري، وبحثنا إمكانية العيوب الزخرفة برعم الزعنفة في morphants BBS. في الواقع، يتم التعبير عن الجينات BBS على نطاق واسع، ولكن بنسبة 36 HPF bbs7 يظهر تخصيب الأمامي، مع التعبير ملحوظ في برعم الزعنفة النامية (16). في morphants BBS، كان حجم الزعانف عموما يمكن تمييزه من النوع البري، مما يشير إلى نمو زعانف عادية نسبيا وقدرتها على البقاء. وقد تطورت الزعانف الصدرية الزرد والأمامية رباعي الأرجل من أطرافهم الأجداد المشترك وتبادل التشكل مماثلة والآليات الجزيئية الكامنة مماثلة (+38 - 43)، بما في ذلك ZPA (44، 45) والتي يتم ترجمتها في اللحمة المتوسطة الخلفي من برعم الزعنفة / أطرافهم ( الشكل 4 A). ويشير ZPA المعلومات الموضعية هامة للمواصفات وأرقام. في الفرخ برعم الطرف، تطعيم لZPA الأمامي إضافي للZPA الأصلي أسفرت عن تشكيل ارقام اضافية تشبه polydactyly البشري (44). وأعرب عن القنفذ الصوتي (Shh على) في الخلفية الفقارية برعم الطرف اللحمة المتوسطة ويتوسط وظائف ZPA، بطريقة تعتمد على التركيز في كل براعم الزعنفة الزرد وبراعم الأطراف رباعي الأرجل (46). منذ زيادة ZPA وظيفة أو SHH النشاط قد يؤدي إلى polydactyly، قمنا بتقييم SHH التعبير. في البرية من نوع الأجنة، وأعرب عن الصورة صاحب السمو في مجال على شكل هلال في المنطقة الخلفية لبرعم الزعنفة الصدرية (الشكل 4 B). هذا مجال التعبير دون تغيير في السيطرة وجرعة منخفضة من الأجنة MO حقن (bbs1، bbs3 وbbs7). والزعنفة الصدرية SHH مجال التعبير في جرعة عالية من bbs1 أو bbs7 morphants يدل على التوسع الأمامي، في حين أن التعبير SHH في خط الوسط ظهري لم يتغير (الشكل 4 C). وتمشيا مع التفاعلات الوراثية التي سبق تحديدها، الزوج الحكيم مزيج من جرعة منخفضة من MO من bbs1 مع bbs7 أيضا أثبتت موسعة التعبير SHH (الشكل 4 D)، في حين أن الزوج الحكيم مزيج من جرعة منخفضة من MO من bbs3 مع bbs7 يظهر نفسه كما البرية من نوع (لا تظهر البيانات). تم قياس متوسط ​​مساحة التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية باستخدام برنامج يماغيج (47)، وأكد ذات دلالة إحصائية (P <0.001) يزيد في جرعة عالية من bbs1 MO، جرعة عالية من bbs7 MO وbbs1 مع bbs7 مزيج جرعة منخفضة في مقارنة مع البرية من نوع الأجنة (الشكل 4 E). وهكذا، في برعم الزعنفة النامية، نلاحظ زيادة نطاق ZPA / SHH دون تكدير أطرافهم / نمو زعانف العام.

الرقم 4.
منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) من برعم الزعنفة الصدرية والقنفذ الصوتي (SHH). (A) تمثيل تخطيطي من برعم الزعنفة الزرد قبل 48 HPF ZPA المترجمة الخلف، ويمكن أن يكون المسمى مع التعبير SHH. جبل بأكمله التهجين الموضعي باستخدام SHH باعتباره التحقيق في مهدها الزعنفة الصدرية من 42 HPF (B) من النوع البري، (C) morphant bbs7 و (D) جرعة منخفضة من bbs1 MO مع مزيج bbs7 MO. رأس السهم يدل SHH التعبير في برعم الطرف على جانب واحد، ويرد مجال التعبير على الجانب الآخر. (E) التمثيل البياني للمنطقة قياس (ميكرون 2) المجال التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية من morphants BBS والنوع البري. * P <0.001.

منذ طفرات وراثية لSHH تظهر خسارة أو الحد من عناصر الهيكل العظمي من الزعانف الصدرية (46)، ونحن مصممون المقبل ما إذا كان -signaling SHH توسعت في مهدها زعنفة من morphants BBS يدفع توسيع الصدرية الهياكل الزعانف. في الزعنفة الصدرية من اليرقات البالغة من العمر 6-7 يوما، العنصر الهيكل العظمي أكثر الداني هو cleithrum (الكلور)، الذي يمتد dorsoventrally (الشكل 5 A). المرافقة الكلورين هو كتفي غرابي (SC)، الذي يمتد على طول قاعدة الزعنفة، والعنصر الأكثر القاصي هي الزعنفة. تلطيخ الأزرق الألسيان في البرية من نوع يحدد مثل قضيب الكلورين (الشكل 5 B، السهم) والشوري المجاور (الشكل 5رأس السهم). BBS الأجنة morphant إثبات وجود الشوري الموسع (الشكل 5 C، رأس السهم)، حيث تظهر نهاية الخلفي البعيدة للالشوري لطبقات الخلايا غير منظمة و / أو إضافية مقارنة مع من النوع البري (الشكل 5 B). بما يتفق مع البيانات الجينية التفاعل، bbs1 مع bbs3 وbbs1 مع مجموعات جرعة bbs7 subphenotypic تظهر أيضا سميكة الشوري (الشكل 5 D، رأس السهم)، في حين bbs3 مع bbs7، التي لا يوجد لها تأثير متناغم على KV أو النقل إلى الوراء، يوضح هيكل برأسية مماثلة إلى البرية من نوع (لا تظهر البيانات). وهكذا، خطر ظيفة BBS التي كتبها النتائج حقن MO في توسيع التعبير SHH والزخرفة في وقت لاحق تغييرات في عناصر الهيكل العظمي للزعنفة الصدرية. وعلى الرغم من الزرد لا تشكل الأرقام، فإن هذه النتائج تشير إلى أن العيوب أطرافهم الزخرفة لوحظت في مرضى BBS ناتجة عن تشوهات SHH التعبير.

الرقم 5.
الصدرية الزرد زعنفة الغضروف تلطيخ. (A) التمثيل التخطيطي للهياكل زعنفة: الكلورين كخط ظهري بطني (السهم). الشوري البعيدة لالكلورين والأقرب إلى زعنفة. (B - D) الألسيان الأزرق تلطيخ الزعنفة الصدرية يوضح هيكل نموذج أولي للغضروف في العمر 6 ايام (B) من النوع البري اليرقات، في حين أن (C) يرقات bbs7 morphant و (D) جرعة منخفضة من الجمع بين bbs1 MO مع bbs7 MO تظهر بنية الشوري الموسع مع 2-3 خطوط الخلايا في المنطقة الخلفية القريبة من الشوري (رأس السهم).

نقاش

وقد ثبت اثني عشر الجينات تسبب بشكل مستقل BBS في البشر. عرض المرضى BBS البشري ميزات مشابهة مستقلة عن تحور الجين الأساسي. لقد أظهرنا في وقت سابق ان ضربة قاضية الفردية من عدة جينات BBS الزرد (bbs2، bbs4-bbs8 وbbs11) النتائج في الظواهر الزرد المشتركة بما في ذلك تشكيل KV غير طبيعي، تشوهات أهداب وجسيم ميلانيني عيوب النقل (9، 16). في هذه الدراسة، علينا أن نظهر أن الخسارة من وظيفة الفردية bbs1 أو bbs3 في النتائج الزرد في نفس الظواهر كما ضربة قاضية أخرى الجينات BBS الزرد. بالإضافة إلى ذلك، فقد استخدمنا الآن في النظام النموذجي الزرد لتحديد التفاعلات بين الجينات الوراثية BBS عن طريق ضرب في وقت واحد أسفل تركيبات الزوج الحكيم من الجينات. لهذا التحليل في الجسم الحي من التفاعلات الوراثية، تم اختبار 28 مجموعات الزوج الحكيم الممكنة من الجينات BBS (bbs1-bbs8) في الجرعات التي لا تنتج النمط الظاهري عندما يتم استخدام morpholino الفردية (جرعة subphenotypic). في جرعات subphenotypic المستخدمة في هذه الدراسة، تم تحديد ثمانية الزوج الحكيم تفاعلات تعاونية. قبل هذه الدراسة، تم إنشاء أي نموذج حيواني لBBS polydactyly. باستخدام نظام نموذجي الزرد، حددنا الزخرفة غيرت من المهد الزعانف وتغييرات لاحقة لعناصر الهيكل العظمي الزعانف. منذ برعم الزعنفة الزرد هو orthologous لبرعم الطرف البشري، وتشير هذه الدراسة وجود صلة بين polydactyly بعد المحوري لوحظت في مرضى BBS وغيرت التعبير SHH في تطوير أطرافهم / برعم الزعنفة.
وظيفة BBS3 المطلوبة من أجل وظيفة الأهداب والنقل حويصلي داخل الخلايا

BBS3 (ARL6) هو ARF مثل البروتين (10). تدعم البيانات الأدوار الوظيفية المختلفة للبروتينات ARL، بما في ذلك تنظيم حويصلة داخل الخلايا والاتجار الغشاء والتجمع أنيبيب (18، 19). يوضح لنا فقدان البيانات من وظيفة أن النتائج bbs3 في نفس الظواهر الزرد كما knockdowns BBS الأخرى، بما في ذلك العيوب KV والخلايا تأخير النقل إلى الوراء. العثور على أهداب في KV يبدو أن تشكلت في البداية في bbs3 ضربة قاضية الزرد، ولكن يتم فقدان أهداب قبل الأوان، ولا تعمل في تشكيل KV العادي. وقد تم مؤخرا تبين أن سبعة البروتينات BBS (BBS1، 2، 4، 5، 7، 8 و 9) شكل مجمع المعروفة باسم BBSome (17). وBBSome يبدو أن تلعب دورا في تكون الأهداب، على الأقل جزئيا، من خلال التفاعل مع / الناتج المحلي الإجمالي عامل الصرف Rab8 GTP (Rabin8). Rab8GTP يدخل أهداب الابتدائي ويعزز تمديد الغشاء الهدبي. منع Rab8GTP إنتاج كتل ciliation وعوائد الظواهر BBS مميزة في الزرد (17). وإن لم يكن جزءا من BBSome، والبيانات المقدمة هنا مما يدل على أن bbs3 ضربة قاضية النتائج في عيوب في KV وأهداب العقدي، وكذلك في جسيم ميلانيني (يحلول عضيات ذات الصلة) النقل، ودعم دور للBBS3 والبروتينات BBS أخرى في مجال النقل الحويصلي ل وهدب (9، 16).

التفاعل بين الجينات الوراثية BBS

تظهر المرضى BBS الإنسان مجموعة واسعة من التباين المظهري. ويعتبر الاختلاف بين المرضى حتى ضمن العائلة الواحدة (وبالتالي مع نفس الطفرات BBS الأولية)، مشيرا إلى المعدلات الوراثية و / أو البيئة من النمط الظاهري. التباين المظهري والتباين الوراثي واسعة من BBS يرفع احتمال وجود تفاعلات معقدة بين الجينات BBS (37). في هذه الدراسة، حددنا ثمانية التفاعلات الوراثية من مجموع 28 التفاعلات الوراثية الزوج الحكيم الممكنة اختبارها. وتجدر الإشارة، كل واحد من ثمانية التفاعل المتآزرة أسفرت عن عيوب KV وتأخر نقل جسيم ميلانيني. لم يلاحظ أي تفاعلات تعاونية التي أثرت فقط مجموعة فرعية من الظواهر. في كل حالة، وزيادة الجرعة كل من morpholinos فوق جرعة subphenotypic أدى إلى زيادة شدة الظواهر ضربة قاضية BBS أبعد من ذلك لوحظ لالفردية ضربة قاضية جرعة عالية، ودعم الفرضية القائلة بأن الجينات BBS يمكن تعديل الظواهر بعضها البعض.
BBS التفاعلات المعقدة يمكن أن يعزى إلى أدوار زائدة عن الحاجة، وظيفة مسار مواز أو شرط stoichometric داخل مجمع البروتين مثل BBSome، على سبيل المثال عدد قليل من الاحتمالات. في هذه الدراسة، أثبتنا أن جرعة عالية من العيوب التي يسببها MO الفردية يمكن انقاذ من قبل المشارك حقن شكل من النوع البري من مرنا الجينات المحددة (أي bbs7 مرنا ينقذ جرعة عالية من bbs7 MO النمط الظاهري)، ولكن ليس عن طريق زيادة مستويات البروتينات BBS أخرى. على سبيل المثال، bbs1 مرنا لا إنقاذ جرعة عالية من العيوب التي يسببها MO-bbs7 والعكس بالعكس، يجادل ضد التكرار وظيفية. في المقابل، مرنا الفردية كافية لانقاذ subphenotypic المنظمات الأعضاء ضربة قاضية مجتمعة (أي bbs7 مرنا يمكن إنقاذ جرعة منخفضة من bbs7 جنبا إلى جنب مع bbs1 العيوب التي يسببها MO)، مما يشير إلى رياضيات الكيمياء المطلوبة داخل المجمع. دراسة حديثة أجرتها Nachury وآخرون. (17) وقد حددت BBS معقدة (وBBSome) وذكرت أن عناصر من مجمع موجودة بكميات متكافئة.
التعرف على مجمع BBSome تتألف من سبعة من 12 البروتينات المعروفة BBS (BBS1، BBS2، BBS4، BBS5، BBS7، BBS8 وBBS9) (17) يمكن استخدامها لتصنيف البروتينات BBS تعرف إلى تلك التي هي جزء من BBSome وتلك التي ليست جزءا من هذا المجمع (BBS3، BBS6، BBS10، BBS11 وBBS12). هذه المعلومات، جنبا إلى جنب مع البيانات التفاعل الوراثي من الدراسة الحالية، يسمح تحديد ما إذا كان BBS الزوج الحكيم التفاعلات الوراثية تنتج عن انخفاض قيمة اثنين من البروتينات BBSome، وضعف مكون من BBSome وعنصر عدم BBSome و / أو في وقت واحد انخفاض قيمة اثنين من البروتينات غير BBSome. وقد لوحظت أنواع الأولين من التفاعلات. على سبيل المثال، كان ينظر إلى أقوى التفاعل بين عنصرين BBSome (BBS1 وBBS7). بالإضافة إلى ذلك، اثنين من البروتينات غير BBSome التي درست (BBS3 وBBS6) عرضت كل من التفاعل وراثيا مع مكونات محددة من BBSome (BBS3 مع BBS1 وBBS2؛ BBS6 مع BBS1 وBBS2)، ولكن ليس مع مكونات BBSome الأخرى وليس مع بعضها البعض. وعلاوة على ذلك، والتفاعلات المادية المباشرة داخل المجمع BBSome لا يتوقع التفاعلات الوراثية. على سبيل المثال، BBS7 يتفاعل جسديا مباشرة مع BBS2 وليس مع BBS1 (17). ومع ذلك، BBS7 يتفاعل وراثيا مع BBS1، ولكن ليس مع BBS2.
على أساس من العثور على البديل متخالف في MGC1203 في عدد قليل من المرضى BBS، Badano وآخرون. (48) تستخدم الزرد لتقييم تأثير روكبي من mgc1203 على الجينات BBS وذكرت أن قمع متواضع من mgc1203 يمارس تأثير روكبي على النمط الظاهري التنموي للmorphants BBS. وبالمثل، knockdowns subphenotypic لدينا جينات معينة BBS الزرد إلى أن بعض الجينات BBS لها تأثير روكبي على النمط الظاهري من الجينات BBS أخرى. ومن الجدير بالذكر أن اثنين من الدراسات المستقلة استخدمت نهج subphenotypic مماثل في الزرد لتقييم التفاعلات الوراثية للbbs10 وbbs12 الجينات (12، 15). وتجدر الإشارة إلى أن واضعي ذكرت العيوب تكون المعيدة باعتباره النمط الظاهري BBS MO التي يسببها (12، 15، 48) وتستخدم هذه النمط الظاهري لتحديد التفاعلات المحتملة بين الجينات BBS. الأجنة morphant في دراستنا لا تظهر أية تغييرات جسيمة في حجم الجسم العام والتشكل. الظواهر عيب أهداب وتأخير النقل لوحظ في الدراسة الحالية هي ذات الصلة بيولوجيا إلى اضطراب البشري.
ذات أهمية سريرية، وتوفير البيانات لدينا نظرة ثاقبة وسائط غير المندلية من BBS الميراث. تم الإبلاغ عن الميراث Triallelic في مجموعة فرعية صغيرة من الحالات BBS (49 - 54). وتشير البيانات المتوفرة لدينا الزرد أن جرعة عالية من ضربة قاضية الفردية BBS الجينات النتائج في أهداب KV والظواهر النقل حويصلة (9، 16). هذه البيانات بيانات دعم الماوس خروج المغلوب أن خسارة كاملة للوظيفة البروتين BBS واحدة كافية للحث على الظواهر BBS (20 - +22). البيانات التفاعل الوراثية المقدمة هنا تشير إلى أن الأليلات hypomorphic وظيفيا من اثنين من البروتينات المحددة BBS يمكن أن تتضافر لتؤدي في الميراث digenic من BBS. على أساس البيانات الزرد يدل الظواهر ذات الصلة الناجمة عن ضربة قاضية في وقت واحد من اثنين من الجينات BBS، فمن المغري أن نفترض أن تغاير في اثنين من الجينات BBS (تغاير مزدوج) يمكن أن تكون كافية لإظهار بعض الظواهر BBS. لم يتم الإبلاغ عن حدوث ذلك. سوف توفر عدة نماذج الماوس BBS تسهيل اختبار هذه الفرضية.

ارتباط بين SSH والعيوب أطرافهم BBS

وقد تم ربط BBS الفيزيولوجيا المرضية لعيوب في وظيفة الأهداب والنقل داخل الخلايا. ومع ذلك، فإن لم يبلغ عنها polydactyly باستمرار في الأمراض الهدبية (+55 - 58). لذلك، وصلات الآلية بين وظيفة الأهداب وpolydactyly لا تزال غير واضحة. منذ الزرد الاقتران الزعانف والأطراف رباعي الأرجل ترتبط phylogenetically، شكليا مماثلة (42، 43، 59) وعرض مماثلة أنماط التعبير الجيني في تطوير أطرافهم / براعم الزعانف، يمكننا استخدام هذا النظام لتحليل الآليات الجزيئية التي تكمن وراء تطورها المبكرة (+38 - 43). BBS الخسارة من وظيفة يدل على توسيع SHH التعبير في مهدها الزعنفة الصدرية دون أن يؤثر ذلك SHH العصبي أنبوب التعبير. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة SHH للتنمية داخل الهيكل زعنفة / أطرافه (43)، وأظهر متحولة الزرد SHH (سيو) فقدان الصدرية حزام عناصر الهيكل العظمي (46، 60)، في حين أن التعبير خارج الرحم من Shh على الدجاج في الثقافة برعم الطرف MICROMASS يسببها الغضاريف رواية عقيدات (61). تحليل للعناصر الهيكلية في BBS اليرقات ضربة قاضية كشف كتفي غرابي سميكة من الزعنفة الصدرية بما يتفق مع زيادة التعبير SHH في مهدها الزعنفة الصدرية. على الرغم من أن تم الإبلاغ عن وظيفة الأهداب وIFT للعب دور في SHH الإشارات (56، 62، 63)، وتستخدم الدراسة الحالية لدينا SHH كعلامات لZPA. بالإضافة إلى ذلك، SHH التعبير في خط الوسط هو رابط الجأش. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة لمعالجة مباشرة لدور أهداب أو نقل الخلايا في تنظيم SHH في morhpants BBS.ومع ذلك، توفر البيانات المتوفرة لدينا في الجسم الحي دليلا على وجود دور وظيفة BBS في أطرافهم / زعنفة برعم الزخرفة مما أدى إلى زيادة SHH الإشارات.

المواد والأساليب

MO العقاقير

وقد صممت المنظمات الأعضاء العقاقير والتي تم شراؤها من أدوات الجينات، LLC. تم microinjected المنظمات الأعضاء في ما يقرب من 3 مجلدات نانولتر في 07:59 الأجنة الخلية بتركيزات تتراوح بين 125-500 م م. تسلسل MO الزرد هي bbs1 _aug (GGGAACAGATGACATGGTTGTTTTG)؛ bbs1 _ exon2 (TGAAACTCACCAATGCATGAGGAGA)؛ السيطرة MO bbs1 _5mis (TAAGaGTGAtGATGGcCACTtGCAT)؛ bbs3 _aug (AGCTTGTCAAAAAGCCCCA TTTGCT)؛ bbs3 _exon2 (TACATCTTTTATTTTCACCTTGAGG) والسيطرة MO bbs3 _5mis (AGgTTcTCAAAAAaCCCgATTTcCT).

الزوج الحكيم مزيج من BBS morpholinos

اثنين من المنظمات الأعضاء BBS مختلفة تستهدف bbs1-bbs8 كانت مجتمعة في الجرعات المنخفضة subphenotypic (125 μ M لكل منهما) وmicroinjected في 07:59 الأجنة الخلية. وكانت الضوابط لهذه التجارب مجموعات من جرعة منخفضة من كل BBS MO والتحكم MO (125 μ M لكل منهما). التركيز النهائي من المنظمات الأعضاء حقنه في أي الجنين في هذه التجربة كانت دائما ثابتة (250 μ م).

تحليل KV

والحويصلات في الأجنة التي يبلغ قطرها أقل من ثلث أن من النوع البري يعتبر انخفاض وتم سجل الأجنة التي الحويصلات لا يمكن تحديد شكليا كما تغيب. تم تصوير الأجنة الحية مع زايس Axiocam على المجسام.

فحص النقل جسيم ميلانيني

تعرض يوم 5 اليرقات إلى ادرينالين (50 ملغ / مل، سيجما، E4375) تضاف إلى الجنين المتوسطة (64) لتركيز النهائي من 500 ميكروغرام / مل. تم رصد جسيم ميلانيني تراجع باستمرار تحت المجهر وسجل نقطة النهاية عندما كانت جميع الأجسام الصباغية في الرأس والجذع محيط بالنواة.

إنقاذ النمط الظاهري ضربة قاضية

وsubcloned مقاومة للMorpholino BBS RNA إلى pCS2 + ناقلات التعبير (65). وقدم RNA الاصطناعية مع mMessage mMachine (AMBION). مرنا (50 نانوغرام / ميكرولتر bbs1 و 100 نانوغرام / ميكرولتر bbs7 كان) شارك في حقن MO المناسب.

جبل بأكمله، في الموقع التهجين من SHH في براعم الزعانف الصدرية

الأجنة، وتعامل مع الصباغ المانع في 12 HPF، كان المثقف إلى 42 HPF وثابتة مع بارافورمالدهيد 4٪ / الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). SHH تم توليفها تحقيقات RNA (روش) من القوالب خطي، العقاقير (digoxigenin-UTP جمعية مهندسي البترول I ، T7 RNA البلمرة) والمعنى (ليس أنا، البلمرة SP6 RNA). جبل بأكمله، في الموقع التهجين أنجز كما وصفها الين وآخرون. (16). مجال SHH تم قياس التعبير عن الرأي 1.37v يماغيج (47). الطالب ر استخدمت -test افتراض عدم المساواة التباين لتقييم فروق ذات دلالة إحصائية في متوسط ​​مساحة SHH التعبير (P <0.001). تم تصوير الأجنة في 50 × التكبير.

الغضروف تلطيخ

تم إجراء الغضروف تلطيخ كما هو موضح في تايلور وفان دايك (66). لفترة وجيزة، اليرقات في 6 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) كانت ثابتة بين عشية وضحاها مع بارافورمالدهيد 4٪ / برنامج تلفزيوني، المجففة تدريجيا مع الايثانول المطلق وملطخة بين عشية وضحاها مع الألسيان الأزرق (30 ملغ في 8: 2 الايثانول: حامض الخليك الجليدي). واليرقات ثم ابيض مع 1٪ هيدروكسيد البوتاسيوم (1 M) / 3٪ بيروكسيد الهيدروجين، مسح مع 0.5٪ trypsine / المشبعة tetraborate الصوديوم، ودرجة الحموضة 9.1، لمدة 2 ساعة والمخزنة في 7: 3 الجلسرين: (1X) PBS. تم تصويرها يتصاعد الغضروف في 50 × التكبير.

 

__________________
استشارى الادوية الطبيعيه وباحث وخبير فى علاجات التوحد
رد مع اقتباس